KR20140084125A

KR20140084125A - 소수성 치환 크로마토그래피용 중성 양쪽성 이온 디스플레이서 분자

Info

Publication number: KR20140084125A
Application number: KR1020147012085A
Authority: KR
Inventors: 베리 엘. 헤이모어
Original assignee: 사켐,인코포레이티드
Priority date: 2011-10-03
Filing date: 2012-10-03
Publication date: 2014-07-04
Also published as: HK1195885A1; KR20140084124A; CN103958016A; WO2013052537A2; WO2013052087A1; HK1195884A1; CN103958016B; US20140296485A1; JP2014534421A; CN103958017B; JP2014531604A; EP2763772A2; EP2763774A1; CA2850765A1; CN103958017A; US9120846B2; WO2013052537A3; IL231886A0; CA2850728A1; IL231885A0

Abstract

본 발명은, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법에 관한 것으로, 소수성 정지 상을 제공하고; 소수성 정지 상에, 분리될 유기 화합물을 포함하는 혼합물을 가하며; 이에 비-표면 활성의 소수성인 중성 양쪽성 이온 디스플레이서 분자 및 임의로 유기 용매를 포함하는 수성 조성물을 가하여 소수성 정지 상으로부터 유기 화합물을 치환하고; 분리된 유기 화합물을 함유하는 소수성 정지 상으로부터 용리된 복수의 분획을 수거하는 단계를 포함하고, 여기서 비-표면 활성의 소수성인 중성 양쪽성 이온 디스플레이서 분자는 상세한 설명에 정의된 바와 같이 화학식 [CM-R^*-CM']을 갖는 소수성 양쪽성 이온을 포함한다.

Description

소수성 치환 크로마토그래피용 중성 양쪽성 이온 디스플레이서 분자{NEUTRAL ZWITTERIONIC DISPLACER MOLECULES FOR HYDROPHOBIC DISPLACEMENT CHROMATOGRAPHY}

치환 크로마토그래피(DC)는 컬럼 크로마토그래피의 3가지 잘 정의된 형태 - 용리(elution), 치환(displacement), 프론탈(frontal) 중의 하나이다. DC는 주로 제조적 방법이지만, 또한 팩킹된 "협소한-구멍(narrow-bore)" 또는 모세관 컬럼을 사용한 "미세제조적(micropreparative)" DC를 사용하는 분석적 적용이 존재한다.

치환 크로마토그래피는, 적합한 고순도 디스플레이서 분자가 이용 가능한 경우 4가지 일반적인 크로마토그래피적 방법들 중의 어느 하나를 사용하여 수행할 수 있다. DC는 (a) 이온-교환 크로마토그래피(양이온-교환, 음이온-교환), (b) 소수성 크로마토그래피[역-상(reversed-phase), 소수성-상호작용, 소수성 전하-유도, 호황성(thiophilic)], (c) 친수성-상호작용 크로마토그래피(HILIC)를 포함하는 정상-상(normal-phase) 크로마토그래피 및 (d) 부동화된 금속-이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)에서 사용된다.

최적화된 DC를 사용하여, 당업자는 고순도(고 분해능), 고 회복성(고수율) 및 고 컬럼 로딩(high column loading)(고 용량)을 동시에 수득할 수 있다 - 후자는 오버로딩된(overloaded) 제조적 용리 크로마토그래피보다 훨씬 더 크다. 대부분의 경우들에서, 이들 이점들은 DC의 단점들을 보다 더 보상한다(더 느린 유속들, 더 긴 실행 시간, 고순도 디스플레이서들에 대한 필요성).

치환 크로마토그래피는, (a) 적용 가능한 크로마토그래피적 방법, (b) 적절한 치수들을 갖는 적합한 크로마토그래피 컬럼,(c) 적절한 이동 상 조건들, (d) 적합한 디스플레이서 분자 및 (e) 적절하게 구성된 LC 장치를 갖는 적합한 작동 프로토콜들을 선택하여 수행한다. 초기에, 적합한 "약하게 치환(diaplacing)하는 이동 상"(캐리어; carrier)을 선택하고, 컬럼은 적합한 유속로 평형시킨다. 캐리어는 유용한 pH 값으로 조절된 pH-완충 화합물을 포함할 수 있다. 최적 치환 유속들은 낮은 경향이 있으며, 전형적으로 35 내지 105 cm/hr의 범위이지만 때때로 이보다 더 높다. 적합한 양의 샘플 용액을 샘플-로딩 유속로 컬럼 상으로 로딩한다. 샘플 용액은, 샘플 또는 디스플레이서 분자들이 하전되거나 양쪽성 이온성인 경우 적절한 수준의 이온 쌍 형성제(ion-pairing agent) 또는 이온 쌍 형성 염과 함께 캐리어 속에서 정제되는 물질을 포함한다. 전형적인 샘플 로딩들은 작동적 관류 용량(operative breakthrough capacity)의 50 내지 80%이다. 다음에, 캐리어 용액 중의 적절한 농도에서 적합한 디스플레이서 화합물로부터 제조된 디스플레이서 이동 상(디스플레이서 완충제)는, 디스플레이서 관류가 관찰될 때까지 치환 유동속도로 컬럼 상으로 펌핑(pumping)된다. 정제된 샘플은, 디스플레이서에서 관류 프런트(displacer breakthrough front) 앞의 컬럼을 제거한다. 컬럼으로부터의 분획을 수집하고 함량 및 순도에 대해 별도로 분석한다. 최종적으로, 디스플레이서는 "디스플레이서 제거 용액"을 이용하여 컬럼으로부터 제거한 다음, 컬럼은 저장하기 위해 또는 후속적인 용도를 위해 이의 원래 상태로 세척하고 재생한다.

일부 국면들에서, 용리 크로마토그래피와 상이하지만, 치환 크로마토그래피는 이해하기 용이하고 수행하기 용이하다. DC에서, 샘플은 이동 상에 의해 컬럼으로부터 "용리"되기 보다는 디스플레이서에 의해 컬럼으로부터 "치환(displaced)"된다. 컬럼의 배출(output)이 온라인으로(예를 들면, UV 흡수, pH, 또는 전도성) 모니터링되는 경우, "용리 크로마토그램"보다는 "치환 트레인(displacement train)"이 수득된다. 치환 트레인은 크로마토그램에서 용매-분리된 "용리 피크들" 보다는 나란한 "치환 밴드들(displacement bands)"로 구성된다. 치환 밴드가 정지 상(stationary phase)을 포화시킬 정도로 큰 경우, 사다리꼴 "포화 밴드(saturating band)"가 형성된다. 치환 밴드가 정지 상을 포화시킬 정도로 크지 않은 경우, 작은 삼각형 "비-포화 밴드"가 형성된다. 포화 밴드의 높이는 작동 점에서 결합-등온선(binding-isotherm)으로 측정하고; 사다리꼴-밴드 또는 삼각형-밴드의 면적은 성분의 양에 비례한다.

소수성 크로마토그래피는 고도로 구성되고 자체결합되고 수소-결합된 액체로부터 수득되는 물의 독특한 용매화 특성들에 거의 전적으로 의존한다. 통상적인 역-상 크로마토그래피 정지 상들(충전되지 않은 C₁₈ 컬럼)에 있어서, 결합은 보통 엔트로피(+T△S)에 의해 구동되는 데, 이는 종종 바람직하지 않은 엔탈피(+△H)를 극복해야만 한다. 따라서, 크로마토그래피 작업자들에 의해 종종 사용되는 온도 범위들(10-70℃) 이상에서, 분석물-결합 및 디스플레이서-결합은 종종 온도 증가에 따라 더 강해진다. 소수성 크로마토그래피의 또 다른 유용한 특징은, 수계 용매의 자체-수소-결합의 구조 및 강도 둘 다를 수정하는 첨가제들의 용도이다. 이들 첨가제들은 크로마토그래피 완충제들 중의 염들(NaCl, K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄), 유기 용매들(MeCN, MeOH, EtOH) 및 극성 유기 분자들(우레아, 올리고-에틸렌글리콜)을 포함한다.

소수성 치환 크로마토그래피는 키랄 분석물들(chiral analytes), 키랄 디스플레이서들 및 키랄 크로마토그래피 매트릭스들을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 조건들 하에서, 아키랄 디스플레이서(achiral displacer)를 사용할 수 있지만, 키랄 디스플레이서의 라세믹 혼합물(racemic mixture)은 사용할 수 없다. 라세믹 키랄 분석물들은 또한 아키랄 크로마토그래피 컬럼 및 아키랄 디스플레이서를 이용하여 정제할 수 있다. 이 경우, 부분입체이성체들을 포함하는 불순물들은 목적하는 라세믹 화합물로부터 제거되지만, 거울상이성체들의 키랄 분해능은 없다. 유용한, 제조적 소수성 치환 크로마토그래피의 개발은 적합한, 고-순도 디스플레이서 분자들의 이용불가능성에 의해 저해되어 왔다. 본 발명자들은 본 출원에서 다양한 형태들의 소수성 치환크로마토그래피에서 활용을 갖는 신규한 디스플레이서 분자들 및 이들의 사용 방법들을 기술한다.

양호한 소수성 디스플레이서 분자들은 화학적 및 물리적 특성들의 독특한 조합을 지녀서 이들이 효율적으로 작용하도록 해야 한다. 일부 가용성, 소수성 분자들은 디스플레이서들로서 작용할 수 있지만, 단지 제한된 소수만이 잘 작용할 수 있다. 본 문서에 기술된 많은 분자들은 잘-작용하는 디스플레이서들에 대한 필요한 요건들을 충족한다.

유용한 역-상, 제조적 치환 크로마토그래피의 개발은 적합한 고순도 디스플레이서 분자들의 비이용 가능성에 의해 방해받아 왔다. 예를 들면, 미국 특허 제 6,239,262호는 디스플레이서들로서 저분자량 표면-활성 화합물을 이용하는 각종의 역상 액체 크로마토그래피 시스템들을 기술한다. 미국 특허 제 6,239,262호는, 디스플레이서들로서 사용된 기재된 표면 활성 화합물을 형성하기 위해 소수성 잔기들과 커플링(coupling)될 수 있는 매우 광범위한 가능한 하전된 잔기들을 기술하고 있지만, 기술된 디스플레이서들의 표면 활성 특성들을 완화시키기 위해 큰 비율의 유기 용매를 포함할 필요가 있다는 것을 기술하고 있다. 이러한 큰 비율들의 유기 용매들이 존재하면, 공정을 상당히 변경시켜서, 역-상의 소수성 치환 크로마토그래피의 이점들이 폄하된다. 또한, 미국 특허 제 6,239,262호에 기술된 강력한 표면 활성 디스플레이서 화합물들은 잘 작용하지 않아서, 상당한 수준의 불순물들이 "정제된" 생성물들 중에 존재할 수 있는 비교적 불량한 내지 보통인(poor-to-mediocre) 품질의 치환 트레인들을 생성시킨다.

본 발명자들은 소수성 치환 크로마토그래피에서 양호한 디스플레이서 거동을 위해 필요한 화학적 및 물리적 특성들의 조합을 독특하게 지니는, 중성의 소수성 양쪽성 이온성(zwitterionic) 또는 이양쪽성 이온성(dizwitterionic) 화합물들의 부류들을 발견하고 개발하였다.

따라서, 본 발명은, 일 실시예에서,

소수성 정지 상(hydrophobic stationary phase)을 제공하고;

소수성 정지 상에, 분리될 유기 화합물을 포함하는 혼합물을 적용하고;

여기에 비-표면 활성의 소수성 중성 양쪽성 이온 디스플레이서 분자를 포함하는 수성 조성물을 적용함으로써 소수성 정지 상으로부터 유기 화합물을 치환하며;

분리된 유기 화합물을 함유하는 소수성 정지 상으로부터 용리된 복수의 분획을 수거하는 단계를

포함하는, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법에 관한 것으로,

비-표면 활성의 소수성 중성 양쪽성 이온 디스플레이서 분자는 다음 화학식을 갖는, 소수성 중성 양쪽성 이온 분자를 포함하고:

[CM-R^*-CM']

상기 식에서,

CM은, 4차 암모늄(I), 4차 포스포늄(II), 설포늄(III), 설폭소늄(IV), 이미다졸리늄(아미디늄)(V), 구아니디늄(VI), 이미다졸륨(VII), 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀리늄(VIII), 1,2,3,4-테트라하이드로퀴놀리늄(IX), 이소인돌리늄(X), 인돌리늄(XI), 벤즈이미다졸리움(XII), 피리디늄(XIIla, XIIIb, XIIIc, XIIId), 퀴놀리늄(XIV), 이소퀴놀리늄(XV)으로부터 선택된 형식 양성(+) 전하(formal positive charge)를 갖는 독립적인 소수성 화학 잔기이고, CM'은 카르복시레이트(XVI), N-아실-α-아미노산(XVII), 설포네이트(XVIII), 설페이트 모노에스테르(XIX), 포스페이트 모노에스테르(XX), 포스페이트 디에스테르(XXI), 포스포네이트 모노에스테르(XXII), 포스포네이트(XXIII), 테트라아릴 보레이트(XXIV), 보로네이트(XXV), 보로네이트 에스테르(XXVI)로부터 선택된 형식 음성(-) 전하(formal negative charge)를 갖는 독립적인 소수성 화학 잔기이고; 여기서 화학 잔기들 (l) 내지 (XXVI)은 다음의 화학 구조식을 갖는다:

상기 식에서,

CM 및 CM'은, 반대의 형식 전하를 가짐으로써 분자가 전체로서 작동 pH에서 제로 형식적 전하(zero formal charge)를 갖는 전기적으로 중성 양쪽성 이온이고, CM 및 CM'은 이중 연결된 화학 잔기, R^*에 의해 서로 화학적으로 부착되며, 당해 잔기는 CM 상의 하나의 R¹, R²　(존재하는 경우), R³　(존재하는 경우) 또는 R⁴　(존재하는 경우) 화학 잔기를 치환하고 CM' 상의 하나의 R^1', R^2'　(존재하는 경우), R^3'　(존재하는 경우) 또는 R^4'(존재하는 경우) 화학 잔기를 치환하고;

여기서 R¹, R^1', R², R^2', R³, R^3', R⁴ 및 R^4' 각각은 화학식 -C_xX_2x _-2r-AR¹　-C_uX_2u-2s-AR²로 독립적으로 정의된 직쇄 또는 측쇄 화학 잔기이고,

R^*는 직접 화학 결합이거나 또는 화학식 -C_xX_2x _-2r-AR¹-C_uX_2u _-2s-로 정의된 CM을 CM'로 연결하는, 이중 연결된, 직쇄 또는 측쇄 화학 잔기이며,

R⁵ 및 R^5'는 화학식 -C_xX_2x _-2r-AR²로 정의된 직쇄 또는 측쇄 화학 잔기이며;

상기 화학식에서,

각각의 AR¹은 독립적으로 이중 연결된 메틸렌 잔기(-CX¹X²-, 메탄으로부터), 이중 연결된 페닐렌 잔기(-C₆G₄-, 벤젠으로부터), 이중 연결된 나프틸렌 잔기(-C₁₀G₆-, 나프탈렌으로부터) 또는 이중 연결된 비페닐렌 잔기(-C₁₂G₈-, 비페닐로부터)이고;

여기서 AR²는 독립적으로 수소(-H), 플루오르(-F), 페닐 그룹(-C₆G₅), 나프틸 그룹(-C₁₀G₇) 또는 비페닐 그룹(-C₁₂G₉)이고;

여기서 각각의 X, X¹　및 X²는 개별적 및 독립적으로, -H, -F,-Cl 또는 - OH이고;

여기서 임의의 -C_xX_2x _-2r- 내의 또는 임의의 -C_uX_2u _-2s- 내의 또는 임의의 -(CX¹X²)_P- 내의 임의의 메틸렌 잔기(-CX¹X²-)는 독립적인 에테르-산소 원자, -O-, 독립적인 티오에테르-황 원자, -S-, 또는 독립적인 케톤-카보닐 그룹, -C(O)-에 의해, 각각의 에테르-산소 원자, 각각의 티오에테르-황 원자 또는 각각의 케톤-카보닐 그룹이 지방족 탄소 원자 또는 방향족 탄소 원자에 각각의 측면에 결합되는 방식으로, 개별적 및 독립적으로, 치환될 수 있으며;

여기서 2개 이하의 에테르-산소 원자들, 2개 이하의 티오에테르-황 원자들 및 2개 이하의 케톤-카보닐 그룹들은 임의의 -C_xX_2x _-2r- 또는 임의의 -C_uX_2u _-2s- 내로 치환될 수 있고;

여기서 m_x는, 에테르-산소 원자들, 티오에테르-황 원자들 및 케톤-카보닐 그룹들로 치환되는 각각의 -C_uX_2x _-2r- 내의 메틸렌 그룹들의 총 수이고, m_u는 에테르-산소 원자들, 티오에테르-황 원자들 및 케톤-카보닐 그룹들로 치환되는 각각의 -C_uX_2u _-2s- 내의 메틸렌 그룹들의 총 수이고;

여기서 G는 개별적 및 독립적으로, -H, -F, -Cl, -CH₃, -OH, -OCH₃, -N(CH₃)₂, -CF₃, -CO₂Me, -CO₂NH₂; -CO₂NHMe, -CO₂NMe₂의 임의의 조합이고;

여기서 G^*는 개별적 및 독립적으로, -F, -Cl, -R², -OH, -OR², -NR²R³, -CF₃, -CO₂Me, -CO₂NH₂; -CO₂NHMe, -CO₂NMe₂의 임의의 조합이고;

여기서 R², R^2', R³, R^3', R⁴및 4^4'의 쌍은, R²/R³, R²/R⁴, R³/R⁴, R^2'/R^3', R^2'/R^4'　또는 R^3'/R^4'가 개별적 및 독립적으로, -(CX¹X²)_p-(여기서, p는 3, 4, 5 또는 6이다)이도록 단일의 화학 잔기를 포함할 수 있고;

