CN103958018B - 用于疏水性置换色谱法的阳离子置换剂分子 - Google Patents

Abstract

通过反相置换色谱法从混合物中分离有机化合物的方法，包括提供疏水性固定相；向疏水性固定相施加包含待分离的有机化合物的混合物；通过向疏水性固定相施加包含非表面活性疏水性阳离子置换剂分子和约10wt％以下的有机溶剂的水性组合物而从疏水性固定相置换有机化合物；以及收集从疏水性固定相洗脱的含有被分离的有机化合物的多个馏分；其中所述非表面活性疏水性阳离子置换剂分子包含疏水阳阴离子和反离子CI，其具有如说明书中所定义的通式A或B：[CM][CI]_d[CM-R*-CM’][CI]_dAB。

Description

用于疏水性置换色谱法的阳离子置换剂分子

背景技术

置换色谱法(DC)是三种已知的柱色谱形式——洗脱色谱法、置换色谱法、前沿色谱法——之一。DC主要是一种制备方法，但也有使用具有填充的“窄孔”或毛细管柱的“微制备”DC的分析应用。

当有可用的合适的高纯度置换剂分子时，可以使用四种常规的色谱方法中的任一种来进行置换色谱法。DC用于(a)离子交换色谱(阳离子交换、阴离子交换)，(b)疏水性色谱(反相、疏水相互作用、疏水电荷诱导、嗜硫)，(c)正相色谱，包括亲水相互作用色谱(HILIC)，和(d)固定化金属离子亲和色谱(IMAC)。

采用优化的DC，可以同时获得高纯度(高分辨率)、高回收率(高收率)和高柱加载(高容量)——后者大大高于过载的制备洗脱色谱法。在大多数情况下，这些优势不仅仅补偿了DC的缺点(较慢的流速、较长的运行时间、需要高纯度置换剂)。

通过选择(a)合适的色谱方法、(b)适当的具有合适尺寸的色谱柱、(c)合适的流动相条件、(d)适当的置换剂分子和(e)适当的操作方案与适当配置的LC装置来进行置换色谱法。最初，选择适当的“弱置换的流动相”(载体)，且在适当的流速下使柱平衡。载体可以含有被调节至有用的pH值的pH缓冲化合物。最佳的置换流速倾向于低，通常在35-105cm/hr的范围内，虽然有时候会更高。在样品加载流速下将适量的样品溶液加载到柱上。样品溶液含有载体中的待纯化的物质以及若样品或置换剂分子带有电荷则含有适当水平的离子配对剂。通常的样品加载量为有效穿透容量(operativebreakthroughcapacity)的50-80％。随后，将由适当的置换剂化合物在载体溶液中以适当的浓度制备的置换剂流动相(置换剂缓冲剂)在置换流速下泵送到柱上直至观察到置换剂穿透。纯化的样品在置换剂穿透的前沿之前从柱中出来。收集从柱中出来的馏分，并单独分析其含量和纯度。最后，使用“置换剂去除溶液”从柱中去除置换剂，随后将柱清洁并再生至其原始状态用于保存或用于随后的使用。

尽管不同于洗脱色谱法，但在某些方面，置换色谱法易于理解和易于实施。在DC中，样品被置换剂从柱中“置换”，而不是被流动相从柱中“洗脱”。当在线监测(例如，经UV吸收、pH或电导率)柱的输出时，获得“置换队列(displacementtrain)”，而不是“洗脱色谱图”。置换队列由并列的“置换带(displacementbands)”组成，而不是在色谱图中由溶剂分离的“洗脱峰”组成。当置换带足够大，以至于使固定相饱和时，形成梯形的“饱和带”。当置换带不大到足以使固定相饱和时，形成小的、三角形的“非饱和带”。饱和带的高度通过操作点的结合等温线来确定；梯形带或三角形带的面积与组分的量成正比。

疏水性色谱法几乎完全取决于水的独特的溶剂化性质，这些性质来自该高度结构化的、自身缔合的、氢键结合的液体。对于常规的反相色谱固定相(不带电荷的C₁₈柱)，结合通常由熵驱动(+TΔS)，其经常必须克服不利的焓(+ΔH)。因此，在色谱工作者经常使用的温度范围内(10-70℃)，被分析物结合和置换剂结合经常随着温度增加而增强。疏水性色谱的另一有用的特征是使用添加剂，其改变水基溶剂的自身氢键结合的结构和强度。这些添加剂包括：色谱缓冲剂中的盐(NaCl、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄)、有机溶剂(MeCN、MeOH、EtOH)和极性有机分子(尿素、寡聚乙二醇)。

可以使用手性被分析物、手性置换剂和手性色谱基质来实施疏水性置换色谱法。在这些条件下，可以使用非手性置换剂，但不能使用手性置换剂的外消旋混合物。还可以使用非手性色谱柱和非手性置换剂来纯化外消旋手性被分析物。在这种情况下，将包括非对映异构体在内的杂质从所关注的外消旋化合物中去除，但没有对映体的手性拆分。通过适当地选择手性色谱基质、流动相和非手性置换剂，常规地制备拆分(分离)对映体。取决于具体的环境，当在手性固定相上进行对映体的置换分离时，相对于好的非手性置换剂，好的、对映纯的手性置换剂可以具有操作上的优势。

适当的高纯度置换剂分子的不可得已阻碍了有用的制备疏水性置换色谱的开发。我们在此描述了新的置换剂分子和使用它们的方法，其可用于各种形式的疏水性置换色谱法。

疏水性置换剂分子应当具有化学和物理性质的独特组合，以便使其有效地起作用。某些可溶的疏水性分子可以用作置换剂，但仅有少数几种很好地起作用。本文件所述的很多分子满足对于很好地起作用的置换剂的必要的要求。

由于适当的高纯度置换剂分子的不可得，已阻碍了有用的反相制备置换色谱法的开发。例如美国专利第6,239,262号描述了使用低分子量表面活性化合物作为置换剂的各种反相液相色谱系统。美国专利第6,239,262号公开了极宽范围的可以与疏水性部分偶联以形成用作所公开的置换剂的表面活性化合物的可能的带电荷部分，但公开了必须包括大量的有机溶剂以减轻所公开的置换剂的表面活性。这样大量有机溶剂的存在显著改变了该过程，减少了反相疏水性置换色谱法的益处。此外，美国专利第6,239,262号所公开的表面活性的置换剂化合物不能很好地起作用，导致相对差质量的置换队列，其中在“纯化的”产物中可以存在显著水平的杂质。

发明内容

适当的很好地起作用并可以很容易检测的高纯度置换剂分子的不可得已阻碍了有用的制备疏水性置换色谱的开发。我们在此描述了一类新的阳离子置换剂分子和使用它们的方法，其可用于各种形式的疏水性置换色谱法。

许多商用的小阳离子分子简单地不与疏水性固定相足够好地结合，而许多大阳离子分子确实结合足够好，但缺少足够的溶解性或者受去垢性问题的困扰，这导致较低的分辨率、对被分析物的较低的柱容量和不期望的发泡。我们发现，许多中等大小的阳离子分子在适当地设计时具有化学和物理性质的独特组合，包括适当的UV吸收，以便其作为疏水性置换剂而有效地起作用。足够真实的是，有一些可以作为置换剂起作用的可溶性疏水性分子，但仅有限的一些很好地起作用。本文中描述的许多分子在根据所建立的之后方案而使用时满足对于很好地起作用的置换剂的必要的要求。

我们已发现并开发了很多类带电荷的疏水性有机化合物，其为盐或两性离子，其独特地具有对于疏水性置换色谱法中好的置换剂行为所必需的化学和物理性质的组合。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及通过反相置换色谱法从混合物分离有机化合物的方法，其包括：

提供疏水性固定相；

向所述疏水性固定相施加包含待分离的有机化合物的混合物；

通过向所述疏水性固定相施加包含非表面活性疏水性阳离子置换剂分子和约10wt％以下的有机溶剂的水性组合物而从所述疏水性固定相置换所述有机化合物；以及

收集从所述疏水性固定相洗脱的含有被分离的有机化合物的多个馏分；

其中所述非表面活性疏水性阳离子置换剂分子包含疏水性阳离子和反离子CI，其具有通式A或B：

[CM][CI]_d[CM-R*-CM’][CI]_d

AB

其中在通式A和B中，各CM或CM’独立地为带有形式电荷的疏水性化学部分，所述化学部分选自：季铵(I)、季鏻(II)、锍(III)、氧化锍(IV)、咪唑啉鎓(脒鎓)(V)、胍鎓(VI)、咪唑鎓(VII)、1,2,3,4-四氢异喹啉鎓(VIII)、1,2,3,4-四氢喹啉鎓(IX)、异吲哚啉鎓(X)、吲哚啉鎓(XI)、苯并咪唑鎓(XII)、吡啶鎓(XIIIa、XIIIb、XIIIc、XIIId)、喹啉鎓(XIV)、异喹啉鎓(XV)、羧酸盐(XVI)、N-酰基-α-氨基酸(XVII)、磺酸盐(XVIII)、硫酸盐单酯(XIX)、磷酸盐单酯(XX)、磷酸盐二酯(XXI)、膦酸盐单酯(XXII)、膦酸盐(XXIII)、四芳基硼酸盐(XXIV)、硼酸盐(XXV)、硼酸盐酯(XXVI)；其中所述化学部分(I)-(XXVI)具有以下化学结构：

其中在通式B中，CM和CM’独立地为带有相同或相反的形式电荷的带电荷的化学部分，且通过双连接的化学部分R*而彼此化学地连接，其中R*替换CM上的一个R¹、R²(若存在)、R³(若存在)或R⁴(若存在)化学部分且替换CM’上的一个R¹、R²(若存在)、R³(若存在)或R⁴(若存在)化学部分；

其中各R¹、R²、R³和R⁴是独立地由下式定义的直链或支链的化学部分，

-C_xX_2x-2r-AR¹-C_uX_2u-2s-AR²，

R*是直接化学键或是由下式定义的双连接的直链或支链的化学部分，

-C_xX_2x-2r-AR¹-C_uX_2u-2s-，

且R⁵为由下式定义的直链或支链的化学部分，

-C_xX_2x-2r-AR²；

其中各AR¹独立地为双连接的亚甲基部分(-CX¹X²-，衍生自甲烷)、双连接的亚苯基部分(-C₆G₄-，衍生自苯)、双连接的亚萘基部分(-C₁₀G₆-，衍生自萘)或双连接的亚联苯基部分(-C₁₂G₈-，衍生自联苯)；

其中AR²独立地为氢(-H)、氟(-F)、苯基(-C₆G₅)、萘基(-C₁₀G₇)或联苯基(-C₁₂G₉)；

其中各X、X¹和X²各自独立地为-H、-F、-Cl或-OH；

其中任意-C_xX_2x-2r-内或任意-C_uX_2u-2s-内或任意-(CX¹X²)_p-内的任意亚甲基部分(-CX¹X²-)可以各自独立地被独立的醚-氧原子-O-、独立的硫醚-硫原子-S-或独立的酮-羰基-C(O)-替换，其方式为使得各醚-氧原子、各硫醚-硫原子或各酮-羰基的每一侧与脂肪族碳原子或芳香族碳原子键合；

其中任何-C_xX_2x-2r-或任何-C_uX_2u-2s-内可替换有不超过两个醚-氧原子、不超过两个硫醚-硫原子和不超过两个酮-羰基；

其中m_x是各-C_xX_2x-2r-中被醚-氧原子、硫醚-硫原子和酮-羰基替换的亚甲基的总数目，且m_u是各-C_uX_2u-2s-中被醚-氧原子、硫醚-硫原子和酮-羰基替换的亚甲基的总数目；

其中G各自独立地为-H、-F、-Cl、-CH₃、-OH、-OCH₃、-N(CH₃)₂、-CF₃、-CO₂Me、-CO₂NH₂；-CO₂NHMe、-CO₂NMe₂的任意组合；

