CN103958016A - 用于疏水性置换色谱法的中性两性离子置换剂分子 - Google Patents
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Abstract
通过反相置换色谱法从混合物中分离有机化合物的方法,包括提供疏水性固定相;向疏水性固定相施加包含待分离的有机化合物的混合物;通过向疏水性固定相施加包含非-表面活性疏水性中性两性离子置换剂分子和任选的有机溶剂的水性组合物而从疏水性固定相置换有机化合物;以及收集从疏水性固定相洗脱的含有被分离的有机化合物的多个馏分;其中所述非-表面活性疏水性中性两性离子置换剂分子包含具有如说明书中所定义的通式[CM-R*-CM’]的疏水性两性离子。
Description
背景技术
置换色谱法(DC)是三种已知的柱色谱形式——洗脱色谱法、置换色谱法、前沿色谱法——之一。DC主要是一种制备方法,但也有使用具有填充的“窄孔”或毛细管柱的“微制备”DC的分析应用。
当有可用的合适的高纯度置换剂分子时,可以使用四种常规的色谱方法中的任一种来进行置换色谱法。DC用于(a)离子交换色谱(阳离子交换、阴离子交换),(b)疏水性色谱(反相、疏水相互作用、疏水电荷诱导、嗜硫),(c)正相色谱,包括亲水相互作用色谱(HILIC),和(d)固定化金属离子亲和色谱(IMAC)。
采用优化的DC,可以同时获得高纯度(高分辨率)、高回收率(高收率)和高柱加载(高容量)——后者大大高于过载的制备洗脱色谱法。在大多数情况下,这些优势不仅仅补偿了DC的缺点(较慢的流速、较长的运行时间、需要高纯度置换剂)。
通过选择(a)合适的色谱方法、(b)适当的具有合适尺寸的色谱柱、(c)合适的流动相条件、(d)适当的置换剂分子和(e)适当的操作方案与适当配置的LC装置来进行置换色谱法。最初,选择适当的“弱置换的流动相”(载体),且在适当的流速下使柱平衡。载体可以含有被调节至有用的pH值的pH缓冲化合物。最佳的置换流速倾向于低,通常在35-105cm/hr的范围内,虽然有时候会更高。在样品加载流速下将适量的样品溶液加载到柱上。样品溶液含有载体中的待纯化的物质以及,若样品或置换剂分子带有电荷或为两性离子的,则含有适当水平的离子配对剂或离子配对盐。通常的样品加载量为有效穿透容量(operative breakthrough capacity)的50-80%。随后,将由适当的置换剂化合物在载体溶液中以适当的浓度制备的置换剂流动相(置换剂缓冲剂)在置换流速下泵送到柱上直至观察到置换剂穿透。纯化的样品在置换剂穿透的前沿之前从柱中出来。收集从柱中出来的馏分,并单独分析其含量和纯度。最后,使用“置换剂去除溶液”从柱中去除置换剂,随后将柱清洁并再生至其原始状态用于保存或用于随后的使用。
尽管不同于洗脱色谱法,但在某些方面,置换色谱法易于理解和易于实施。在DC中,样品被置换剂从柱中“置换”,而不是被流动相从柱中“洗脱”。当在线监测(例如,经UV吸收、pH或电导率)柱的输出时,获得“置换队列(displacement train)”,而不是“洗脱色谱图”。置换队列由并列的“置换带(displacement bands)”组成,而不是在色谱图中由溶剂分离的“洗脱峰”组成。当置换带足够大,以至于使固定相饱和时,形成梯形的“饱和带”。当置换带不大到足以使固定相饱和时,形成小的、三角形的“非饱和带”。饱和带的高度通过操作点的结合等温线来确定;梯形带或三角形带的面积与组分的量成正比。
疏水性色谱法几乎完全取决于水的独特的溶剂化性质,这些性质来自该高度结构化的、自身缔合的、氢键结合的液体。对于常规的反相色谱固定相(不带电荷的C18柱),结合通常由熵驱动(+TΔS),其经常必须克服不利的焓(+ΔH)。因此,在色谱工作者经常使用的温度范围内(10-70℃),被分析物结合和置换剂结合经常随着温度增加而增强。疏水性色谱的另一有用的特征是使用添加剂,其改变水基溶剂的自身氢键结合的结构和强度。这些添加剂包括:色谱缓冲剂中的盐(NaCl、K2HPO4、(NH4)2SO4)、有机溶剂(MeCN、MeOH、EtOH)和极性有机分子(尿素、寡聚乙二醇)。
可以使用手性被分析物、手性置换剂和手性色谱基质来实施疏水性置换色谱法。在这些条件下,可以使用非手性置换剂,但不能使用手性置换剂的外消旋混合物。还可以使用非手性色谱柱和非手性置换剂来纯化外消旋手性被分析物。在这种情况下,将包括非对映异构体在内的杂质从所关注的外消旋化合物中去除,但没有对映体的手性拆分。适当的高纯度置换剂分子的不可得已阻碍了有用的制备疏水性置换色谱的开发。我们在此描述了新的置换剂分子和使用它们的方法,其可用于各种形式的疏水性置换色谱法。
好的疏水性置换剂分子应当具有化学和物理性质的独特组合,以便使其有效地起作用。某些可溶的疏水性分子可以用作置换剂,但仅有少数几种很好地起作用。本文件所述的很多分子满足对于很好地起作用的置换剂的必要的要求。
由于适当的高纯度置换剂分子的不可得,已阻碍了有用的反相制备置换色谱法的开发。例如美国专利第6,239,262号描述了使用低分子量表面活性化合物作为置换剂的各种反相液相色谱系统。美国专利第6,239,262号公开了极宽范围的可以与疏水性部分偶联以形成用作所公开的置换剂的表面活性化合物的可能的带电荷部分,但公开了必须包括大量的有机溶剂以减轻所公开的置换剂的表面活性。这样大量有机溶剂的存在显著改变了该过程,减少了反相疏水性置换色谱法的益处。此外,美国专利第6,239,262号所公开的强表面活性的置换剂化合物不能很好地起作用,导致相对从差到中等质量的置换队列,其中在“纯化的”产物中可以存在显著水平的杂质。
发明内容
我们已发现并开发了很多类中性疏水性两性离子或二两性离子化合物,其独特地具有对于疏水性置换色谱法中好的置换剂行为所必需的化学和物理性质的组合。
因此,在一个实施方案中,本发明涉及通过反相置换色谱法从混合物分离有机化合物的方法,其包括:
提供疏水性固定相;
向所述疏水性固定相施加包含待分离的有机化合物的混合物;
通过向所述疏水性固定相施加包含非-表面活性疏水性中性两性离子置换剂分子的水性组合物而从所述疏水性固定相置换所述有机化合物;以及
收集从所述疏水性固定相洗脱的含有被分离的化合物的多个馏分;
其中所述非-表面活性疏水性中性两性离子置换剂分子包含具有以下通式的疏水性中性两性离子:
[CM-R*-CM’]
其中在所述通式中,CM为独立的带有形式正(+)电荷的疏水性化学部分,其选自:季铵(I)、季鏻(II)、锍(III)、氧化锍(IV)、咪唑啉鎓(脒鎓)(V)、胍鎓(VI)、咪唑鎓(VII)、1,2,3,4-四氢异喹啉鎓(VIII)、1,2,3,4-四氢喹啉鎓(IX)、异吲哚啉鎓(X)、吲哚啉鎓(XI)、苯并咪唑鎓(XII)、吡啶鎓(XIIIa、XIIIb、XIIIc、XIIId)、喹啉鎓(XIV)、异喹啉鎓(XV),且CM’为独立的带有形式负(-)电荷的疏水性化学部分,其选自:羧酸盐(XVI)、N-酰基-α-氨基酸(XVII)、磺酸盐(XVIII)、硫酸盐单酯(XIX)、磷酸盐单酯(XX)、磷酸盐二酯(XXI)、膦酸盐单酯(XXII)、膦酸盐(XXIII)、四芳基硼酸盐(XXIV)、硼酸盐(XXV)、硼酸盐酯(XXVI);其中所述化学部分(I)-(XXVI)具有以下化学结构:
其中在所述通式中,CM和CM’为独立的带有相反的形式电荷的带电荷的化学部分,使得所述分子作为整体是在操作pH下带有零形式电荷的电中性两性离子,且CM和CM’通过双连接的化学部分R*而彼此化学地连接,其中R*替换CM上的一个R1、R2(若存在)、R3(若存在)或R4(若存在)化学部分且替换CM’上的一个R1'、R2'(若存在)、R3'(若存在)或R4'(若存在)化学部分(在此,CM'上的R基团用符号(')表示,例如,R1'是CM'上的R1基团);
其中各R1、R1'、R2、R2'、R3、R3'、R4和R4'是独立地由下式定义的直链或支链的化学部分,
-CxX2x-2r-AR1-CuX2u-2s-AR2,
R*是直接化学键或是由下式定义的连接CM与CM'的双连接的直链或支链的化学部分,
-CxX2x-2r-AR1-CuX2u-2s-,
且R5和R5'独立地为由下式定义的直链或支链的化学部分,
-CxX2x-2r-AR2;
其中各AR1独立地为双连接的亚甲基部分(-CX1X2-,衍生自甲烷)、双连接的亚苯基部分(-C6G4-,衍生自苯)、双连接的亚萘基部分(-C10G6-,衍生自萘)或双连接的亚联苯基部分(-C12G8-,衍生自联苯);
其中AR2独立地为氢(-H)、氟(-F)、苯基(-C6G5)、萘基(-C10G7)或联苯基(-C12G9);
其中各X、X1和X2各自独立地为-H、-F、-Cl或-OH;
其中任意-CxX2x-2r-内或任意-CuX2u-2s-内或任意-(CX1X2)p-内的任意亚甲基部分(-CX1X2-)可以各自独立地被独立的醚-氧原子-O-、独立的硫醚-硫原子-S-或独立的酮-羰基-C(O)-替换,其方式为使得各醚-氧原子、各硫醚-硫原子或各酮-羰基的每一侧与脂肪族碳原子或芳香族碳原子键合;
其中任何-CxX2x-2r-内或任何-CuX2u-2s-内可替换有不超过两个醚-氧原子、不超过两个硫醚-硫原子和不超过两个酮-羰基;
其中mx是各-CxX2x-2r-中被醚-氧原子、硫醚-硫原子和酮-羰基替换的亚甲基的总数目,且mu是各-CuX2u-2s-中被醚-氧原子、硫醚-硫原子和酮-羰基替换的亚甲基的总数目;
其中G各自独立地为-H、-F、-Cl、-CH3、-OH、-OCH3、-N(CH3)2、-CF3、-CO2Me、-CO2NH2;-CO2NHMe、-CO2NMe2的任意组合;
其中G*各自独立地为-F、-Cl、-R2、-OH、-OR2、-NR2R3、-CF3、-CO2Me、-CO2NH2;-CO2NHMe、-CO2NMe2的任意组合;
其中一对R2、R2'、R3、R3'、R4和R4'可以包含单独的化学部分,从而R2/R3、R2/R4、R3/R4、R2’/R3’、R2’/R4’或R3’/R4’各自独立地为-(CX1X2)p-,其中p=3、4、5或6;
其中对于各R1、R1'、R2、R2'、R3、R3'、R4、R4'、R5、R5'和R*,各x、r、u、s、mx、mu的整数值独立地选择,整数值r和s是所含的分离的顺式/反式烯类(烯烃)基团的总数加上所含的简单单环结构的总数且落在以下范围内:0≤r≤2和0≤s≤2,数值x+u-mx-mu落在以下范围内:0≤x+u-mx-mu≤11;
其中在CM或CM’内含有至少一个芳香族化学部分、杂环芳香族化学部分、咪唑啉化学部分、脒化学部分或胍化学部分;
其中各R化学部分的基团-疏水-指数(n)在数值上等于脂肪族碳原子的数目加上烯类碳原子的数目加上硫醚-硫原子的数目加上氯原子的数目加上氟原子的数目的五分之一加上醚-氧原子的数目的一半加上酮-碳原子的数目的一半加上数目超过六个的芳香族碳原子的数目的一半的总和减去超过一个的羟基氧原子的数目;