여기서 x, r, u, s, m_x, m_u의 각각의 정수 값들은 각각의 R¹, R^1', R², R^2', R³, R^3', R⁴, R^4', R⁵, R^5' 및 R^*에 대하여 독립적으로 선택되고, 정수 값들 r 및 s는 포함되고 분리된 시스/트랜스 올레핀계(알켄) 그룹들의 총 수 + 포함된 단일의 모노사이클릭 구조들의 총 수이며 범위들 0 ≤ r ≤ 2 및 0 ≤ s ≤ 2에 속하고, 수치적 양(numeric quantity) x+u-m_x-m_u는 범위 0 ≤ x+u-m_x-m_u ≤ 11에 속하고;

여기서 적어도 하나의 방향족 화학 잔기, 헤테로사이클릭 방향족 화학 잔기, 이미다졸린 화학 잔기, 아미딘 화학 잔기 또는 구아니딘 화학 잔기는 CM 또는 CM' 내에 포함되고;

여기서 각각의 R-화학 잔기에 대한 그룹-소수성-지수(n)는 지방족 탄소 원자들의 수 + 올레핀계 탄소 원자들의 수 + 티오에테르-황 원자들의 수 + 염소 원자들의 수 + 플루오르 원자들의 수의 1/5 + 에테르-산소 원자들의 수의 1/2 + 케톤-탄소 원자들의 수의 1/2 + 수 6을 넘는 방향족 탄소 원자들의 수의 1/2의 합 - 수 1을 넘는 하이드록실-산소 원자들의 수와 수치적으로 동일하고;

여기서 각각의 [CM-R^*-CM']에 대한 전체-소수성 지수(N)는 지방족 탄소 원자들의 수 + 올레핀계 탄소 원자들의 수 + 티오에테르-황 원자들의 수 + 염소 원자들의 수 + 플루오르 원자들의 수의 1/5 + 에테르-산소 원자들의 수의 1/2 + 케톤-탄소 원자들의 수의 1/2 + 수 6을 넘는 방향족 탄소 원자들의 수의 1/2의 합 - 수 1을 넘는 하이드록실-산소 원자들의 수와 수치적으로 동일하고;

여기서 R¹　및 R^1' 에 대한 그룹-소수성 지수들(¹n 및　^1'n)은 4.0 <　¹n,^1'n < 12.0의 범위에 속하고, R², R^2', R³, R^3', R⁵, R^5', R^*에 대한 그룹-소수성 지수들(²n,　^2'n, ³n,　^3'n,　⁵n,　^5'n 및 ^*n)은, 존재하는 경우, 범위 0.0 ≤　²n, ^2'n,　³n, ^3'n,　⁵n, ^5'n, ^*n < 12.0에 속하며, R⁴　및 R^4'에 대한 그룹-소수성 지수들(⁴n 및　^4'n)은, 존재하는 경우, 범위 0.0 ≤　⁴n, ^4'n ≤ 5.0에 속하고;

여기서 전체-소수성-지수(N)은 범위 10.0 ≤ N < 24.0에 속하며;

여기서 사이클릭 화학 잔기에 대해 계산된 그룹-소수성-지수의 수치 값은 2개의 각각의 R-화학 잔기들 사이에 동일하게 나누어지고;

여기서 R¹은, 단지 하나의 R-화학 잔기가 CM 또는 CM'에 부착되는 경우 이러한 R-화학 잔기로 정의되고; 여기서 R¹은, CM 또는 CM'에 부착된 하나 이상의 화학 잔기들이 존재하는 경우 그룹-소수성-지수의 최대 값을 갖는 이러한 R-화학 잔기로 정의되며; 여기서 R⁴는, CM 또는 CM'에 부착된 3개 이상의 R-화학 잔기들이 존재하는 경우 그룹-소수성-지수의 최소값을 갖는 이러한 R-화학 잔기로 정의되고;

일반적으로 본원에서, CM은 양이온이고 CM'은 음이온이며, 각각의 CM 및 CM'은 각각, [CM-R^*-CM']내 전기적 중성이 유지되는 한, 하나 이상의 양이온 또는 음이온을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 비-표면 활성 소수성 디스페이서 분자를 포함하는 수성 조성물은 pH 완충제 이외의 첨가된 염이 존재하지 않는다.

일 실시예에서, CM은 다음 화학식 I 또는 II를 갖는다:

상기 화학식 I 또는 II에서, R¹은 C₈-C₁₁ 하이드로카빌 잔기이고, R²　및 R³은 독립적으로 C₁-C₄ 하이드로카빌 잔기 또는 벤질이고, R⁴는 벤질, 할로-치환된 벤질, 4-알킬벤질, 4-트리플루오로메틸 벤질, 4-페닐벤질, 4-알콕시벤질, 4-아세트아미도벤질, H₂NC(O)CH₂-, PhHNC(O)CH₂-, 디알킬-NC(O)CH₂-로부터 선택되고, 여기서 알킬은 C₁-C₄이고, 단 CM에는 1개 이하의 벤질 그룹이 존재한다.

일 실시예에서, CM은 다음 화학식 I 또는 II를 갖는다:

상기 화학식 I 또는 II에서, R¹　및 R²는 독립적으로 C₄-C₈ 알킬 또는 사이클로헥실이고, R³는 C₁-C₄ 알킬이며, R⁴는 페닐, 2-, 3- 또는 4-할로페닐, 벤질, 2-, 3- 또는 4-할로벤질, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- 또는 3,5-디할로벤질, 2,4,6- 또는 3,4,5-트리할로벤질, C₆H₅CH₂CH₂- 또는 2-, 3- 또는 4-트리플루오로메틸벤질이다.

일 실시예에서, CM은 화학식 VIII, IX, X 또는 XI이고, R¹는 C₅-C₁₁ 알킬이며 R²는 C₁-C₈　알킬이고 G는 위에서 정의한 바와 같다.

일 실시예에서, CM은 다음 화학식 I 또는 II를 갖는다:

상기 화학식 I 또는 II에서, R¹는 C₆-C₁₁ 알킬이고, R²　및 R³은 독립적으로 C₁-C₄　알킬이고, R⁴는 PhC(O)CH₂-, 4-FC₆H₄C(O)CH₂-, 4-CH₃C₆H₄C(O)CH₂-, 4-CF₃C₆H₄C(O)CH₂-, 4-ClC₆H₄C(O)CH₂-, 4-BrC₆H₄C(O)CH₂-, ㎗-PhC(O)CH(Ph)-, Ph(CH₂)₂-, Ph(CH₂)₃-, Ph(CH₂)₄-, ㎗-PhCH₂CH(OH)CH₂-, t-PhCH=CHCH₂-, 1-(CH₂)나프틸렌, 9-(CH₂)안트라센, 2-, 3- 또는 4-FC₆H₄CH₂- 또는 벤질이다.

일 실시예에서, CM은 다음 화학식 I 또는 II를 갖는다:

상기 화학식 I 또는 II에서, R¹는 C₆-C₁₁ 알킬이고, R²와 R³은 함께 -(CH₂)₄-이고, R⁴는 PhC(O)CH₂-, 4-FC₆H₄C(O)CH₂-, 4-CH₃C₆H₄C(O)CH₂-, 4-CF₃C₆H₄C(O)CH₂-, 4-ClC₆H₄C(O)CH₂-, 4-BrC₆H₄C(O)CH₂-, ㎗-PhC(O)CH(Ph)-, Ph(CH₂)₂-, Ph(CH₂)₃-, Ph(CH₂)₄-, ㎗-PhCH₂CH(OH)CH₂-, t-PhCH=CHCH₂-, 2-, 3- 또는 4-FC₆H₄CH₂-, 벤질, 3-ClC₆H₄CH₂-, 2,6-F₂C₆H₃CH₂-, 3,5-F₂C₆H₃CH₂-, 4-CH₃C₆H₄CH₂-, 4-CH₃CH₂C₆H₄CH₂-, 4-CH₃OC₆H₄CH₂-, (CH₃)₂NC(O)CH₂- 또는 (CH₃CH₂)₂NC(O)CH₂-이다.

일 실시예에서, CM은 다음 화학식 I 또는 II를 갖는다:

상기 화학식 I 또는 II에서, R¹는 C₄-C₆ 알킬, 벤질 또는 2-, 3- 또는 4-FC₆H₄CH₂-이고, R²　및 R³는 독립적으로 C₁-C₈　알킬, CH₃(OCH₂CH₂)₂-, CH₃CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂- 또는 CH₃CH₂OCH₂CH₂-이며, R⁴는 Ph(CH₂)₄-, 4-PhC₆H₄CH₂-, 4-FC₆H₄CH₂-, 4-CF₃C₆H₄CH₂-, PhC(O)CH₂-, 4-FC₆H₄C(O)CH₂-, 4-PhC₆H₄C(O)CH₂-, 4-PhC₆H₄CH₂-, 나프틸렌-1-CH₂-, 안트라센-9-CH₂- 또는 Ph(CH₂)_n-이고, 여기서 n은 5 내지 8이다.

일 실시예에서, CM은 화학식 [(R¹R²R³NCH₂)₂C₆H₃G]²⁺이고, 여기서 R¹은 C₄-C₁₁ 알킬이고, R²　및 R³은 독립적으로 C₁-C₆ 알킬이거나 또는 R²와 R³은 함께 취해져서 -(CH₂)₄-이며, G는 H 또는 F이다.

일 실시예에서, CM은 화학식 [R¹R²R³NCH₂C₆H₄-C₆H₄CH₂NR¹R²R³]²⁺이며, 여기서, R¹은 C₄-C₁₁ 알킬이고, R²　및 R³은 독립적으로 C₁-C₆ 알킬이거나 또는 R²와 R³은 함께 취해져서 -(CH₂)₄-이다.

일 실시예에서, CM은 다음 화학식 III 또는 IV를 갖는다:

상기 화학식 III 또는 IV에서, R¹은 C₈-C₁₁ 알킬 또는 4,4'-CH₃(CH₂)₄C₆H₄-C₆H₄CH₂-이고, R²는 C₁-C₆　알킬 또는 4-FC₆H₄CH₂-이며, R³은 C₁-C₆　알킬이다.

일 실시예에서, CM은 다음 화학식 XIV 또는 XV을 갖는다:

상기 화학식 XIV 또는 XV에서, R¹은 C₈-C₁₁ 알킬이며, 각각의 G 및 R⁵는 위에서 정의한 바와 같다.

일 실시예에서, CM은 다음 화학식 XIIIa, XIIIb, XIIIc, XIIId 또는 XIIIe를 갖는다:

상기 화학식 XIIIa, XIIIb, XIIIc, XIIId 또는 XIIIe에서, R¹은 C₈-C₁₁ 알킬 또는 C₈-C₁₁ 4-페닐이고, R²는 H, C₁-C₆ 알킬 또는 알콕시, 2-피리딜, C₁-C₆ 알킬 치환된 2-피리딜, 또는 피롤리디닐이며, 각각의 G는 위에서 정의한 바와 같다.

일 실시예에서, CM은 다음 화학식 VII를 갖는다:

상기 화학식 VII에서, R¹은 C₅-C₁₁ 알킬이고, R²　및 R⁵는 독립적으로 H 또는 C₁-C₆ 알킬 또는 페닐이다.

일 실시예에서, CM은 다음 화학식 XII을 갖는다:

상기 화학식 XII에서, R¹은 C₅-C₁₁ 알킬이고, R²　및 R⁵는 독립적으로 H 또는 C₁-C₆ 알킬 또는 페닐이며, G는 위에서 정의한 바와 같다.

일 실시예에서, CM'은 다음 화학식 XXIV 또는 XXV을 갖는다:

상기 화학식 XXIV에서, R¹은 페닐, 4-EtC₆H₄-, 4-ⁿPrC₆H₄-, 4-ⁿBuC₆H₄-, 4-MeOC₆H₄-, 4-FC₆H₄-, 4-MeC₆H₄-, 4-MeOC₆H₄-, 4-EtC₆H₄-, 4-ClC₆H₄-, 또는 C₆F₅-이며; 각각의 R², R³ 및 R⁴는 독립적으로 페닐, 4-FC₆H₄-, 4-MeC₆H₄-, 4-MeOC₆H₄-, 4-EtC₆H₄-, 4-ClC₆H₄- 또는 C₆F₅-이며; 상기 화학식 XXV에서, R¹은 4-(4-ⁿBuC₆H₄)C₆H₄- 또는 4-(4-ⁿBuC₆H₄)-3-ClC₆H₃-이다.

일 실시예에서, CM'은 4-R¹C₆H₄SO₃H, 5-R¹-2-HO-C₆H₃SO₃H, 4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-4'-SO₃H 및 4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-3'-SO₃H로부터 선택된 화학식을 가지며, 여기서 R¹은 CH₃(CH₂)_n이고, 여기서 n은 4 내지 10이며 X는 H 또는 OH이다.

일 실시예에서, CM'은 다음 화학식 XVIII 또는 XXIII을 갖는다:

상기 화학식 XVIII 및 화학식 XXIII에서, R¹은 C₆H₅(CH₂)_n-이고, 여기서 n은 5 내지 11이다.

일 실시예에서, CM'은 5-R¹-2-HO-C₆H₃CO₂H 및 R¹C(O)NHCH(C₆H₅)CO₂H로부터 선택된 화학식을 가지며, 여기서 R¹은 CH₃(CH₂)_n- 이고, 여기서 n은 4 내지 10이다.

일 실시예에서, CM'은 화학식 4-R¹C₆H₄PO₃H₂를 갖고, 여기서 R¹은 CH₃(CH₂)_n-이고, 여기서 n은 4 내지 10이다.

일 실시예에서, 수성 조성물은 약 25 부피% 미만, 또는 약 20 부피% 미만, 또는 약 15 부피% 미만, 또는 약 10 부피% 미만, 또는 약 5 부피% 미만의 양의 유기 용매를 추가로 포함한다.

도 1a는, 본 발명의 예시적인 실시예에 따르는 치환 크로마토그래피 공정을 위한 상대 흡수 장치들(y-축)에 대한 시간을 플롯팅(x-축)하는 미정제 합성 펩티드를 정제하기 위한 치환 흔적이다.

본원에서 사용된 바와 같은, "비-표면 활성"이라는 용어는, 본 발명에 따라 사용된 중성 양쪽성 이온 비-표면 활성 디스플레이서 화합물과 관련하여, 이와 같이 기술된 화합물이 본 발명에 따라 치환 크로마토그래피 공정에서 사용된 화합물의 농도보다 더 큰 중요한 미셀 농도("CMC")를 가짐을 의미한다. 일 실시예에서, 비-표면 활성 디스플레이서 화합물의 농도는, CMC에 영향을 미치게 되는 유기 용매, 염 또는 기타 제제의 부재하의 물 속의 화합물에 대하여 CMC의 약 80% 미만이다. 일 실시예에서, 비-표면 활성 디스플레이서 화합물의 농도는, CMC에 영향을 미치게 되는 유기 용매, 염 또는 기타 제제의 부재하의 물 속의 화합물에 대하여 CMC의 약 60% 미만이다. 일 실시예에서, 비-표면 활성 디스플레이서 화합물의 농도는, CMC에 영향을 미치게 되는 유기 용매, 염 또는 기타 제제의 부재하의 물 속의 화합물에 대하여 CMC의 약 50% 미만이다.

일 실시예에서, 본 발명에 따라 사용된 비-표면 활성 소수성인 중성 양쪽성 이온 디스플레이서 분자를 포함하는 수성 조성물은, (1) 양쪽성 이온 비-표면 활성 디스플레이서 화합물이 이의 CMC보다 낮은 농도에서 존재하는 것; (2) 각각의 [CM-R^*-CM']에 대하여 전체-소수성-지수(N)가 범위 10 ≤ N < 24에 속하는 것; (3) 각각의 R¹ 및 R^1'에 대한 그룹-소수성-지수(¹n)가 범위 4 <　¹n < 12 내에 속하고, 각각의 R², R^2', R³, R^3', R⁵, R^5' 및 R^*에 대한 그룹-소수성-지수(²n,　³n,　⁵n 및 ^*n)가, 존재하는 경우, 범위 0 ≤　²n,　³n,　⁵n, ^*n < 12 내에 속하며, 각각의 R⁴ 또는 R^4'에 대한 그룹-소수성-지수(⁴n)가, 존재하는 경우, 범위 0 ≤　⁴n ≤ 5 내에 속하는 것; (4) 조성물이 약 5 부피% 이상의 유기 용매를 포함하는 것; (5) 조성물이, 당해 조성물의 pH를 조절하고 제어하는데 필요한 pH 완충제 이외에 0.1M 미만의 염 또는 1.0M 이상의 염을 함유하는 것 중의 하나 또는 이들의 2개 이상의 조합으로 인하여 부정적인 표면 활성 특성들을 나타내지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은, "저 유기 용매 함량"은, 예를 들면, 약 25 부피% 미만의, 본 발명에 기재된 중성 양쪽성 이온 비-표면 활성 디스플레이서 화합물을 포함하는 수성 "캐리어" 조성물 중의 유기 용매 함량을 일반적으로 나타낸다. 일 실시예에서, 수성 "캐리어" 조성물의 유기 용매 함량은 약 20 부피% 미만의 임의의 유기 용매를 포함한다. 일 실시예에서, 수성 "캐리어" 조성물의 유기 용매 함량은 약 15 부피% 미만의 임의의 유기 용매를 포함한다. 일 실시예에서, 수성 "캐리어" 조성물의 유기 용매 함량은 약 10 부피% 미만의 임의의 유기 용매를 포함한다. 일 실시예에서, 수성 "캐리어" 조성물의 유기 용매 함량은 약 5 부피% 미만의 임의의 유기 용매를 포함한다. 일 실시예에서, 수성 "캐리어" 조성물은 유기 용매를 포함하지 않는다.