其中G*各自独立地为-F、-Cl、-R²、-OH、-OR²、-NR²R³、-CF₃、-CO₂Me、-CO₂NH₂；-CO₂NHMe、-CO₂NMe₂的任意组合；

其中一对R²、R³和R⁴可以包含单独的化学部分，从而R²/R³、R²/R⁴、R³/R⁴、R^2’/R^3’、R^2’/R^4’或R^3’/R^4’各自独立地为-(CX¹X²)_p-，其中p＝3、4、5或6；

其中对于各R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R*，各x、r、u、s、m_x、m_u的整数值独立地选择，整数值r和s是所含的分离的顺式/反式烯类(烯烃)基团的总数加上所含的简单单环结构的总数且落在以下范围内：0≤r≤2和0≤s≤2，数值x+u-m_x-m_u落在以下范围内：0≤x+u-m_x-m_u≤11；

其中在A或B的CM或CM’内含有至少一个芳香族化学部分、杂环芳香族化学部分、咪唑啉化学部分、脒化学部分或胍化学部分；

其中各R化学部分的基团-疏水-指数(n)在数值上等于脂肪族碳原子的数目加上烯类碳原子的数目加上硫醚-硫原子的数目加上氯原子的数目加上氟原子的数目的五分之一加上醚-氧原子的数目的一半加上酮-碳原子的数目的一半加上数目超过六个的芳香族碳原子的数目的一半的总和减去超过一个的羟基氧原子的数目；

其中各[CM]或[CM-R*-CM’]的总-疏水-指数(N)在数值上等于脂肪族碳原子的数目加上烯类碳原子的数目加上硫醚-硫原子的数目加上氯原子的数目加上氟原子的数目的五分之一加上醚-氧原子的数目的一半加上酮-碳原子的数目的一半加上数目超过六个的芳香族碳原子的数目的一半的总和减去超过一个的羟基氧原子的数目；

其中R¹和R^1’的基团-疏水-指数(¹n和^1’n)落在以下范围内：4.0<¹n,^1’n<12.0，当存在时，R²、R^2’、R³、R^3’、R⁵、R^5’、R*的基团-疏水-指数(²n、^2’n、³n、^3’n、⁵n、^5’n和*n)落在以下范围内：0.0≤²n、^2’n、³n、^3’n、⁵n、^5’n、*n<12.0，且当存在时，R⁴和R^4’的基团-疏水-指数(⁴n和^4’n)落在以下范围内：0.0≤⁴n,^4’n≤5.0；

其中总-疏水-指数(N)除以g的值落在以下范围内：10.0≤N/g<24.0；

其中在A中，当带电荷的部分CM具有形式正电荷或形式负电荷时，g＝1，且在B中，当CM和CM’具有形式正电荷时或者当CM和CM’具有形式负电荷时，g＝2，且在B中，当CM具有形式正电荷且CM’具有形式负电荷时，g＝1；

其中对于环状化学部分所计算的基团-疏水-指数的数值平均分配在两个分别的R化学部分之间；

其中当仅有一个R化学部分连接至CM或CM’时，R¹被识别为该R化学部分；其中当有超过一个R化学部分连接至CM或CM’时，R¹被识别为具有基团-疏水-指数最大值的该R化学部分；其中当有超过三个R化学部分连接至CM或CM’时，R⁴被识别为具有基团-疏水-指数最小值的该R化学部分；且

其中CI是非干扰性的、带相反电荷的反离子或这样的反离子的混合物，且d的值为零、正整数或正分数，从而保持整个疏水性化合物的电中性。

在一个实施方案中，包含非表面活性疏水性离子置换剂分子的水性组合物除了pH缓冲剂之外不含有添加的盐。

在一个实施方案中，CM具有通式I或II：

其中在通式I或II中，R¹是C₈-C₁₁烃基部分，R²和R³独立地为C₁-C₄烃基部分或苄基，且R⁴选自苄基、卤素取代的苄基、4-烷基苄基、4-三氟甲基苄基、4-苯基苄基、4-烷氧基苄基、4-乙酰氨基苄基、H₂NC(O)CH₂-、PhHNC(O)CH₂-、二烷基-NC(O)CH₂-，其中烷基为C₁-C₄，条件是在CM中存在不超过一个苄基基团。

在一个实施方案中，CM具有通式I或II：

其中在通式I或II中，R¹和R²独立地为C₄-C₈烷基或环己基，R³为C₁-C₄烷基，且R⁴为苯基、2-、3-或4-卤代苯基、苄基、2-、3-或4-卤代苄基、2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-或3,5-二卤代苄基、2,4,6-或3,4,5-三卤代苄基、C₆H₅CH₂CH₂-或2-、3-或4-三氟甲基苄基。

在一个实施方案中，CM具有通式VIII、IX、X或XI，R¹为C₅-C₁₁烷基且R²为C₁-C₈烷基。

在一个实施方案中，CM具有通式I或II：

其中在通式I或II中，R¹为C₆-C₁₁烷基，R²和R³独立地为C₁-C₄烷基，且R⁴为PhC(O)CH₂-、4-FC₆H₄C(O)CH₂-、4-CH₃C₆H₄C(O)CH₂-、4-CF₃C₆H₄C(O)CH₂-、4-ClC₆H₄C(O)CH₂-、4-BrC₆H₄C(O)CH₂-、dl-PhC(O)CH(Ph)-、Ph(CH₂)₂-、Ph(CH₂)₃-、Ph(CH₂)₄-、dl-PhCH₂CH(OH)CH₂-、t-PhCH＝CHCH₂-、1-(CH₂)亚萘基、9-(CH₂)蒽基、2-、3-或4-FC₆H₄CH₂-或苄基。

在一个实施方案中，CM具有通式I或II：

其中在通式I或II中，R¹为C₆-C₁₁烷基，R²和R³一起为-(CH₂)₄-，且R⁴为PhC(O)CH₂-、4-FC₆H₄C(O)CH₂-、4-CH₃C₆H₄C(O)CH₂-、4-CF₃C₆H₄C(O)CH₂-、4-ClC₆H₄C(O)CH₂-、4-BrC₆H₄C(O)CH₂-、dl-PhC(O)CH(Ph)-、Ph(CH₂)₂-、Ph(CH₂)₃-、Ph(CH₂)₄-、dl-PhCH₂CH(OH)CH₂-、t-PhCH＝CHCH₂-、2-、3-或4-FC₆H₄CH₂-、苄基、3-ClC₆H₄CH₂-、2,6-F₂C₆H₃CH₂-、3,5-F₂C₆H₃CH₂-、4-CH₃C₆H₄CH₂-、4-CH₃CH₂C₆H₄CH₂-、4-CH₃OC₆H₄CH₂-、(CH₃)₂NC(O)CH₂-或(CH₃CH₂)₂NC(O)CH₂-。

在一个实施方案中，CM具有通式I或II：

其中在通式I或II中，R¹为C₄-C₆烷基、苄基或2-、3-或4-FC₆H₄CH₂-，R²和R³独立地为C₁-C₈烷基、CH₃(OCH₂CH₂)₂-、CH₃CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂-或CH₃CH₂OCH₂CH₂-，且R⁴为Ph(CH₂)₄-、4-PhC₆H₄CH₂-、4-FC₆H₄CH₂-、4-CF₃C₆H₄CH₂-、PhC(O)CH₂-、4-FC₆H₄C(O)CH₂-、4-PhC₆H₄C(O)CH₂-、4-PhC₆H₄CH₂-、亚萘基-1-CH₂-、蒽基-9-CH₂-或Ph(CH₂)_n-，其中n＝5-8。

在一个实施方案中，CM具有通式[(R¹R²R³NCH₂)₂C₆H₃G]²⁺，其中R¹为C₄-C₁₁烷基，R²和R³独立地为C₁-C₆烷基或者R²和R³一起为-(CH₂)₄-，且G为H或F。

在一个实施方案中，CM具有通式[R¹R²R³NCH₂C₆H₄-C₆H₄CH₂NR¹R²R³]²⁺，其中R¹为C₄-C₁₁烷基，R²和R³独立地为C₁-C₆烷基或者R²和R³一起为-(CH₂)₄-。

在一个实施方案中，CM具有通式III或IV：

其中在通式III或IV中，R¹为C₈-C₁₁烷基或4,4’-CH₃(CH₂)₄C₆H₄-C₆H₄CH₂-，R²为C₁-C₆烷基或4-FC₆H₄CH₂-，且R³为C₁-C₆烷基。

在一个实施方案中，CM具有通式XIV或XV：

其中在通式XIV或XV中，R¹为C₈-C₁₁烷基，且各G和R⁵为如上文所定义。

在一个实施方案中，CM具有通式XIIIa、XIIIb、XIIIc、XIIId或XIIIe：

其中在通式XIIIa、XIIIb、XIIIc、XIIId或XIIIe中，R¹为C₈-C₁₁烷基或C₈-C₁₁4-苯基，R²为H、C₁-C₆烷基或烷氧基、2-吡啶基、C₁-C₆烷基取代的2-吡啶基或吡咯烷基，且各G为如上文所定义。

在一个实施方案中，CM具有通式VII：

其中在通式VII中，R¹为C₅-C₁₁烷基，R²和R⁵独立地为H或C₁-C₆烷基或苯基。

在一个实施方案中，CM具有通式XII：

其中在通式XII中，R¹为C₅-C₁₁烷基，R²和R⁵独立地为H或C₁-C₆烷基或苯基，且G为如上文所定义。

在一个实施方案中，CM具有通式XXIV或XXV：

其中在通式XXIV中，R¹是苯基、4-EtC₆H₄-、4-ⁿPrC₆H₄-、4-ⁿBuC₆H₄-、4-MeOC₆H₄-、4-FC₆H₄-、4-MeC₆H₄-、4-MeOC₆H₄-、4-EtC₆H₄-、4-ClC₆H₄-或C₆F₅-；且各R₂、R³和R⁴独立地为苯基、4-FC₆H₄-、4-MeC₆H₄-、4-MeOC₆H₄-、4-EtC₆H₄-、4-ClC₆H₄-或C₆F₅-；且

其中在通式XXV中，R¹是4-(4-ⁿBuC₆H₄)C₆H₄-或4-(4-ⁿBuC₆H₄)-3-ClC₆H₃-。

在一个实施方案中，CM具有选自以下的通式：4-R¹C₆H₄SO₃H、5-R¹-2-HO-C₆H₃SO₃H、4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-4’-SO₃H和4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-3’-SO₃H，其中R¹是CH₃(CH₂)_n，其中n＝4-10且X是H或OH。

在一个实施方案中，CM具有通式XVIII或XXIII：

其中在通式XVIII中和在所述通式XXIII中，R¹是C₆H₅(CH₂)_n-，其中n＝5-11。

在一个实施方案中，CM具有选自以下的通式：5-R¹-2-HO-C₆H₃CO₂H和R¹C(O)NHCH(C₆H₅)CO₂H，其中R¹是CH₃(CH₂)_n-，其中n＝4-10。

在一个实施方案中，CM具有通式4-R¹C₆H₄PO₃H₂其中R¹是CH₃(CH₂)_n-，其中n＝4-10。

在一个实施方案中，CI是选自以下的非干扰性阴离子或非干扰性阴离子的混合物：Cl^-、Br^-、I^-、OH^-、F^-、OCH₃ ^-、d,l-HOCH₂CH(OH)CO₂ ^-、HOCH₂CO₂ ^-、HCO₂ ^-、CH₃CO₂ ^-、CHF₂CO₂ ^-、CHCl₂CO₂ ^-、CHBr₂CO₂ ^-、C₂H₅CO₂ ^-、C₂F₅CO₂ ^-、ⁿC₃H₇CO₂ ^-、ⁿC₃F₇CO₂ ^-、CF₃CO₂ ^-、CCl₃CO₂ ^-、CBr₃CO₂ ^-、NO₃ ^-、ClO₄ ^-、BF₄ ^-、PF₆ ^-、HSO₄ ^-、HCO₃ ^-、H₂PO₄ ^-、CH₃OCO₂ ^-、CH₃OSO₃ ^-、CH₃SO₃ ^-、C₂H₅SO₃ ^-、NCS^-、CF₃SO₃ ^-、H₂PO₃ ^-、CH₃PO₃H^-、HPO₃ ^2-、CH₃PO₃ ^2-、CO₃ ^2-、SO₄ ^2-、HPO₄ ^2-、PO₄ ^3-。