其中各[CM-R*-CM’]的总-疏水-指数(N)在数值上等于脂肪族碳原子的数目加上烯类碳原子的数目加上硫醚-硫原子的数目加上氯原子的数目加上氟原子的数目的五分之一加上醚-氧原子的数目的一半加上酮-碳原子的数目的一半加上数目超过六个的芳香族碳原子的数目的一半的总和减去超过一个的羟基氧原子的数目;
其中R1和R1’的各基团-疏水-指数(1n和1’n)落在以下范围内:4.0<1n,1’n<12.0,当存在时,R2、R2’、R3、R3’、R5、R5’、R*的各基团-疏水-指数(2n、2’n、3n、3’n、5n、5’n和*n)落在以下范围内:0.0≤2n、2’n、3n、3’n、5n、5’n、*n<12.0,且当存在时,R4和R4’的各基团-疏水-指数(4n和4’n)落在以下范围内:0.0≤4n,4’n≤5.0;
其中总-疏水-指数(N)落在以下范围内:10.0≤N<24.0;
其中对于环状化学部分所计算的基团-疏水-指数的数值平均分配在两个分别的R化学部分之间;
其中当仅有一个R化学部分连接至CM或CM’时,R1被识别为该R化学部分;其中当有超过一个R化学部分连接至CM或CM’时,R1被识别为具有基团-疏水-指数最大值的该R化学部分;其中当有超过三个R化学部分连接至CM或CM’时,R4被识别为具有基团-疏水-指数最小值的该R化学部分。
一般在本文中,CM是阳离子且CM'是阴离子,且各CM和CM'可以分别包括超过一个阳离子或阴离子,只要保持[CM-R*-CM']中的电中性即可。
在一个实施方案中,包含非-表面活性疏水性置换剂分子的水性组合物除了pH缓冲剂之外不含有添加的盐。
在一个实施方案中,CM具有通式I或II:
其中在通式I或II中,R1是C8-C11烃基部分,R2和R3独立地是C1-C4烃基部分或苄基,且R4选自苄基、卤素-取代的苄基、4-烷基苄基、4-三氟甲基苄基、4-苯基苄基、4-烷氧基苄基、4-乙酰氨基苄基、H2NC(O)CH2-、PhHNC(O)CH2-、二烷基-NC(O)CH2-,其中烷基是C1-C4,条件是在CM中不存在超过一个苄基。
在一个实施方案中,CM具有通式I或II:
其中在通式I或II中,R1和R2独立地是C4-C8烷基或环己基,R3是C1-C4烷基,且R4是苯基、2-、3-或4-卤代苯基、苄基、2-、3-或4-卤代苄基、2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-或3,5-二卤代苄基、2,4,6-或3,4,5-三卤代苄基、C6H5CH2CH2-或者2-、3-或4-三氟甲基苄基。
在一个实施方案中,CM具有通式VIII、IX、X或XI,R1是C5-C11烷基且R2是C1-C8烷基且G为如上文所定义。
在一个实施方案中,CM具有通式I或II:
其中在通式I或II中,R1是C6-C11烷基,R2和R3独立地是C1-C4烷基,且R4是PhC(O)CH2-、4-FC6H4C(O)CH2-,4-CH3C6H4C(O)CH2-、4-CF3C6H4C(O)CH2-、4-ClC6H4C(O)CH2-、4-BrC6H4C(O)CH2-、dl-PhC(O)CH(Ph)-、Ph(CH2)2-、Ph(CH2)3-、Ph(CH2)4-、dl-PhCH2CH(OH)CH2-、t-PhCH=CHCH2-、1-(CH2)亚萘基、9-(CH2)蒽基、2-、3-或4-FC6H4CH2-或苄基。
在一个实施方案中,CM具有通式I或II:
R1是C6-C11烷基,R2和R3一起是-(CH2)4-,且R4是PhC(O)CH2-、4-FC6H4C(O)CH2-、4-CH3C6H4C(O)CH2-、4-CF3C6H4C(O)CH2-、4-ClC6H4C(O)CH2-、4-BrC6H4C(O)CH2-、dl-PhC(O)CH(Ph)-、Ph(CH2)2-、Ph(CH2)3-、Ph(CH2)4-、dl-PhCH2CH(OH)CH2-、t-PhCH=CHCH2-、2-、3-或4-FC6H4CH2-、苄基、3-ClC6H4CH2-、2,6-F2C6H3CH2-、3,5-F2C6H3CH2-、4-CH3C6H4CH2-、4-CH3CH2C6H4CH2-、4-CH3OC6H4CH2-、(CH3)2NC(O)CH2-或(CH3CH2)2NC(O)CH2-。
在一个实施方案中,CM具有通式I或II:
其中在通式I或II中,R1是C4-C6烷基、苄基或者2-、3-或4-FC6H4CH2-,R2和R3独立地是C1-C8烷基、CH3(OCH2CH2)2-、CH3CH2OCH2CH2OCH2CH2-或CH3CH2OCH2CH2-,且R4是Ph(CH2)4-、4-PhC6H4CH2-、4-FC6H4CH2-、4-CF3C6H4CH2-、PhC(O)CH2-、4-FC6H4C(O)CH2-、4-PhC6H4C(O)CH2-、4-PhC6H4CH2-、亚萘基-1-CH2-、蒽基-9-CH2-或Ph(CH2)n-,其中n=5-8。
在一个实施方案中,CM具有通式[(R1R2R3NCH2)2C6H3G]2+,其中R1是C4-C11烷基,R2和R3独立地是C1-C6烷基或者R2和R3一起是-(CH2)4-,且G是H或F。
在一个实施方案中,CM具有通式[R1R2R3NCH2C6H4-C6H4CH2NR1R2R3]2+,其中R1是C4-C11烷基,R2和R3独立地是C1-C6烷基或者R2和R3一起是-(CH2)4-。
在一个实施方案中,CM具有通式III或IV:
其中在通式III或IV中,R1是C8-C11烷基或4,4’-CH3(CH2)4C6H4-C6H4CH2-,R2是C1-C6烷基或4-FC6H4CH2-,且R3是C1-C6烷基。
在一个实施方案中,CM具有通式XIV或XV:
其中在通式XIV或XV中,R1是C8-C11烷基,且各G和R5为如上文所定义。
在一个实施方案中,CM具有通式XIIIa、XIIIb、XIIIc、XIIId或XIIIe:
其中在通式XIIIa、XIIIb、XIIIc、XIIId或XIIIe中,R1是C8-C11烷基或C8-C114-苯基,R2是H、C1-C6烷基或烷氧基、2-吡啶基、C1-C6烷基取代的2-吡啶基或吡咯烷基,且各G为如上文所定义。
在一个实施方案中,CM具有通式VII:
其中在通式VII中,R1是C5-C11烷基,R2和R5独立地是H或C1-C6烷基或苯基。
在一个实施方案中,CM具有通式XII:
其中在通式XII中,R1是C5-C11烷基,R2和R5独立地是H或C1-C6烷基或苯基,且G为如上文所定义。
在一个实施方案中,CM,\'具有通式XXIV或XXV:
其中在通式XXIV中,R1是苯基、4-EtC6H4-、4-nPrC6H4-、4-nBuC6H4-、4-MeOC6H4-、4-FC6H4-、4-MeC6H4-、4-MeOC6H4-、4-EtC6H4-、4-ClC6H4-或C6F5-;且各R2、R3和R4独立地为苯基、4-FC6H4-、4-MeC6H4-、4-MeOC6H4-、4-EtC6H4-、4-ClC6H4-或C6F5-;且
其中在通式XXV中,R1是4-(4-nBuC6H4)C6H4-或4-(4-nBuC6H4)-3-ClC6H3-。
在一个实施方案中,CM'具有选自以下的通式:4-R1C6H4SO3H、5-R1-2-HO-C6H3SO3H、4-R1-C6H4-C6H3X-4’-SO3H和4-R1-C6H4-C6H3X-3’-SO3H,其中R1是CH3(CH2)n,其中n=4-10且X是H或OH。
在一个实施方案中,CM'具有通式XVIII或XXIII:
其中在通式XVIII中和在通式XXIII中,R1是C6H5(CH2)n-,其中n=5-11。
在一个实施方案中,CM'具有选自以下的通式:5-R1-2-HO-C6H3CO2H和R1C(O)NHCH(C6H5)CO2H,其中R1是CH3(CH2)n-,其中n=4-10。
在一个实施方案中,CM'具有通式4-R1C6H4PO3H2其中R1是CH3(CH2)n-,其中n=4-10。
在一个实施方案中,水性组合物进一步包括有机溶剂,其量为低于约25体积%,或低于约20体积%,或低于约15体积%,或低于约10体积%,或低于约5体积%。
附图说明
图1A是对于根据本发明的示例性实施方案的置换色谱法过程将时间(x-轴)相对于相对吸收单位(y-轴)作图得到的粗合成肽的纯化的置换痕迹(displacement trace)。
具体实施方式
本文中针对根据本发明所采用的中性两性离子非表面活性置换剂化合物所用的“非表面活性”意指所述化合物的临界胶束浓度(“CMC”)大于根据本发明的置换色谱法过程中所采用的化合物的浓度。在一个实施方案中,在不存在有机溶剂、盐或其它会影响CMC的试剂时,非表面活性置换剂化合物的浓度低于该化合物在水中的CMC的约80%。在一个实施方案中,在不存在有机溶剂、盐或其它会影响CMC的试剂时,非表面活性置换剂化合物的浓度低于该化合物在水中的CMC的约60%。在一个实施方案中,在不存在有机溶剂、盐或其它会影响CMC的试剂时,非表面活性置换剂化合物的浓度低于该化合物在水中的CMC的约50%。
在一个实施方案中,包含根据本发明所采用的非表面活性疏水性中性两性离子置换剂分子的水性组合物由于以下的两种或更多种的组合而不表现出不利的表面活性特征:(1)两性离子非表面活性置换剂化合物以低于其CMC的浓度存在;(2)各[CM-R*-CM’]的总-疏水-指数(N)落在以下范围内:10≤N<24;(3)各R1或R1'的基团-疏水-指数(1n)落在以下范围内:4<1n<12,当存在时,各R2、R2'、R3、R3'、R5、R5'和R*的基团-疏水-指数(2n、3n、5n和*n)落在以下范围内:0≤2n、3n、5n、*n<12,且当存在时,各R4或R4'的基团-疏水-指数(4n)落在以下范围内:0≤4n≤5;(4)该组合物含有大于约5体积%或更多的有机溶剂;(5)该组合物含有低于0.1M或高于1.0M的不同于调节和控制组合物的pH所需的pH缓冲剂的盐。
本文所用的"低有机溶剂含量"一般性地指在例如包含根据本发明的中性两性离子非表面活性置换剂化合物的水性“载体”组合物中的有机溶剂含量为低于约25体积%。在一个实施方案中,水性“载体”组合物的有机溶剂含量含有低于约20体积%的任何有机溶剂。在一个实施方案中,水性“载体”组合物的有机溶剂含量含有低于约15体积%的任何有机溶剂。在一个实施方案中,水性“载体”组合物的有机溶剂含量含有低于约10体积%的任何有机溶剂。在一个实施方案中,水性“载体”组合物的有机溶剂含量含有低于约5体积%的任何有机溶剂。在一个实施方案中,水性“载体”组合物不含有机溶剂。