일 실시예에서, 유기 용매는, 메탄올(CH₃OH 또는 MeOH), 에탄올(C₂H₅OH 또는 EtOH) 또는 아세토니트릴(CH₃CN 또는 MeCN) 중의 하나 또는 이들 2개 이상의 혼합물이다. 일 실시예에서, 수성 "캐리어" 조성물은 적합한 유기 용매들의 혼합물을 포함한다. 일 실시예에서, 수성 "캐리어" 조성물은 유기 용매를 포함하지 않는다.

소수성 치환 크로마토그래피는 키랄 분석물, 키랄 디스플레이서, 및 키랄 크로마토그래피 매트릭스를 사용하여 수행할 수 있다. 이들 조건에서, 아키랄 디스플레이서를 사용할 수 있지만, 키랄 디스플레이서의 라세믹 혼합물은 사용할 수 없다. 라세믹 키랄 분석물들은 또한 아키랄 크로마토그래피 컬럼 및 아키랄 디스플레이서를 사용하여 정제할 수 있다. 이 경우, 부분입체이성체들을 포함하는 불순물들은 목적하는 라세믹 화합물로부터 제거하지만, 거울상 이성체의 키랄 분해는 존재하지 않는다.

본원에 기재된 일부 중성 양쪽성 이온 디스플레이서는 부착된 4개의 상이한 그룹을 갖는 4차 질소를 가지며, 이에 따라 고유하게 키랄; 예를 들면, 하기 표들 V에서, 라세믹 디스플레이서 화합물들 722, 736, 755이다. 더욱이, 중성 양쪽성 이온 디스플레이서들의 일부는 아키랄 질소 원자에 부착된 단일의 키랄 그룹; 예를 들면, 디스플레이서 화합물 731을 포함한다. 키랄 크로마토그래피 매트릭스, 이동 상 및 아키랄 디스플레이서를 적절하게 선택하는 경우, 거울상이성체들은 정규적으로 제조적으로 분해(분리)된다. 특정한 상황들에 좌우되어, 양호한, 거울상이성체적으로 순수한, 키랄 디스플레이서는, 키랄 정지 상에서 거울상이성체들의 치환 분리를 수행하는 경우 양호한 아키랄 디스플레이서에 비하여 성능상의 이점들을 가질 수 있다.

유용한 pH 범위 - 화학식 A 또는 B를 갖는 중성 양쪽성 이온성의 소수성 디스플레이서들의 각종 부류들은 하전된 잔기들의 화학적 특성에 좌우되어 상이한 유용한 pH 범위들을 갖는다. 탈양자화가능한 양이온성 그룹들을 포함하는 중성 양쪽성 이온성의 소수성 디스플레이서는 실제 pKa 값들 이하의 pH 1-2 단위들 이상에서 작동해야 한다. 양자화 가능한 음이온성 그룹들을 포함하는 중성 양쪽성 이온성의 소수성 디스플레이서는 실제 pKa 값들을 이상의 pH 1-2 단위들 이상에서 작동해야 한다.

·오늄 그룹 - 일반적으로, 4차 암모늄, 4차 포스포늄, 3차 설포늄, 3차 설폭소늄 및 관련된 양이온성 그룹들, 예를 들면, 피리디늄, 이미다졸륨, 구아니디늄은 광범위한 유용한 pH 범위, 1-11 이상을 갖는데, 그 이유는 이들 그룹들이 정상 조건들 하에서 탈양자화 가능한 N-H, S-H 또는 P-H 잔기들을 갖지 않기 때문이다.

·아민 및 구아니딘 그룹 - 탈양자화 가능한 N-H 잔기들을 갖는 3차 지방족 아민들(pKa~9.5) 및 관련된 치환된 구아니딘들(pKa~13.5)은, 실제 pKa 값들 미만인 pH 1-2 단위들 이상에서 작동하는 경우 유용한 양이온 그룹들이다.

·설포네이트 그룹 - 일반적으로, 지방족 설포네이트들(pKa ~ -2.0) 및 방향족 설포네이트들(pKa~-2.5)은 이들의 매우 낮은 pKa 값들로 인하여, 광범위하게 유용한 pH 범위들, 1 내지 11을 갖는다.

·카르복시레이트 그룹 - 일반적으로, 단순한 지방족 카르복시레이트(pKa ~ 3.0-5.0), 방향족 카르복시레이트(pKa~-2.5-4.5), 베타인을 포함하는 글리신 유도체(pKa~2.0)와 호모베타인을 포함하는 β-알라닌 유도체(pKa~3.5)는, 실제 pKa 값을 초과하는 pH 1-2 단위에서 작동하는 경우 유용한 음이온성 잔기이다.

·포스포네이트 그룹 - 포스포네이트는 유용한 음이온성 그룹일 수 있지만, 이들의 용도는 제 2의 산 해리(pK_a2)로 인하여 복잡하다. 포스포네이트 그룹을 포함하는 중성 양쪽성 이온성의 소수성 디스플레이서는 실제 pK_a1을 초과하는 pH 1-2 단위들 이상에서 및 동시에 실제 pK_a2 미만의 pH 1-2 단위들 이상에서 작동하여야 한다. 유사하게, 포스포네이트 그룹을 포함하는 디스플레이서는 양호한 크로마토그래피 거동을 수득하기 위하여 실제 pK_a2를 초과하는 pH 1-2 단위들 이상에서 작동하여야 한다. 일반적으로, 유사한 지방족 포스포네이트들은 각각 ~2.2 및 7.7의 pK_a1 및 pK_a2 값들을 가지며, 간단한 방향족 포스포네이트들은 각각 ~2.0 및 7.2의 pK_a1 및 pK_a2 값들을 갖는다.

디스플레이서 결합 강도 - 디스플레이서는 샘플의 성분들 모두보다 더 강하게 또는 목적하는 주 성분들 모두보다 적어도 더 강하게 결합해야 한다. 양호한 경험칙은, 1 내지 4% 이하의 샘플 질량이 디스플레이서 보다 더 강하게 결합해야 한다는 것이다.

최적의 디스플레이서는 정지 상에 너무 강하거나 너무 약하게 결합하지 않아야 한다. 적절한 결합 강도는 목적하는 분석물 및 연합된 결합-등온선들에 좌우된다. 대개, 특정한 범위의 결합 강도들을 갖는 디스플레이서들의 범위는 정제되는 각종의 상이한 컬럼들 및 분석물들에 대하여 필요하다. 디스플레이서가 너무 강하게 결합하면, 저 분해능, 저 분석물 결합 용량, 디스플레이서 제거 시 곤란성 및 긴-사이클 시간과 같은 불량한 성능이 수득된다. 디스플레이서가 너무 약하게 결합하면, 불량한 치환 트레인이 디스플레이서 하부의 치환된 분석물의 너무 많은 "테일링(tailing)"과 함께 수득될 수 있거나, 단지 부분 치환만이 있거나 치환이 전혀 없을 수 있다.

적절한 결합 강도를 갖는 디스플레이서들을 선택하는 데 도움을 주는 편리한 경험칙은, 치환 실험에서 사용될 컬럼들 및 이동 상들과 유사한 것들을 이용하여 잠재적인 디스플레이서들 및 분석물들의 간단한 구배 용리 크로마토그래피를 수행하는 것이다. 제 1 스크린으로서, 디스플레이서는 60분 구배에서의 목적하는 분석물들보다 5 내지 15분 더 늦게 용리하여야 한다. 이상적으로, 당업자는 단일 분석물들 및 분석물들의 혼합물들의 등온선들을 측정하게 되었지만 이는 시간 소모적이며 종종 비실용적이다. 이는 결합-등온선에서 조기에 작동하기 때문에, 이러한 경험칙은 완벽하지 않지만, 추가의 DC 최적화를 위한 편리한 출발점을 제공한다.

이용 가능한 결합 등온선 - 적절한 결합 강도와는 별도로, 유용한 소수성 디스플레이서는 특정한 다른 유용한 특성들과 함께 결합 등온선들을 가져야 한다.

(1) 디스플레이서 및 분석물 분자들을 위한 단정의(monomodal) 볼록 상향 등온선들(랑뮈르-형 등온선 거동; Langmuir-type isotherm behavior)은 이소택틱 치환 트레인들을 정돈되게 형성하는 것을 촉진시키며 방법 최적화 공정을 단순화시킨다. 이는 방향족 알콜들(예: 치환된 페놀들, 나프톨들, 하이드록시비페닐들)과 같은 많은 다른 하전되지 않은 소수성 디스플레이서 분자들(비-양쪽성 이온들)의 결합-등온선들과 대조적으로 많은 중성 양쪽성 이온 디스플레이서 분자들의 유용한 특성이고, 지방 알콜들(예: 1-도데칸올, 1,2-도데칸디올) 및 하전되지 않은 지방 카복실산들(예: 미리스트산)은 저농도들에서 정상적으로 거동한 다음 바이모달(bimodal)이 되며 다시 고농도들에서 일어난다(BET-형 등온선 거동). 이러한 결합 거동은 종종 소수성 디스플레이서의 다중 층들의 부착으로부터 발생하며, 여기서 각각의 층은 상이한 결합 특성들을 갖는다. 이러한 결합 거동은 치환 공정 및 이의 유용한 이행을 상당히 복잡하게 만든다.

(2) DC에서의 크로마토그래피적 결과들은 또한, 디스플레이서 분자들이 용액중에서 자체-연합을 수행하는 경우 복잡해진다. 농도들이 증가함에 따라, 디스플레이서 자체-연합과 관련된 문제점들은 악화된다. 다시, 중성 양쪽성 이온 소수성 디스플레이서들 내의 하전된 그룹들은 수용액 속에서 자체-연합의 문제점들을 감소시키거나 억제한다.

(3) 추가의 복잡한 문제점들은 또한, 생성물 및/또는 불순물 등온선들이 높은 비-선형 결합 영역에서 디스플레이서 등온선을 교차할 때 발생할 수 있다. 이러한 거동은 치환 순서의 역전, 치환 밴드들 사이의 중첩 영역들의 확장 및 공동-치환을 갖는 문제점들을 야기한다. 이러한 경우, 디스플레이서 농도에서의 작은 변화들은 치환 트레인에서의 큰 변화들을 야기해서 방법 최적화를 매우 어렵게 만들 수 있다.

본 발명자들은, 적절한 반대-이온들 및 소량의 선택된 유기 용매들로 보충된 적절하게 고안된 소수성의 중성 양쪽성 이온 디스플레이서 분자들이 랑뮈르-형 결합 거동 및 유용한 범위들의 결합 강도들을 갖는 효과적인 소수성의 중성 양쪽성 이온 디스플레이서들의 군을 제공함을 밝혀내었다.

이온 쌍 형성제 - 이들의 많은 장점들과 함께, 소수성 디스플레이서 분자들은 분석물에 대해 양호한 이온 쌍 형성제 및 중성 양쪽성 이온성의 소수성 디스플레이서에 대해 양호한 이온 쌍 형성 염 둘다를 가져야 한다. 이온 쌍 형성 음이온은 보다 강력한 이온 쌍 형성 음이온 및 보다 약한 이온 쌍 형성 양이온을 갖는 염이다. 이온 쌍 형성 양이온은 보다 약한 이온 쌍 형성 음이온 및 보다 강한 이온 쌍 형성 양이온을 갖는 염이다. 이온 쌍 형성 염은, 음이온 및 양이온 둘 다가 보다 강력한 이온 쌍 형성 특성들을 갖는 염이다. 실제, 음이온 및 양이온 둘 다가 너무 강한 이온 쌍 형성 특성들을 갖는 경우, 이는 물 속에서 매우 잘 용해되지 않는다. 이온 쌍 형성 염들은 이들의 pl 근처인 중성 양쪽성 이온 디스플레이서들 및 양쪽성 이온 분석물을 제외하고는 본 발명에 대해 관련성이 거의 없다. pl은 "등전점"이며, 이는, 양성 전하들의 수가 음성 전하들의 수와 동일하고, 전체 양쪽성 이온 화합물이 순 제로 전하(net zero charge)를 갖는 임의의 양쪽성 이온 화학적 화합물(흔히 단백질 또는 펩티드)의 pH 또는 pH 값의 범위이다.

이온 쌍 형성제는 디스플레이서의 결합 등온선 및 디스플레이서의 작용 및 활용에 유의적으로 영향을 미친다. 이온 쌍 형성제의 농도는 적절한 양의 K⁺, NH₄ ⁺, 이온 쌍 형성 음이온의 양자화된 아민 염들 또는 이온 쌍 형성 양이온의 Cl^_/HCO₂ ^_ 염들을 첨가하여 독립적으로 조절한다. 하전된 소수성 디스플레이서에 대한 이온 쌍 형성 반대-이온의 특성들은 이의 치환 특성들에 강하게 영향을 미친다. 이는 또한 사실이지만, 중성 양쪽성 이온성의 소수성 디스플레이서들의 경우에는 보다 적은 정도이다. 몇몇의 반대-이온들이 용액 중의 이온 쌍 형성에 포함될 수 있으며, 거의 모든 반대-이온들은 소수성 크로마토그래피 매트릭스 상의 흡수된 상태에서 이온 쌍 형성에 포함된다. 디스플레이서 및 분석물에 대한 동일한 이온 쌍 형성제(들)이 양호한 크로마토그래피적 분해를 위해 사용되어야 한다. 유용한 이온 쌍 형성 반대-이온들은 일반적으로 단일 하전된다. 이들의 고 용매화 에너지들로 인하여, 2가 이온들(SO₄ ^2-, Ca²⁺) 및 3가 이온들(PO^3-, La³⁺)이 일반적으로 덜 유용하지만 일부 전문화된 경우들에서 사용될 수 있다. 이러한 일반적인 법칙에 대한 예외들은 ^-O₃S(CH₂)₄SO₃ ^- 및 Me₃N⁺(CH₂)₄N⁺Me₃와 같은 단일 유기 이온에서 분리된 다수의 단일 하전된 잔기이다.

더 큰 소수성 특성을 갖는 반대-이온들은 결합강도를 증가시키고 또한 용해도를 감소시키는 경향이 있다. 더욱이, 소수성 디스플레이서 염들을 사용하는 경우, DC의 분해능은, 반대-이온 자체가 너무 소수성이거나 너무 친수성인 경우 감소할 수 있다. 전형적으로, 반대-이온의 중간 소수성/친수성 특성은 최고의 결과들을 제공하지만, 이는 정제되는 분자에 따라 변한다. 각각의 정제를 위한 최적의 반대-이온은 실험적으로 측정하여야 한다. 예를 들면, CH₃CO₂ ^_　반대-이온을 갖는 소수성 4차 암모늄 디스플레이서는 양호한 용해도 및 보통(mediocre) 분해능을 제공하며, 여기서 CF₃CO₂ ^_　는 보통 분해능을 제공하지만, 허용되는 용해도 및 양호한 분해능을 제공하며, CCl₃CO₂ ^_　는 불량한 용해도 및 보통 분해능을 제공한다. 휘발성 이온 쌍 형성제들은 감압하에서 편리하게 제거되지만, 비휘발성의 것들은 디아필트레이션(diafiltration), 침전 또는 결정화와 같은 다른 수단으로 용이하게 제거한다. 표 I은 유용한 1가 이온 쌍 형성 음이온들의 부분 목록을 제공한다. 표 II는 유용한 일가의 이온 쌍 형성 양이온들의 부분 목록을 제공한다. 양자화된-아민(pKa~9.8-11.0), 양자화된 아미딘(pKa~12.5) 또는 양자화된 구아니딘(pKa~13.5) 이온 쌍 형성제들을 사용하는 경우, 작동 pH는 각각의 아민의 pKa 미만의 1-2 pH 단위들 이상이어야 한다. 음이온성 이온 쌍 형성제들을 사용하는 경우, 작동 pH는 각각의 산의 pKa를 초과하는 1-2 pH 단위들 이상이어야 한다. 이러한 가이드라인에 대한 주목할만한 예외는 이온 쌍 형성제 및 pH 완충제 둘 다로서 동시에 작용하는 트리플루오로아세트산이다.

[표 I]

이온 쌍 형성 강도의 대략적인 순서에서의 1가 음이온

약한 플루오라이드 < 하이드록사이드 < 글루코네이트 < 글리세레이트 < 글리콜레이트 < 락테이트

중간 포르메이트 < 아세테이트 < 비카보네이트 < 프로피오네이트 < 부티레이트 < 메탄설포네이트 < 에탄설포네이트 < 디플루오로아세테이트 < 클로라이드

중간 강도 브로마이드 < 트리플루오로아세테이트 < 디클로로아세테이트 < 니트레이트

강한 트리플레이트 < 요오다이드 < 디브로모아세테이트 < 티오시아네이트 < 트리클 로로아세테이트 < 퍼클로레이트 < 헥사플루오로이소부티레이트 < 펜타플루오로프로피오네이트 < 테트라플루오로보레이트 < 헥사플루오로포스페이트 < 트리브로모아세테이트

[표 II]

근사적 순서의 이온 쌍 형성 강도에 있어서 일가 양이온

RP 매트릭스에 대한 음이온의 암모늄-이온-쌍 보조된 결합을 평가하기 위한 가이드라인

·소수성 및 향상된 결합은 지방족 탄소 원자들의 수와 함께 증가한다.

·동일한 수의 지방족 탄소 원자들의 경우, 주요 암모늄 그룹들은 4차 암모늄 그룹들보다 더 우수하게 분석물 결합을 향상시킨다 (ⁿ부틸-NH₃ ⁺ > Et₂NH₂ ⁺ > EtMe₂NH⁺ > Me₄N⁺).

·동일한 수의 지방족 탄소 원자들의 경우, 선형 그룹들은 측쇄 그룹들보다 더 우수하게 분석물 결합을 향상시킨다 ("ⁿ부틸 > ⁱ부틸).