在一个实施方案中，CI是选自以下的非干扰性无机阳离子或这样的非干扰性阳离子的混合物：碱金属离子(Li⁺、Na⁺、K⁺、Rb⁺、Cs⁺)、碱土金属离子(Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺)、二价过渡金属离子(Mn²⁺、Zn²⁺)和NH₄ ⁺；其中CI是选自以下的非干扰性有机阳离子或这样的非干扰性阳离子的混合物：质子化的伯胺(1+)、质子化的仲胺(1+)、质子化的叔胺(1+)、质子化的二胺(2+)、季铵盐离子(1+)、锍离子(1+)、氧化锍离子(1+)、鏻离子(1+)、双-季铵盐离子(2+)，其可以含有C₁-C₆烷基和/或C₂-C₄羟基烷基。

附图说明

图1b、2、3、4、5、6b(a)B和7是对于根据本发明的示例性实施方案的置换色谱法过程将馏分数(x-轴)相对于每一馏分中每一组分的浓度(mg/mL)作图得到的置换数据的馏分分析。

图6b(a)A是对于根据本发明的示例性实施方案的置换色谱法过程将时间(x-轴)相对于相对吸收单位(y-轴)作图得到的粗合成肽的纯化的置换痕迹(displacementtrace)。

具体实施方式

本文中针对根据本发明所采用的阳离子非表面活性置换剂化合物所用的“非表面活性”意指所述化合物的临界胶束浓度(“CMC”)大于根据本发明的置换色谱法过程中所采用的化合物的浓度。在一个实施方案中，在不存在有机溶剂、盐或其它会影响CMC的试剂时，非表面活性置换剂化合物的浓度低于该化合物在水中的CMC的约80％。在一个实施方案中，在不存在有机溶剂、盐或其它会影响CMC的试剂时，非表面活性置换剂化合物的浓度低于该化合物在水中的CMC的约60％。在一个实施方案中，在不存在有机溶剂、盐或其它会影响CMC的试剂时，非表面活性置换剂化合物的浓度低于该化合物在水中的CMC的约50％。

在一个实施方案中，包含根据本发明所采用的非表面活性阳离子疏水性置换剂分子的水性组合物由于以下的两种或更多种的组合而不表现出不利的表面活性特征：(1)阳离子非表面活性置换剂化合物以低于其CMC的浓度存在；(2)各[CM]或[CM-R*-CM’]的总-疏水-指数(N)除以g的值落在以下范围内：10≤N/g<24；(3)各R¹的基团-疏水-指数(¹n)落在以下范围内：4<¹n<12，当存在时，各R²、R³、R⁵和R*的基团-疏水-指数(²n、³n、⁵n和*n)落在以下范围内：0≤²n、³n、⁵n、*n<12，且当存在时，各R⁴的基团-疏水-指数(⁴n)落在以下范围内：0≤⁴n≤5；(4)该组合物含有大于约5体积％或更多的有机溶剂。

本文所用的"低有机溶剂含量"一般性地指在例如包含根据本发明的阳离子非表面活性置换剂化合物的水性“载体”组合物中的有机溶剂含量为低于约25％体积比。在一个实施方案中，水性“载体”组合物的有机溶剂含量含有低于约20％体积比的任何有机溶剂。在一个实施方案中，水性“载体”组合物的有机溶剂含量含有低于约15％体积比的任何有机溶剂。在一个实施方案中，水性“载体”组合物的有机溶剂含量含有低于约10％体积比的任何有机溶剂。在一个实施方案中，水性“载体”组合物的有机溶剂含量含有低于约5％体积比的任何有机溶剂。在一个实施方案中，水性“载体”组合物不含有机溶剂。

在一个实施方案中，有机溶剂是甲醇(CH₃OH或MeOH)、乙醇(C₂H₅OH或EtOH)或乙腈(CH₃CN或MeCN)中的一种或者两种或更多种的混合物。在一个实施方案中，水性“载体”组合物含有适当的有机溶剂的混合物。在一个实施方案中，水性“载体”组合物不含有机溶剂。

可以使用手性被分析物、手性置换剂和手性色谱基质来实施疏水性置换色谱法。在这些条件下，可以使用手性置换剂，但不能使用手性置换剂的外消旋混合物。还可以使用非手性色谱柱和非手性置换剂来纯化外消旋的手性被分析物。在这种情况下，将包括非对映异构体在内的杂质从所关注的外消旋化合物中去除，但没有对映体的手性拆分。

本文所述的某些阳离子置换剂具有带有连接的四个不同基团的季氮并因此是固有手性的；参见例如下表V-IX中的外消旋置换剂化合物43-45、50-53、58-59、64-66。此外，某些阳离子置换剂含有与非手性氮原子连接的单一的手性基团；参见例如外消旋置换剂化合物203和206以及衍生自l-苯基丙氨酸的对映纯的置换剂化合物67。通过适当地选择手性色谱基质、流动相和非手性置换剂，常规地制备拆分(分离)对映体。取决于具体的环境，当在手性固定相上进行对映体的置换分离时，相对于好的非手性置换剂，好的、对映纯的手性置换剂可以具有操作上的优势。

可用的pH范围–取决于带电荷的部分的化学性质，具有通式A或B的多种类型的阳离子疏水性置换剂具有不同的可用的pH范围。含有可脱质子化的阳离子基团的阳离子疏水性置换剂应当在低于实际pKa值1-2单位以上的pH下操作。含有可质子化的阴离子基团的阳离子疏水性置换剂应当在高于实际pKa值1-2单位以上的pH下操作。

·鎓基团-通常，季铵、季鏻、叔锍、叔氧化锍和相关的阳离子基团，例如吡啶鎓、咪唑鎓、胍鎓，具有很宽的可用pH范围，1-11或更大，因为它们在正常条件下不具有可脱质子化的N-H、S-H或P-H部分。

·胺和胍基团–具有可脱质子化的N-H部分的脂肪族叔胺(pKa～9.5)和相关的取代的胍(pKa～13.5)当在低于实际pKa值1-2单位以上的pH下操作时是有用的阳离子基团。

置换剂结合强度–置换剂应当比样品中所有组分更强地与柱结合或者至少比所有所关注的主要组分更强地结合。一个很好的经验法则是比置换剂更强地结合的样品质量应当不超过1-4％。

最佳的置换剂应当与固定相既不太强也不太弱地结合。适当的结合强度取决于所关注的被分析物和相关联的结合等温线。通常，对于多种不同的柱和待纯化的被分析物，需要具有一定范围结合强度的一系列置换剂。若置换剂结合过强，则获得很差的性能，例如较低的分辨率、较低的被分析物结合能力、难以去除置换剂以及更长的循环时间。若置换剂结合过弱，则可能导致很差的置换队列，其置换剂下方有太多的被置换的被分析物的“拖尾”，或者可能仅有部分的置换或者完全不发生置换。

一个有助于选择具有适当的结合强度的置换剂的方便的、经验法则的方法是，使用与要用于置换实验的类似的柱和流动相，对潜在的置换剂和被分析物实施简单的梯度洗脱色谱法。作为第一次筛选，在60分钟梯度中，置换剂应当比所关注的被分析物晚5-15分钟洗脱。理想的是，可以测量单一被分析物和被分析物的混合物的等温线，但这很耗时且经常不实用。由于其初期在结合等温线上操作，该经验法则的方法不完美，但为进一步的DC优化提供方便的出发点。

置换剂结合强度–置换剂应当比样品中所有组分更强地与柱结合或者至少比所有所关注的主要组分更强地结合。一个很好的经验法则是比置换剂更强地结合的样品质量应当不超过1-4％。

最佳的置换剂应当与固定相既不太强也不太弱地结合。适当的结合强度取决于所关注的被分析物和相关联的结合等温线。通常，对于多种不同的柱和待纯化的被分析物，需要具有一定范围结合强度的一系列置换剂。若置换剂结合过强，则获得很差的性能，例如较低的分辨率、较低的被分析物结合能力、难以去除置换剂以及更长的循环时间。若置换剂结合过弱，则可能导致很差的置换队列，其置换剂下方有太多的被置换的被分析物的“拖尾”，或者可能仅有部分的置换或者完全不发生置换。

一个有助于选择具有适当的结合强度的置换剂的方便的、经验法则的方法是，使用与要用于置换实验的类似的柱和流动相，对潜在的置换剂和被分析物实施简单的梯度洗脱色谱法。作为第一次筛选，在60分钟梯度中，置换剂应当比所关注的被分析物晚5-15分钟洗脱。理想的是，可以测量单一被分析物和被分析物的混合物的等温线，但这很耗时且经常不实用。由于其初期在结合等温线上操作，该经验法则的方法不完美，但为进一步的DC优化提供方便的出发点。

可用的结合等温线–除了适当的结合强度之外，可用的疏水性置换剂需要具有带有某些其它可用特征的结合等温线。

(1)置换剂和被分析物分子的单模态(monomodal)凸面向上等温线(朗缪尔型等温线行为)有利于有序地形成全同置换队列并简化方法优化过程。与许多其它不带电荷的疏水性置换剂分子(非两性离子)的结合等温线相反，这是许多阳离子置换剂分子的有用的性质，所述其它不带电荷的疏水性置换剂分子例如芳香族醇(如，取代的苯酚、萘酚、羟基联苯)、脂肪族醇(如，1-十二醇、1,2-十二烷二醇)和不带电荷的脂肪族羧酸(如，肉豆蔻酸)，其在较低浓度下行为正常，然后在较高浓度下变成双模态并再次增加(BET型等温线行为)。该结合行为经常来自多层疏水性置换剂的沉积，每一层具有不同的结合特性。该结合行为使置换过程以及其可用的实施大大复杂化。

(2)当置换剂分子在溶液中发生自身缔合时，DC中的色谱结果也被复杂化。随着浓度增加，与置换剂自身缔合相关的问题变得更严重。同样，阳离子疏水性置换剂中的带电荷基团抑制水溶液中的自身缔合问题。

(3)当产物和/或杂质等温线在更高的非线性结合区域与置换剂等温线交叉时，也产生进一步的复杂性。该行为导致置换顺序的反转，加宽置换带之间的重叠区域和与共-置换相关的问题。在这种情况下，置换剂浓度的微小变化会导致置换队列的大变化，从而使得很难进行方法优化。

我们已经发现，补充有适当的反离子和少量有用的有机溶剂的适当设计的阳离子置换剂分子提供一系列有效的疏水性置换剂，其具有朗缪尔型结合行为和有用的结合强度范围。

用于阳离子置换剂的离子-配对阴离子–由于其所有这许多优势，阳离子疏水性置换剂分子具有一个额外的要求：选择好的离子-配对阴离子，CI。离子-配对阴离子显著影响置换剂的结合等温线和置换剂的功能和应用。通过添加适量的离子-配对阴离子的K⁺、NH₄ ⁺、质子化的胺盐或离子-配对阳离子的Cl^-/HCO₂ ^-盐，独立地调节离子-配对试剂的浓度。阳离子疏水性置换剂的离子-配对阴离子的性质强烈影响其置换性质。在溶液中，离子-配对中涉及少数阴离子，而在疏水性色谱基质上的吸附状态中，离子-配对中涉及几乎所有阴离子。对于好的色谱分辨率，应当对置换剂和被分析物使用相同的离子-配对试剂。可用的离子-配对反离子通常为带有单电荷的。由于它们较高的溶剂化能量，二价离子(SO₄ ^2-)和三价离子(PO₄ ^3-)通常不那么有用，但可以用在某些专门的情况下。该一般规则的例外是诸如ˉO₃S(CH₂)₄SO₃ˉ的单一有机离子中隔开的多个带有单一电荷的部分。