在一个实施方案中,有机溶剂是甲醇(CH3OH或MeOH)、乙醇(C2H5OH或EtOH)或乙腈(CH3CN或MeCN)中的一种或者两种或更多种的混合物。在一个实施方案中,水性“载体”组合物含有适当的有机溶剂的混合物。在一个实施方案中,水性“载体”组合物不含有机溶剂。
可以使用手性被分析物、手性置换剂和手性色谱基质来实施疏水性置换色谱法。在这些条件下,可以使用手性置换剂,但不能使用手性置换剂的外消旋混合物。还可以使用非手性色谱柱和非手性置换剂来纯化外消旋的手性被分析物。在这种情况下,将包括非对映异构体在内的杂质从所关注的外消旋化合物中去除,但没有对映体的手性拆分。
本文所述的某些中性两性离子置换剂具有带有连接的四个不同基团的季氮并因此是固有手性的;参见例如下表V中的外消旋置换剂化合物722、736、755。此外,某些中性两性离子置换剂含有与非手性氮原子连接的单一的手性基团;参见例如置换剂化合物731。通过适当地选择手性色谱基质、流动相和非手性置换剂,常规地制备拆分(分离)对映体。取决于具体的环境,当在手性固定相上进行对映体的置换分离时,相对于好的非手性置换剂,好的、对映纯的手性置换剂可以具有操作上的优势。
可用的pH范围–取决于带电荷的部分的化学性质,具有通式A或B的多种类型的中性两性离子疏水性置换剂具有不同的可用的pH范围。含有可脱质子化的阳离子基团的中性两性离子疏水性置换剂应当在低于实际pKa值1-2单位以上的pH下操作。含有可质子化的阴离子基团的阴离子疏水性置换剂应当在高于实际pKa值1-2单位以上的pH下操作。
·鎓基团-通常,季铵、季鏻、叔锍、叔氧化锍和相关的阳离子基团,例如吡啶鎓、咪唑鎓、胍鎓,具有很宽的可用pH范围,1-11或更大,因为这些基团在正常条件下不具有可脱质子化的N-H、S-H或P-H部分。
·胺和胍基团–具有可脱质子化的N-H部分的脂肪族叔胺(pKa~9.5)和相关的取代的胍(pKa~13.5)当在低于实际pKa值1-2单位以上的pH下操作时是有用的阳离子基团。
·磺酸盐基团–通常,脂肪族磺酸盐(pKa~-2.0)和芳香族磺酸盐(pKa~-2.5)由于其非常低的pKa值而具有宽的可用的pH范围,1-11。
·羧酸盐基团–通常,简单脂肪族羧酸盐(pKa~3.0-5.0)、芳香族羧酸盐(pKa~2.5-4.5)、包括甜菜碱(pKa~2.0)在内的甘氨酸衍生物以及包括高甜菜碱(pKa~3.5)在内的β-丙氨酸衍生物当在高于实际pKa值1-2单位以上的pH下操作时是有用的阴离子部分。
·膦酸盐基团–膦酸盐可以是有用的阴离子基团,但其应用由于第二酸解离(pKa2)而复杂化。含有膦酸盐基团的中性两性离子疏水性置换剂应当在高于实际pKa11-2单位以上且同时低于实际pKa21-2个pH单位的pH下操作。类似地,含有膦酸盐基团的置换剂应当在高于实际pKa21-2单位以上的pH下操作,以获得好的色谱行为。通常,简单脂肪族膦酸盐的pKa1和pKa2分别为~2.2和7.7,而简单芳香族膦酸盐的pKa1和pKa2分别为~2.0和7.2。
置换剂结合强度–置换剂应当比样品中所有组分更强地与柱结合或者至少比所有所关注的主要组分更强地结合。一个很好的经验法则是比置换剂更强地结合的样品质量应当不超过1-4%。
最佳的置换剂应当与固定相既不太强也不太弱地结合。适当的结合强度取决于所关注的被分析物和相关联的结合等温线。通常,对于多种不同的柱和待纯化的被分析物,需要具有一定范围结合强度的一系列置换剂。若置换剂结合过强,则获得很差的性能,例如较低的分辨率、较低的被分析物结合能力、难以去除置换剂以及更长的循环时间。若置换剂结合过弱,则可能导致很差的置换队列,其置换剂下方有太多的被置换的被分析物的“拖尾”,或者可能仅有部分的置换或者完全不发生置换。
一个有助于选择具有适当的结合强度的置换剂的方便的、经验法则的方法是,使用与要用于置换实验的类似的柱和流动相,对潜在的置换剂和被分析物实施简单的梯度洗脱色谱法。作为第一次筛选,在60分钟梯度中,置换剂应当比所关注的被分析物晚5-15分钟洗脱。理想的是,可以测量单一被分析物和被分析物的混合物的等温线,但这很耗时且经常不实用。由于其初期在结合等温线上操作,该经验法则的方法不完美,但为进一步的DC优化提供方便的出发点。
可用的结合等温线–除了适当的结合强度之外,可用的疏水性置换剂应当具有带有某些其它可用特征的结合等温线。
(1)置换剂和被分析物分子的单模态(monomodal)凸面向上等温线(朗缪尔型等温线行为)有利于有序地形成全同置换队列并简化方法优化过程。与许多其它不带电荷(非-两性离子)的疏水性置换剂分子的结合等温线相反,这是许多中性两性离子置换剂分子的有用的性质,所述其它不带电荷的疏水性置换剂分子例如芳香族醇(如,取代的苯酚、萘酚、羟基联苯)、脂肪族醇(如,1-十二醇、1,2-十二烷二醇)和不带电荷的脂肪族羧酸(如,肉豆蔻酸),其在较低浓度下行为正常,然后在较高浓度下变成双模态并再次增加(BET型等温线行为)。该结合行为经常来自多层疏水性置换剂的沉积,每一层具有不同的结合特性。该结合行为使置换过程以及其可用的实施大大复杂化。
(2)当置换剂分子在溶液中发生自身缔合时,DC中的色谱结果可能被复杂化。随着浓度增加,与置换剂自身缔合相关的问题变得更严重。同样,中性两性离子疏水性置换剂中的带电荷基团减少或防止水溶液中的自身缔合问题。
(3)当产物和/或杂质等温线在更高的非线性结合区域与置换剂等温线交叉时,可能产生进一步的复杂性。该行为导致置换顺序的反转,加宽置换带之间的重叠区域和与共-置换相关的问题。在这种情况下,置换剂浓度的微小变化会导致置换队列的大变化,从而使得很难进行方法优化。
我们已经发现,补充有适当的反离子和少量所选的有机溶剂的适当设计的疏水性中性两性离子置换剂分子提供一系列有效的疏水性中性两性离子置换剂,其具有朗缪尔型结合行为和有用的结合强度范围。
离子-配对试剂–由于其所有这许多优势,疏水性置换剂分子应当具有用于被分析物的好的离子-配对试剂以及用于中性两性离子疏水性置换剂的好的离子配对-盐。离子-配对阴离子是具有较强的离子-配对阴离子和较弱的离子-配对阳离子的盐。离子-配对阳离子是具有较弱的离子-配对阴离子和较强的离子-配对阳离子的盐。离子-配对盐是其中阴离子和阳离子均具有较强的离子-配对性质的盐。在实践中,若阴离子和阳离子均具有过强的离子-配对性质,则其在水中不能很好地溶解。离子-配对盐除了对接近其pI的中性两性离子置换剂和两性离子被分析物之外与本发明几乎没有关联。pI是“等电点”,其是任何两性离子化合物(经常为蛋白质或肽)的pH或pH值的范围,在该pH或pH值的范围,正电荷的数目等于负电荷的数目且整个两性离子化合物具有净零电荷。
离子-配对试剂显著影响置换剂的结合等温线和置换剂的功能和应用。通过添加适量的离子-配对阴离子的K+、NH4 +、质子化的胺盐或离子-配对阳离子的Cl-/HCO2 -盐,独立地调节离子-配对试剂的浓度。带电荷的疏水性置换剂的离子-配对反离子的性质强烈影响其置换性质。对中性两性离子疏水性置换剂也是如此,但程度较低。在溶液中,离子-配对中可能涉及少数反离子,而在疏水性色谱基质上的吸附状态中,离子-配对中涉及几乎所有反离子。对于好的色谱分辨率,应当对置换剂和被分析物使用相同的离子-配对反离子。可用的离子-配对反离子通常为带有单电荷的。由于它们较高的溶剂化能量,二价离子(SO4 2-、Ca2+)和三价离子(PO4 3-、La3+)通常不那么有用,但可以用在某些专门的情况下。该一般规则的例外是诸如ˉO3S(CH2)4SO3ˉ和Me3N+(CH2)4N+Me3的单一有机离子中隔开的多个带有单一电荷的部分。
具有更高疏水性的反离子倾向于增加结合强度并降低溶解性。此外,当使用疏水性置换剂盐时,若反离子本身过于疏水或者过于亲水,则DC的分辨率可能下降。通常,反离子的中等的疏水/亲水特性给出最好的结果,但这根据被纯化的分子而变化。对于每次纯化,应当通过实验来确定最佳的反离子。例如,具有CH3CO2ˉ反离子的疏水性季铵置换剂给出好的溶解性和中等的分辨率,CF3CO2ˉ给出中等的但可接受的溶解性和好的分辨率,且CCl3CO2ˉ给出差的溶解性和中等的分辨率。挥发性离子-配对试剂很方便地减压去除,而非挥发性试剂很容易通过诸如渗滤、沉淀或结晶的其它方式去除。表I给出了可用的一价离子-配对阴离子的部分列表。表II给出了可用的一价离子-配对阳离子的部分列表。当使用质子化的胺(pKa~9.8-11.0)、质子化的脒(pKa~12.5)或质子化的胍(pKa~13.5)离子-配对试剂时,操作pH应当比各胺的pKa低1-2个pH单位。当使用阴离子性离子-配对试剂时,操作pH应当高于各自酸的pKa1-2个pH单位以上。该指南的一个值得注意的例外是三氟乙酸,其同时作为离子-配对试剂和pH缓冲剂起作用。
表I.离子-配对强度的近似顺序的一价阴离子
弱 氟化物<氢氧化物<葡萄糖酸盐<甘油酸盐<乙醇酸盐<乳酸盐
中等 甲酸盐<乙酸盐<碳酸氢盐<丙酸盐<丁酸盐<甲烷磺酸盐<乙烷磺酸盐<二氟乙酸盐<氯化物
中强 溴化物<三氟乙酸盐<二氯乙酸盐<硝酸盐
强 三氟甲磺酸盐<碘化物<二溴乙酸盐<硫氰酸盐<三氯乙酸盐<高氯酸盐<六氟异丁酸盐<五氟丙酸盐<四氟硼酸盐<六氟磷酸盐<三溴乙酸盐
表II.离子-配对强度的近似顺序的一价阳离子
Na+<K+~NH4 +<MeNH3 +
MeNH3 +<EtNH3 +<nC3H7NH3 +<nC4H9NH3 +<nC5H11NH3 +<nC6H13NH3 +
MeC(NH2)2 +<EtC(NH2)2 +<nC3H7C(NH2)2 +<nC4H9C(NH2)2 +<nC5H11C(NH2)2 +<nC6H13C(NH2)2 +
Me2NC(NH2)2 +<EtMeNC(NH2)2 +<nC3H7MeNC(NH2)2 +<nC4H9MeNC(NH2)2 +<nC5H11MeNC(NH2)2 +<nC6H13MeNC(NH2)2 +
Me2NH2 +<EtNMeH2 +<nC3H7NMeH2 +<nC4H9NMeH2 +<nC5H11NMeH+<nC6H13NMeH2 +
Me2NH2 +<Et2NH2 +<(nC3H7)2NH2 +
Me3NH+<EtNMe2H+<nC3H7NMe2H+<nC4H9NMe2H+<nC5H11NMe2H+<nC6H13NMe2H+
Me3NH+<Et2NMeH+<(nC3H7)2NMeH+
Me3NH+<Et3NH+<(nC3H7)3NH+
Me4N+<EtNMe3 +<nC3H7NMe3 +<nC4H9NMe3 +<nC5H11NMe3 +<nC6H13NMe3 +
Me4N+<Me2N+Et2<Me2N+C4H8<(nC3H7)2NMe2 +
Me4N+<Et3NMe+<(nC3H7)3NMe+
Me4N+<Et4N+<(nC3H7)4N+