·동일한 수의 지방족 탄소 원자들의 경우, 선형 그룹들은 사이클릭 그룹들보다 더 우수하게 분석물 결합을 향상시켰다 ("ⁿ펜틸 > 사이클로펜틸).

·특정의 화학 잔기들의 경우, 암모늄 이온들과 일부 분석물들 사이의 수소 결합은 분석물 결합; 예를 들면, 주요 암모늄 대 포스페이트 디에스테르들(올리고뉴클레오타이드들) 및 구아니디늄 대 카르복시레이트들(Asp- 및 Glu-함유 펩티드들)을 향상시킨다.

혼합된 반대-이온들은 종종 크로마토그래피적 분해의 손실을 초래하며 일반적으로 피해진다. 그러나, 혼합된 반대-이온들이 사용될 수 있는 경우 1세트의 조건들이 존재한다; 즉, (a) 목적하는 반대-이온이, 존재하는 다른 반대-이온들보다 상당히 더 강한 이온 쌍 형성 특성들을 갖는 경우와, (b) 목적하는 반대-이온이 샘플 로딩 혼합물 및 디스플레이서 완충제 속에서 화학양론적 과량으로 존재하는 경우 모두.

가장 일반적으로 사용된 이온-쌍와 음이온들은 포르메이트, 아세테이트, 클로라이드, 브로마이드 및 트리플루오로아세테이트이다. 저 이온 쌍 형성 강도로 인하여, 포르메이트 및 아세테이트는 양호한 분해능을 위해 조심스런 최적화를 필요로 한다. 브로마이드 및 트리플루오로아세테이트는 낮은 pH에서 펩티드들을 위해 최적의 결과들을 제공하는 것으로 보인다. 일반적으로, 양호한 크로마토그래피적 결과들은 클로라이드 및 브로마이드를 이온 쌍 형성 음이온들로 사용하는 경우에 수득될 수 있지만, 2개의 특별한 주의들이 이루어져야 한다. (1) 산성 조건들 하에서, 크로마토그래피 용액들은 기체상 HCl 또는 HBr의 손실로 인한 헬륨 퍼징 또는 진공 탈기에 의해 탈기될 수 없어서 pH를 변화시키고 음이온의 농도를 변화시킨다. 이러한 문제점은 크로마토그래피 용액들을 제조하기 위해 탈기된 증류수를 사용하고 공기의 재흡수를 방지하기 위해 폐쇄된 용기들 속에 용액들을 저장함으로써 극복한다. (2) 클로라이드 및 브로마이드는 스테인레스 강 HPLC 장치에 대하여 잠재적으로 부식성이지만, PEEK, 테플론, 세라믹, 유리 및 티타늄으로 제조된 장치는 안전하다. 주요한 문제점은 낮은 pH에서 공기(산소)에 의해 유발된 스테인레스 강의 할라이드-촉매화된 부식이다. HPLC 용액들이 적절하게 탈산소화되면, 스테인레스 강의 할라이드-촉진된 부식은 상당히 감소된다.

이온 쌍 형성제들의 잠재적으로 시간-소모적인 스크리닝을 단순화하기 위하여, 다음의 추천들이 각종 분석물을 위한 초기 출발점들로서 제공된다:

·펩티드 및 소 단백질(pH = 2.0-3.5): Br^-, CF₃CO₂ ^-

·펩티드 및 소 단백질(pH = 6.5-8.0): Me₄N⁺, Me₃NH⁺, Me₃NEt⁺, Me₂EtNH⁺

·올리고뉴클레오타이드(pH = 6.5-8.0): ⁿC₄H₉-NH₃ ⁺, ⁿC₅H₁₁-NH₃ ⁺, ⁿC₆H₁₃-NH₃ ⁺

·DMT-On 올리고뉴클레오타이드들(pH = 7.0-8.0): EtNH₃ ⁺, Et₃NH⁺

용해도 - "소수성 크로마토그래피" 또는 보다 적합하게는, "소해성 크로마토그래피(solvophobic chromatography)"에서, 주요한 용매 성분이 물인 경우, 잠재적 소수성 디스플레이서 분자들은 종종 제한된 용해도를 갖는다. 소수성 분자들은, 소수성 분자, 예를 들면, 하전된 이온-그룹들, 친수성 반대-이온들, 극성 그룹들 또는 수소-결합 공여체들 또는 수용체들로서 작용하는 그룹들에 부착된 "친수성 그룹들"이 존재하지 않는 한 임의의 인지할만한 정도로 대개 물 속에서 용해되지 않는다. 방향족 분자들은, pi-전자들이 약한 수소-결합 수용체들로서 작용하는 독특한 방식으로 인하여 독특한 방식으로 물과 상호작용한다. 더욱이, 방향족 분자들은 수용액에서 면-대-면 pi-적층에 관여할 수 있다. 이들 작지만 중요한 효과들은, 사이클로헥산(~10μM) 및 트랜스-데칼린(<1 μM)과 비교하여 벤젠(9 mM) 및 나프탈렌(200μM)의 물 속에서의 높은 용해도에서 반영되며, 하이드록실화되지 않은 아렌들과 비교하여 페놀(960 mM) 및 β-나프톨(7 mM)의 높은 용해도에서 반영된다. 유용한 디스플레이서 분자의 분자 구조는 물 속에서 또는 저 유기물 함량을 갖는 물 속에서 합리적인 용해도(10-50 mM)를 가능하게 하여야 하지만 동시에 충분히 소수성이어서 정지 상에 강하게 결합해야 한다. 일반적으로, 하전된 디스플레이서 분자들은 하전된 종들(species), 특히 반대-이온들의 증가된 용매화 에너지들로 인하여 중성의 것들보다 더 우수한 용해도 특성들을 갖는다. 이는 양호한 디스플레이서들로서 거동하기 위하여 중성 양쪽성 이온 분자들에 대한 물리적 및 화학적 특성들의 독특한 균형을 필요로 한다. 중성 양쪽성 이온성의 소수성 디스플레이서는 독특한 용해도 특성들을 나타낸다. 대표적인 음이온성 또는 양이온성 화합물들과는 달리, 중성 양쪽성 이온성의 디스플레이서 화합물들은, 염 농도가 증가함에 따라 물 속에서의 용해도가 증가한다. 이러한 일반적이지 않은 "염화-인(salting-in)" 효과는, 중성 양쪽성 이온 화합물들이 HIC 크로마토그래피에서 디스플레이서들로서 사용되도록 한다. 더욱이, 수성 디스플레이서 완충제 속의 소량의 에탄올은 용해도를 유의적으로 증가시킬 수 있는 반면 유사한 양의 아세토니트릴은 효과가 거의 없다.

일반적으로 말해서, 불량한 디스플레이서 용해도를 보상하기 위하여 유기 용매의 수준들을 증가시키는 것은 좀처럼 유용한 결과들을 생성하지 않는다는 점을 주목하는 것이 중요하다. 0 내지 25% 유기 용매 또는 더 바람직하게는 2 내지 15% 유기 용매를 사용하여 최적의 크로마토그래피적 결과들을 수득한다. 이동 상의 높은 유기물 함량(25-75%)을 일부 경우들에 사용할 수 있지만 흔히 용량 및 분해능은 종종 더 나빠진다.

감소된 생성물-디스플레이서 연합 - 소수성 치환 크로마토그래피와 함께 발생할 수 있는 한 가지 문제점은 용액 중에서의 소수성 디스플레이서와 소수성 분석물의 연합이다. 이는 분해능 및 오염의 상당한 손실을 야기할 수 있다. 정지 상에서의 흡수된 상태의 디스플레이서-분석물 연합이 또한 일어날 수 있지만 존재하는 적합한 양들의 이온 쌍 형성제들을 사용하는 경우 덜 문제가 된다. 이러한 문제를 취급하는 양호한 방법은 하전된 분석물들 및 하전된 소수성 디스플레이서들을 동일한 전하로 사용하는 것이다. 이들 문제들은 때때로 중성의 소수성 디스플레이서들 및 중성의 소수성 분석물들이 상호작용하는 경우 발생할 수 있지만, 이러한 문제는, 중성의 디스플레이서가 양쪽성 이온 특성들을 갖는 경우 덜 일반적이다.

디스플레이서 자체-연합 및 미셀 형성 - 화학 구조 및 물리적 특성들이 전도성인 일부 경우들에서, 중성 양쪽성 이온성의 소수성 분자들은 자체-연합성이어서, 용액 중에서 미셀들 및 미세-형 자체-연합된 구조들을 형성할 수 있다. 이러한 상황은 디스플레이서 용액들의 원하지 않는 발포(foaming)뿐만 아니라, DC에서의 용해도의 손실도 일으킬 수 있다. 용액 중의 디스플레이서는 각종 화학 평형들에 의해 상호관련되는 각종 형태들로 자체로 발견된다. 더욱이, 미셀들은 소수성 분석물 분자들에 대한 캐리어들로서 작용하여 이들이 각종 형태들로 용액 중에 존재하도록 할 수 있다. 이러한 원하지 않는 현상은 농도 의존성이며 메탄올, 에탄올 또는 아세토니트릴과 같은 소량의 적합한 유기 용매를 첨가하여 효과적으로 억제한다. 적합하게 설계된, 중성 양쪽성 이온 디스플레이서 분자들은 미셀 형성을 증진시키지 않고 더 우수한 치환 결과들을 제공한다. 본원에 기술된 중성 양쪽성 이온 디스플레이서 분자들은 중성인 비-양쪽성 이온 디스플레이서 분자들과는 달리 용액 중에서 자체-연합된 구조들을 형성하는 경향이 거의 없다. 따라서, R-그룹들, 그룹-소수성 지수들을 R¹-R³에 대하여 12.0 이하로 유지시키면, 원하지 않는 세정성의 문제점을 감소시킨다.

고순도 - 디스플레이서 중의 불순물 - 디스플레이서는 적합한 정도의 순도에서 사용되어야 한다. 제조적 크로마토그래피의 목적은 목적하는 성분으로부터 불순물을 제거하는 것이다. 디스플레이서 자체와 관련된 불순물들에 의한 바람직한 화합물의 오염은 거의 문제가 되지 않지만, 디스플레이서 용액 중의 "조기 치환(early displacing)"에 의한 오염은 일부 경우들에서 불순물들의 양들 및 이들의 결합 특성들에 따라 문제가 될 수 있다. 따라서, 양호한 디스플레이서는 조기 치환 불순물을 거의 함유하지 않거나 전혀 함유하지 않아야 한다.

적합한 UV 흡광도 - DC 실험 전반에 걸쳐 디스플레이서의 위치와 양들을 추적하기 위하여, 디스플레이서 관통 곡선들을 관찰하기 위하여 및 컬럼 재생 과정들 동안에 디스플레이서 제거를 따르기 위하여, 적절한 자외선 흡수를 갖는 디스플레이서를 갖는 것이 유용하다. 고 흡수성은 디스플레이서 및 분석물의 고 농도들로 인하여 필요하지 않거나 바람직하지 않다. 일반적으로, 무색 디스플레이서는, 분석물들이 일부 주파수들에서 따를 수 있고 디스플레이서가 다른 주파수들에서 모니터링될 수 있도록 분석물들의 UV 흡수성의 영역에 해당하는 저 흡수성의 윈도우들을 전략적으로 배치시킨 UV 스펙트럼을 갖추고 있는 것이 바람직하다.

제조의 용이성 및 비용 - 화학 합성, 생산 및 제조의 편리하고 비용-효과적인 방법들은 유용한 디스플레이서들 및 합리적인 비용들을 생성하기 위해 중요하다. 더욱이, 정제, 특히 비-크로마토그래피적 정제의 실제적인 방법들은 비용-효과적인 방법으로 순도 요건들을 성취하기 위해 필요하다.

화학적 안정성, 저 독성, 및 긴 저장 수명 - 이의 모든 다른 목적하는 화학적 및 물리적 특성들 중에서, 유용한 디스플레이서 분자는 화학적으로 안정해야 한다. 이는 분석물 분자들에 대하여 불활성이어야 하고 물, 일반 유기 용매들, 약 염기들, 약산들 및 산소(공기)에 대하여 화학적으로 안정(비반응성)해야 한다. 이는 전형적인 사용 및 저장 조건들 하에서 광-안정성 및 열 안정성이어야 하며 이상적인 저장 수명을 지녀야 한다. 디스플레이서 분자들은 육안으로 무색이지만 필수적인 수준들의 UV 흡광도를 갖는 것이 매우 바람직하다. 염료들은 일반적으로 소수성 치환 크로마토그래피용의 유용한 디스플레이서들을 제조하지 않는다. 유용한 디스플레이서 분자들은 또한 저 독성을 가질 필요가 있고, 디스플레이서와 접촉하게 될 수 있는 생물학적 및 약물 샘플들도 보호할 필요가 있을 뿐만 아니라 작업자들도 보호할 필요가 있다.

적합한 크로마토그래피적 컬럼: 가장 일반적인 유형의 역-상 컬럼은 옥타데실 피복된 실리카이지만, 많은 소수성 정지 상들은 DC에서의 유용성을 발견한다. 적합한 정지 상의 예들은 표 III에 나열되어 있다. 궁극적으로, 정지 상의 최고의 선택은 연구중에 있는 각각의 시스템에 대해 실험적으로 측정한다.

[표 III]

소수성 정지 상에 대한 물질

● 피복된 다공성 실리카(공유결합된 실란들)

·옥타데실(C₁₈)　 ·도데실(C₁₂)

·옥틸(C₈) ·헥실(C₆)

·부틸(C₄) ·펜타플루오로페닐프로필(C₆F₅-C₃)

·페닐프로필(Ph-C₃)　 ·페닐헥실(Ph-C₆)

·p-비페닐(Ph-Ph)　 ·β-나프틸에틸(Nap-C₂)

● 피복되지 않은 다공성 폴리스티렌/디비닐벤젠

● 다공성 플루오로카본 중합체

● 다공성 폴리옥타데실메타크릴레이드 중합체

● 탄소형 상들(carbon-like phases):

·다공성 흑연화 탄소

·세정된 목탄

·다공성 지르코니아 위의 탄소

·다공성 지르코니아 위의 탄소에 결합된 C₁₈

● 무기 산화물 위의 유기 중합체 피복

● 혼합된-모드 소수성 상

·음성 표면 전하를 갖는 C₁₈

·양성 표면 전하를 갖는 C₁₈

·묻혀진 음성 전하를 갖는 C₁₈

·묻혀진 양성 전하를 갖는 C₁₈

치환 크로마토그래피에서의 더 우수한 결과들은, 더 우수한 회복률 및 수율을 제공하는 더 길고 양호하게 팩킹된 컬럼들을 사용하여 수득한다. 표 IV는 컬럼 치수 및 초기 유속들의 초기 선택들에 대한 안내를 제공한다.

[표 IV]

크로마토그래피 컬럼 치수

a) 500 mm 또는 2 x 250 mm b) 초기 유속 =75 cm/hr(12.5 mm/min); 최적화될 필요가 있음.

적절한 컬럼 길이는 양호한 결과들을 위해 중요하다. 치환 트레인을 완전히 날카롭게 하고 양호한 분해능을 제공하기 위해서는 충분히 길어야 한다. 그러나, 너무 긴 컬럼들은 분리 시간을 불필요하게 증가시키고 불량하게 팩킹된 베드(bed)들 및 감소된 분해능을 가질 수 있다. 많은 경우들에서, 2개의 잘 팩킹된 보다 짧은 컬럼들은 양호한 크로마토그래피적 결과들로 말단-대-말단 부착될 수 있다. 작은 분자들(MW <3KDa)을 사용한 상당한 실험은, 최적 컬럼 길이가 5 ㎛ 입자들에 대해 범위 15-45 cm 내에 있고 10 ㎛ 입자들에 대해 범위 20-60 cm 내에 있음을 나타낸다. 공극 크기들이 80-100 Å인 다공성 입자들은 전통적인 약물들 및 작은 펩티드들을 위해 적합하고, 중간 및 대형 올리고펩티드들 및 올리고뉴클레오타이들에 대해서는 120-150 Å의 공극 크기들이 적합하며, 대부분의 단백질들 및 DNA에 대해서는 300-500 Å의 공극 크기들이 적합하다. 비-다공성 입자들이 사용될 수 있지만, 로딩 용량은 상당히 감소할 것이다.

원통형 컬럼들에서, 평면 유동-프런트(planar flow-front)가 설정되어 이것이 유동 축에 수직이되는 것이 중요하다. 다량의 샘플을 정제하기 위해 규모를 키우는 것은, 일단 최적화된 프로토콜이 보다 작은 컬럼에서 개발되면 치환 크로마토그래피에서 간단하고 용이해진다. 가장 짧은 허용되는 컬럼 길이가 발견된 후에, 규모를 키우는 것은 일정한 선형 유속를 유지시키면서 컬럼 직경을 증가시켜서 간단히 성취한다. 적합한 수정들을 가하여, 치환 크로마토그래피는 방사상-유동 컬럼들 및 축방향-유동 모놀리쓰 컬럼들(axial-flow monolith columns)로 사용할 수 있다. 치환 크로마토그래피의 원리들은 또한 분석적 및 제조적 박층 크로마토그래피에서 적용할 수 있다.

성공적인 치환 크로마토그래피 장치의 가동

유기 화합물, 전통적인 약물, 및 펩티드의 치환 크로마토그래피는 오래 동안에 수행되어 왔지만, 보통의-내지-불량한 결과들이 종종 수득된다. 양호한 디스플레이서들, 양호한 컬럼들 및 양호한 작동 프로토콜들은, 본원에 기술된 바와 같이, 우수한 재현가능성 및 현저히 양호한 크로마토그래피적 성능을 생성한다.