具有更高疏水性的阴离子倾向于增加结合强度并降低溶解性。此外，当使用疏水性置换剂盐时，若阴离子本身过于疏水或者过于亲水，则DC的分辨率可能下降。通常，阴离子的中等的疏水/亲水特性给出最好的结果，但这根据被纯化的分子而变化。对于每次纯化，应当通过实验来确定最佳的反离子。例如，具有CH₃CO₂ˉ反离子的疏水性季铵置换剂给出好的溶解性和中等的分辨率，CF₃CO₂ˉ给出中等的但可接受的溶解性和好的分辨率，且CCl₃CO₂ˉ给出差的溶解性和中等的分辨率。挥发性离子-配对试剂很方便地减压去除，而非挥发性试剂很容易通过诸如渗滤、沉淀或结晶的其它方式去除。表I给出了可用的一价离子-配对阴离子的部分列表。当使用阴离子性离子-配对试剂时，操作pH应当高于各自酸的pKa1-2个pH单位以上。该指南的一个值得注意的例外是三氟乙酸，其同时作为离子-配对试剂和pH缓冲剂起作用。

表I.离子-配对强度的近似顺序的一价阴离子

混合的阴离子经常导致色谱分辨率的损失且通常要避免。然而，当可以使用混合阳离子时有一组条件；即，当(a)所关注的阴离子比存在的其它阴离子具有显著更强的离子-配对性质，且(b)所关注的阴离子在样品加载混合物中和在置换剂缓冲剂中以化学计量过量存在时。

最常用的离子-配对阴离子是甲酸盐、乙酸盐、氯化物、溴化物和三氟乙酸盐。由于较低的离子-配对强度，甲酸盐和乙酸盐要求小心的优化，以获得好的分辨率。溴化物和三氟乙酸盐似乎对肽和小蛋白质给出最好的结果。通常，用氯化物和溴化物作为离子-配对阴离子可以获得好的色谱结果，但应当采取两个特殊的预防措施。(1)在酸性条件下，色谱溶液不能通过氦净化或真空脱气来脱气，这是由于气态HCl或HBr的损失从而改变pH并改变阴离子的浓度。通过使用脱气的蒸馏水来制备色谱溶液并将溶液保存在封闭的容器中以防止空气再吸收来克服该问题。(2)氯化物和溴化物对不锈钢HPLC装置有潜在腐蚀性，但由PEEK、特氟龙、陶瓷、玻璃和钛制成的装置是安全的。主要问题是卤化物催化的低pH下由空气(氧气)引起的不锈钢的腐蚀。若HPLC溶液被适当地脱氧，则卤化物促进的不锈钢的腐蚀被大大降低。

溶解性–在“疏水性色谱法”中，或者更恰当地说，在“疏溶剂性色谱法”(其中主要的溶剂组分是水)中，潜在的疏水性置换剂分子经常具有有限的溶解性。疏水性分子通常不在水中溶解至任何可感知的程度，除非有“亲水性基团”连接至该疏水性分子，例如带电荷的离子性基团、亲水性反离子、一个或多个作为氢键供体或受体起作用的极性基团。芳香族分子由于其中π-电子作为弱的氢键受体的独特方式而与水以独特的形式相互作用。此外，芳香族分子可以在水溶液中以面对面π-堆叠而啮合(engage)。这些小的但重要的效果反映在苯(9mM)和萘(200μM)在水中相对于环己烷(～10μM)和反式-萘烷(<1μM)的较高溶解度中以及苯酚(960mM)和α-萘酚(7mM)相对于未羟基化的芳烃的较高溶解度中。可用的置换剂分子的分子结构应当有助于在水中和在具有低有机含量的水中合理的溶解度(10-50mM)，但同时足够疏水，从而其与固定相很强地结合。通常，带电荷的置换剂分子由于带电荷的物质(尤其是反离子)的溶剂化能量增加而比中性分子具有更好的溶解性质。这要求物理和化学性质的独特平衡，以便中性两性离子分子表现为好的置换剂。阳离子疏水性置换剂显示独特的溶解性。

一般说来，很重要的是注意，增加有机溶剂的水平以补偿差的置换剂溶解性很少得到有用的结果。用0-25％有机溶剂或更优选的2-15％有机溶剂获得最好的色谱结果。在某些情况下可以使用流动相中更高的有机含量(25-75％)，但通常容量和分辨率经常会受到很大影响。

降低的产物-置换剂缔合–疏水性置换色谱法的一个潜在的问题是可能的疏水性置换剂与疏水性被分析物在溶液中的缔合。这可能导致分辨率的显著损失和污染。在固定相上成吸附状态的置换剂-被分析物缔合也可能发生，但由于适量的适当的离子-配对试剂的存在而不那么成问题。应对该问题的好的方法是使用带电荷的被分析物和具有相同电荷的带电荷的疏水性置换剂。

置换剂自身缔合与胶束形成–在一些情况下，当化学结构和物理性质有益时，阳离子疏水性分子可以自身缔合，在溶液中形成胶束和类胶束自身缔合结构。这种情况可以导致DC中分辨率的损失以及置换剂溶液的不期望的发泡。溶液中的置换剂以各种形式存在，这些形式通过各种化学平衡而相互关联。此外，胶束可以作为疏水性被分析物分子的载体而起作用，导致它们在溶液中以各种形式存在。这种不期望的现象是浓度依赖性的且通过添加少量的适当的有机溶剂例如甲醇、乙醇或乙腈来有效地抑制。适当设计的阳离子置换剂分子不增强(disenhance)胶束形成并给出更好的置换结果。因此，对于R-基团R¹-R³，保持基团疏水指数低于12.0降低不期望的去垢性的问题。

高纯度–置换剂中的杂质–置换剂应当具有足够的纯度。制备色谱的目的是从所关注的组分中去除杂质。期望的化合物被置换剂本身污染很少是个问题，但在某些情况下，被置换剂溶液中的“早期置换”杂质污染可能是成问题的，这取决于杂质的量及其结合性质。因此，好的置换剂应当含有很少量的早期置换杂质或不含早期置换杂质。

适当的UV吸收–为了在整个DC实验中跟踪置换剂的位置和量，以观察置换剂穿透曲线并在柱再生操作中跟踪置换剂去除，使置换剂具有中等的紫外吸收是有用的。由于置换剂和被分析物的高浓度，不需要也不优选高吸收。通常，优选无色置换剂，其UV光谱具有战略性定位的低吸收窗口，从而可以在某些频率跟踪被分析物并在其它频率监测置换剂。

易于制造和成本–方便的和有成本效益的化学合成、生产和制造方法是重要的，以便以合理的成本生产可用的置换剂。此外，需要实用的纯化方法，尤其是非-色谱纯化，以便以有成本效益的方式达到纯度要求。

化学稳定性、低毒性和长寿命–除了其所有其它期望的化学和物理性质之外，可用的置换剂分子应当是化学稳定的。它应当对被分析物分子是惰性的，且对水、常用的有机溶剂、温和的碱、温和的酸和氧(空气)是化学稳定的(非-反应性的)。它在通常的使用和储存条件下应当是光-稳定的和热稳定的且具有合理的寿命。非常优选置换剂分子是视觉上无色的，但具有必要水平的UV吸收。可用的置换剂分子还需要具有低毒性，这不仅保护工作者还保护可能与置换剂接触的生物和药物样品。

适当的色谱柱：尽管最常用的反相柱类型是十八烷基涂布的硅胶，但很多疏水性固定相可以用于DC中(参见表III)。最终，对于所研究的每个系统，固定相的最佳选择通过实验确定。

表II.用于疏水性固定相的材料

●涂布的多孔硅胶(共价键合的硅烷)

●未涂布的多孔聚苯乙烯/二乙烯基苯

●多孔氟碳聚合物

●多孔聚十八烷基甲基丙烯酸酯聚合物

●类碳相：

·多孔石墨化碳

·清洁的炭

·多孔氧化锆上的碳

·与多孔氧化锆上的碳键合的C₁₈

●无机氧化物上的有机聚合物涂层

●混合模式疏水相

·具有负表面电荷的C₁₈

·具有正表面电荷的C₁₈

·具有埋藏的负电荷的C₁₈

·具有埋藏的正电荷的C₁₈

用给出更好的回收和收率的更长的、很好地装填的柱在置换色谱法中获得更好的结果。表IV提供了初始选择柱尺寸和初始流速的指引。

表III.色谱柱尺寸

a)500mm或2x250mm

b)初始流速＝75cm/hr(12.5mm/min)；需要优化

适当的柱长度对于好的结果是很重要的。它应当足够长，以完全改进置换队列并给出好的分辨率。然而，过长的柱不必要地增加分离时间并经常导致装填很差的床和降低的分辨率。在很多情况下，两个装填很好的柱可以头尾相连获得好的色谱结果。相当多的利用小分子(MW<3KDa)的实验表明，最佳的柱长度落在以下范围内：对于5μm颗粒为15-45cm且对于10μm颗粒为20-60cm。孔径为的多孔颗粒适于传统的药物和小肽，适于中等的和大的寡肽和寡核苷酸且适于大多数蛋白和DNA。可以使用非-多孔的颗粒，但加载容量会显著下降。

在圆柱形柱中，重要的是建立平面的流动前沿，使得其垂直于流动的轴。在置换色谱法中，一旦已经在较小的柱上形成了优化的方案，则按比例放大以纯化更大量的样品是简单易行的。在发现可接受的最短的柱长度之后，通过增加柱直径同时保持恒定的线性流速而简单地实现按比例放大。经适当的修改，可以用径向流动柱和用轴向流动整体柱来使用置换色谱法。置换色谱法的原理可以适用于分析和制备薄层色谱。

运行成功的置换色谱法实验

尽管有机化合物、传统药物和肽的置换色谱法已被进行了很多年，但经常获得中等至差的结果。好的置换剂、好的柱和好的操作方案产生优异的重复性和非常好的色谱性能。

置换剂和浓度–使用具有适当的结合强度的好的通用阳离子置换剂来进行初始的评价。可以使用阳离子置换剂来纯化阳离子、中性非离子和中性两性离子被分析物。置换剂应当比待纯化的物质与柱更强地结合，但置换剂不应当过强地结合。通常的置换剂浓度为10-50mM的范围。起初，置换剂浓度被设定为10-15mM。根据需要，向置换剂溶液中添加pH缓冲剂和离子-配对阴离子。除了置换剂的存在以及离子-配对阴离子的水平之外，置换剂溶液和载体溶液应当具有相同的组成(包括pH)。置换剂14、198和318(见下)是好的通用阳离子置换剂的实例。在方法优化过程中，将置换剂浓度增加至20-30mM或更高可能是有帮助的。

选择离子-配对试剂–不使用离子-配对试剂、使用无效的离子-配对试剂、使用混合的离子-配对试剂以及使用不足水平的好的离子-配对试剂是置换色谱实验中差的色谱性能的主要原因中一些。进行疏水性置换色谱的人通常不重视或不了解这一点。这在下文的实施例8中进行了充分的说明。表I含有可用于疏水性色谱的可用的一价离子-配对阴离子的列表。当被分析物或置换剂带电荷时需要它们。对于带电荷的被分析物和置换剂，结合等温线强烈地取决于反离子的化学性质及其浓度。那些具有中等至中强的结合性质的离子-配对试剂通常是可用的最好的。当用离子-配对试剂开始实验时，尝试溴化物或三氟乙酸盐(游离酸或NH₄ ⁺盐)作为离子-配对阴离子。当被分析物需要离子-配对阴离子时，它通常在DC实验中规定用于阳离子置换剂的离子-配对阴离子的选择。用于被分析物和置换剂的离子-配对阴离子应当相同。

离子-配对试剂的浓度–如之前所注意到的，使用不足水平的好的离子-配对试剂是置换色谱法实验中差色谱性能的一个主要原因。以下给出用于计算样品溶液中离子-配对试剂的适当浓度(C_IPS,mM))的公式：

C_IPS＝E_sxC_s(mM)xG_s

其中E_s是样品的过量因子，C_s是样品的浓度(mM)且G_s是操作pH下样品的净电荷的绝对值。E_s的最佳值是需要实验确定的参数。以下给出用于计算置换剂溶液中离子-配对试剂的适当浓度(C_IPD,mM)的公式：