估计阴离子与RP基质的铵离子对辅助的结合的指南
·疏水性和增强的结合随着脂肪族碳原子的数目增加。
·对于相同数目的脂肪族碳原子,伯铵基团比季铵基团更好地增强被分析物结合(正丁基-NH3 +>Et2NH2 +>EtMe2NH+>Me4N+)。
·对于相同数目的脂肪族碳原子,直链基团比支链基团更好地增强被分析物结合(正丁基>异丁基)。
·对于相同数目的脂肪族碳原子,直链基团比环状基团更好地增强被分析物结合(正戊基>环戊基)。
·对于某些化学部分,铵离子和某些被分析物之间的氢结合增强被分析物结合,例如,伯铵与磷酸盐二酯(寡核苷酸)以及胍盐与羧酸盐(含Asp-和Glu-的肽)的结合。
混合的反离子经常导致色谱分辨率的损失且通常要避免。然而,当可以使用混合反离子时有一组条件;即,当(a)所关注的反离子比存在的其它反离子具有显著更强的离子-配对性质,且(b)所关注的反离子在样品加载混合物中和在置换剂缓冲剂中以化学计量过量存在时。
最常用的离子-配对阴离子是甲酸盐、乙酸盐、氯化物、溴化物和三氟乙酸盐。由于较低的离子-配对强度,甲酸盐和乙酸盐要求小心的优化,以获得好的分辨率。溴化物和三氟乙酸盐似乎对于低pH下的肽给出最好的结果。通常,用氯化物和溴化物作为离子-配对反离子可以获得好的色谱结果,但应当采取两个特殊的预防措施。(1)在酸性条件下,色谱溶液不能通过氦净化或真空脱气来脱气,这是由于气态HCl或HBr的损失从而改变pH并改变阴离子的浓度。通过使用脱气的蒸馏水来制备色谱溶液并将溶液保存在封闭的容器中以防止空气再吸收来克服该问题。(2)氯化物和溴化物对不锈钢HPLC装置有潜在腐蚀性,但有PEEK、特氟龙、陶瓷、玻璃和钛制成的装置是安全的。主要问题是卤化物催化的低pH下由空气(氧气)引起的不锈钢的腐蚀。若HPLC溶液被适当地脱氧,则卤化物促进的不锈钢的腐蚀被大大降低。
为了简化潜在耗时的离子-配对试剂的筛选,以下推荐用作各被分析物的初始出发点:
·肽和小蛋白(pH=2.0-3.5):Br-、CF3CO2 -
·肽和小蛋白(pH=6.5-8.0):Me4N+、Me3NH+、Me3NEt+、Me2EtNH+
·寡核苷酸(pH=6.5-8.0):nC4H9-NH3 +、nC5H11-NH3 +、nC6H13-NH3 +
·DMT-On寡核苷酸(pH=7.0-8.0):EtNH3 +、Et3NH+
溶解性–在“疏水性色谱法”中,或者更恰当地说,在“疏溶剂性色谱法”(其中主要的溶剂组分是水)中,潜在的疏水性置换剂分子经常具有有限的溶解性。疏水性分子通常不在水中溶解至任何可感知的程度,除非有“亲水性基团”连接至该疏水性分子,例如带电荷的离子性基团、亲水性反离子、一个或多个作为氢键供体或受体起作用的极性基团。芳香族分子由于其中π-电子作为弱的氢键受体的独特方式而与水以独特的形式相互作用。此外,芳香族分子可以在水溶液中以面对面π-堆叠而啮合(engage)。这些小的但重要的效果反映在苯(9mM)和萘(200μM)在水中相对于环己烷(~10μM)和反式-萘烷(<1μM)的较高溶解度中以及苯酚(960mM)和α-萘酚(7mM)相对于未羟基化的芳烃的较高溶解度中。可用的置换剂分子的分子结构应当有助于在水中和在具有低有机含量的水中合理的溶解度(10-50mM),但同时足够疏水,从而其与固定相很强地结合。通常,带电荷的置换剂分子由于带电荷的物质(尤其是反离子)的溶剂化能量增加而比中性分子具有更好的溶解性质。这要求物理和化学性质的独特平衡,以便中性两性离子分子表现为好的置换剂。中性两性离子疏水性置换剂显示出独特的溶解性。与典型的阴离子和阳离子化合物不同,中性两性离子置换剂化合物经常随着盐浓度增加而增加在水中的溶解度。该反常的“盐溶”效应允许中性两性离子化合物被用作HIC色谱中的置换剂。此外,水性置换剂缓冲剂中少量的乙醇可以显著增加溶解性,而类似量的已经几乎没有效果。
一般说来,很重要的是注意,增加有机溶剂的水平以补偿差的置换剂溶解性很少得到有用的结果。用0-25%有机溶剂或更优选的2-15%有机溶剂获得最好的色谱结果。在某些情况下可以使用流动相中更高的有机含量(25-75%),但容量和分辨率经常会受到很大影响。
降低的产物-置换剂缔合–疏水性置换色谱法可能发生的一个问题是疏水性置换剂与疏水性被分析物在溶液中的缔合。这可能导致分辨率的显著损失和污染。在固定相上成吸附状态的置换剂-被分析物缔合也可能发生,但由于适量的离子-配对试剂的存在而不那么成问题。应对该问题的一个好方法是使用带电荷的被分析物和具有相同电荷的带电荷的疏水性置换剂。当中性疏水性置换剂和中性疏水性被分析物相互作用时,有时可以发生这些问题,但当中性置换剂具有两性离子性质时,该问题不那么常见。
置换剂自身缔合与胶束形成–在一些情况下,当化学结构和物理性质有益时,中性两性离子疏水性分子可以自身缔合,在溶液中形成胶束和类胶束自身缔合结构。这种情况可以导致DC中分辨率的损失以及置换剂溶液的不期望的发泡。溶液中的置换剂以各种形式存在,这些形式通过各种化学平衡而相互关联。此外,胶束可以作为疏水性被分析物分子的载体而起作用,导致它们在溶液中以各种形式存在。这种不期望的现象是浓度依赖性的且通过添加少量的适当的有机溶剂例如甲醇、乙醇或乙腈来有效地抑制。适当设计的中性两性离子置换剂分子不增强(disenhance)胶束形成并给出更好的置换结果。本文所述的中性两性置换剂分子比中性非两性离子置换剂分子远远更不易于在溶液中形成自身缔合结构。因此,对于R-基团R1-R3,保持基团疏水指数低于12.0降低不期望的去垢性的问题。
高纯度–置换剂中的杂质–置换剂应当以足够的纯度使用。制备色谱的目的是从所关注的组分中去除杂质。期望的化合物被与置换剂本身缔合的杂质污染很少是个问题,但在某些情况下,被置换剂溶液中的“早期置换”杂质污染可能是成问题的,这取决于杂质的量及其结合性质。因此,好的置换剂应当含有很少量的早期置换杂质或不含早期置换杂质。
适当的UV吸收–为了在整个DC实验中跟踪置换剂的位置和量,以观察置换剂穿透曲线并在柱再生操作中跟踪置换剂去除,使置换剂具有中等的紫外吸收是有用的。由于置换剂和被分析物的高浓度,既不需要也不优选高吸收。通常,优选无色置换剂,其UV光谱具有战略性定位的与被分析物的UV吸收的区域对应的低吸收窗口,从而可以在某些频率跟踪被分析物并在其它频率监测置换剂。
易于制造和成本–方便的和有成本效益的化学合成、生产和制造方法是重要的,以便以合理的成本生产可用的置换剂。此外,需要实用的纯化方法,尤其是非-色谱纯化,以便以有成本效益的方式达到纯度要求。
化学稳定性、低毒性和长寿命–除了其所有其它期望的化学和物理性质之外,可用的置换剂分子应当是化学稳定的。它应当对被分析物分子是惰性的,且对水、常用的有机溶剂、温和的碱、温和的酸和氧(空气)是化学稳定的(非-反应性的)。它在通常的使用和储存条件下应当是光-稳定的和热稳定的且具有合理的寿命。优选置换剂分子是视觉上无色的,但具有必要水平的UV吸收。对于疏水性置换色谱,染料通常不用作可用的置换剂。可用的置换剂分子还需要具有低毒性,这不仅保护工作者还保护可能与置换剂接触的生物和药物样品。
适当的色谱柱:尽管最常用的反相柱类型是十八烷基涂布的硅胶,但很多疏水性固定相可以用于DC中。适当的固定相的实例列于表III中。最终,对于所研究的每个系统,固定相的最佳选择通过实验确定。
表III.用于疏水性固定相的材料
●涂布的多孔硅胶(共价键合的硅烷)
·十八烷基(C18) ·十二烷基(C12)
·辛基(C8) ·己基(C6)
·丁基(C4) ·五氟苯基丙基(C6F5-C3)
·苯基丙基(Ph-C3) ·苯基己基(Ph-C6)
·p-联苯(Ph-Ph) ·β-萘基乙基(Nap-C2)
●未涂布的多孔聚苯乙烯/二乙烯基苯
●多孔氟碳聚合物
●多孔聚十八烷基甲基丙烯酸酯聚合物
●类碳相:
·多孔石墨化碳
·清洁的炭
·多孔氧化锆上的碳
·与多孔氧化锆上的碳键合的C18
●无机氧化物上的有机聚合物涂层
●混合模式疏水相
·具有负表面电荷的C18
·具有正表面电荷的C18
·具有埋藏的负电荷的C18
·具有埋藏的正电荷的C18
用给出更好的回收和收率的更长的、很好地装填的柱在置换色谱法中获得更好的结果。表IV提供了初始选择柱尺寸和初始流速的指引。
表IV.色谱柱尺寸
a)500mm或2x250mm
b)初始流速=75cm/hr(12.5mm/min);需要优化
适当的柱长度对于好的结果是很重要的。它应当足够长,以完全改进置换队列并给出好的分辨率。然而,过长的柱不必要地增加分离时间并可能具有装填很差的床和降低的分辨率。在很多情况下,两个装填很好的较短的柱可以头尾相连获得好的色谱结果。相当多的利用小分子(MW<3KDa)的实验表明,最佳的柱长度落在以下范围内:对于5μm颗粒为15-45cm且对于10μm颗粒为20-60cm。孔径为的多孔颗粒适于传统的药物和小肽,的孔径适于中等的和大的寡肽和寡核苷酸且 的孔径适于大多数蛋白和DNA。可以使用非-多孔的颗粒,但加载容量会显著下降。
在圆柱形柱中,重要的是建立平面的流动前沿,使得其垂直于流动的轴。在置换色谱法中,一旦已经在较小的柱上形成了优化的方案,则按比例放大以纯化更大量的样品是简单易行的。在发现可接受的最短的柱长度之后,通过增加柱直径同时保持恒定的线性流速而简单地实现按比例放大。经适当的修改,可以用径向流动柱和用轴向流动整体柱来使用置换色谱法。置换色谱法的原理还可以适用于分析和制备薄层色谱。
运行成功的置换色谱法实验
尽管有机化合物、传统药物和肽的置换色谱法已被进行了很多年,但经常获得中等至差的结果。本文所公开的好的置换剂、好的柱和好的操作方案产生优异的重复性和非常好的色谱性能。
置换剂和浓度–使用具有适当的结合强度的好的通用中性两性离子置换剂来进行初始的评价。可以使用中性两性离子置换剂来纯化阳离子、中性非离子、中性两性离子和阴离子被分析物。置换剂应当比待纯化的物质与柱更强地结合,但置换剂不应当过强地结合。通常的置换剂浓度为10-50mM的范围。起初,置换剂浓度被设定为10-15mM。根据需要,向置换剂溶液中添加pH缓冲剂和离子-配对试剂。除了置换剂的存在以及离子-配对盐的浓度之外,置换剂溶液和载体溶液应当具有相同的组成(包括pH)。置换剂713、738和753(参见下表V)是好的通用中性两性离子置换剂的实例。在方法优化过程中,将置换剂浓度增加至20-30mM或更高可能是有帮助的。