디스플레이서 및 농도 - 초기 평가는 적절한 결합 강도를 갖는 양호한 일반적인 목적의 중성 양쪽성 이온 디스플레이서를 사용하여 수행한다. 중성 양쪽성 이온 디스플레이서들을 사용하여 양이온성, 중성의 비-이온성 및 중성 양쪽성 이온 및 음이온성 분석물을 정제할 수 있다. 디스플레이서는 정제되는 물질보다 더 강하게 컬럼에 결합해야 하지만, 디스플레이서는 너무 강하게 결합하지 않아야 한다. 전형적인 디스플레이서 농도들은 10-50 mM의 범위에 있다. 초기에, 디스플레이서 농도는 10-15 mM에서 설정된다. 필요에 따라, pH 완충제 및 이온 쌍 형성제가 디스플레이서 용액에 가해진다. 디스플레이서 용액 및 캐리어 용액은, 디스플레이서의 존재 및 이온 쌍 형성 염의 농도를 제외하고는, 동일한 조성들(pH 포함)을 가져야 한다. 디스플레이서들(713, 738 및 753)(하기 표 V 참조)은 양호한 일반적인 목적의 중성 양쪽성 이온 디스플레이서들의 예들이다. 방법 최적화 동안에, 디스플레이서 농도를 20-30 mM 이상으로 증가시키는 것이 도움이 될 수 있다.

이온 쌍 형성제 선택 - 이온 쌍 형성제를 사용하지 않고, 비효율적인 이온 쌍 형성제를 사용하고, 혼합된 이온 쌍 형성제를 사용하며 및 불충분한 수준들의 양호한 이온 쌍 형성제를 사용하는 것은 치환 크로마토그래피 실험들에서 불량한 크로마토그래피적 성능의 주요한 원인들 중의 일부이다. 표 I 및 II는 소수성 크로마토그래피에 유용한 유용한, 일가의, 이온 쌍 형성 음이온들 및 이온 쌍 형성 양이온들의 목록들을 포함한다. 이들은, 분석물 또는 디스플레이서가 하전되는 경우 필요하다. 하전된 분석물들 및 디스플레이서들에 있어서, 결합-등온선들은 반대-이온 및 이의 농도의 화학적 특성들에 강하게 좌우된다. 본 발명자들의 데이터는, 중성 양쪽성 이온 디스플레이서들과의 이온 쌍 형성 염들이 소수성 정지 상들에 대해 증진된 결합으로 보다 날카로운 치환 밴드들을 생성함을 또한 나타낸다. 중간 내지 중간 정도로 강한 결합 특성들을 갖는 이들 이온 쌍 형성제들은 대개 사용하기에 가장 좋다. 이온 쌍 형성제들을 사용하여 실험을 시작하는 경우, 이온 쌍 형성 음이온으로서 브로마이드 또는 트리플루오로아세테이트(유리 산 또는 NH₄ ⁺　염)를 써보고 이온 쌍 형성 양이온의 경우, K⁺, NH₄ ⁺ 또는 양자화된 모노-, 디- 또는 트리메틸아민(유리 아민 또는 포르메이트 염)을 써본다. 초기 실험들 동안에는 메틸암모늄 트리플루오로아세테이트([MeNH₃][CF₃CO₂])로 시작한다. 분석물이 이온 쌍 형성제를 필요로 하는 경우, 이는 대개 DC 실험에서 IP제의 선택을 나타낸다. 분석물 및 디스플레이서에 대한 이온 쌍 형성제(염)은 동일해야 한다.

이온 쌍 형성제의 농도 - 앞에서 언급한 바와 같이, 불충분한 수준들의 양호한 이온 쌍 형성제를 사용하는 것은 치환 크로마토그래피 실험들에서 불량한 크로마토그래피적 성능의 주요한 원인들 중의 하나이다. 샘플 용액 중의 이온 쌍 형성제의 적합한 농도(C_IPS, mM)를 계산하는 식은 다음 식으로 제공된다:

C_IPS = E_S x C_S(mM) x G_S

상기 식에서, E_S는 샘플에 대한 초과 인자이고, C_s는 샘플의 농도(mM)이며, G_s는 작동적 pH에서 샘플의 순 전하(net charge)의 절대값이다. E_S의 최적 값은 실험적으로 측정하는 데 필요한 파라미터이다. 디스플레이서 용액 중의 이온 쌍 형성제의 적합한 농도(C_IPD, mM)를 계산하기 위한 식은 다음 식으로 제공된다:

C_IPD = E_d　x C_d(mM) x G_d

상기 식에서, E_d는 디스플레이서의 초과 인자이고, C_d는 디스플레이서의 농도(mM)이며, G_d는 작동적 pH에서 디스플레이서의 순 전하의 절대값이다. E_d의 최적 값은 실험적으로 측정할 필요가 있는 파라미터이다. 적어도 화학양론적 양의 이온 쌍 형성제가 용액들 중에 존재하는 것이 필수적이다(E_S　≥ 1.0 및 E_d ≥ 1.0). 실제, 본 발명자들의 경험상, E_S는 범위 1.1-10.0, 더 바람직하게는 범위 1.2-6.0, 더 바람직하게는 1.5-4.5 내에 있어야 한다. 더욱이, 본 발명자들의 경험상, E_d는 범위 1.1-10.0, 더 바람직하게는 범위 1.2-4.0 내에 있어야 한다. 크로마토그래피적 성능에서 심각한 열화(deterioration)는, 이온 쌍 형성 농도가 최적화되지 않거나 너무 낮은 경우, 즉 E_S　< 1.0 및/또는 E_d　< 1.0인 경우에 수득된다.

이의 등전점 근처인 펩티드 또는 단백질의 경우 또는 중성 양쪽성 이온 디스플레이서의 경우, G_S 및 G_d는 거의 0이다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은, 특정의 유용한 농도들에서 이온 쌍 형성 염들(이온 쌍 형성 양이온과 이온 쌍 형성 음이온)이 펩티드들/단백질들(pH~pl)의 치환 밴드들 및 중성 양쪽성 이온 디스플레이서들의 가파름(sharpness)을 유의적으로 증진시킴으로서 보다 우수한 치환 정제들을 생성함을 밝혀내었다.

하기 예 2에서, 이온 쌍 형성 염을 사용하여 이온 쌍 형성 염이 부재한 경우보다 더 우수한 결과들이 수득된다. pH 6.0에서 펩티드는 2개의 1+ 전하들 및 2개의 1- 전하들을 가져서 전체 전하는 거의 0이다. pH 6.0에서 디스플레이서는 하나의 1+ 전하 및 하나의 1- 전하를 가져서 전체 전하는 거의 0이다. 양호한 크로마토그래피 결과들은, G_S가 2이고 G_d가 1인 것으로 추정하여 수득된다.

RP 컬럼 선택 - 초기의 역-상 작업을 위해, 실리카 위의 수개의 양호한 품질의 옥타데실 또는 실리카 컬럼들 위의 페닐헥실을 평가해야 한다(치수들이 4.6 x 250 mm인 5㎛ 구형 입자들). 더 큰 제조적 컬럼들로 규모를 키우는 것은 이후에 수행할 수 있으며 비교적 간단하다. 중요한 주제는 적합한 기공 크기를 선택하는 것이다. 너무 크거나 너무 작은 기공들을 갖는 매트릭스들은 종종 감소된 용량을 유발하며 때때로 감소된 분해능을 유발한다. 상기한 표들 III 및 IV를 참조한다.

유속 - 치환 크로마토그래피는 "쿼시-평형 기술(quasi-equilibrium technique)"이기 때문에, 비교적 느린 유속들이 종종 필요하다. 최적 유속는 분해능을 잃지 않는 가능한 가장 빠른 유속이다. 샘플 로딩 유속 및 치환 유속는, 둘 다 35-105 cm/hr의 범위로 대략 동일해야 한다. 통상적인 약물들, 올리고펩티드들 및 올리고뉴클레오타이드들에 있어서 75 cm/hr에서 시작하고 단백질들 및 DNA에 있어서는 40 cm/hr에서 시작한다. 재생 유속들은 치환 유속의 2 내지 8배이어야 한다. 약물들, 펩티드들 또는 올리고뉴클레오타이드들을 역-상 컬럼들 상에서 승온들에서 정제하는 경우, 더 빠른 유속들이 사용될 수 있다.

온도 - 역-상 크로마토그래피 및 기타 형태들의 소수성 크로마토그래피는 +△H를 갖는 +T△S에 의해 주로 구동되기 때문에, 고온은 종종 더 강한 결합, 더 빠른 결합 역학 및 분명히 상이한 분해능을 생성한다. 결과적으로, 컬럼의 온도 및, 어느 정도는, 치환 완충제들은 주의깊게 조절(+/- 0.5 ℃)하여 밴드 확장을 방지하여야 한다. 초기 작업은 종종 25℃에서 수행한 다음, 승온들(45, 65℃)은, 샘플이 이를 견딜 경우 시도하며, 유기 용매의 비점은 적합하다.

유기 용매 선택 - 대부분의 수-혼화성 유기 용매들이 작용할 것이지만, 아세토니트릴, 메탄올 및 에탄올이 가장 일반적으로 사용된다. 일부 DC 정제들은 약간의 유기 용매를 사용하거나 유기 용매를 전혀 사용하지 않고 수행한다. 이는 변성되지 않은 단백질들의 실질적인 RPC 및 HIC 정제를 저 염 및 저 유기 용매로 허용한다. 유기 용매를 사용하지 않은 작동은 또한, 휘발성, 난연성 용매들과 연관된 안정성 문제들이 존재하는 경우 도움이 될 수도 있다. 실험하는 경우, 먼저 펩티드들에 대한 아세토니트릴, 대형 단백질들 올리고뉴클레오타이드들 및 DNA에 대한 저분자량 유기 약물들 및 작은 단백질들 또는 메탄올을 시도한다. 물 속의 이러한 샘플의 용해도가 허용가능한 경우, 캐리어 완충제, 디스플레이서 완충제 및 샘플 로딩 용액 중의 3% v/v MeCN, 4% v/v EtOH 또는 5% v/v MeOH로 시작하고; 이들 3개 용액들의 유기물 함량은 동일해야 한다. 유기 용매 함량은 각각의 샘플, 컬럼 및 디스플레이서에 대해 최적화될 필요가 있는 중요한 파라메터이다. 일반적인 작동 목적으로, 유기 용매는 약 15 부피% 미만, 더 바람직하게는 약 10 부피% 미만, 여전히 더 바람직하게는 약 5 부피% 미만이어야 한다. 옥타데실 컬럼들이 사용되는 경우, 2 내지 3 부피%의 아세토니트릴, 3 내지 4 부피%의 에탄올 또는 4 내지 5 부피%의 메탄올이 대개 매트릭스의 최적 작용화를 위해 필요하다. 페닐헥실 및 옥틸 컬럼들이 대개 유기 용매의 부재를 견딜 수 있다.

pH 및 pH 완충제 선택 - 샘플, 디스플레이서, 이온 쌍 형성제 중에 또는 정지 상 위에 이온화 가능한 양자들이 존재하는 경우 pH 완충제들이 필요하다. 일부 샘플들은 특정 pH 범위 내에서 단지 안정하다. 일부 샘플들의 경우, 크로마토그패피적 분해능은 매우 pH-의존성이다. 일반적으로, 양이온성 샘플들은 중성 양쪽성 이온 디스플레이서들 및 양이온성 완충제들을 사용하여 정제한다. 양이온성 완충제들과 관련된 음이온들은 이온 쌍 형성 음이온과 동일해야 한다. 일부 경우들에서, 상이한 음이온이 상당히 더 약한 이온 쌍 형성 특성들을 갖는 한 사용될 수 있다. 마찬가지로, 주요한 이온 쌍 형성 음이온보다 훨씬 더 약한 이온 쌍 형성 특성들을 갖는 경우 음이온성 pH-완충제가 사용될 수 있으며; 따라서 트리플루오로아세테이트가 이온 쌍 형성 음이온인 경우 포름산 또는 아세트산이 pH 완충제들로서 사용될 수 있다. 명백한 이유들로, 낮은 pK_a　값들을 갖는 중성 및 양이온성 아민들이 유용한 pH 완충제들이다: N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(5.9, TMEDA), N,N-디메틸피페라진(4.2, DMP), 디아조비사이클로옥탄(3.0, DABCO).

유사하게, 음이온성 샘플들은 중성 양쪽성 이온 디스플레이서들 및 음이온성 pH 완충제들을 사용하여 정제한다. 음이온성 pH 완충제들과 관련된 양이온들은, 이온 쌍 형성 양이온과 동일하여야 하지만, 일부 경우들에서, 유의적으로 보다 약한 이온 쌍 형성 특성들을 갖는 양이온이어야 한다. 또한, 때때로 양이온성 pH-완충제들이 사용될 수 있지만 단지 이들이 기본적인 이온 쌍 형성 양이온보다 더 약한 이온 쌍 형성 특성들을 지닌 경우에만 사용될 수 있으며; 따라서, N-메틸모르폴린(7.4, NMM), 트리에탄올아민(7.8, TEOA) 및 TRIS(8.1)는, 트리메틸암모늄 또는 트리에틸암모늄이 이온 쌍 형성 양이온인 경우에 pH 완충제들로서 때때로 사용될 수 있다. 중간-범위의 pK_a　값들을 갖는 음이온성 화합물들이 pH-완충제들로서 유용할 수 있다: TABS(8.4), TAPSO(7.6), 메틸포스폰산(7.6, MPA), MOPS(7.2), MOPSO(6.9), 인산(6.8), 모노메틸포스피르산(6.3), 인산(6.3), MES(6.2), 3,3-디메틸글루타르산(5.9, DMG), 석신산(5.2, SUC), 아세트산(4.6, HOAc).

동시-치환 - 수백개의 성분들 및 불순물을 포함하는 샘플들을 사용하여 작업하는 경우, 동시-치환은, 결합 등온선들의 어느 곳에서 DC 실험들이 발생하는 지에 무관하게 목적하는 주 성분을 사용하여 동시-치환하는 수개의 주요 성분들이 존재하기 쉽기 때문에, 거의 피할 수 없는 현상이다. 운좋게도, 치환 크로마토그래피에서의 동시-치환은 제조적 용리 크로마토그래피에서의 동시-용리보다 훨씬 덜 심각한 문제이다. 동시-치환은 다음과 같은 2가지 조건들에서 발생한다: (1) 결합-등온선들이 너무 유사해서 불량한 분해능이 존재하는 경우 및 (2) 결합-등온선의 작동 영역 근처에서 결합-등온선들의 교차가 존재하는 경우. 운좋게도, 이러한 주제를 다루는 간단한 방법들이 존재한다:

a. 디스플레이서의 농도를 변화시킴,

b. 상이한 결합 특성들을 갖는 상이한 디스플레이서로 변화시킴에 의해, 결합-등온선들 위의 상이한 점을 작동시킴으로써 상이한 조건들 하에 제 2의 DC 실험을 수행함.

대안적으로, 등온선들 자체는,

c. 크로마토그래피 매트릭스를 변화시킴(정지 상),

d. 유기 용매의 농도를 변화시킴,

e. 상이한 유기 용매를 변화시킴,

f. 상이한 이온 쌍 형성제로 변화시킴,

g. 온도를 변화시킴에 의해 변화시킬 수 있다.

제 2의 "직교형" IP-RP DC 단계는 전형적으로 우수한 순도(~99.5%)를 우수한 수율(90-95%)로 제공한다.

샘플 로딩 방법 - 샘플은 2가지 방법들 중의 하나를 사용하여 샘플 주입 밸브를 통해 컬럼 위로 로딩시킨다. 이 샘플은, DC 실험이 수행되는 결합-등온선의 동일한 지점에서 프론탈(frontal) 크로마토그래피 조건들 하에 로딩하여야 한다. 캐리어는, 샘플이 로딩된 후에 컬럼을 통과하지 않는다. 방법 1: 샘플 로딩 펌프를 사용한다; 방법 2: 주입 루프를 사용한다. 대개, 부분 루프 주입만을 사용한다. 루프 내의 샘플은 먼저 캐리어 및 이후에 디스플레이서 용액을 사용하여 루프로부터 컬럼 위로 사라지게 하여야 한다. 루프 부피의 85-95%를 컬럼 위로 로딩하여 캐리어에 의해 희석된 샘플이 로딩되지 않도록 해야 한다.

컬럼 로딩 - DC 실험들은 비교적 고 로딩률, 전형적으로 최대 로딩 용량의 60-80%의 범위로 수행한다. 작동적 컬럼 로딩 용량은 고정된 수가 아니며, 이보다는 결합 등온선의 어느 곳에서 DC 실험이 작동하는 지에 좌우된다.

컬럼 용량의 전부가 사용을 위해 이용 가능한 것은 아니다(하기한 "예외" 참조). 실제, 컬럼 부피의 단지 90-98%만이 사용가능하다. 일단 샘플이 컬럼 위로 로딩되면, 디스플레이서 완충제는 이후에 컬럼 상으로 펌핑된다. 컬럼 하부로 상이한 속도들에서 각각 운행하도록 진행되는 3개의 프런트(front)들이 존재한다: (1) 액체 프런트 (T₁, 디스플레이서 완충제 - 디스플레이서), (2) 샘플 프런트 (T₂) 및 (3) 디스플레이서 포화 프런트 자체(T₃). 첫번째 프런트는 제 2 및 제 3 프런트들보다 더 빠르게 운행하며 이용 가능한 컬럼 용량을 제한하는 데, 그 이유는 첫번째 프런트가, 치환 트레인(T₂)이 빠져나가기 시작하기 전에 컬럼을 빠져나가야 하기 때문이다. 프런트들의 실제 속도들은 치환 유동속도에 직접적으로 좌우된다. 프런트 속도들의 비, α, Vel₁-/Vel₂는 다음 식으로 주어진다:

α = K_m　/ (R x C_d)

상기 식에서, K_m은 C_d의 디스플레이서 농도에서 매트릭스의 디스플레이서 결합 용량(디스플레이서 mg / 팩킹된 매트릭스 ㎖)이고, 여기서 C_d는 디스플레이서 완충제 중의 디스플레이서 농도(디스플레이서 mg / 디스플레이서 완충제 ㎖)이고, R은 컬럼의 총 부피에 대한 컬럼 중의 액체의 부피의 비(액체 ㎖ / 베드 부피 ㎖). 최대 %의 이용 가능한 컬럼 부피는 다음 식으로 주어진다:

(100 x (α-1 )) / α

아래 예 2에서, 각각의 α-값은 21.98이며, 각각의 최대 유용한 용량은 95.4%이다. C_d가 증가함에 따라, K_m은 또한 감소할 것이지만, 등온선의 비선형 부분에서 높게 작동하는 것만큼 높지는 않다. 따라서, α는 증가할 것이고 최대 %의 이용 가능한 컬럼 용량은 감소할 것이다.