C_IPD＝E_dxC_d(mM)xG_d

其中E_d是置换剂的过量因子，C_d是置换剂的浓度(mM)且G_d是操作pH下置换剂的净电荷的绝对值。E_d的最佳值是需要实验确定的参数。关键是，溶液中存在至少化学计量量的离子-配对试剂(E_s≥1.0和E_d≥1.0)。在实践中，我们的经验是E_s应当为1.1-10.0的范围，更优选1.2-6.0的范围，还更优选1.5-4.5的范围。此外，我们的经验是E_d应当为1.1-10.0的范围，更优选为1.2-4.0的范围。当离子-配对浓度未优化或者过低时，即E_s<1.0和/或E_d<1.0时，导致色谱性能的严重恶化。

选择好的RP柱–对于初期的反相工作，应当评价若干质量好的硅胶上的十八烷基或硅胶上的苯基己基柱(5μm球状颗粒，尺寸为4.6x250mm)。按比例放大至更大的制备柱可以随后进行，且相对容易。关键问题是选择适当的孔径。具有过大或过小的孔的基质经常导致容量降低并且有时分辨率降低。参见上文的表II和III。

流速–因为置换色谱法是“准-平衡技术”，所以经常需要相对慢的流速。最佳的流速是不损失分辨率的可能的最快流速。样品加载流速和置换流速应当大致相同，均在35-105cm/hr的范围内。对于传统的药物、寡肽和寡核苷酸由75cm/hr开始，或者对于蛋白质和DNA由40cm/hr开始。再生流速应当为置换流速的2-8倍。当在反相柱上在升高的温度下纯化药物、肽或寡核苷酸时，可以使用更快的流速。

温度–因为反相色谱和其它形式的疏水性色谱在很大程度上被+TΔS与+ΔH驱动，所以更高的温度经常导致更强的结合、更快的结合动力学和明显不同的分辨率。因此，应当小心地调节柱的温度以及在某种程度上置换缓冲剂的温度(+/-0.5℃)以防止带变宽。初始工作经常在25℃下进行，然后如果样品可以承受则尝试升高的温度(45,65℃)，且有机溶剂的沸点是合适的。

选择有机溶剂–尽管大多数与水混溶的有机溶剂会起作用，但最经常使用乙腈、甲醇和乙醇。在很少有机溶剂或根本无有机溶剂存在的条件下进行某些DC纯化。这允许用低盐和低有机溶剂进行实际的未变性的蛋白质的RPC和HIC纯化。当存在与挥发性易燃溶剂相关的安全问题时，在无有机溶剂的条件下操作也可以是有用的。在实验时，首先对肽、低分子量有机药物和小蛋白质尝试乙腈，或者对大蛋白质、寡核苷酸和DNA尝试甲醇。若样品在水中的溶解度可以接受，则由载体缓冲剂、置换剂缓冲剂和样品加载溶液中的3％v/vMeCN、4％v/vEtOH或5％v/vMeOH开始；这三种溶液中的有机含量应当相同。有机溶剂含量是对于每个样品、柱和置换剂需要优化的重要参数。对于通用操作，有机溶剂应当低于约15体积％，更优选低于约10体积％，还更优选约5体积％。当使用十八烷基柱时，对于基质的最佳功能，通常需要2-3％乙腈、3-4％乙醇或4-5％甲醇。苯基己基和辛基柱通常可以承受不存在有机溶剂的条件。

选择pH和pH缓冲剂–当样品、置换剂、离子-配对试剂中或固定相上存在可电离的质子时，需要pH缓冲剂。某些样品仅在特定pH范围内稳定。对于某些样品，色谱分辨率是强pH-依赖性的。通常，使用阳离子置换剂和阳离子缓冲剂纯化包括阳离子样品。与阳离子缓冲剂缔合的阴离子应当与离子-配对阴离子相同。在某些情况下，可以使用不同的阴离子，只有其具有显著更弱的离子-配对性质。类似地，如果阴离子pH缓冲剂具有比主要离子-配对阴离子(principleion-pairinganion)弱得多的离子-配对性质，则可以使用阴离子pH缓冲剂；因此，当三氟乙酸盐是离子-配对阴离子时，可以使用甲酸或乙酸作为pH缓冲剂。由于显而易见的原因，具有低pK_a值的中性和阳离子胺是有用的pH缓冲剂：N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(5.9，TMEDA)、N-乙基哌嗪(5.0，NEP)、N,N-二甲基哌嗪(4.2，DMP)、二氮杂双环辛烷(3.0，DABCO)。

表IV.用于10mM[D⁺][O₂CF₃]置换剂的缓冲体系

共-置换–当处理含有数百个组分和杂质的样品时，共-置换几乎是不可避免的现象，因为不管DC实验发生在结合等温线的任何地方，都很有可能存在若干与主要的受关注组分共-置换的次要组分。幸运的是，置换色谱法中的共-置换远远没有制备洗脱色谱中的共-洗脱问题那么严重。共-置换在两种条件下发生：(1)当结合等温线如此类似，使得产生差的分辨率时，以及(2)当在结合等温线的操作区域附近存在结合等温线的交叉时。幸运的是，存在简单的方法来应对该问题：通过

a.改变置换剂的浓度，

b.改变至具有不同结合形式不同置换剂，

通过在结合等温线的不同点操作而在不同的条件下进行第二DC实验。

或者，可以通过以下来改变等温线本身：

c.改变色谱基质(固定相)，

d.改变有机溶剂的浓度，

e.改变至不同的有机溶剂，

f.改变至不同的离子-配对试剂，

g.改变温度。

第二“正交”IP-RPDC步骤通常以优异的收率(90-95％)给出优异的纯度(～99.5％)。

样品加载方法–使用两种方法之一经由样品注射阀将样品加载到柱上。应当在前沿色谱条件下在结合等温线上进行DC实验的同一点处加载样品。在加载样品后，载体不经过柱。方法1：使用样品加载泵；方法2：使用注射环。通常，仅使用部分环注射(partialloopinjection)。环中的样品应当首先被载体然后被置换剂溶液驱出环到柱上。不超过85-95％的环体积应当被加载到柱上，从而不加载被载体稀释的样品。

柱加载–在相对高的加载下进行DC实验，通常在最大加载容量的60-80％范围内。有效柱加载容量不是固定的数字；而是取决于DC实验在结合等温线的何处进行操作。

不是所有的柱容量都可以利用(参见下文的“例外”)。在实践中，仅90-98％的柱容量是可用的。一旦样品已被加载到柱上，随后就将置换剂缓冲剂泵送到柱上。形成有三种前沿，其各自以不同的速度沿柱行进：(1)液体前沿(T₁，置换剂缓冲剂减去置换剂)，(2)样品前沿(T₂)以及(3)置换剂饱和前沿本身(T₃)。第一前沿比第二和第三前沿行进得更快且限定了可用的柱容量，因为第一前沿应当在置换队列(T₂)开始出来之前离开柱。各前沿的实际速度直接取决于置换流速。前沿速度的比例α，Vel₁/Vel₂，由下式给出：

α＝K_m/(RxC_d)

其中K_m是置换剂浓度为C_d时基质的置换剂结合容量(每mL装填的基质的置换剂mg数)，其中C_d是置换剂缓冲剂中的置换剂浓度(每mL置换剂缓冲剂的置换剂mg数)，R是柱中液体的体积与柱的总体积的比例(每mL_m床体积的液体mL数)。最大％可用柱容量由下式给出：

(100x(α-1))/α

在下文的实施例1b和6b(a)中，各自的α-值是22.24和21.49，且各自的最大柱容量为95.5％和95.3％。注意，随着C_d增加，K_m也会增加，但若在等温线的非线性部分的高处运行时，不会增加很多。因此，α会降低且最大％可用柱容量会降低。

例外-若样品中存在显著水平的不期望的、初期置换的杂质，可以通过将柱过加载并在置换剂流开始之前在样品加载期间将这些杂质移除来增加柱的可用容量，甚至超过100％。因此，基于整个样品，柱加载可以为最大值的105％，但基于主要产物的量加上后期置换的杂质，柱加载可以仅为80％。

样品溶液的浓度和体积–加载样品的浓度是一个重要的操作参数。最佳的样品加载浓度(mg/mL)与来自置换实验的经纯化产物的输出浓度(置换队列的平台区域)相同。结合等温线、柱结合容量和输出浓度是初始未知的。使用如下所示的初始估算，用加载到柱上的样品溶液简单地进行第一次置换实验：

(1)选取希望工作的初始柱加载百分数，例如75％。

样品加载时间＝置换剂穿透时间(T₃-T₁)x0.75

＝(586min-270min)x0.75＝237min

(对于实施例6b(a))

(2)通过两种方法之一选取样品的初始浓度：

(a)初始样品浓度(mg/mL)＝0.25x置换剂浓度(mM)x式量(mg/μmole)

＝0.12x10mMx1.7466mg/μmole＝2.10mg/mL(对于实施例6b(a))

(b)对于样品选取估算的柱结合容量，例如50mg样品/mL基质。假定置换流速和样品加载流速相同：

初始样品浓度(mg/mL)＝(柱结合容量(mg/mL_m)x柱体积(mL_m)/((T₂-T₁)x样品流速(mL/min))

＝(50mg/mL_mx4.155mL_m)/((586min-270min)x0.208mL/min)

＝3.16mg/mL

(对于实施例6b(a))

若用加载的样品进行的第一次DC实验导致过加载条件(>100％加载)，则在一半的样品浓度下重新运行实验。从使用样品的第一次成功的DC实验的结果，很容易计算实际加载浓度和实际柱加载容量，且这些值随后用于调节用于第二次DC实验的样品浓度和加载。

样品制备–以上文所述的浓度和量制备加载样品溶液。为了过量填充该环或者填充样品加载泵和递送线路的死体积，需要足够过量的溶液。pH、pH缓冲剂的量和有机溶剂的量与载体和置换剂缓冲剂相同。将样品溶解在载体中改变其pH，因此样品溶液的pH必须在溶解后再次调节。然而，离子-配对试剂的量可以不同。样品溶液中所用的离子-配对试剂必须与置换剂缓冲剂中所用的相同。对此，样品的离子-配对要求规定样品溶液中和置换剂溶液中使用何种离子-配对试剂。基于操作pH下的形式化学电荷以及主要被分析物的浓度，计算离子-配对试剂或离子-配对盐的浓度。参见上文的“离子-配对试剂的浓度”。

样品的组成和历史应当是已知的。若样品含有阴离子，则其化学性质和量(浓度)也应当是已知的。(a)显然，若不存在阴离子，则在样品制备中不进行调节。(b)若样品中的阴离子与DC中所用的离子-配对阴离子相同，则相应地减少添加至样品溶液的离子-配对阴离子的量。(c)若样品中的阴离子的离子-配对性质显著弱于DC中所用的离子-配对阴离子，则其存在可以忽略。(d)若样品中的阴离子的离子-配对性质强于DC中所用的离子-配对试剂，则阴离子应当在处理之前被交换或去除。

收集馏分–置换色谱法给出优异的色谱分辨率，尤其是使用好的C₁₈-反相柱采用优化的方案时。然而，分辨率很难观察到，因为所有的带作为置换队列中背靠背的带而一起从柱中出来。许多小杂质的三角形带的宽度小于30秒(<100μL)。因此，对于置换剂穿透时间为250分钟且样品加载为80％的实验，置换队列会为约200分钟宽，且必须提取超过400个馏分，从而在馏分收集过程中不损失色谱分辨率。分析400个馏分确实有启发且有趣，但也是令人生畏的工作。这时，在线实时馏分分析会是有用的。在实践中，我们不理会分辨率，而仅收集100-130个较大的馏分。即便是该数目的馏分也代表大量的工作。

在进行制备DC实验且仅关注纯化的主要组分的情况下，馏分收集过程被大大简化。基于在不同频率(UV)下观察的置换队列的形状，判断所关注的主要带的开始和结束，然后在这两个区域中分析约10个馏分，以便确定要汇集哪些馏分。分析20个馏分而不是100-130个馏分是更容易的工作。