选择离子-配对试剂–不使用离子-配对试剂、使用无效的离子-配对试剂、使用混合的离子-配对试剂以及使用不足水平的好的离子-配对试剂是置换色谱实验中差的色谱性能的主要原因中一些。表I和II含有可用于疏水性色谱的可用的一价离子-配对阴离子和离子-配对阳离子的列表。当被分析物或置换剂带电荷时需要它们。对于带电荷的被分析物和置换剂,结合等温线强烈地取决于反离子的化学性质及其浓度。我们的数据也已显示,具有中性两性离子置换剂的离子-配对盐导致锐度更高的置换带,伴随与疏水性固定相的增强的结合。那些具有中等至中强的结合性质的离子-配对试剂通常是可用的最好的。当用离子-配对试剂开始实验时,尝试溴化物或三氟乙酸盐(游离酸或NH4 +盐)作为离子-配对阴离子并尝试K+、NH4 +或质子化的单-、二-或三甲基胺(游离碱或甲酸盐)作为离子-配对阳离子。在初始实验中由甲基铵三氟乙酸盐([MeNH3][CF3CO2])出发。当被分析物需要离子-配对试剂时,它通常在DC实验中规定IP试剂的选择。用于被分析物和置换剂的离子-配对试剂(盐)应当相同。
离子-配对试剂的浓度–如之前所注意到的,使用不足水平的好的离子-配对试剂是置换色谱法实验中差色谱性能的一个主要原因。以下给出用于计算样品溶液中离子-配对试剂的适当浓度(CIPS,mM))的公式:
CIPS=EsxCs(mM)xGs
其中Es是样品的过量因子,Cs是样品的浓度(mM)且Gs是操作pH下样品的净电荷的绝对值。Es的最佳值是需要实验确定的参数。以下给出用于计算置换剂溶液中离子-配对试剂的适当浓度(CIPD,mM)的公式:
CIPD=EdxCd(mM)xGd
其中Ed是置换剂的过量因子,Cd是置换剂的浓度(mM)且Gd是操作pH下置换剂的净电荷的绝对值。Ed的最佳值是需要实验确定的参数。关键是,溶液中存在至少化学计量量的离子-配对试剂(Es≥1.0和Ed≥1.0)。在实践中,我们的经验是Es应当为1.1-10.0的范围,更优选1.2-6.0的范围,还更优选1.5-4.5的范围。此外,我们的经验是Ed应当为1.1-10.0的范围,更优选为1.2-4.0的范围。当离子-配对浓度未优化或者过低时,即Es<1.0和/或Ed<1.0时,导致色谱性能的严重恶化。
接近其等电点的肽或蛋白质或者中性两性离子置换剂的情况下,Gs和Gd接近于零。然而,我们发现,在某些有用的浓度下的离子-配对盐(带有离子-配对阴离子的离子-配对阳离子)显著增强肽/蛋白质(pH~pI)和中性两性离子置换剂的置换带的锐度,从而导致更好的置换纯化。
在下文的实施例2中,用离子-配对盐比不用离子-配对盐获得更好的结果。肽pH6.0具有两个1+电荷和两个1-电荷,其净电荷接近于零。置换剂在pH=6.0具有一个1+电荷和一个1-电荷,其净电荷接近于零。通过假定Gs为2且Gd为1,获得好的色谱结果。
选择RP柱–对于初期的反相工作,应当评价若干质量好的硅胶上的十八烷基或硅胶上的苯基己基柱(5μm球状颗粒,尺寸为4.6x250mm)。按比例放大至更大的制备柱可以随后进行,且相对容易。关键问题是选择适当的孔径。具有过大或过小的孔的基质经常导致容量降低并且有时分辨率降低。参见上文的表III和IV。
流速–因为置换色谱法是“准-平衡技术”,所以经常需要相对慢的流速。最佳的流速是不损失分辨率的可能的最快流速。样品加载流速和置换流速应当大致相同,均在35-105cm/hr的范围内。对于传统的药物、寡肽和寡核苷酸由75cm/hr开始,或者对于蛋白质和DNA由40cm/hr开始。再生流速应当为置换流速的2-8倍。当在反相柱上在升高的温度下纯化药物、肽或寡核苷酸时,甚至可以使用更快的流速。
温度–因为反相色谱和其它形式的疏水性色谱在很大程度上被+TΔS与+ΔH驱动,所以更高的温度经常导致更强的结合、更快的结合动力学和明显不同的分辨率。因此,应当小心地调节柱的温度以及在某种程度上置换缓冲剂的温度(+/-0.5℃)以防止带变宽。初始工作经常在25℃下进行,然后如果样品可以承受则尝试升高的温度(45,65℃),且有机溶剂的沸点是合适的。
选择有机溶剂–尽管大多数与水混溶的有机溶剂会起作用,但最经常使用乙腈、甲醇和乙醇。在很少有机溶剂或根本无有机溶剂存在的条件下进行某些DC纯化。这允许用低盐和低有机溶剂进行实际的未变性的蛋白质的RPC和HIC纯化。当存在与挥发性易燃溶剂相关的安全问题时,在无有机溶剂的条件下操作也可以是有用的。在实验时,首先对肽、低分子量有机药物和小蛋白质尝试乙腈,或者对大蛋白质、寡核苷酸和DNA尝试甲醇。若样品在水中的溶解度可以接受,则由载体缓冲剂、置换剂缓冲剂和样品加载溶液中的3%v/v MeCN、4%v/v EtOH或5%v/v MeOH开始;这三种溶液中的有机含量应当相同。有机溶剂含量是对于每个样品、柱和置换剂需要优化的重要参数。对于通用操作,有机溶剂应当低于约15体积%,更优选低于约10体积%,还更优选约5体积%。当使用十八烷基柱时,对于基质的最佳功能,通常需要2-3体积%乙腈、3-4体积%乙醇或4-5体积%甲醇。苯基己基和辛基柱通常可以承受不存在有机溶剂的条件。
选择pH和pH缓冲剂–当样品、置换剂、离子-配对试剂中或固定相上存在可电离的质子时,需要pH缓冲剂。某些样品仅在特定pH范围内稳定。对于某些样品,色谱分辨率是强pH-依赖性的。通常,使用中性两性离子置换剂和阳离子缓冲剂纯化阳离子样品。与阳离子缓冲剂缔合的阴离子应当与离子-配对阴离子相同。在某些情况下,可以使用不同的阴离子,只要其具有显著更弱的离子-配对性质。类似地,如果阴离子pH缓冲剂具有比主要离子-配对阴离子(principle ion-pairing anion)弱得多的离子-配对性质,则可以使用阴离子pH缓冲剂;因此,当三氟乙酸盐是离子-配对阴离子时,可以使用甲酸或乙酸作为pH缓冲剂。由于显而易见的原因,具有低pKa值的中性和阳离子胺是有用的pH缓冲剂:N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(5.9,TMEDA)、N,N-二甲基哌嗪(4.2,DMP)、二氮杂双环辛烷(3.0,DABCO)。
类似地,使用中性两性离子置换剂和阴离子pH缓冲剂纯化包括阴离子样品。与阴离子pH缓冲剂缔合的阳离子应当与离子-配对阳离子相同,但在某些情况下可以是具有显著更弱的离子-配对性质的阳离子。此外,有时可以使用阳离子pH缓冲剂,但仅当它们具有比主要的离子-配对阳离子更弱的离子-配对性质时;因此,当三甲基铵或三乙基铵是离子-配对阳离子时,有时可以使用N-甲基吗啉(7.4,NMM)、三乙醇胺(7.8,TEOA)和TRIS(8.1)作为pH缓冲剂。具有中间范围pKa值的阴离子化合物可以是有用的pH缓冲剂:TAPS(8.4)、TAPSO(7.6)、甲基膦酸(7.6,MPA)、MOPS(7.2)、MOPSO(6.9)、磷酸(6.8)、单甲基磷酸(6.3)、亚磷酸(6.3)、MES(6.2)、3,3-二甲基戊二酸(5.9,DMG)、琥珀酸(5.2,SUC)、乙酸(4.6,HOAc)。
共-置换–当处理含有数百个组分和杂质的样品时,共-置换几乎是不可避免的现象,因为不管DC实验发生在结合等温线的任何地方,都很有可能存在若干与主要的受关注组分共-置换的次要组分。幸运的是,置换色谱法中的共-置换远远没有制备洗脱色谱中的共-洗脱问题那么严重。共-置换在两种条件下发生:(1)当结合等温线如此类似,使得产生差的分辨率时,以及(2)当在结合等温线的操作区域附近存在结合等温线的交叉时。幸运的是,存在简单的方法来应对该问题:通过
a.改变置换剂的浓度,
b.改变至具有不同结合形式不同置换剂,
通过在结合等温线的不同点操作而在不同的条件下进行第二DC实验。
或者,可以通过以下来改变等温线本身:
c.改变色谱基质(固定相),
d.改变有机溶剂的浓度,
e.改变至不同的有机溶剂,
f.改变至不同的离子-配对试剂,
g.改变温度。
第二“正交”IP-RP DC步骤通常以优异的收率(90-95%)给出优异的纯度(~99.5%)。
样品加载方法–使用两种方法之一经由样品注射阀将样品加载到柱上。应当在前沿色谱条件下在结合等温线上进行DC实验的同一点处加载样品。在加载样品后,载体不经过柱。方法1:使用样品加载泵;方法2:使用注射环。通常,仅使用部分环注射(partial loop injection)。环中的样品应当首先被载体然后被置换剂溶液驱出环到柱上。不超过85-95%的环体积应当被加载到柱上,从而不加载被载体稀释的样品。
柱加载–在相对高的加载下进行DC实验,通常在最大加载容量的60-80%范围内。有效柱加载容量不是固定的数字;而是取决于DC实验在结合等温线的何处进行操作。
不是所有的柱容量都可以利用(参见下文的“例外”)。在实践中,仅90-98%的柱容量是可用的。一旦样品已被加载到柱上,随后就将置换剂缓冲剂泵送到柱上。形成有三种前沿,其各自以不同的速度沿柱行进:(1)液体前沿(T1,置换剂缓冲剂减去置换剂),(2)样品前沿(T2)以及(3)置换剂饱和前沿本身(T3)。第一前沿比第二和第三前沿行进得更快且限定了可用的柱容量,因为第一前沿应当在置换队列(T2)开始出来之前离开柱。各前沿的实际速度直接取决于置换流速。前沿速度的比例α,Vel1/Vel2,由下式给出:
α=Km/(RxCd)
其中Km是置换剂浓度为Cd时基质的置换剂结合容量(每mL装填的基质的置换剂mg数),其中Cd是置换剂缓冲剂中的置换剂浓度(每mL置换剂缓冲剂的置换剂mg数),R是柱中液体的体积与柱的总体积的比例(每mL床体积的液体mL数)。最大%可用柱容量由下式给出:
(100x(α-1))/α
在下文的实施例2中,各自的α-值是21.98,且各自的最大可用容量为95.4%。注意,随着Cd增加,Km也会增加,但若在等温线的非线性部分的高处运行时,不会增加很多。因此,α会降低且最大%可用柱容量会降低。
对于前述内容有例外。若样品中存在显著水平的不期望的、初期置换的杂质,可以通过将柱过加载并在置换剂流开始之前在样品加载期间将这些杂质移除来增加柱的可用容量,甚至超过100%。因此,基于整个样品,柱加载可以为最大值的105%,但基于主要产物的量加上后期置换的杂质,柱加载可以仅为80%。
样品溶液的浓度和体积–加载样品的浓度是一个重要的操作参数。最佳的样品加载浓度(mg/mL)与来自置换实验的经纯化产物的输出浓度(置换队列的平台区域)相同。结合等温线、柱结合容量和输出浓度是初始未知的。使用如下所示的初始估算,用加载到柱上的样品溶液简单地进行第一次置换实验:
(1)选取希望工作的初始柱加载百分数,例如75%。
样品加载时间=置换剂穿透时间(T3-T1)x0.75
=(434min-220min)x0.75=161min
(对于下文的实施例2)
(2)通过两种方法之一选取样品的初始浓度:
(a)初始样品浓度(mg/mL)=0.25x置换剂浓度(mM)x式量(mg/μmole)
=0.25x10mM x1.7466mg/μmole=4.37mg/mL(对于下文的实施例2)
(b)对于样品选取估算的柱结合容量,例如50mg样品/mL基质。假定置换流速和样品加载流速相同:
初始样品浓度(mg/mL)=(柱结合容量(mg/mLm)x柱体积(mLm)/((T2-T1)x样品流速(mL/min))