상기 기재에 예외가 존재한다. 상당한 수준들의 원하지 않는 조기-치환 불순물들이 샘플 내에 존재하는 경우, 당업자는, 컬럼을 오버로딩하고 디스플레이서 유동이 시작되기 전에 샘플 로딩 동안에 이들 불순물을 쏟아버림으로써 100% 이상까지도, 컬럼의 이용 가능한 용량을 증가시킬 수 있다. 따라서, 컬럼 로딩은 전체 샘플을 기준으로 하여 최대의 105%일 수 있지만, 컬럼 로딩은 주 생성물 + 나중-치환 불순물들의 양을 기준으로 하여 단지 80%가 될 수 있다.

샘플 용액의 농도 및 부피 - 로딩 샘플의 농도는 중요한 작동 파라메터이다. 최적의 샘플 로딩 농도(mg/㎖)는 치환 실험으로부터의 정제된 생성물의 배출 농도(output concentration) - 치환 트레인의 평탄부 영역(plateau region)과 동일하다. 결합 등온선들, 컬럼 결합 용량들 및 배출 농도들은 초기에는 알려져 있지 않다. 다음에 나타낸 바와 같은 초기 추정치들을 사용하여 컬럼 상으로 로딩된 샘플 용액을 사용한 제 1 치환 실험을 간단하게 수행한다:

(1) 당업자가 작업하기 원하는 초기 컬럼 로딩 비율, 즉 75%를 취한다.

샘플 로딩 시간 = 디스플레이서 관통 시간(T₃-T₁) x 0.75

= (434 분-220 분) x 0.75 = 161 분 (하기 예 2에서)

(2) 2가지 방법들 중의 하나로 샘플에 대한 초기 농도를 취함:

(a) 초기 샘플 농도(mg/㎖) = 0.25 x 디스플레이서 농도(mM) x 제형 중량(mg/㎛ole)= 0.25 x 10 mM x 1.7466 mg/㎛ole = 4.37 mg/㎖(하기 예 2에서)

(b) 샘플에 대한 추정된 컬럼 결합 용량, 즉 50 mg 샘플/㎖ 매트릭스를 취한다. 치환 유동-속도 및 샘플 로딩 유동-속도가 동일하다고 추정한다:

초기 샘플 농도(mg/㎖) = (컬럼 결합 용량(mg/㎖_m) x 컬럼 부피(㎖_m) / ((T₂-T₁) x 샘플 유속(㎖/분))

= (50 mg/㎖_m　x 4.155 ㎖_m) / ((434 분-220 분) x 0.208 ㎖/분) = 4.67 mg/㎖ (하기 예 2에서).

로딩된 샘플을 사용한 제 1 DC 실험이 오버로딩된 조건들(>100% 로딩)을 생성하는 경우, 실험을 샘플 농도의 절반에서 재수행한다. 하나의 샘플을 사용하는 동안의 첫번째의 성공적인 DC 실험의 결과들로부터, 실제 로딩 농도 및 실제 컬럼 로딩 용량을 용이하게 계산하고, 이들 값들을 이후에 사용하여 샘플 농도를 조정하고 제 2 DC 실험을 위해 로딩한다.

샘플 제조 - 로딩 샘플 용액을 상기한 바와 같은 농도 및 양에서 제조한다. 충분히 과량의 용액이 루프를 과대충전하거나 샘플 로딩 펌프 및 운반 라인들의 죽은 부피(dead volume)를 충전하기 위해 필요하다. pH, pH 완충제의 양 및 유기 용매의 양은 캐리어 및 디스플레이서 완충제와 동일하다. 샘플을 캐리어 속에 용해시키면 이의 pH를 변화시켜서, 샘플 용액의 pH가 용해 후에 재조절되어야 할 것이다. 그러나, 이온 쌍 형성제의 양은 상이할 수 있다. 샘플 용액 속에 사용된 이온 쌍 형성제는 디스플레이서 완충제 속에 사용된 것과 반드시 동일해야 한다. 이러한 관점에서, 이온 쌍 형성제가 샘플 용액 및 디스플레이서 용액 중에 사용되는, 샘플의 이온 쌍 형성 요건들이 언급된다. 주 분석물의 작동 pH 및 농도에서 형식적인 화학 전하를 기준으로 하여, 이러한 농도의 농도는 이온 쌍 형성제이거나 이온 쌍 형성 염이 계산된다. 상기한 "이온 쌍 형성제의 농도"를 참조한다.

샘플의 조성 및 이력은 공지되어야 한다. 샘플이 음이온 또는 양이온을 포함하는 경우, 이의 화학적 특성 및 양(농도)도 공지되어야 한다. (a) 분명하게, 음이온 또는 양이온이 존재하지 않는 경우, 임의의 조절도 샘플 제조 시에 이루어지지 않는다. (b) 샘플 중의 음이온/양이온이 DC에서 사용된 이온 쌍 형성제와 동일한 경우, 샘플 용액에 첨가된 이온 쌍 형성제의 양은 이에 따라 감소된다. (c) 샘플 중의 음이온/양이온이 DC에서 사용된 이온 쌍 형성제보다 상당히 더 약한 이온 쌍 형성 특성들을 갖는 경우, 이의 존재는 무시된다. (d) 샘플 내의 음이온/양이온이 DC에서 사용된 이온 쌍 형성제보다 더 강한 이온 쌍 형성 특성들을 갖는 경우, 음이온/양이온은 가공하기 전에 교환하거나 제거해야 한다.

분획의 수거 - 치환 크로마토그래피는, 특히 양호한 C₁₈-역-상 컬럼을 사용하는 최적화된 프로토콜들을 사용하여, 우수한 크로마토그래피적 분해능을 제공하다. 그러나, 분해능은, 모든 밴드들이 치환 트레인에서 백-투-백 밴드들(back-to-back bands)과 함께 컬럼을 빠져나오기 때문에 관찰하기 힘들다. 많은 작은 불순물 삼각형-밴드들은 30 초 너비(<100 ㎕) 미만이다. 따라서, 250 분 및 80% 샘플 로딩의 디스플레이서 관통 시간을 사용한 실험에서, 치환 트레인은 약 200 분 너비일 수 있으며, 400개 이상의 분획들이 취해져서 크로마토그래피적 분해능이 분획-회수 공정 동안에 손실되지 않도록 할 수 있다. 400개 분획을 분석하는 것은 진실로 이해시키고 관심을 갖도록 하는 것이지만 또한 두렵게 하는 일이다. 이는, 온라인 실시간 분획 분석이 유용할 수 있는 경우이다. 실제, 본 발명자들은 분해된 것을 어느 정도 버리고 100 내지 130개의 큰 분획들만 수집한다. 이러한 수의 분획들의 분석은 많은 작업을 나타낸다.

제조적 DC 실험들이 수행되고 단지 정제된 주성분만이 관심이 있는 상황에서, 분획 회수 공정은 매우 간단해진다. 각종 주파수들(UV)에서 관찰된 치환 트레인의 형태를 기준으로 하여, 목적하는 주 밴드의 시작 및 끝을 판단한 다음 약 10개의 분획을 두 가지 영역들에서 분석하여, 임의의 분획을 모을 것인지를 결정한다. 100 내지 130개의 분획들 대신에 20개의 분획을 분석하는 것은 용이한 작업이다.

아래 예 2에서, 분석은 훨씬 더 용이하다. 위에서의 방법을 기준으로 하여, 목적한 주요 밴드의 개시 및 종결을 판단하고, 보존적인 풀링(pooling)을 임의의 분석 없이 이루고 단지 하나의 분석을 최종 풀(pool)에서 수행한다.

디스플레이서 제거 및 컬럼 재생 - 디스플레이서는 임의의 pH 완충제 또는 이온 쌍 형성제도 없이 5-10 컬럼 부피들의 95/5(v/v) 에탄올-물 또는 80/10/10(v/v/v) 아세토니트릴-ⁿ프로판올-물을 사용하여 제거한다. 이러한 목적은 가장 짧은 시간에서 컬럼으로부터 >99.9% 이상의 디스플레이서를 효과적으로 제거하기 위한 것이다. 유속를 증가(100-400 cm/hr)시켜서, 매트릭스가 증가된 배-압(back-pressure)을 견딜 경우 컬럼 재생 공정으로 가속시킨다. 디스플레이서의 최대 흡수율(디스플레이서 지시사항들 참조) 근처의 디스플레이서 제거율을 관찰하여 재생 공정이 UV 검출에 의해 조심스럽게 모니터링되고 최적화되도록 한다.

첨가된 염의 효과 - 수성 용매들 중의 염들은 용해된 소수성 분석물들 및 소수성 디스플레이서들에 대하여 덜 수용가능한 용매들을 생성시켜서 소수성 크로마토그래피적 매트릭스들에 대하여 더 강한 결합을 일으킨다. 이는 소수성-상호작용 크로마토그래피(HIC) 뒤에 있는 원리이다. 분석물의 용해도가 염 용액 중에서 충분한 한, 염의 첨가는 분석물 결합 및, 소수성 매트릭스에 대한 분석물 결합 및 선택성을 조절하기 위한 양호한 방법이다. 앞서 나타낸 바와 같이, 중성 양쪽성 이온성의 소수성 디스플레이서는 이와 관련하여 유일하다. 대표적인 음이온성 또는 양이온성 화합물들과는 달리, 중성인, 양쪽성 이온성의 디스플레이서 화합물들은, 염 농도가 증가함에 따라 용해도가 증가한다. 이러한 일반적이지 않은 "염화-인(salting-in)" 효과는, 중성 양쪽성 이온 화합물들이 HIC 크로마토그래피에서 디스플레이서들로서 사용되도록 한다.

일부 경우들에서, 소수성 매트릭스에 결합하는 분석물은 너무 약해서 충분한 분석물 결합을 수득하기 위해서는 염이 가해질 필요가 있다. 일반적으로 사용된 염 용액들은 약 0.5 내지 약 2.5M의 농도로서(NH₄)₂SO₄, K₂SO₄, Na₂SO₄, NaCl 및 KCl 중의 하나이다. 많은 상이한 염들을 각종 농도들에서 사용하는 경우, 치환 모드의 HIC는 단백질들의 유용한 크로마토그래피적 분리들을 위한 많은 선택사항들을 제공한다.

기구 프로토콜 - 예 1에 대한 예 프로토콜을 참조한다(이중 펌프 작동). 선행 실험들로부터의 잔류하는 디스플레이서는 잠재적인 문제점이기 때문에, 프로토콜은 라인 퍼징 작동들(line purging operations), 신속한 컬럼 재생 및 평형 작동들을 가져서, HPLC 시스템 및 컬럼이 샘플 로딩 직전에 완전히 세정되고 적절하게 평형되도록 한다. 이러한 단계들은 단순히 예방적이며 항상 필요하지는 않다. 프로토콜은 (a) 예비-평형화 순서, (b) 평형화 순서, (c) 샘플 로딩 순서, (d) 치환 순서 및 (e) 재생 순서를 단일 프로토콜로 포함한다. 시스템 중의 죽은 부피과 관련된 문제점들을 극복하기 위하여, 모든 로딩 완충제들, 디스플레이서 완충제들 및 샘플 용액들을 시스템을 통해 퍼징하여 컬럼 상으로 펌핑하기 직전에 폐기한다. 이러한 방식으로, 컬럼은 밸브 스위칭(valve switching) 시 즉시 희석되지 않은 용액들의 날카로운 프런트를 보이게 된다. 샘플 용액들은 탈기시켜서 기체 버블들이 이들 속에 형성되지 않도록 해야한다. 주입 루프들이 사용되는 경우, 이들은 약 10%로 과충전될 필요가 있다. 이러한 과충전은 추가의 용도로 수집할 수 있다. 완전 루프 주입물을 사용하지 않아야 하며, 부분 루프 주입물들만을 사용하여야 한다. 경험은, 루프 부피의 단지 85-95% 만이 루프 도관의 내부 직경에 따라 사용될 수 있음을 나타내는 데, 그 이유는 샘플 용액이 드라이버 용액과 혼합되고 이를 희석시키기 때문이다. 루프 내의 샘플은 로딩 완충제를 사용하여 컬럼 상으로 구동시키지만, 샘플 로딩 공정의 끝을 향해서는 구동시키지 않고, 구동 용액은 디스플레이서 완충제로 변한다. 이는, 디스플레이서 완충제가 컬럼 상으로 직접 펌핑되는 디스플레이서 완충제 자체 직전에 시스템을 통해 퍼징되도록 한다. 재생 공정의 초기 부분 동안에, 더 느린 유속들이 사용된다. 따라서, 높은 배압과 관련된 문제점들은 거의 발생하지 않는다. 일단 대부분의 디스플레이서가 제거되면, 더 빠른 유속들을 사용할 수 있다.

방법 최적화 - 모든 형태들의 제조적 크로마토그래피를 사용하는 경우, 크로마토그래피적 방법들 및 과정들의 최적화가 중요하지만 약간의 실험이 필요하다. 치환 크로마토그래피의 이점들은 종종 가격-시간에 따라 발생한다. 시간-소모적인 인자들은 방법 최적화 동안에 최소화될 수 있다.

·분리 시간에 무관하게 치환 정제를 위한 근사적인 최적 조건들을 측정한다.

·분해능이 감소할 때까지 샘플 로딩 용액의 농도와 디스플레이서 농도를 증가시킨다.

·분해능이 감소할 때까지 치환 유속 및 샘플 로딩 유속를 증가시킨다.

·예비-평형 순서 및 디스플레이서 제거/컬럼 재생 순서들을 단축시킨다.

기존의 프로토콜들은 방법 최적화를 위한 유용한 출발점을 제공하지만, 이들은 연구하에 있는 특정한 샘플을 위한 수정을 필요로 할 것이다. 시간에 무관하게 순도에 대해 최적화시킨 샘플 프로토콜(예 1)은 하기에 나타낸다. 목적하는 샘플의 특정한 물리적 특성들 및 크로마토그래피적 특성들에 대해 맞춰진 방법 최적화를 수행하는 것이 중요하다. 최적화 시, 더 긴 공정시간들(600-800 min)은 종종 200 내지 300 분 및 일부 경우들에서 100 내지 150 분으로 감소될 수 있다.

치환 모드에 사용된 소수성 크로마토그래피는 (a) 높은 매트릭스 생산성 (매트릭스의 수명에 걸친 매트릭스 리터 당 생성물 그람), (b) 높은 부피 생산성(컬럼 부피의 리터 당 생성물 그람), (c) 높은 용매 생산성(사용된 용매의 리터당 생성물 그람)을 갖지만 (d) 보통의 시간 생산성(시간 단위당 생성물 그람)을 가질 수 있다. 적절한 방법 최적화는 시간 인자를 이동시킨다.

적절하게 구성된 기구화 ( Properly Configured Instrumentation ): 작은 제조적 HPLC 시스템을 위한 전형적인 기구 구성은 하기에 나타낸다.

·주 펌프: 스테인레스 강, 티타늄, 세라믹, PEEK; 0.01 - 10㎖/min 유속; 3000-4500 psi 압력으로 정밀하게 함.

·임의의 컬럼 바이패스 밸브: 2개 위치, 6구 스위칭 밸브(스테인레스 강, PEEK); 컬럼 인라인 또는 바이패스 컬럼. 이는 편리한 선택사항이다.

·필요한 샘플 주입 밸브: 주입 루프 또는 샘플 주입 펌프를 위한 2개 위치, 6구 주입 밸브(스테인레스 강, PEEK).

·주입 루프: 20-40 ㎖의 주입 루프(스테인레스 강, PEEK). 루프는 오버로딩(~10%)되어야 한다. 부분 루프 주입만이 사용되며, 전형적으로 85-95% 이하의 루프 부피가 사용된다. 주입 루프나 샘플 펌프 중의 하나를 사용한다.

·샘플 펌프: 이는 샘플 주입을 위한 주 펌프와 유사하다. 샘플은 펌프 헤드의 유동 경로와 호환성이 있어야 한다. 주입 루프 또는 샘플 펌프 중의 하나를 사용한다. 2-펌프 작동을 사용하여, 2개 펌프들의 유속들을 보정하여 이들의 유동들을 조화시킬 수 있어야 한다.

·구배 혼합기 없음: 치환 크로마토그래피에서 구배 혼합기를 바이패싱하거나 제거한다.

·UV 검출기: 짧은 경로, 저 부피 석영 유동-셀(0.2-2.0 mm 유동 경로, <10 ㎕ 유동 부피)을 갖는, 200-400 nm 주파수 범위의 다중 파장 또는 광-다이오드-배열 검출기.

·임의의 전도성 검출기: 유동 셀을 갖는 전도성 검출기, 0.1 - 200 mS, UV 검출기 후의 <100 ㎕ 유동-부피; <500 ㎕/min의 치환 유속에서 분석하기 위한 분획을 수집하는 경우의 바이패스 전도성 유동-셀.

·분획 수집기: 시간 또는 방울들의 수에 따른 분획 당 10 ㎕ 내지 10 ㎖.

·컬럼 냉각기/가열기: 0-100 ℃ +/-0.5 ℃. 컬럼이 주변 온도와 실질적으로 상이한 온도에서 작동하는 경우, 완충제 용액들을 가열하거나 냉각하기 위한 배열들이 필요하다.