置换剂去除和柱再生–使用5-10倍柱体积的95/5(v/v)乙醇-水或80/10/10(v/v/v)乙腈-正丙醇-水而不使用任何pH缓冲剂或离子-配对试剂来去除置换剂。目的是在最短的时间内有效地从柱中去除>99.9％或更多的置换剂。若基质可以承受增加的反压(back-pressure)，则增加流速(100-400cm/hr)以加速柱再生过程。在置换剂的吸收最大值(参见置换剂说明)附近观察置换剂的去除允许通过UV检测而小心地监控和优化再生过程。

添加的盐的效果–水性溶剂中的盐使得溶剂对溶解的疏水性被分析物和疏水性置换剂不那么友好，导致与疏水性色谱基质更强的结合。这是疏水性-相互作用色谱(HIC)背后的原理。只要被分析物在盐溶液中的溶解性足够，则盐的添加是调节被分析物对疏水性基质的结合和选择性的良好方式。

在某些情况下，被分析物与疏水性基质的结合是如此弱，使得需要添加的盐以获得足够的被分析物结合。常用的盐溶液为0.5-2.5M(NH₄)₂SO₄、K₂SO₄、Na₂SO₄、NaCl、KCl。在各种浓度的许多不同盐的帮助下，置换模式的HIC为有用的蛋白质色谱分离提供许多选择。

仪器方案–参见实施例1的示例性方案(双泵操作)。因为来自先前试验的残余置换剂是潜在的问题，所以该方案具有线路清洗操作、快速柱再生和平衡操作以确保HPLC系统和柱在临加载样品之前完全清洁并适当地平衡。这些步骤仅仅是警戒性的，但不总是必要的。该方案在单一的方案中包括(a)预-平衡程序，(b)平衡程序，(c)样品加载程序，(d)置换程序，和(e)再生程序。为了克服与系统中的死体积相关的问题，所有加载的缓冲剂、置换剂缓冲剂和样品溶液均在临泵送至柱上之前被经过系统冲洗至废液中。通过这种方式，在紧随阀门切换之后，柱中会出现未稀释的溶液的尖锐前沿。样品溶液应当被脱气，使得在其中不形成气泡。当使用注射环时，它们需要被过填充约10％。过填充可以被收集用于进一步应用。不应当使用满环注射，仅使用部分环注射。经验要求，根据环管路的内径，仅可以使用85-95％的环体积，因为样品溶液与驱动溶液混合并将其稀释。环中的样品被加载缓冲剂驱动到柱上，但将近样品加载过程的末尾，将驱动溶液换成置换剂缓冲剂。这允许在临将置换剂缓冲剂本身直接泵送到柱上之前将置换剂缓冲剂冲洗经过系统。在再生过程的初始部分，使用较慢的流速。因此，与高反压相关的问题很少发生。一旦大部分置换剂被去除，则可以使用较高的流速。

方法优化–对于所有形式的制备色谱，色谱方法和操作的优化都是很重要的，但它需要一些努力。置换色谱法的益处伴随着价格–时间。在方法优化过程中使耗时因素最小化。

·确定置换纯化的近最佳条件而不考虑分离的时间。

·增加置换剂浓度和样品加载溶液的浓度直至分辨率下降。

·增加置换流速和样品加载流速直至分辨率下降。

·缩短预-平衡程序和置换剂去除/柱再生程序。

现存的方案为方法优化提供有用的起点，但它们会需要针对被研究的具体样品进行修改。下文示出一个样品方案(实施例1)，其已被针对纯度进行了优化，而不考虑时间。重要的是进行适应于所关注的样品的具体物理性质和色谱性质的方法优化。在优化后，较长的方法(600-800min)经常可以降至200-300分钟，且在某些情况下降至100-150分钟。

以置换模式使用的疏水性色谱具有(a)高基质生产率(在基质的寿命期间内每升基质的产物克数)，(b)高体积生产率(每升柱体积的产物克数)，(c)高溶剂生产率(每升所用溶剂的产物克数)，但(d)可能具有中等的时间生产率(每升单位时间的产物克数)。适当的方法优化减轻时间因素。

适当配置的仪器：以下给出用于小制备HPLC系统的典型的仪器配置。

·主泵：不锈钢、钛、陶瓷、PEEK；精确的0.01-10mL/min流速；3000-4500psi压力。

·任选的柱旁路阀门：双位、六通开关阀(不锈钢、PEEK)；柱串联(columninline)或旁路柱。这是方便选项。

·要求的样品注射阀：用于注射环或样品注射泵的双位、六通注射阀(不锈钢、PEEK)。

·注射环：20-40mL注射环(不锈钢、PEEK)。环应当被过加载(～10％)。仅使用部分环注射，通常不超过环体积的85-95％。使用注射环或样品泵中的一个。

·样品泵：这类似于用于样品注射的主泵。样品应当与泵头的流程(flowpath)相容。使用注射环或样品泵中的一个。对于双泵操作，应当校准两个泵的流速，使得它们的流速可以匹配。

·无梯度混合器：在置换色谱法中绕过或去除梯度混合器。

·UV检测器：多波长或光-二极管-阵列检测器，200-400nm频率范围，具有短程、低体积石英流动池(0.2-2.0mm流程，<10μL流动体积)。

·任选的电导检测器：UV检测器之后的电导检测器，具有流动池，0.1-200mS，<100μL流动体积；在<500μL/min的置换流速下收集用于分析的馏分时的旁路电导流动池。

·馏分收集器：通过时间或通过滴数的10μL至10mL的每个馏分。

·柱冷却器/加热器：0-100℃+/-0.5℃。若柱在显著不同于环境温度的温度下操作，则需要进行设置，以加热或冷却缓冲剂溶液。

实施例1a：示例性方案。粗合成血管紧张素I的置换色谱纯化

仪器配置：具有4条溶剂线路的单一主泵，具有40mL环的样品注射阀，柱旁路阀

样品注射阀：6通阀，其由单通道切换逻辑(single-channeltogglelogic)控制(S3＝0，旁路环(bypassloop)，S3＝1，环串联(inline))

柱旁路阀：6通阀，其由单通道切换逻辑控制(S6＝0，柱串联(columninline)，S6＝1，绕过柱(bypasscolumn))

柱后的UV光二极管阵列检测器(流动池：0.5mm流程，10μL体积)，随后是电导率检测器(流动池：170μL体积)。当收集馏分用于分析时，绕过电导率池。

加载缓冲剂＝A-缓冲剂(S1＝1，流动开，S1＝0流动关)；置换剂缓冲剂＝B-缓冲剂(S2＝1，流动开，S2＝0流动关)；

置换剂去除缓冲剂＝C-缓冲剂(S4＝1，流动开，S4＝0流动关)；柱储存缓冲剂＝D-缓冲剂(S5＝1，流动开，S5＝0流动关)

在程序开始之前，将清洁的柱简单地用A-缓冲剂冲洗，以去除柱储存缓冲剂。

将注射器中的约44mL脱气的样品溶液加载到样品注射环中；防止空气进入环。

对于柱的描述、关于初始样品的细节以及加载缓冲剂/置换剂缓冲剂/样品溶液的含量，参见实施例7b。

置换剂去除缓冲剂(C-缓冲剂)＝10％(v/v)1-丙醇、10％(v/v)DI水在乙腈中。

柱储存缓冲剂(D-缓冲剂)＝50/50(v/v)乙腈/水，含有甲酸(15mM)和甲酸 铵(15mM)。

实施例1b：使用置换剂14进行的粗血管紧张素I的置换色谱纯化–较低浓度下的较高加载(参见图1b-分析)

操作条件：

起始肽：脱盐的粗合成血管紧张素I，82.7％纯度，FW～1.296mg/μmole，电荷＝+4

柱：WatersXbridgeBEH130，5μm，4.6x250mmSS，硅胶上的-C₁₈

流速：加载＝208μL/min；置换＝208μL/min

离子-配对试剂：三氟乙酸盐(CF₃CO₂ ^-)

温度：23℃

pH：2.0

置换剂缓冲剂：10.0mM置换剂14+12mMCF₃CO₂H在DI水中含有3％(v/v)MeCN，pH＝2.0含有NH₄OH

加载缓冲剂：12mMTFA在水中具有3％(v/v)MeCN，pH＝2.0具有NH₄OH

样品溶液：4.38mg/mL肽在水中，含有3％(v/v)MeCN和27mMCF₃CO₂ ^-；pH＝2.0含有NH₄OH

加载量：155.0mg，35.4mL，来自40mL环；

加载时间：170.1min.(2.84hr)

馏分量：416μL

结果：

馏分分析：将馏分稀释(20μL样品+40μL加载缓冲剂)并通过分析洗脱HPLC在215nm下分析(25μL注射)；计算是基于面积％。

总运行时间：8.4hr

输出浓度：3.29mg/mL

柱加载：最大容量的71.2％

柱容量：～52.4mg肽/mL基质3.29mg肽/mL溶液

～167μmole置换剂/mL基质10.0μmole置换剂/mL溶液

评述：样品浓度/输出浓度＝1.3

样品中CF₃CO₂ ^-的量＝化学计量量的2.0倍。

获得优异的结果。在使用小“分析型”柱的该实施例中，同时获得好的加载(37.3g/L)、好的纯度和好的收率(>99％纯度80％收率；>98.5％纯度95％收率)。这说明了优化的反相置换色谱法的能力。

实施例2：使用置换剂14进行的粗血管紧张素I的置换色谱纯化–在较高浓度下的较低加载(参见图2-分析)

操作条件：

起始肽：脱盐的粗合成血管紧张素I，82.7％纯度，FW～1.296mg/μmole，电荷＝+4

柱：WatersXbridgeBEH130，5μm，4.6x250mmSS，硅胶上的-C₁₈

流速：加载＝208μL/min；置换＝208μL/min

离子-配对试剂：三氟乙酸盐(CF₃CO₂ ^-)

温度：23℃

pH：2.0

置换剂缓冲剂：10.0mM置换剂14+12mMCF₃CO₂H在DI水中含有3％(v/v)MeCN，pH＝2.0含有NH₄OH

加载缓冲剂：12mMTFA在水中，含有3％(v/v)MeCN，pH＝2.0含有NH₄OH

样品溶液：24.0mg/mL肽在水中，含有3％(v/v)MeCN和140mMCF₃CO₂ ^-；pH＝2.0含有NH₄OH

加载量：109.3mg，4.56mL，来自5mL环

加载时间：21.9min.(0.37hr)

馏分量：458μL

结果：

馏分分析：将馏分稀释(20μL样品+40μL加载缓冲剂)并通过分析洗脱HPLC在215nm下分析(25μL注射)；计算是基于面积％。

总运行时间：5.9hr

输出浓度：3.30mg/mL

柱加载：最大容量的50.1％

柱容量：～52.5mg肽/mL基质3.30mg肽/mL溶液

～167μmole置换剂/mL基质10.0μmole置换剂/mL溶液

评述：样品浓度/输出浓度＝7.3

样品中CF₃CO₂ ^-＝化学计量量的1.9倍。

使用小的“分析-型”柱以中等的加载(26.3g/L)、好的纯度和好的收率(>99％纯度85％收率；>98.5％纯度95％收率)获得好的结果。总运行时间被缩短(5.9hr)，因为样品加载时间被缩短了(2.84hr至0.37hr)。在～70％样品加载下的类似结果给出较差的纯度(数据未示出)，因此加载百分比被降低至约50％，纯度水平在该点被改善。这些数据显示，较低的柱加载百分数可以有效地补偿由于在过高的浓度(7.3倍)下加载样品而引起的降低的分辨率。因此，若要保持高纯度和高收率，则存在一种权衡：(a)较高的样品加载和较长的时间或者较低的样品加载和较短的时间。对于含有容易去除的杂质的样品，高样品加载和较短的时间仍然可以导致高纯度和高收率。

实施例3：使用置换剂413进行的粗血管紧张素I的置换色谱纯化–具有“较低结合-等温线"的不同置换剂(参见图3-分析)