=(50mg/mLmx4.155mLm)/((434min-220min)x0.208mL/min)
=4.67mg/mL
(对于下文的实施例2)
若用加载的样品进行的第一次DC实验导致过加载条件(>100%加载),则在一半的样品浓度下重新运行实验。从使用样品的第一次成功的DC实验的结果,很容易计算实际加载浓度和实际柱加载容量,且这些值随后用于调节用于第二次DC实验的样品浓度和加载。
样品制备–以上文所述的浓度和量制备加载样品溶液。为了过量填充该环或者填充样品加载泵和递送线路的死体积,需要足够过量的溶液。pH、pH缓冲剂的量和有机溶剂的量与载体和置换剂缓冲剂相同。将样品溶解在载体中改变其pH,因此样品溶液的pH必须在溶解后再次调节。然而,离子-配对试剂的量可以不同。样品溶液中所用的离子-配对试剂必须与置换剂缓冲剂中所用的相同。对此,样品的离子-配对要求规定样品溶液中和置换剂溶液中使用何种离子-配对试剂。基于操作pH下的形式化学电荷以及主要被分析物的浓度,计算离子-配对试剂或离子-配对盐的浓度。参见上文的“离子-配对试剂的浓度”。
样品的组成和历史应当是已知的。若样品含有阴离子或阳离子,则其化学性质和量(浓度)也应当是已知的。(a)显然,若不存在阴离子或阳离子,则在样品制备中不进行调节。(b)若样品中的阴离子/阳离子与DC中所用的离子-配对试剂相同,则相应地减少添加至样品溶液的离子-配对试剂的量。(c)若样品中的阴离子/阳离子的离子-配对性质显著弱于DC中所用的离子-配对试剂,则其存在可以忽略。(d)若样品中的阴离子/阳离子的离子-配对性质强于DC中所用的离子-配对试剂,则阴离子/阳离子应当在处理之前被交换或去除。
收集馏分–置换色谱法给出优异的色谱分辨率,尤其是使用好的C18-反相柱采用优化的方案时。然而,分辨率很难观察到,因为所有的带作为置换队列中背靠背的带而一起从柱中出来。许多小杂质的三角形带的宽度小于30秒(<100μL)。因此,对于置换剂穿透时间为250分钟且样品加载为80%的实验,置换队列会为约200分钟宽,且必须提取超过400个馏分,从而在馏分收集过程中不损失色谱分辨率。分析400个馏分确实有启发且有趣,但也是令人生畏的工作。这时,在线实时馏分分析会是有用的。在实践中,可以稍微不理会分辨率,而仅收集100-130个较大的馏分。即便是该数目的馏分的分析也代表相当大量的工作。
在进行制备DC实验且仅关注纯化的主要组分的情况下,馏分收集过程被大大简化。基于在不同频率(UV)下观察的置换队列的形状,判断所关注的主要带的开始和结束,然后在这两个区域中分析约10个馏分,以便确定要汇集哪些馏分。分析20个馏分而不是100-130个馏分是更容易的工作。
在下文的实施例2中,分析甚至更容易。基于以上的方法,判断所关注的主要带的开始和结束,不经过分析而进行保存性汇集且对最终汇集物仅进行一次分析。
置换剂去除和柱再生–使用5-10倍柱体积的95/5(v/v)乙醇-水或80/10/10(v/v/v)乙腈-正丙醇-水而不使用任何pH缓冲剂或离子-配对试剂来去除置换剂。目的是在最短的时间内有效地从柱中去除>99.9%或更多的置换剂。若基质可以承受增加的反压(back-pressure),则增加流速(100-400cm/hr)以加速柱再生过程。在置换剂的吸收最大值(参见置换剂说明)附近观察置换剂的去除允许通过UV检测而小心地监控和优化再生过程。
添加的盐的效果–水性溶剂中的盐使得溶剂对溶解的疏水性被分析物和疏水性置换剂不那么友好,导致与疏水性色谱基质更强的结合。这是疏水性-相互作用色谱(HIC)背后的原理。只要被分析物在盐溶液中的溶解性足够,则盐的添加是调节被分析物对疏水性基质的结合和选择性的良好方式。如以前所注意到的,中性两性离子疏水性置换剂在这方面是独特的。与典型的阴离子或阳离子化合物不同,中性两性离子置换剂化合物经常随着盐浓度的增加而增加溶解性。该反常的“盐溶”效应允许中性两性离子化合物被用作HIC色谱中的置换剂。
在某些情况下,被分析物与疏水性基质的结合是如此弱,使得需要添加的盐以获得足够的被分析物结合。常用的盐溶液包括浓度为约0.5至约2.5M的(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4、NaCl和KCl中的一种。在各种浓度的许多不同盐的帮助下,置换模式的HIC为有用的蛋白质色谱分离提供许多选择。
仪器方案–参见实施例1的示例性方案(双泵操作)。因为来自先前试验的残余置换剂是潜在的问题,所以该方案具有线路清洗操作、快速柱再生和平衡操作以确保HPLC系统和柱在临加载样品之前完全清洁并适当地平衡。这些步骤仅仅是警戒性的,但不总是必要的。该方案在单一的方案中包括(a)预-平衡程序,(b)平衡程序,(c)样品加载程序,(d)置换程序,和(e)再生程序。为了克服与系统中的死体积相关的问题,所有加载的缓冲剂、置换剂缓冲剂和样品溶液均在临泵送至柱上之前被经过系统冲洗至废液中。通过这种方式,在紧随阀门切换之后,柱中会出现未稀释的溶液的尖锐前沿。样品溶液应当被脱气,使得在其中不形成气泡。当使用注射环时,它们需要被过填充约10%。过填充可以被收集用于进一步应用。不应当使用满环注射,仅使用部分环注射。经验要求,根据环管路的内径,仅可以使用85-95%的环体积,因为样品溶液与驱动溶液混合并将其稀释。环中的样品被加载缓冲剂驱动到柱上,但将近样品加载过程的末尾,将驱动溶液换成置换剂缓冲剂。这允许在临将置换剂缓冲剂本身直接泵送到柱上之前将置换剂缓冲剂冲洗经过系统。在再生过程的初始部分,使用较慢的流速。因此,与高反压相关的问题很少发生。一旦大部分置换剂被去除,则可以使用较高的流速。
方法优化–对于所有形式的制备色谱,色谱方法和操作的优化都是很重要的,但它需要一些实验。置换色谱法的益处经常伴随着价格–时间。可以在方法优化过程中使耗时因素最小化。
·确定置换纯化的近最佳条件而不考虑分离的时间。
·增加置换剂浓度和样品加载溶液的浓度直至分辨率下降。
·增加置换流速和样品加载流速直至分辨率下降。
·缩短预-平衡程序和置换剂去除/柱再生程序。
现存的方案为方法优化提供有用的起点,但它们会需要针对被研究的具体样品进行修改。下文示出一个样品方案(实施例1),其已被针对纯度进行了优化,而不考虑时间。重要的是进行适应于所关注的样品的具体物理性质和色谱性质的方法优化。在优化后,较长的处理时间(600-800min)经常可以降至200-300分钟,且在某些情况下降至100-150分钟。
以置换模式使用的疏水性色谱具有(a)高基质生产率(在基质的寿命期间内每升基质的产物克数),(b)高体积生产率(每升柱体积的产物克数),(c)高溶剂生产率(每升所用溶剂的产物克数),但(d)可能具有中等的时间生产率(每单位时间的产物克数)。适当的方法优化减轻时间因素。
适当配置的仪器:以下给出用于小制备HPLC系统的典型的仪器配置。
·主泵:不锈钢、钛、陶瓷、PEEK;精确的0.01-10mL/min流速;3000-4500psi压力。
·任选的柱旁路阀门:双位、六通开关阀(不锈钢、PEEK);柱串联(column inline)或旁路柱。这是方便选项。
·要求的样品注射阀:用于注射环或样品注射泵的双位、六通注射阀(不锈钢、PEEK)。
·注射环:20-40mL注射环(不锈钢、PEEK)。环应当被过加载(~10%)。仅使用部分环注射,通常不超过环体积的85-95%。使用注射环或样品泵中的一个。
·样品泵:这类似于用于样品注射的主泵。样品应当与泵头的流程(flow path)相容。使用注射环或样品泵中的一个。对于双泵操作,应当校准两个泵的流速,使得它们的流速可以匹配。
·无梯度混合器:在置换色谱法中绕过或去除梯度混合器。
·UV检测器:多波长或光-二极管-阵列检测器,200-400nm频率范围,具有短程、低体积石英流动池(0.2-2.0mm流程,<10μL流动体积)。
·任选的电导检测器:UV检测器之后的电导检测器,具有流动池,0.1-200mS,<100μL流动体积;在<500μL/min的置换流速下收集用于分析的馏分时的旁路电导流动池。
·馏分收集器:通过时间或通过滴数的10μL至10mL的每个馏分。
·柱冷却器/加热器:0-100℃+/-0.5℃。若柱在显著不同于环境温度的温度下操作,需要进行设置,以加热或冷却缓冲剂溶液。
实施例1:用于纯化粗合成α-内啡肽的置换方案
仪器配置:主泵(1)具有4条缓冲剂线路,样品加载泵(2)具有1条溶剂线路,泵选择器阀门,柱旁路阀门(Column Bypass Valve)
泵选择器阀门:6-通阀,其由单通道切换逻辑(single-channel toggle logic)控制(S3=0,泵1至柱-泵2至废液;S3=1,泵1至废液-泵2至柱)
柱阀门:6-通阀,其由单通道切换逻辑控制(S6=0,液体流经柱;S6=1,液体流绕过柱)
柱之后的UV光二极管阵列检测器(流动池:0.5mm流程,9μL体积),随后是电导检测器(流动池:170μL体积);当收集馏分用于分析时,去除电导流动池。
加载缓冲剂=泵1上的A-线(S1=1-流动开,S1=0-流动关);置换剂缓冲剂=泵1上的B-线(S2=1-流动开,S2=0-流动关);置换剂去除缓冲剂=泵1上的C-线(S4=1-流动开,S4=0-流动关);柱储存缓冲液=泵1上的D-线(S5=1-流动开,S5=0-流动关);样品溶液=泵2上的A-线(S7=1,样品流动开,S7=0,样品流动关)。将样品溶液过滤(0.2μ)并脱气。
在程序开始之前,将清洁的柱简单地用A-缓冲剂冲洗,以去除柱储存缓冲剂。对于细节的描述,参见实施例2。
置换剂去除缓冲剂(C-缓冲剂)=乙腈中的10%(v/v)1-丙醇、10%(v/v)DI水。
柱储存缓冲剂(D-缓冲剂)=含有甲酸(15mM)和甲酸铵(15mM)的70/30(v/v)甲醇/水。
实施例2:使用置换剂740–中性两性离子置换剂在pH6.0,pH~pI进行粗合成α-内啡肽的置换色谱法纯化(参见图示1A)
操作条件:
起始肽:脱盐的粗合成α-内啡肽(样品B),59.3%纯度,FW~1.7466mg/μmole,pH=6.0下的电荷=~0(+2/-2)。
柱:Waters Xbridge BEH130,5mm,4.6x250mm SS,硅胶上的-C18。
流速:加载=208μL/min;置换=208μL/min
离子-配对盐:甲基铵三氟乙酸盐
温度=23℃ pH=6.0
置换剂缓冲剂:10.0mM置换剂740+20mM MES(酸)+含有5%(v/v)EeOH的20mM三氟乙酸的DI水溶液,pH=6.0含有40%MeNH2。
加载缓冲剂:20mM MES(酸)+含有5%(v/v)EeOH的20mM三氟乙酸的DI水溶液,pH=6.0含有40%MeNH2。
样品溶液:含有5%(v/v)EeOH的6.88mg/mL肽的DI水溶液,20mM MES(酸)+20mM三氟乙酸;pH=6.0含有40%MeNH2。