예 1: 미정제 합성 α-엔도르핀의 정제를 위한 치환 프로토콜

기구 구성: 4개의 완충제 라인들을 갖는 주 펌프(1), 1개의 용매 라인들을 갖는 샘플 로딩 펌프(2), 펌프 선택기 밸브, 컬럼 바이패스 밸브

펌프 선택기 밸브: 단일-채널 토글 로직에 의해 조절된 6구 밸브(S3=0, 컬럼에 대한 펌프 1-폐기하기 위한 펌프2, S3=1 폐기하기 위한 1개의 펌프l-컬럼에 대한 펌프2)

컬럼 밸브: 단일-채널 토글 로직에 의해 조절된 6구 밸브(S6=0, 컬럼을 통과하는 액체 유동, S6=1, 액체 유동 바이패스들 컬럼)

컬럼(유동-셀: 0.5 mm 경로길이, 9 ㎕ 부피) 및 이후의 전도성 검출기(유동-셀: 170 ㎕ 부피) 후의 UV 광다이오드 배열 검출기.

분획을 분석을 위해 수집하는 경우 전도성 유동 셀을 제거한다.

로딩 완충제 = 펌프l 상의 A-라인(S1=1, 유동 개시(flow on), S1=0 유동 차단(flow off)); 디스플레이서 완충제 = 펌프1 상의 B-라인(S2=1, 유동 개시, S2=0 유동 차단); 디스플레이서 제거 완충제 = 펌프l 상의 C-라인(S4=1, 유동 개시, S4=0 유동 차단); 컬럼 저장 완충제 = 펌프1 상의 D-라인(S5=1, 유동 개시, S5=0 유동 차단); 샘플 용액 = 펌프2 상의 A-라인(S7=1, 샘플 유동 개시, S7=0 샘플 유동 차단). 샘플 용액을 여과(0.2μ)하고 탈기한다.

순서가 시작되기 전에, 세정된 컬럼을 A-완충제로 간단히 퍼징하여 컬럼 저장 완충제를 제거한다. 다른 세부사항들의 설명에 대해서는 예 2를 참조한다.

디스플레이서 제거 완충제(C-완충제)=10%(v/v)의 1-프로판올, 아세토니트릴 중의 10%(v/v)의 DI 수.

컬럼 저장 완충제(D-완충제) = 포름산(15 mM) 및 암모늄 포르메이트(15 mM)를 갖는 70/30(v/v)의 메탄올/물.

예 2: 디스플레이서 740을 사용하는 미정제 합성 α-엔도르핀의 치환 크로마토그래피 정제 - pH 6.0, pH ~ pl 에서 중성 양쪽성 이온 디스플레이서(참조: 도 1a)

작동 조건:

출발 펩티드: 탈염된 미정제 합성 α-엔도르핀(샘플 B), 59.3% 순도, FW ~ 1.7466 mg/㎛ole, 전하 = pH 6.0에서 ~0(+2/-2).

컬럼: Waters Xbridge BEH130, 5 mm, 135 Å, 4.6 x 250 mm SS, 실리카 상의 -C₁₈

유속: 로딩 = 208 ㎕/min; 치환 = 208 ㎕/min.

이온 쌍 형성 염: 메틸암모늄 트리플루오로아세테이트

온도: 23℃ pH: 6.0

디스플레이서 완충제: 탈이온수 w/ 5%(v/v) EtOH에서, 10.0 mM 디스플레이서 740 + 20 mM MES(산) + 20mM 트리플루오로아세트산, pH=6.0 w/ 40% MeNH₂.

로딩 완충제: 탈이온수 w/ 5%(v/v) EtOH에서, 20 mM MES(산) + 20mM 트리플루오로아세트산, pH=6.0 w/ 40% MeNH₂.

샘플 용액: 5%(v/v) EtOH를 함유하는 탈이온수 중의 6.88 mg/㎖ 펩티드, 20 mM MES(산) + 20mM 트리플루오로아세트산, pH=6.0 w/ 40% MeNH₂.

로딩 양: 로딩 펌프(펌프 2)로부터 226.1 mg; 로딩 시간 = 158.0 min(2.63hr).

분획 크기: 416㎕; 5㎕의 포름산을 각각의 분획에 가하였다 - pH는 3.5로 감소했다; 분획은 분석 또는 풀링까지 즉시 동결되었다(-20℃).

결과:

분획 분석: 분획 분석은 수행하지 않는다. 정제된 분획을 치환 흔적(trace)의 형상을 기준으로 보존적으로 풀링한다.

풀링된 생성물의 분석들은 분석적 용리 HPLC - IPRP 크로마토그래피를 사용하여 수행한다. 분획을 215nm에서 모니터링한다: 계산들은 면적 %를 기준으로 한다.

총 실행 시간: 6.2 hr

배출 농도: 7.02 mg/㎖

컬럼 로딩: 전체 샘플을 기준으로 한 최대 용량의 73.4%

컬럼 용량: 전체 샘플을 기준으로 ~74.1 mg 펩티드/㎖의 매트릭스 @ 7.02 mg 펩티드/㎖ 용액

~107 ㎛ole 디스플레이서/㎖ 매트릭스 @ 15.0 ㎛ole 디스플레이서/㎖ 용액

순도%: 99.0%

수율%: 74%; 데이터는 분획 분석 없이 보존적 분획 - 풀을 기준으로 하였다; 실제 수율은 보다 높을 수 있다 (80-85%)

코멘트: 샘플 농도/배출 농도 = 0.98

샘플 중 IP 염 = 화학량론적 양의 2.5배(G_S =2로 추정)

우수한 결과들이 충분한 로딩 용량(74.1g/L), 탁월한 순도 및 충분한 수율(99.0% 순도 @ >74% 수율)로 작은 "분석-유형" 컬럼을 미정제 펩티드로부터 1 단계로 사용하여 수득된다. 당해 예는 중성 양쪽성 이온 디스플레이서를 사용하여 pH~pI(pH=6.0)인 미정제 합성 펩티드의 정제를 나타내기 위해 설계된다. 양호한 결과들이 이의 부재시 수득되나(데이터는 나타내지 않음), 이온 쌍 형성염([MeNH₃][CF₃CO₂])의 사용으로 날카로은 치환 추적이 생성된다. 20mM 농도의 이온 쌍 형성 염은, G_S=2, E_S=2.5, G_d=1, E_d=2.0이라는 추정들을 기준으로 한다; 상기 내용 참조. 5 부피% EtOH를 포함하는 용매는 5 부피%의 MeCN을 사용하는 경우보다 약간 더 우수한 결과들을 제공한다(데이터는 나타내지 않음). 디스플레이서 치환 밴드 및 펩티드 치환 밴드들은 약간 날카롭다. pH=2.0에서 양이온성 디스플레이서를 사용한 치환 결과와 비교하여(데이터는 나타내지 않음), pH=6.0에서 양쪽성 이온 디스플레이서를 사용한 이러한 결과들은 어느 정도 더 낮은 로딩 용량(74g/L 대 84g/L)에서 약간 더 높은 순도(99.0% 대 98.8%)를 제공하며; 수율들은 비교될 수 없다.

예 3: HPLC 분석 -

방법 3a, 3b - 중성 양쪽성 이온 에 대한 역-상: 분석들은 Dionex/ESA Biosciences(제조원: 매사츄세츠주 첼름스포드(Chelmsford)) Corona Plus CAD 검출기와 Waters Xbridge BEH130, 5 ㎛, 135 Å, 4.6 x 250 mm SS, 실리카 상의 -C₁₈, 역-상 크로마토그래피 컬럼(제조원: 매사츄세츠주 첼름스포드)와 함께 Waters 996 PDA 검출기가 장착된 Waters Corp.(제조원: 매사츄세츠주 밀포드) 구배 HPLC를 사용하여 수행하였다.

샘플 주입: A 완충제 중의 25 ㎕의 ~1 mM 샘플 용액

UV 검출: 분석될 화합물에 좌우되어 208-220 nm

유속: 1.0 ㎖/min.

A 완충제: 0.1 %(v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 HPLC-등급 증류수에서 5% CH₃CN(v/v).

B 완충제: 0.1 %(v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 HPLC-등급 CH₃CN 중의 5% H₂O(v/v).

조사 구배 방법: 100%A 0-2 min

100%A 내지 100%B 2-62 min

100%B 62-70 min

분석적 구배 방법: 10%B 0-2 min

10%B 내지 50%B 2-57 min

50%B 내지 100%B 57-62 min

100%B 62-67 min

방법 3c - 장쇄 알킬 할라이드들에 대한 역-상:

10a, 10b와 동일

샘플 주입: A 완충제 중의 25 ㎕의 ~1 mM 샘플 용액

UV 검출: 분석될 화합물들에 따라 200-220 nm

유속: 1.0 ㎖/min.

A 완충제: 0.1 %(v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 HPLC-구배 증류수 중의 5% CH₃CN(v/v).

B 완충제: 0.1 %(v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 HPLC-구배 CH₃CN 중의 5% H₂O(v/v).

구배 방법: 50%A/50%B 0-2 min

50% A/50% B 내지 100%B 2-62 min

100%B 62-70 min

예 4: N-벤질-N- 메틸옥틸아민의 제조( fw =233.39)

254.5g의 새롭게 증류된 N-메틸벤질아민(2.1 mole, fw=121.18, ~271 ㎖)을, 가열 맨틀(heating mantle), 기계적 교반기, 250㎖ 부가 깔때기, 환류 응축기 및 테플론-피복된 열전쌍이 장착된 1L 들이 4구 환저 플라스크 속에서 350 ㎖ 교반 아세토니트릴에 가한다. 반응은 느린 N₂　퍼지를 사용하여 질소 대기 하에서 수행한다. 135.2g의 새롭게 증류된 1-브로모데칸(0.70 mole, fw=221.19, ~121 ㎖)을 교반 혼합물에 반응 발열이 55-65℃의 반응 온도를 유지하도록 하는 속도로 적가 방식으로 가한다. 이러한 조건들하에서, 브로모데칸 첨가는 약 2시간을 필요로 한다. 전체 브로모데칸이 가해지고 반응 온도가 45℃ 이하로 강하된 후에, 교반 반응 혼합물을 2시간 동안 80℃로 가열한 다음 냉각시킨다. 반응 혼합물을 HPLC로 주기적으로 모니터링하여 브로모데칸이 전체적으로 소비되는 것을 보장한다. 반응물이 냉각되면서, 생성물의 덜 조밀한 상부 층이 형성되기 시작한다. 반응 혼합물이 주위 온도로 냉각되면, 100 ㎖ 증류수를 교반 혼합물에 부분방식으로 가하여 상 분리를 촉진시키고 아민 하이드로브로마이드의 결정화를 방지한다. 반응 혼합물을 1L들이 분별 깔때기로 이전시키고 이들이 약 -20℃로 2시간 동안 냉각되도록 함으로써 완전한 상 분리를 달성한다. 하부 상을 버리고 상부 상을 깔대기 속에 유지시킨다. 증류수 중의 1.0 L 10% w/w NaOH를 가하고, 혼합물을 골고루 혼합한 다음 1시간 동안 침전되도록 한다. 상들을 다시 분리시키고, 상부 생성물 상을 보유하고, 1.0L의 증류수를 혼합물에 가하고 이를 완전 혼합한다. 상들을 약 2시간 후 분리하고, 상부 생성물 상을 회전 증발기(80℃ 욕 온도) 속에 두어 물, 아세토니트릴 및 일부 잔류하는 출발 아민을 제거한다. 당해 과정으로 143g(88%)의 담황색 점성 액체를 96 내지 98%의 순도(GC, HPLC)로 수득한다. 주요 불순물은 출발 아민(2-4%)이다. 당해 물질을 진공 증류(172-175℃, 1torr)시켜 90% 증류 수율의 무색 액체(99.8% 순도)를 수득한다. 이는, 출발하는 제 2 아민 및 제 1 알킬 할라이드 자체들이 순수한 경우 양호한 품질의 생성물을 생산하는 깨끗한 반응이다.

예 5: N-벤질-N- 메틸 -N- ⁿ 옥틸글리신 내부 염( fw =291.43)의 제조

116.7g의 증류된 N-벤질-N-메틸옥틸아민(0.50 mole, fw=233.39, 132㎖)를, 기계적 교반기, 250 ㎖ 적가 깔때기, 및 테플론-피복된 열전쌍이 장착된 500㎖ 들이 4-구 환저 플라스크에 가한다. 반응은 용매의 부재하에 느린 N₂　퍼지를 사용하여 질소 대기하에서 수행한다. 주위 온도에서 교반 아민에 84.2g의 증류된 브로모아세트산, 메틸 에스테르(0.55 mole, fw=152.97, 54㎖)를 적가 방식으로 약 45분의 기간에 걸쳐 가한다. 작지만, 인식할만한 발열이 일어난다. 초기의 균질한 반응 혼합물을 심하게 점성이 될 때까지(약 1시간) 교반한다. 15분내에, 점성의 하부 생성물 층이 형성된다. 당해 혼합물을 실온에서 20시간 동안 정치시키면 이 동안에 전체 혼합물이 황색의, 점성인 오일성 덩어리로 된다. 과량의 알킬화제를 경사여과하여 제거하고, 점성 오일을 MTBE로 수회 조심스럽게 세척한다. MTBE 세척물을 버린다. 잔류하는 MTBE는 회전 증발기를 사용하여 제거함으로써 미정제 점성의 황색 오일을 수득한다. 이러한 수용성, 오일성 생성물을 350㎖의 증류수 속에 실온에서 용해하여 투명한, 담황색 용액을 수득한다. 주위 온도에서 75g의 45% 수성 KOH를 폴리프로필렌 플라스크 속에 포함된 교반하는 수성 혼합물에 적가한다. 에스테르 비누화가 실온에서 거의 즉시 일어난다. 혼합물을 80℃(30분)로 잠시 가열하여 반응이 완료되도록 보장한다. 용매(물)를 회전 증발기를 사용하여 완전히 제거함으로써, 점성의, 담-황색 생성물 잔사를 생산한다. 당해 생성물을 소량의 이소프로필 알코올 속에 용해시킨 후 여과하여 백색 고체(KBr)를 제거한다. 투명한 여액을 MTBE로 연마하여 담황색 오일을 형성시킨다. 용매를 경사여과하여 제거하고 오일성 생성물을 MTBE로 세척하고 MTBE는 버린다. 생성물 속의 잔류하는 MTBE는 회전 증발기로 제거한다. 오일을 최소량의 무수 에탄올 속에 용해한 후 물로 연마한다. 물/에탄올 용매를 경사여과하여 제거함으로써 점성의, 무색 액체를 수득한다. 1회 이상의 라운드의 이소프로판올/MTBE 연마 후 에탄올/물 연마를 수행한다. 생성물을 진공 오븐 속에서 밤새 건조시키고 실온으로 냉각시켜 순수한 생성물을 용매가 유리된, 무색의 점성 오일(117g, 80% 수율)로서 형성시킨다. 당해 물질은 분석적으로 순수하며 제한되지만 증류수 속에서 충분한 용해도를 갖는다. 무기 염들(KBr, NaCl) 및 유기 염들([MeNH₃][CF₃CO₂])의 존재하에서, 수 용해도는 유의적으로 증가한다. 주위온도에서 정치시킨 후, 오일을 서서히 고화시켜 왁스성의, 저-융점 고체를 형성시킨다.

β-알라닌 유도체를 브로모프로피온산, 메틸 에스테르로부터 유사하게 생산하고; 초기 4차 암모늄 브로마이드는 백색의 결정성 고체이지만, 가수분해된 양쪽성 이온은 점성 액체이다. 프로판설폰과 부탄 설폰과의 반응들을 아세토니트릴 속에서 아민을 사용하여 수행하고; 반응들이 완료된 후, 용매를 제거하며 후처리는 유사하다. 나트륨 브로모에탄설포네이트와의 반응들을 95/5 중량% 에탄올/물 속에서 수행한다. C₁₁, C₁₀ 및 C₉ 화합물들 중 대부분은 저 융점 고체들로서 분리된다. 대부분의 C₈ 및 C₇ 화합물들은 점성 액체들로서 분리되며, 이들 중 일부는 서서히 고화된다.