操作条件：

起始肽：脱盐的粗合成血管紧张素I，82.7％纯度，FW～1.296mg/μmole，电荷＝+4

柱：WatersXbridgeBEH130，5μm，4.6x250mmSS，硅胶上的-C₁₈

流速：加载＝208μL/min；置换＝208μL/min

离子-配对试剂：三氟乙酸盐(CF₃CO₂ ^-)

温度：23℃

pH：2.0

置换剂缓冲剂：10.0mM置换剂413+12mMCF₃CO₂H在DI水中含有3％(v/v)MeCN，pH＝2.0含有NH₄OH

加载缓冲剂：12mMTFA在水中含有3％(v/v)MeCN，pH＝2.0含有NH₄OH

样品溶液：7.27mg/mL肽在水中含有3％(v/v)MeCN和43mMCF₃CO₂ ^-；pH＝2.0含有NH₄OH

加载量：160.7mg，22.1mL，来自30mL环

加载时间：106.3min.(1.77hr)

馏分量：312μL

结果：

馏分分析：将馏分稀释(10μL样品+40μL加载缓冲剂)并通过分析洗脱HPLC在215nm处分析(25μL注射)；计算是基于面积％。

总运行时间：5.6hr

输出浓度：5.38mg/mL

柱加载：66.7％of最大容量

柱容量：～58.0mg肽/mL基质5.38mg肽/mL溶液

～115μmole置换剂/mL基质10.0μmole置换剂/mL溶液

评述：样品浓度/输出浓度＝1.3

样品中CF₃CO₂ ^-的量＝化学计量量的1.9倍。

使用小的“分析-型”柱以好的加载(38.7g/L)、优异的纯度和优异的收率(>99％纯度85％收率；>98.5％纯度95％收率)获得优异的结果。运行时间被缩短(5.6hr)，因为样品加载时间和置换时间均被缩短，这是由于较高的样品加载和较高的操作浓度，而较高的样品加载和较高的操作浓度反过来又是由置换剂413的“较低结合-等温线”产生的。在该实施例中，使用相同的柱和相同的肽，当改变了置换剂(与实施例1b相比)。这些结果显示，当在产品和杂质的结合-等温线的较高处运行时，获得同样好的纯度和收率。因为在10mM下使柱饱和需要较少的置换剂413(115vs167μmole置换剂/mL基质)，肽以较高的浓度离开柱(5.38vs3.19mg/mL)，且实验在肽结合-等温线的较高处操作(58.0vs52.5mg肽/mL基质)。

实施例4：使用置换剂14进行粗血管紧张素I的置换色谱纯化–不同的反相柱(参见图4-分析)

操作条件：

起始肽：脱盐的粗合成血管紧张素I，82.7％纯度，FW～1.296mg/μmole，电荷＝+4

柱：Varian/PolymerLabsPLRP-S，5μm，4.6x250mmSS，未涂布的多孔聚苯乙烯/二乙烯基苯

流速：加载＝208μL/min；置换＝208μL/min

离子-配对试剂：三氟乙酸盐(CF₃CO₂-)

温度：23℃

pH：2.0

置换剂缓冲剂：10.0mM置换剂14+12mMCF₃CO₂H在DI水中含有3％(v/v)MeCN，pH＝2.0含有NH₄OH

加载缓冲剂：12mMTFA在水中，含有3％(v/v)MeCN，pH＝2.0含有NH₄OH

样品溶液：3.50mg/mL肽在水中，含有3％(v/v)MeCN和22mMCF₃CO₂ ^-；pH＝2.0含有NH₄OH

加载量：116.0mg，33.2mL，来自40mL环

加载时间：159.4min.(2.66hr)

馏分量：458μL

结果：

馏分分析：将馏分稀释(30μL样品+20μL加载缓冲剂)并通过分析洗脱HPLC在215nm处分析(25μL注射)；计算是基于面积％。

总运行时间：9.7hr

输出浓度：1.86mg/mL

柱加载：最大容量的73.2％

柱容量：～38.1mg肽/mL基质1.86mg肽/mL溶液

～212μmole置换剂/mL基质10.0μmole置换剂/mL溶液

评述：样品浓度/输出浓度＝2.0

样品中CF₃CO₂ ^-的量＝化学计量量的2.0倍。

使用小的“分析-型”柱以低-至-中等的加载(27.9g/L)、中等纯度和合理的收率(>97.5％纯度90％收率)获得好的结果。该实施例被设计为显示使用相同的肽和相同的置换剂并行比较两个柱(与实施例1b比较)。一般而言，聚苯乙烯柱的结果很好，但不像硅胶上的C₁₈柱的结果那么好。总运行时间稍微更长，柱结合能力较低且最终纯度稍微较低(97.5％vs98.5-99.0％)。通过调整置换剂的类型、其浓度和离子-配对试剂(数据未显示)，总运行时间被缩短，且结合能力增加，接近硅胶上的C₁₈柱的结果。然而，产物纯度在很大程度上保持为与聚苯乙烯柱上的该运行大约相同。这些结果总体上对应于来自制备洗脱色谱的结果，其表明聚苯乙烯柱与硅胶上的C₁₈柱相比给出下降的色谱分辨率。实施例5：使用置换剂318进行粗α-促黑激素的置换色谱纯化–不同的肽和不同的置换剂(参见图5-分析)

操作条件：

起始肽：脱盐的粗合成α-促黑激素，80.8％纯度，FW～1.665mg/μmole，电荷＝+3

柱：WatersXbridgeBEH130，5μm，4.6x250mmSS，硅胶上的-C₁₈

流速：加载＝208μL/min；置换＝208μL/min

离子-配对试剂：三氟乙酸盐(CF₃CO₂ ^-)

温度：23℃

pH：2.0

置换剂缓冲剂：10.0mM置换剂318+12mMCF₃CO₂H在DI水中，含有3％(v/v)MeCN，pH＝2.0含有NH₄OH

加载缓冲剂：12mMTFA在水中，含有3％(v/v)MeCN，pH＝2.0含有NH₄OH

样品溶液：9.04mg/mL肽在水中，含有3％(v/v)MeCN和33mMCF₃CO₂ ^-；pH＝2.0含有NH₄OH

加载量：216.2mg，23.9mL，来自30mL环

加载时间：115.0min.

馏分量：312μL

结果：

馏分分析：将馏分稀释(10μL样品+50μL加载缓冲剂)并通过分析洗脱HPLC在215nm处分析(25μL注射)；计算是基于面积％。

总运行时间：6.2hr

输出浓度：6.52mg/mL

柱加载：最大容量的66.7％

柱容量：～79.3mg肽/mL基质6.52mg肽/mL溶液

～129μmole置换剂/mL基质10.0μmole置换剂/mL溶液

评述：样品浓度/输出浓度＝1.4

样品中CF₃CO₂ ^-的量＝化学计量量的2.0倍。

使用小的“分析-型”柱以好的加载(52.0g/L)、好的纯度和好的收率(>99％纯度85％收率；>98.5％纯度95％收率)获得优异的结果。该实施例被设计为显示使用不同的肽和不同的置换剂在相同的柱(硅胶上的C₁₈)进行并行的比较(参见实施例1b)。α-促黑激素具有较高的固有结合能力，且需要更少的置换剂318来使柱饱和(129vs167μmole置换剂/mL)。这两种因素一起导致更高的对肽的结合能力(79.3vs52.4g肽/L基质)，但置换队列很好地尖锐化，给出高纯度以及高收率。

实施例6a：示例性方案和置换队列。粗合成α-内啡肽的置换色谱纯化

仪器配置：主泵(1)具有4条溶剂线路，样品加载泵(2)具有2条溶剂线路，泵选择器阀

泵选择器阀：6通阀，由单通道切换逻辑控制(S3＝0，泵1至柱-泵2至废液，S3＝1泵1至废液-泵2至柱)

柱后的UV光二极管阵列检测器(流动池：0.5mm流程，9μL体积)，随后是电导率检测器(流动池：170μL体积)。

加载缓冲剂＝泵1上的A-线路(S1＝1，流动开，S1＝0流动关)；置换剂缓冲剂＝泵1上的B-线路(S2＝1，流动开，S2＝0流动关)；置换剂去除缓冲剂＝泵1上的C-线路(S4＝1，流动开，S4＝0流动关)；柱储存缓冲剂＝泵1上的D-线路(S5＝1，流动开，S5＝0流动关)；加载缓冲剂＝泵2上的A-线路(S6＝1，流动开，S6＝0，流动关)；样品溶液＝泵2上的B-线路(S7＝1，流动开，S7＝0流动关)。

在程序开始之前，将清洁的柱简单地用A-缓冲剂冲洗，以去除柱储存缓冲剂。

对于柱的描述、关于初始样品的细节以及加载缓冲剂/置换剂缓冲剂/样品溶液的含量，参见实施例12b。

置换剂去除缓冲剂(C-缓冲剂)＝10％(v/v)1-丙醇，10％(v/v)DI水在乙腈中。

柱储存缓冲剂(D-缓冲剂)＝50/50(v/v)乙腈/水，含有甲酸(15mM)和甲酸铵(15mM)。

实施例6b：使用置换剂198进行粗合成α-内啡肽的置换色谱纯化–较大的颗粒、较大的柱和较低的初始纯度(参见图6b(a)A–置换痕迹；图6b(a)B–分析)

操作条件：

起始肽：脱盐的粗合成α-内啡肽，64.3％纯度，FW～1.746mg/μmole，电荷＝+2，均在硅胶上的-C₁₈上

柱：6b(a)：WatersXbridgeBEH130,5μm，10.0x250mmSS，硅胶上的-C₁₈

6b(b)：WatersXbridgeBEH130，10μm，10.0x250mmSS，硅胶上的-C₁₈

6b(c)：WatersXbridgeBEH130，10μm，10.0x500(2x250)mmSS，硅胶上的-C₁₈

流速：加载＝1016μL/min；置换＝961μL/min，对于所有三个实验。

离子-配对试剂：三氟乙酸盐(CF₃CO₂ ^-)

温度：23℃

pH：2.0

置换剂缓冲剂：10.0mM置换剂198+12mMCF₃CO₂H在DI水中，含有3％(v/v)MeCN，pH＝2.0

加载缓冲剂：12mMTFA在水中，含有3％(v/v)MeCN，pH＝2.0，含有NH₄OH

样品溶液：

(a)5.59mg/mL肽在水中，含有3％(v/v)MeCN和26mMCF₃CO₂ ^-；pH＝2.0

(b)5.59mg/mL肽在水中，含有3％(v/v)MeCN和26mMCF₃CO₂ ^-；pH＝2.0

(c)11.18mg/mL肽在水中，含有3％(v/v)MeCN和52mMCF₃CO₂ ^-；pH＝2.0

加载量：

(a)1164mg，208.3mL，来自加载泵；加载时间＝205.0min。

(b)1164mg，208.3mL，来自加载泵；加载时间＝205.0min。(3.42hr)

(c)2329mg，208.3mL，来自加载泵；加载时间＝205.0min。(3.42hr)

馏分量：(a)1.49mL；(b)1.49mL；(c)2.98mL

结果-6b(a)(参见图6b(a)A和6b(a)B)