加载量:226.1mg,来自加载泵(泵2);加载时间=158.0min.(2.63hr)
馏分量:416μL;5μL甲酸添加至每个馏分–pH降低至3.5;将馏分立即冷冻(-20℃)直至分析或汇集。
结果:
馏分分析:不进行馏分分析。基于置换痕迹的形状,将纯化的馏分保存性汇集。
使用分析洗脱HPLC-IPRP色谱对汇集的产物进行分析。在215nm监测馏分;计算是基于面积%。
总运行时间:6.2hr
输出浓度:7.02mg/mL
柱加载:基于全部样品的最大容量的73.4%;
柱容量:~74.1mg肽/mL基质@7.02mg肽/mL溶液,基于总样品~107μmole置换剂/mL基质@15.0μmole置换剂/mL溶液
纯度%:99.0%
收率%:74%;数据基于保存性馏分汇集,不经过馏分分析;实际收率很可能更高(80-85%)。
评述:样品浓度/输出浓度=0.98
样品中的IP盐=化学计量量的2.5倍(假定Gs=2)。
使用小“分析型”柱在一步中以合理的加载容量(74.1g/L)、优异的纯度和合理的收率(99.0%纯度@>74%收率)由粗肽获得了好的结果。该实施例被设计为显示使用中性两性离子置换剂进行的粗合成肽的纯化,其中pH~pI(pH=6.0)。在其不存在时获得好的结果(数据未示出),但使用离子-配对盐([MeNH3][CF3CO2])导致锐度更高的置换色谱。离子-配对盐的20mM浓度是基于Gs=2、Es=2.5、Gd=1、Ed=2.0的假设;参见上文。含有5vol%EtOH的溶剂和5vol%MeCN给出略好的结果(数据未示出)。置换剂置换带和肽置换带相当尖锐。与使用阳离子置换剂在pH=2.0下的置换结果(数据未示出)相比,使用两性离子置换剂在pH=6.0下的这些结果以略微较低的加载容量(74g/L vs84g/L)给出略高的纯度(99.0%vs98.8%);收率不可比。
实施例3:HPLC分析-
方法3a,3b–用于中性两性离子的反相:使用装备有与Dionex/ESABiosciences(Chelmsford,MA)Corona Plus CAD检测器串联的Waters996PDA检测器和Waters Xbridge BEH130,5μm,4.6x250mm SS,硅胶上的-C18,反相色谱柱(Chelmsford,MA)的Waters公司(Milford,MA)梯度HPLC进行分析。
样品注入:25μL在A缓冲剂中的~1mM样品溶液
UV检测:208-220nm,取决于待分析的化合物
流速:1.0mL/min。
A缓冲剂:含有0.1%(v/v)三氟乙酸的5%CH3CN(v/v)在HPLC-级蒸馏水中。
B缓冲剂:含有0.1%(v/v)三氟乙酸的5%H2O(v/v)在HPLC-级CH3CN中。
调查梯度法:100%A 0-2min
100%A至100%B 2-62min
100%B 62-70min
分析梯度法:
方法3c–用于长链烷基卤化物的反相:
与10a、10b相同
样品注入:25μL在A缓冲剂中的~1mM样品溶液
UV检测:200-220nm,取决于待分析的化合物
流速:1.0mL/min。
A缓冲剂:含有0.1%(v/v)三氟乙酸的5%CH3CN(v/v)在HPLC-级蒸馏水中。
B缓冲剂:含有0.1%(v/v)三氟乙酸的5%H2O(v/v)在HPLC-级CH3CN中。
梯度法:50%A/50%B 0-2min
50%A/50%B至100%B 2-62min
100%B 62-70min
实施例4:N-苄基-N-甲基辛基胺(fw=233.39)的制备。
在装配有加热套、机械搅拌器、250mL加料漏斗、回来冷凝器和特氟龙涂布的热电偶的1L4-颈圆底烧瓶中,将254.5g新鲜蒸馏的N-甲基苄基胺(2.1mole,fw=121.18,~271mL)添加至350mL搅拌的乙腈中。反应在氮气气氛下进行,伴随缓慢的N2吹扫。将135.2g新鲜蒸馏的1-溴辛烷(0.70mole,fw=221.19,~121mL)逐滴添加至搅拌的混合物,添加速率为使得反应放热使反应温度保持在55-65℃的范围。在这些条件下,溴辛烷添加需要约2小时。在添加全部溴辛烷且反应温度降至低于45℃之后,将搅拌的反应混合物加热至80℃保持2hr,然后使其冷却。通过HPLC周期性地监测反应混合物,以便确保溴辛烷被完全消耗。随着反应冷却,开始形成不那么稠(less dense)的产物的上层。在反应冷却至环境温度后,向搅拌的混合物滴加100mL蒸馏水,以有利于相分离和防止胺氢溴酸盐的结晶。将反应混合物转移至1L分液漏斗中然后冷却至约-20℃保持2小时,以便达到完全的相分离。将下层弃去,并将上层保留在漏斗中。添加1.0L10%w/w NaOH的蒸馏水溶液,将混合物充分混合,然后使其沉降约1小时。各相再次分离,保留上层产物相,向混合物添加1.0L蒸馏水并充分混合。约2小时后各相分离,并将上层产物相置于旋转蒸发仪中(80℃浴温)以便除去水、乙腈和某些残余的起始胺。该操作得到143g(88%)的淡黄色粘稠液体,纯度为96-98%(GC,HPLC)。主要杂质是起始胺(2-4%)。该物质被真空蒸馏(172-175℃,1托),得到90%蒸馏收率的无色液体(99.8%纯度)。这是清洁的反应,若起始的仲胺和伯烷基氯化物本身是纯的,则其产生高质量的产物。
实施例5:N-苄基-N-甲基-N-正辛基甘氨酸内盐(fw=291.43)的制备
将116.7g蒸馏的N-苄基-N-甲基辛基胺(0.50mole,fw=233.39,132mL)添加至装配有机械搅拌器、250mL加料漏斗和特氟龙涂布的热电偶的500mL4-颈圆底烧瓶中。反应在氮气气氛中无溶剂的存在下进行,伴随缓慢的N2吹扫。在环境温度下在约45分钟的时间内向搅拌的胺逐滴添加84.2g蒸馏的溴代乙酸甲酯(0.55mole,fw=152.97,54mL)。存在少量但可注意到的放热。搅拌初始为均一的反应混合物直至其变得过于粘稠(约1小时)。在15分钟内,形成粘稠的下层产物层。使该混合物在室温下静置20小时,在此期间内整个混合物变成黄色粘稠油状物质。倾出过量的烷基化剂,并用MTBE将粘稠的油小心洗涤数次。弃去MTBE洗涤物。使用旋转蒸发仪除去残余的MTBE,得到粗粘稠黄色油。在室温下将该水溶性油状产物溶解在350mL蒸馏水中,得到澄清的淡黄色溶液。在环境温度下,向聚丙烯烧瓶中所含的搅拌的水性混合物滴加75g的45%KOH水溶液。在室温下几乎立即发生酯皂化。将混合物短暂加热至80℃(30分钟)以确保反应完全。使用旋转蒸发仪完全除去溶剂(水),产生粘性的淡黄色产物残余物。将该产物溶解在最少量的异丙醇中,然后过滤,以除去白色固体(KBr)。将澄清的滤液用MTBE研磨(triturated),形成淡黄色油。倾出溶剂,并将油状产物用MTBE洗涤,将其弃去。使用旋转蒸发仪除去产物中残余的MTBE。将油溶解在最少量的无水乙醇中,然后用水研磨。倾出水/醇溶剂,得到粘稠的无色液体。再进行一轮异丙醇/MTBE研磨随后乙醇/水研磨。将产物在真空烘箱中干燥过夜,并冷却至室温,形成纯产物,其为不含溶剂的无色粘稠的油(117g,80%收率)。该物质是分析纯的且在蒸馏水中具有有限的但足够的溶解性。在无机盐(KBr,NaCl)和有机盐([MeNH3][CF3CO2])的存在下,水溶性显著增加。在环境温度下静置后,油缓慢固化,形成蜡状低熔点固体。
类似地由溴代丙酸甲酯产生β-丙氨酸衍生物;初始的季铵溴化物是白色晶体状固体,但水解的两性离子是粘稠的液体。用乙腈中的胺进行与丙烷磺内酯和丁烷磺内酯的反应;在反应完全后,除去溶剂且处理是类似的。在95/5wt%乙醇/水中进行与溴代乙烷磺酸钠的反应。分离出大部分的C11、C10和C9化合物,其为低熔点固体。分离出大部分C8和C7化合物,其为粘稠的液体,其中一些缓慢固化。
Claims (21)
1.通过反相置换色谱法从混合物分离有机化合物的方法,包括:
提供疏水性固定相;
向所述疏水性固定相施加包含待分离的有机化合物的混合物;
通过向所述疏水性固定相施加包含非-表面活性疏水性中性两性离子置换剂分子的水性组合物而从所述疏水性固定相置换所述有机化合物;以及
收集从所述疏水性固定相洗脱的含有被分离的有机化合物的多个馏分;
其中所述非-表面活性疏水性中性两性离子置换剂分子包含具有以下通式的疏水性中性两性离子:
[CM-R*-CM’]
其中在所述通式中,CM为独立的带有形式正(+)电荷的疏水性化学部分,其选自:季铵(I)、季鏻(II)、锍(III)、氧化锍(IV)、咪唑啉鎓(脒鎓)(V)、胍鎓(VI)、咪唑鎓(VII)、1,2,3,4-四氢异喹啉鎓(VIII)、1,2,3,4-四氢喹啉鎓(IX)、异吲哚啉鎓(X)、吲哚啉鎓(XI)、苯并咪唑鎓(XII)、吡啶鎓(XIIIa、XIIIb、XIIIc、XIIId)、喹啉鎓(XIV)、异喹啉鎓(XV),且CM’为独立的带有形式负(-)电荷的疏水性化学部分,其选自:羧酸盐(XVI)、N-酰基-α-氨基酸(XVII)、磺酸盐(XVIII)、硫酸盐单酯(XIX)、磷酸盐单酯(XX)、磷酸盐二酯(XXI)、膦酸盐单酯(XXII)、膦酸盐(XXIII)、四芳基硼酸盐(XXIV)、硼酸盐(XXV)、硼酸盐酯(XXVI);其中所述化学部分(I)-(XXVI)具有以下化学结构:
其中在所述通式中,CM和CM’为独立的带有相反的形式电荷的带电荷的化学部分,使得所述分子作为整体是在操作pH下带有零形式电荷的电中性两性离子,且CM和CM’通过双连接的化学部分R*而彼此化学地连接,其中R*替换CM上的一个R1、R2(若存在)、R3(若存在)或R4(若存在)化学部分且替换CM’上的一个R1'、R2'(若存在)、R3'(若存在)或R4'(若存在)化学部分;
其中各R1、R1'、R2、R2'、R3、R3'、R4和R4'是独立地由下式定义的直链或支链的化学部分,
-CxX2x-2r-AR1-CuX2u-2s-AR2,
R*是直接化学键或是由下式定义的双连接的直链或支链的化学部分,
-CxX2x-2r-AR1-CuX2u-2s-,
且R5为由下式定义的直链或支链的化学部分,
-CxX2x-2r-AR2;
其中各AR1独立地为双连接的亚甲基部分(-CX1X2-,衍生自甲烷)、双连接的亚苯基部分(-C6G4-,衍生自苯)、双连接的亚萘基部分(-C10G6-,衍生自萘)或双连接的亚联苯基部分(-C12G8-,衍生自联苯);
其中AR2独立地为氢(-H)、氟(-F)、苯基(-C6G5)、萘基(-C10G7)或联苯基(-C12G9);
其中各X、X1和X2各自独立地为-H、-F、-Cl或-OH;
其中任意-CxX2x-2r-内或任意-CuX2u-2s-内或任意-(CX1X2)p-内的任意亚甲基部分(-CX1X2-)可以各自独立地被独立的醚-氧原子-O-、独立的硫醚-硫原子-S-或独立的酮-羰基-C(O)-替换,其方式为使得各醚-氧原子、各硫醚-硫原子或各酮-羰基的每一侧与脂肪族碳原子或芳香族碳原子键合;