[표 V]

Claims

역-상 치환 크로마토그래피(reverse-phase displacement chromatography)에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법으로서,
소수성 정지 상(hydrophobic stationary phase)을 제공하는 단계와,
상기 소수성 정지 상에, 분리될 유기 화합물을 포함하는 혼합물을 가하는 단계와
여기에 비-표면 활성의 소수성인 중성 양쪽성 이온 디스플레이서 분자(displacer molecule)를 포함하는 수성 조성물을 가하여 상기 소수성 정지 상으로부터 유기 화합물을 치환하는 단계와,
분리된 유기 화합물을 함유하는 상기 소수성 정지 상으로부터 용리된 복수의 분획(fraction)을 수거하는 단계를
포함하는, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법에 있어서,
상기 비-표면 활성의 소수성인 중성 양쪽성 이온 디스플레이서 분자는 다음 화학식을 갖고:
[CM-R^*-CM']
상기 화학식에서,
CM은, 4차 암모늄(I), 4차 포스포늄(II), 설포늄(III), 설폭소늄(IV), 이미다졸리늄(아미디늄)(V), 구아니디늄(VI), 이미다졸륨(VII), 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀리늄(VIII), 1,2,3,4-테트라하이드로퀴놀리늄(IX), 이소인돌리늄(X), 인돌리늄(XI), 벤즈이미다졸리움(XII), 피리디늄(XIIla, XIIIb, XIIIc, XIIId), 퀴놀리늄(XIV), 이소퀴놀리늄(XV)으로부터 선택된 형식 양성(+) 전하를 갖는 독립적인 소수성 화학 잔기이고, CM'은, 카르복시레이트(XVI), N-아실-α-아미노산(XVII), 설포네이트(XVIII), 설페이트 모노에스테르(XIX), 포스페이트 모노에스테르(XX), 포스페이트 디에스테르(XXI), 포스포네이트 모노에스테르(XXII), 포스포네이트(XXIII), 테트라아릴 보레이트(XXIV), 보로네이트(XXV), 보로네이트 에스테르(XXVI)로부터 선택된 형식 음성(-) 전하를 갖는 독립적인 소수성 화학 잔기이며, 여기서 화학 잔기 (I) 내지 (XXVI)은 다음의 화학식을 갖고,

상기 화학식에서,
CM 및 CM'은, 반대의 형식 전하를 가짐으로써 분자가 전체로서 작동 pH에서 제로 형식 전하(zero formal charge)를 갖는 전기적으로 중성 양쪽성 이온이도록 하는 독립적으로 하전된 화학 잔기이고, CM 및 CM'은 이중 연결된 화학 잔기 R^*에 의해 서로 화학적으로 부착되며, 당해 잔기는 CM 상의 하나의 R¹, R²　(존재하는 경우), R³　(존재하는 경우) 또는 R⁴　(존재하는 경우) 화학 잔기를 치환하고 CM' 상의 하나의 R^1', R^2'　(존재하는 경우), R^3'　(존재하는 경우) 또는 R^4'(존재하는 경우) 화학 잔기를 치환하고,
각각의 R¹, R^1', R², R^2', R³, R^3', R⁴ 및 R^4'는, 화학식 -C_xX_2x _-2r-AR¹-C_uX_2u _-2s-AR²로 독립적으로 정의된 직쇄 또는 측쇄 화학 잔기이며,
R^*는 직접 화학 결합이거나 또는 화학식 -C_xX_2x _-2r-AR¹-C_uX_2u _-2s-로 정의된 이중 연결된 직쇄 또는 측쇄 화학 잔기이고,
R⁵는 화학식 -C_xX_2x _-2r-AR²로 정의된 직쇄 또는 측쇄 화학 잔기이며,
각각의 AR¹은, 독립적으로 이중 연결된 메틸렌 잔기(-CX¹X²-, 메탄으로부터), 이중 연결된 페닐렌 잔기(-C₆G₄-, 벤젠으로부터), 이중 연결된 나프틸렌 잔기(-C₁₀G₆-, 나프탈렌으로부터) 또는 이중 연결된 비페닐렌 잔기(-C₁₂G₈-, 비페닐로부터)이고,
AR²는, 독립적으로 수소(-H), 플루오르(-F), 페닐 그룹(-C₆G₅), 나프틸 그룹(-C₁₀G₇) 또는 비페닐 그룹(-C₁₂G₉)이며,
각각의 X, X¹　및 X²는, 개별적 및 독립적으로, -H, -F, -CI 또는 -OH이고,
임의의 -C_xX_2x _-2r- 내의 또는 임의의 -C_uX_2u _-2s- 내의 또는 임의의 -(CX¹X²)_P- 내의 임의의 메틸렌 잔기(-CX¹X²-)는, 독립적인 에테르-산소 원자, -O-, 독립적인 티오에테르-황 원자, -S-, 또는 독립적인 케톤-카보닐 그룹, -C(O)-에 의해, 각각의 에테르-산소 원자, 각각의 티오에테르-황 원자 또는 각각의 케톤-카보닐 그룹이 지방족 탄소 원자 또는 방향족 탄소 원자에 각각의 측면에 결합되는 방식으로, 개별적 및 독립적으로, 치환될 수 있으며,
2개 이하의 에테르-산소 원자, 2개 이하의 티오에테르-황 원자, 및 2개 이하의 케톤-카보닐 그룹은, 임의의 -C_xX_2x _-2r- 또는 임의의 -C_uX_2u _-2s- 내로 치환될 수 있고,
m_x는, 에테르-산소 원자, 티오에테르-황 원자, 및 케톤-카보닐 그룹으로 치환되는 각각의 -C_uX_2x _-2r- 내의 메틸렌 그룹의 총 수이고, m_u는 에테르-산소 원자, 티오에테르-황 원자, 및 케톤-카보닐 그룹으로 치환되는 각각의 -C_uX_2u _-2s- 내의 메틸렌 그룹의 총 수이며,
G는, 개별적 및 독립적으로, -H, -F, -Cl, -CH₃, -OH, -OCH₃, -N(CH₃)₂, -CF₃, -CO₂Me, -CO₂NH₂; -CO₂NHMe, -CO₂NMe₂의 임의의 조합이고,
G^*는, 개별적 및 독립적으로, -F, -Cl, -R², -OH, -OR², -NR²R³, -CF₃, -CO₂Me, -CO₂NH₂; -CO₂NHMe, -CO₂NMe₂의 임의의 조합이며,
R², R^2', R³, R^3', R⁴ 및 R^4'의 쌍은, R²/R³, R²/R⁴, R³/R⁴, R^2'/R^3', R^2'/R^4'　또는 R^3'/R^4'가 개별적 및 독립적으로 -(CX¹X²)p-(여기서, p = 3, 4, 5 또는 6이다)이도록 단일 화학 잔기를 포함할 수 있고,
x, r, u, s, m_x, m_u의 각각의 정수 값은, 각각의 R¹, R^1', R², R^2', R³, R^3', R⁴, R^4', R⁵　및 R^*에 대하여 독립적으로 선택되고, 정수 값 r 및 s는 포함되고, 분리된 시스/트랜스 올레핀계(알켄) 그룹의 총 수 + 포함된 단일 모노사이클릭 구조의 총 수이며, 범위 0≤r≤2 및 0≤s≤2에 속하고, 수치량(numeric quantity) x+u-m_x-m_u는 범위 0≤x+u-m_x-m_u≤11에 속하며,
적어도 하나의 방향족 화학 잔기, 헤테로사이클릭 방향족 화학 잔기, 이미다졸린 화학 잔기, 아미딘 화학 잔기 또는 구아니딘 화학 잔기는 CM 또는 CM' 내에 포함되고,
각각의 R-화학 잔기에 대한 그룹-소수성-지수(n)는, 지방족 탄소 원자의 수 + 올레핀계 탄소 원자의 수 + 티오에테르-황 원자의 수 + 염소 원자의 수 + 플루오르 원자의 수의 1/5 + 에테르-산소 원자의 수의 1/2 + 케톤-탄소 원자의 수의 1/2 + 수 6을 넘는 방향족 탄소 원자의 수의 1/2의 합 - 수 1을 넘는 하이드록실-산소 원자의 수와 수치적으로 동일하며,
각각의 [CM-R^*-CM']에 대한 전체-소수성 지수(N)는, 지방족 탄소 원자의 수 + 올레핀계 탄소 원자의 수 + 티오에테르-황 원자의 수 + 염소 원자의 수 + 플루오르 원자의 수의 1/5 + 에테르-산소 원자의 수의 1/2 + 케톤-탄소 원자의 수의 1/2 + 수 6을 넘는 방향족 탄소 원자들의 수의 1/2의 합 - 수 1을 넘는 하이드록실-산소 원자의 수와 동일하고,
R¹　및 R^1' 에 대한 그룹-소수성 지수(¹n 및　^1'n)는, 범위 4.0 <　¹n,^1'n < 12.0에 속하고, R², R^2', R³, R^3', R⁵, R^5', R^*에 대한 그룹-소수성 지수(²n,　^2'n, ³n,　^3'n,　⁵n,　^5'n 및 ^*n)는, 존재하는 경우, 범위 0.0 ≤　²n, ^2'n,　³n, ^3'n,　⁵n, ^5'n, ^*n < 12.0에 속하며, R⁴　및 R^4'에 대한 그룹-소수성 지수(⁴n 및　^4'n)는, 존재하는 경우, 범위 0.0 ≤　⁴n, ^4'n ≤ 5.0에 속하고,
전체-소수성-지수(N)는, 범위 10.0 ≤ N/g < 24.0에 속하며,
사이클릭 화학 잔기에 대해 계산된 그룹-소수성-지수의 수치 값은, 2개의 각각의 R-화학 잔기 사이에 동일하게 나누어지고,
R¹은, 단지 하나의 R-화학 잔기가 CM 또는 CM'에 부착되는 경우 이러한 R-화학 잔기로 정의되고; 여기서 R¹은, CM 또는 CM'에 부착된 하나 이상의 R-화학 잔기가 존재하는 경우 그룹-소수성-지수의 최대값을 갖는 이러한 R-화학 잔기로 정의되며; 여기서 R⁴는, CM 또는 CM'에 부착된 3개 이상의 R-화학 잔기가 존재하는 경우 그룹-소수성-지수의 최소값을 갖는 이러한 R-화학 잔기로 정의되는, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항에 있어서, 비-표면 활성의 양쪽성 이온성 소수성 디스플레이서 분자를 포함하는 상기 수성 조성물은 pH 완충제 이외에 추가된 염을 함유하지 않는, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은 화학식 I 또는 II를 갖고,

상기 화학식 I 또는 II에서, R¹은 C₈-C₁₁ 하이드로카빌 잔기이고, R²　및 R³은 독립적으로 C₁-C₄ 하이드로카빌 잔기 또는 벤질이며, R⁴는 벤질, 할로-치환된 벤질, 4-알킬벤질, 4-트리플루오로메틸 벤질, 4-페닐벤질, 4-알콕시벤질, 4-아세트아미도벤질, H₂NC(O)CH₂-, PhHNC(O)CH₂-, 디알킬-NC(O)CH₂-로부터 선택되고, 알킬은 C₁-C₄이고, 단 CM에는 1개 이하의 벤질 그룹이 존재하는, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은 화학식 I 또는 II를 갖고,

상기 화학식 I 또는 II에서, R¹　및 R²는 독립적으로 C₄-C₈ 알킬 또는 사이클로헥실이고, R³는 C₁-C₄ 알킬이며, R⁴는 페닐, 2-, 3- 또는 4-할로페닐, 벤질, 2-, 3- 또는 4-할로벤질, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- 또는 3,5-디할로벤질, 2,4,6- 또는 3,4,5-트리할로벤질, C₆H₅CH₂CH₂- 또는 2-, 3- 또는 4-트리플루오로메틸벤질인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은 화학식 VIII, IX, X 또는 XI을 갖고, R¹은 C₅ _-11 알킬이며, R²는 C₁-C₈　알킬인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은 화학식 I 또는 II를 갖고,

상기 화학식 I 또는 II에서, R¹는 C₆-C₁₁ 알킬이고, R²　및 R³은 독립적으로 C₁-C₄　알킬이고, R⁴는 PhC(O)CH₂-, 4-FC₆H₄C(O)CH₂-, 4-CH₃C₆H₄C(O)CH₂-, 4-CF₃C₆H₄C(O)CH₂-, 4-ClC₆H₄C(O)CH₂-, 4-BrC₆H₄C(O)CH₂-, ㎗-PhC(O)CH(Ph)-, Ph(CH₂)₂-, Ph(CH₂)₃-, Ph(CH₂)₄-, ㎗-PhCH₂CH(OH)CH₂-, t-PhCH=CHCH₂-, 1-(CH₂)나프틸렌, 9-(CH₂)안트라센, 2-, 3- 또는4-FC₆H₄CH₂- 또는 벤질인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은 화학식 I 또는 II를 갖고,

상기 화학식 I 또는 II에서, R¹는 C₆-C₁₁ 알킬이고, R²와 R³은 함께 -(CH₂)₄-이고, R⁴는 PhC(O)CH₂-, 4-FC₆H₄C(O)CH₂-, 4-CH₃C₆H₄C(O)CH₂-, 4-CF₃C₆H₄C(O)CH₂-, 4-ClC₆H₄C(O)CH₂-, 4-BrC₆H₄C(O)CH₂-, ㎗-PhC(O)CH(Ph)-, Ph(CH₂)₂-, Ph(CH₂)₃-, Ph(CH₂)₄-, ㎗-PhCH₂CH(OH)CH₂-, t-PhCH=CHCH₂-, 2-, 3- 또는 4-FC₆H₄CH₂-, 벤질, 3-ClC₆H₄CH₂-, 2,6-F₂C₆H₃CH₂-, 3,5-F₂C₆H₃CH₂-, 4-CH₃C₆H₄CH₂-, 4-CH₃CH₂C₆H₄CH₂-, 4-CH₃OC₆H₄CH₂-, (CH₃)₂NC(O)CH₂- 또는 (CH₃CH₂)₂NC(O)CH₂-인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은 화학식 I 또는 II를 갖고,

상기 화학식 I 또는 II에서, R¹은 C₄-C₆ 알킬, 벤질 또는 2-, 3- 또는 4-FC₆H₄CH₂-이고, R²　및 R³는 독립적으로 C₁-C₈　알킬, CH₃(OCH₂CH₂)₂-, CH₃CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂- 또는 CH₃CH₂OCH₂CH₂-이며, R⁴는 Ph(CH₂)₄-, 4-PhC₆H₄CH₂-, 4-FC₆H₄CH₂-, 4-CF₃C₆H₄CH₂-, PhC(O)CH₂-, 4-FC₆H₄C(O)CH₂-, 4-PhC₆H₄C(O)CH₂-, 4-PhC₆H₄CH₂-, 나프틸렌-1-CH₂-, 안트라센-9-CH₂- 또는 Ph(CH₂)_n-이고, 여기서 n은 5 내지 8인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은 화학식 [(R¹R²R³NCH₂)₂C₆H₃G]²⁺를 갖고, 여기서 R¹은 C₄-C₁₁ 알킬이고, R²　및 R³은 독립적으로 C₁-C₆ 알킬이거나 또는 R²와 R³은 함께 취해져서 -(CH₂)₄-이며, G는 H 또는 F인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은 화학식 [R¹R²R³NCH₂C₆H₄-C₆H₄CH₂NR¹R²R³]²⁺를 갖고, 여기서 R¹은 C₄-C₁₁ 알킬이고, R²　및 R³은 독립적으로 C₁-C₆ 알킬이거나 또는 R²와 R³은 함께 취해져서 -(CH₂)₄-인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은 화학식 III 또는 IV를 갖고,

상기 화학식 III 또는 IV에서, R¹은 C₈-C₁₁ 알킬 또는 4,4'-CH₃(CH₂)₄C₆H₄-C₆H₄CH₂-이고, R²는 C₁-C₆　알킬 또는 4-FC₆H₄CH₂-이며, R³은 C₁-C₆　알킬인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은 화학식 XIV 또는 XV를 갖고,

상기 화학식 XIV 또는 XV에서, R¹은 C₈-C₁₁ 알킬이며, 각각의 G 및 R⁵는 상기 정의한 바와 같은, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은 화학식 XIIIa, XIIIb, XIIIc, XIIId 또는 XIIIe를 갖고,

상기 화학식 XIIIa, XIIIb, XIIIc, XIIId 또는 XIIIe에서, R¹은 C₈-C₁₁ 알킬 또는 C₈-C₁₁ 4-페닐이고, R²는 H, C₁-C₆ 알킬 또는 알콕시, 2-피리딜, C₁-C₆ 알킬 치환된 2-피리딜, 또는 피롤리디닐이며, 각각의 G는 상기 정의한 바와 같은, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은 화학식 VII을 갖고,

상기 화학식 VII에서, R¹은 C₅-C₁₁ 알킬이고, R²　및 R⁵는 독립적으로 H 또는 C₁-C₆ 알킬 또는 페닐인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은 화학식 XII를 갖고,

상기 화학식 XII에서, R¹은 C₅-C₁₁ 알킬이고, R²　및 R⁵는 독립적으로 H 또는 C₁-C₆ 알킬 또는 페닐이며, G는 상기 정의한 바와 같은, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, CM'는 화학식 XXIV 또는 XXV를 갖고,

상기 화학식 XXIV에서, R¹은 페닐, 4-EtC₆H₄-, 4-ⁿPrC₆H₄-, 4-ⁿBuC₆H₄-, 4-MeOC₆H₄-, 4-FC₆H₄-, 4-MeC₆H₄-, 4-MeOC₆H₄-, 4-EtC₆H₄-, 4-ClC₆H₄-, 또는 C₆F₅-이며; 각각의 R², R³ 및 R⁴는 독립적으로 페닐, 4-FC₆H₄-, 4-MeC₆H₄-, 4-MeOC₆H₄-, 4-EtC₆H₄-, 4-ClC₆H₄- 또는 C₆F₅-이며; 상기 화학식 XXV에서, R¹은 4-(4-ⁿBuC₆H₄)C₆H₄- 또는 4-(4-ⁿBuC₆H₄)-3-ClC₆H₃-인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, CM'은 4-R¹C₆H₄SO₃H, 5-R¹-2-HO-C₆H₃SO₃H, 4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-4'-SO₃H, 및 4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-3'-SO₃H로부터 선택된 화학식을 갖고, 여기서 R¹은 CH₃(CH₂)_n이고, 여기서 n은 4 내지 10이며, X는 H 또는 OH인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, CM'은 화학식 XVIII 또는 XXIII을 갖고,

상기 화학식 XVIII 및 화학식 XXIII에서, R¹은 C₆H₅(CH₂)_n-이고, 여기서 n은 5 내지 11인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, CM'은 5-R¹-2-HO-C₆H₃CO₂H와 R¹C(O)NHCH(C₆H₅)CO₂H로부터 선택된 화학식을 갖고, 여기서 R¹은 CH₃(CH₂)_n-이고, 여기서 n은 4 내지 10인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, CM'은 화학식 4-R¹C₆H₄PO₃H₂이고, 여기서 R¹은 CH₃(CH₂)_n-이며, 여기서 n은 4 내지 10인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 조성물은 유기 용매를 약 25 부피% 미만, 또는 약 20 부피% 미만, 또는 약 15 부피% 미만, 또는 약 10 부피% 미만, 또는 약 5 부피% 미만의 양으로 더 포함하는, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.