其中任何-CxX2x-2r-内或任何-CuX2u-2s-内可替换有不超过两个醚-氧原子、不超过两个硫醚-硫原子和不超过两个酮-羰基;
其中mx是各-CxX2x-2r-中被醚-氧原子、硫醚-硫原子和酮-羰基替换的亚甲基的总数目,且mu是各-CuX2u-2s-中被醚-氧原子、硫醚-硫原子和酮-羰基替换的亚甲基的总数目;
其中G各自独立地为-H、-F、-Cl、-CH3、-OH、-OCH3、-N(CH3)2、-CF3、-CO2Me、-CO2NH2;-CO2NHMe、-CO2NMe2的任意组合;
其中G*各自独立地为-F、-Cl、-R2、-OH、-OR2、-NR2R3、-CF3、-CO2Me、-CO2NH2;-CO2NHMe、-CO2NMe2的任意组合;
其中一对R2、R2'、R3、R3'、R4和R4'可以包含单独的化学部分,从而R2/R3、R2/R4、R3/R4、R2’/R3’、R2’/R4’或R3’/R4’各自独立地为-(CX1X2)p-,其中p=3、4、5或6;
其中对于各R1、R1'、R2、R2'、R3、R3'、R4、R4'、R5和R*,各x、r、u、s、mx、mu的整数值独立地选择,整数值r和s是所含的分离的顺式/反式烯类(烯烃)基团的总数加上所含的简单单环结构的总数且落在以下范围内:0≤r≤2和0≤s≤2,数值x+u-mx-mu落在以下范围内:0≤x+u-mx-mu≤11;
其中在CM或CM’内含有至少一个芳香族化学部分、杂环芳香族化学部分、咪唑啉化学部分、脒化学部分或胍化学部分;
其中各R化学部分的基团-疏水-指数(n)在数值上等于脂肪族碳原子的数目加上烯类碳原子的数目加上硫醚-硫原子的数目加上氯原子的数目加上氟原子的数目的五分之一加上醚-氧原子的数目的一半加上酮-碳原子的数目的一半加上数目超过六个的芳香族碳原子的数目的一半的总和减去超过一个的羟基氧原子的数目;
其中各[CM-R*-CM’]的总-疏水-指数(N)在数值上等于脂肪族碳原子的数目加上烯类碳原子的数目加上硫醚-硫原子的数目加上氯原子的数目加上氟原子的数目的五分之一加上醚-氧原子的数目的一半加上酮-碳原子的数目的一半加上数目超过六个的芳香族碳原子的数目的一半的总和减去超过一个的羟基氧原子的数目;
其中R1和R1’的各基团-疏水-指数(1n和1’n)落在以下范围内:4.0<1n,1’n<12.0,当存在时,R2、R2’、R3、R3’、R5、R5’、R*的各基团-疏水-指数(2n、2’n、3n、3’n、5n、5’n和*n)落在以下范围内:0.0≤2n、2’n、3n、3’n、5n、5’n、*n<12.0,且当存在时,R4和R4’的各基团-疏水-指数(4n和4’n)落在以下范围内:0.0≤4n,4’n≤5.0;
其中总-疏水-指数(N)落在以下范围内:10.0≤N<24.0;
其中对于环状化学部分所计算的基团-疏水-指数的数值平均分配在两个分别的R化学部分之间;
其中当仅有一个R化学部分连接至CM或CM’时,R1被识别为该R化学部分;其中当有超过一个R化学部分连接至CM或CM’时,R1被识别为具有基团-疏水-指数最大值的该R化学部分;其中当有超过三个R化学部分连接至CM或CM’时,R4被识别为具有基团-疏水-指数最小值的该R化学部分。
2.如权利要求1所述的方法,其中包含非-表面活性疏水性置换剂分子的水性组合物除了pH缓冲剂之外不含有添加的盐。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中CM具有通式I或II:
其中在通式I或II中,R1是C8-C11烃基部分,R2和R3独立地是C1-C4烃基部分或苄基,且R4选自苄基、卤素-取代的苄基、4-烷基苄基、4-三氟甲基苄基、4-苯基苄基、4-烷氧基苄基、4-乙酰氨基苄基、H2NC(O)CH2-、PhHNC(O)CH2-、二烷基-NC(O)CH2-,其中烷基是C1-C4,条件是在CM中不存在超过一个苄基。
4.如权利要求1或2所述的方法,其中CM具有通式I或II:
其中在通式I或II中,R1和R2独立地是C4-C8烷基或环己基,R3是C1-C4烷基,且R4是苯基、2-、3-或4-卤代苯基、苄基、2-、3-或4-卤代苄基、2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-或3,5-二卤代苄基、2,4,6-或3,4,5-三卤代苄基、C6H5CH2CH2-或者2-、3-或4-三氟甲基苄基。
5.如权利要求1或2所述的方法,其中CM具有通式VIII、IX、X或XI,R1是C5-C11烷基且R2是C1-C8烷基。
6.如权利要求1或2所述的方法,其中CM具有通式I或II:
其中在通式I或II中,R1是C6-C11烷基,R2和R3独立地是C1-C4烷基,且R4是PhC(O)CH2-、4-FC6H4C(O)CH2-,4-CH3C6H4C(O)CH2-、4-CF3C6H4C(O)CH2-、4-ClC6H4C(O)CH2-、4-BrC6H4C(O)CH2-、dl-PhC(O)CH(Ph)-、Ph(CH2)2-、Ph(CH2)3-、Ph(CH2)4-、dl-PhCH2CH(OH)CH2-、t-PhCH=CHCH2-、1-(CH2)亚萘基、9-(CH2)蒽基、2-、3-或4-FC6H4CH2-或苄基。
7.如权利要求1或2所述的方法,其中CM具有通式I或II:
其中在通式I或II中,R1是C6-C11烷基,R2和R3一起是-(CH2)4-,且R4是PhC(O)CH2-、4-FC6H4C(O)CH2-、4-CH3C6H4C(O)CH2-、4-CF3C6H4C(O)CH2-、4-ClC6H4C(O)CH2-、4-BrC6H4C(O)CH2-、dl-PhC(O)CH(Ph)-、Ph(CH2)2-、Ph(CH2)3-、Ph(CH2)4-、dl-PhCH2CH(OH)CH2-、t-PhCH=CHCH2-、2-、3-或4-FC6H4CH2-、苄基、3-ClC6H4CH2-、2,6-F2C6H3CH2-、3,5-F2C6H3CH2-、4-CH3C6H4CH2-、4-CH3CH2C6H4CH2-、4-CH3OC6H4CH2-、(CH3)2NC(O)CH2-或(CH3CH2)2NC(O)CH2-。
8.如权利要求1或2所述的方法,其中CM具有通式I或II:
其中在通式I或II中,R1是C4-C6烷基、苄基或者2-、3-或4-FC6H4CH2-,R2和R3独立地是C1-C8烷基、CH3(OCH2CH2)2-、CH3CH2OCH2CH2OCH2CH2-或CH3CH2OCH2CH2-,且R4是Ph(CH2)4-、4-PhC6H4CH2-、4-FC6H4CH2-、4-CF3C6H4CH2-、PhC(O)CH2-、4-FC6H4C(O)CH2-、4-PhC6H4C(O)CH2-、4-PhC6H4CH2-、亚萘基-1-CH2-、蒽基-9-CH2-或Ph(CH2)n-,其中n=5-8。
9.如权利要求1或2所述的方法,其中CM具有通式[(R1R2R3NCH2)2C6H3G]2+,其中R1是C4-C11烷基,R2和R3独立地是C1-C6烷基或者R2和R3一起是-(CH2)4-,且G是H或F。
10.如权利要求1或2所述的方法,其中CM具有通式[R1R2R3NCH2C6H4-C6H4CH2NR1R2R3]2+,其中R1是C4-C11烷基,R2和R3独立地是C1-C6烷基或者R2和R3一起是-(CH2)4-。
11.如权利要求1或2所述的方法,其中CM具有通式III或IV:
其中在通式III或IV中,R1是C8-C11烷基或4,4’-CH3(CH2)4C6H4-C6H4CH2-,R2是C1-C6烷基或4-FC6H4CH2-,且R3是C1-C6烷基。
12.如权利要求1或2所述的方法,其中CM具有通式XIV或XV:
其中在通式XIV或XV中,R1是C8-C11烷基,且各G和R5为如上文所定义。
13.如权利要求1或2所述的方法,其中CM具有通式XIIIa、XIIIb、XIIIc、XIIId或XIIIe:
其中在通式XIIIa、XIIIb、XIIIc、XIIId或XIIIe中,R1是C8-C11烷基或C8-C114-苯基,R2是H、C1-C6烷基或烷氧基、2-吡啶基、C1-C6烷基取代的2-吡啶基或吡咯烷基,且各G为如上文所定义。
14.如权利要求1或2所述的方法,其中CM具有通式VII:
其中在通式VII中,R1是C5-C11烷基,R2和R5独立地是H或C1-C6烷基或苯基。
15.如权利要求1或2所述的方法,其中CM具有通式XII:
其中在通式XII中,R1是C5-C11烷基,R2和R5独立地是H或C1-C6烷基或苯基,且G为如上文所定义。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法,其中CM'具有通式XXIV或XXV:
其中在通式XXIV中,R1是苯基、4-EtC6H4-、4-nPrC6H4-、4-nBuC6H4-、4-MeOC6H4-、4-FC6H4-、4-MeC6H4-、4-MeOC6H4-、4-EtC6H4-、4-ClC6H4-或C6F5-;且各R2、R3和R4独立地为苯基、4-FC6H4-、4-MeC6H4-、4-MeOC6H4-、4-EtC6H4-、4-ClC6H4-或C6F5-;且
其中在通式XXV中,R1是4-(4-nBuC6H4)C6H4-或4-(4-nBuC6H4)-3-ClC6H3-。
17.如权利要求1-15中任一项所述的方法,其中CM'具有选自以下的通式:4-R1C6H4SO3H、5-R1-2-HO-C6H3SO3H、4-R1-C6H4-C6H3X-4’-SO3H和4-R1-C6H4-C6H3X-3’-SO3H,其中R1是CH3(CH2)n,其中n=4-10且X是H或OH。
18.如权利要求1-15中任一项所述的方法,其中CM'具有通式XVIII或XXIII:
其中在通式XVIII中和在通式XXIII中,R1是C6H5(CH2)n-,其中n=5-11。
19.如权利要求1-15中任一项所述的方法,其中CM'具有选自以下的通式:5-R1-2-HO-C6H3CO2H和R1C(O)NHCH(C6H5)CO2H,其中R1是CH3(CH2)n-,其中n=4-10。
20.如权利要求1-15中任一项所述的方法,其中CM'具有通式4-R1C6H4PO3H2,其中R1是CH3(CH2)n-,其中n=4-10。
21.如前述任一权利要求所述的方法,其中所述水性组合物进一步包括有机溶剂,其量为低于约25体积%,或低于约20体积%,或低于约15体积%,或低于约10体积%,或低于约5体积%。
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