馏分分析：将馏分稀释(10μL样品+40μL加载缓冲剂)并通过分析洗脱HPLC在215nm处分析(25μL注射)；计算是基于面积％。

总运行时间：8.9hr

输出浓度：5.47mg/mL

柱加载：最大容量的70.5％

柱容量：～84.1mg肽/mL基质5.47mg肽/mL溶液

～161μmole置换剂/mL基质10.0μmole置换剂/mL溶液

结果-6b(b)(无图)：

馏分分析：将馏分稀释(10μL样品+40μL加载缓冲剂)并通过分析洗脱HPLC在215nm处分析(25μL注射)；计算是基于面积％。

总运行时间：9.1hr

输出浓度：5.27mg/mL

柱加载：最大容量的71.3％

柱容量：～83.2mg肽/mL基质5.27mg肽/mL溶液

～165μmole置换剂/mL基质10.0μmole置换剂/mL溶液

结果-6b(c)(无图)：

馏分分析：将馏分稀释(10μL样品+40μL加载缓冲剂)并通过分析洗脱HPLC在215nm处分析(25μL注射)；计算是基于面积％。

总运行时间：14.5hr

输出浓度：5.41mg/mL

柱加载：最大容量的70.7％

柱容量：～83.7mg肽/mL基质5.41mg肽/mL溶液

～162μmole置换剂/mL基质10.0μmole置换剂/mL溶液

评述：样品浓度/输出浓度：1.0(6b(a))；1.1(6b(b))；2.1(6b(c))。

样品中CF₃CO₂ ^-的量＝化学计量量的4.0倍(6b(a)，6b(c)&6b(c))。

使用具有5μm和10μm粒径的“半制备-型”柱以好的加载(59.2-59.3g/L)、高纯度和好的收率(>98.5％纯度90％收率)由三次运行均获得优异的结果。加载百分数(70.5-71.3％)和输出浓度(5.27-5.47mg/mL)均一且可重复。这些实施例说明了优化了的制备置换色谱法的能力和应用。(1)相同长度的、填充有相同反相基质的4.6mm和10.0mmID柱之间的制备分辨率几乎没有差别。(2)在25cm柱长度时，5μm和10μm基质均给出好的结果，其中10μm材料给出略微较差的分辨率，这是由略微降低的纯度(～0.6％)所表明的。(3)在50cm柱长度时，10μm基质获得完全的分辨率；简单的计算表明，30-40cm的床长度是足够长的。(4)两个适当地首尾相连的、很好地填充的柱在置换色谱法实验中有效地起作用。(5)对于具有60+％初始纯度的肽(α-内啡肽)在最佳汇集的纯度(98.8％)并不显著低于对于具有80+％初始纯度的肽(血管紧张素I，α-促黑激素)在最佳汇集的纯度(99.1％)。(6)在许多情况下，在样品加载溶液中以好的结果使用离子-配对试剂的化学计量量的1.5-2.0倍；然而，对于α-内啡肽，在CF₃CO₂ ^-的化学计量量的3.5-4.0倍获得显著更好的分辨率。

实施例7：使用置换剂198进行预纯化的α-内啡肽的置换色谱纯化–不同的结合-等温线导致改善的纯度(参见图7–分析)

操作条件：

起始肽：预纯化的α-内啡肽，98.4％纯度，FW～1.746mg/μmole，电荷＝+2

柱：WatersXbridgeBEH130，5μm，4.6x250mmSS，硅胶上的-C₆Ph

流速：加载＝208μL/min；置换＝208μL/min

离子-配对试剂：三氟乙酸盐(CF₃CO₂ ^-)；

温度：23℃

pH：2.0

置换剂缓冲剂：10.0mM置换剂198+12mMCF₃CO₂H在DI水中含有3％(v/v)MeCN，pH＝2.0含有NH₄OH

加载缓冲剂：12mMTFA在水中，含有3％(v/v)MeCN，pH＝2.0，含有NH₄OH

样品溶液：5.26mg/mL肽在水中，含有3％(v/v)MeCN和21mMCF₃CO₂ ^-；pH＝2.0，含有NH₄OH

加载量：158.9mg，30.2mL，来自40mL环

加载时间：145.2.0min.

馏分量：437μL

结果：

馏分分析：将馏分稀释(15μL样品+35μL加载缓冲剂)并通过分析洗脱HPLC在215nm处分析(25μL注射)；计算是基于面积％。

总运行时间：7.3hr

输出浓度：3.85mg/mL

柱加载：最大容量的71.1％

柱容量：～53.8mg肽/mL基质3.85mg肽/mL溶液

～147μmole置换剂/mL基质10.0μmole置换剂/mL溶液

评述：样品浓度/输出浓度＝1.3

样品中CF₃CO₂ ^-的量＝化学计量量的3.6倍。

使用小的“分析-型”柱以好的加载(38.3g/L)、优异的纯度和优异的收率(>99.5％纯度95％收率)获得优异的结果。该实施例被设计为显示在适当条件下纯化预纯化的样品如何可以有效的得到高纯度肽。(1)杂质的总量由1.6％显著下降至0.4-0.5％，伴随着最小的产物损失(5-10％)。(2)杂质的下降主要由产物和杂质的结合-等温线的变化而产生，而不是由柱的分辨率的改善而产生。在起始物质中，1.6％的杂质由12种少量的杂质构成，其中的8种在该纯化过程中被有效地除去。剩余4种共-置换的组分的水平在纯化过程中被稍微降低。(3)因为4种剩余的杂质的共-置换是限制最终纯度的主要因素，所以从60％回收率至95％回收率，纯度谱几乎不变。(4)该纯化的成功来自具有不同结合-等温线的苯基己基柱的选择。在十八烷基(C₁₈)柱上进行同一样品的类似的置换色谱纯化的尝试未能得到显著的改善(数据未示出)。这很可能是对的，因为十八烷基柱用于在第一步骤中由粗物质中纯化样品。(5)这些结果显示，连续两次置换纯化可以常规地导致高纯度肽的高-收率生产。

实施例8：使用置换剂14进行粗血管紧张素I的置换色谱纯化–使用不同的离子-配对阴离子、浓度和混合物

除了置换剂的反-离子和离子-配对阴离子(酸)的添加量之外，实施例7中七个实验的所有操作条件均相同。在所有情况下，操作pH均相同(pH＝2.0)。为了减少分析工作的量，对于中心的15种馏分的汇集给出对比的纯度数据。因为对于给定的置换实验，在整个主要置换带中共-置换的水平几乎不变，来自该汇集方法的分析数据给出有代表性的和可比的结果。

结果：

注：a)实施例1

评述：

在除了实验“G”之外的大部分条件下获得了普遍好的结果。从涉及离子-配对阴离子的类型、混合物和水平的该研究中有清楚的结果。

1.仅三氟乙酸盐(A)和仅溴化物(B)的实验得到类似的结果(0.9-1.0％杂质)，而对于仅氯化物(C)的实验，则给出较高的杂质水平(1.4％杂质)。因此，三氟乙酸盐和溴化物是比氯化物更好的离子-配对试剂。

2.只要存在足够的三氟乙酸盐，混合的三氟乙酸盐-氯化物(E，F)实验给出与仅三氟乙酸盐实验大约相同的杂质水平(0.9-1.0％杂质)。与之相反，混合的三氟乙酸盐-溴化物(D)实验给出更差的结果；杂质水平由0.9％增加至1.9％。尽管仅三氟乙酸(A)和仅溴化物(B)实验给出好的结果，阴离子的混合物并不给出好的结果。显然，具有类似的(但不相同的)离子-配对强度的两种离子-配对阴离子的混合物互相干扰，导致带变宽和更高的纯度水平。具有显著不同的离子-配对强度的两种离子-配对阴离子的存在导致较强的一种占主导(只要其存在的量足够)且导致较低的杂质水平。

3.当存在两种离子-配对试剂(Cl^-，CF₃CO₂ ^-)且较强的一种以低于化学计量量存在时，获得最差的结果(G)。这导致“双-带”，其中置换剂和混合物的许多组分以两个带从柱中出来，第一个是氯化物盐且第二个是三氟乙酸盐。这导致显著的带变宽和各双-带组分的重叠，从而使总杂质水平从0.9％增加至3.3％。添加不足量的三氟乙酸盐(较强的离子-配对阴离子)给出比完全不具有三氟乙酸盐更差的结果(3.3％杂质vs1.4％杂质)。添加超过化学计量量的较高水平的三氟乙酸盐引起杂质水平再次下降(3.3％至0.9％)。

4.注意，以上结果仅适用于三氟乙酸盐(离子-配对阴离子)在置换剂缓冲剂中的水平。在样品加载溶液中存在足够的三氟乙酸盐。当样品溶液中的三氟乙酸盐不足时，杂质水平甚至变得(数据未示出)。

实施例9：HPLC分析-

方法9a，9b–用于阳离子的反相：使用装备有与Dionex/ESABiosciences(Chelmsford,MA)CoronaPlusCAD检测器串联的Waters996PDA检测器和WatersXbridgeBEH130、5μm、4.6x250mmSS、硅胶上的-C₁₈反相色谱柱(Chelmsford,MA)的WatersCorp.(Milford,MA)梯度HPLC进行分析。

样品注入：25μL的A缓冲剂中的～1mM样品溶液

UV检测：208-220nm，取决于待分析的化合物

流速：1.0mL/min.

A缓冲剂：5％CH₃CN(v/v)在HPLC-级蒸馏水中，含有0.1％(v/v)三氟乙酸。

B缓冲剂：5％H₂O(v/v)在HPLC-级CH₃CN中，含有0.1％(v/v)三氟乙酸。

调查梯度法：100％A0-2min

100％A至100％B2-62min

100％B62-70min

方法9c–用于长链烷基卤化物的反相：

样品注入：25μL的A缓冲剂中的～1mM样品溶液

UV检测：200-220nm，取决于待分析的化合物

流速：1.0mL/min.

A缓冲剂：5％CH₃CN(v/v)在HPLC-级蒸馏水中，含有0.1％(v/v)三氟乙酸。

B缓冲剂：5％H₂O(v/v)在HPLC-级CH₃CN中，含有0.1％(v/v)三氟乙酸。

梯度法：50％A/50％B0-2min

50％A/50％B至100％B2-62min

100％B62-70min

实施例10：N-癸基吡咯烷(fw＝211.39)的制备

在装配有加热套、机械搅拌器、500mL加料漏斗、回流冷凝器和特氟龙涂布的热电偶的2L4-颈圆底烧瓶中，将426.7g新鲜蒸馏的吡咯烷(6.0mole,fw＝71.12,～500mL)添加到500mL搅拌的乙腈中。反应在氮气氛下进行，伴随缓慢的N₂吹扫。将442.4g新鲜蒸馏的1-溴癸烷(2.0mole，fw＝221.19，～415mL)逐滴添加到搅拌的混合物中，添加速率使得反应放热将反应温度保持在45-55oC的范围。在这些条件下，溴癸烷添加需要约2小时。在全部溴癸烷添加完且反应温度降至低于45℃之后，将搅拌的反应混合物加热至80℃，保持1hr，然后使其冷却。通过HPLC(方法10g)周期性地监测反应混合物，以便确保溴癸烷被完全消耗。在反应期间，开始形成产物的不那么稠(lessdense)的上层，其体积随着反应混合物冷却至环境温度而增加。在冷却后，当反应温度达到约50℃时，向搅拌的混合物分批添加100mL蒸馏水，以便有利于相分离并防止吡咯烷氢溴酸盐的结晶。当反应温度低于30℃时，将其转移至2L分液漏斗中，并使其静置约3小时，以允许完全的相分离。将上层相保留在漏斗中，添加1.0L10％w/wNaOH在蒸馏水中的溶液，将混合物充分混合，然后允许其沉降过夜。分离各相，保留上层产物相，添加1.0L1％w/wNaOH在蒸馏水中的溶液，将混合物充分混合，然后再次允许其沉降过夜。分离各相，并将上层产物相与80g无水硫酸镁粉末一起置于烧杯中。将粘稠的混合物手工混合约15分钟，然后经微孔性烧结玻璃过滤器过滤。一旦产物被过滤，则将硫酸镁用少量正戊烷洗涤并过滤。将戊烷溶液与过滤的产物合并，并置于旋转蒸发仪上。在减压下除去大部分挥发性组分(戊烷、残留的乙腈、吡咯烷、水)。使用旋转蒸发仪，在真空下(～10托)将粘稠的产物搅拌并加热(70℃，乙二醇-水浴)过夜(18hr)，同时在液体N₂温度下捕获挥发物。最后，再次在真空线上(0.5托，100℃)将混合物搅拌并加热过夜以除去最后痕量的挥发物。该操作得到399g(94％)淡黄色粘稠液体，其纯度为99.0-99.6％(GC，HPLC)。该物质对于大多数应用是足够纯的。若需要，则将该物质蒸馏(118-122℃，3托)，得到无色液体的90％蒸馏收率(99.8％纯度)。

这是干净的反应，若起始的仲胺和初级烷基氯化物本身是纯的，则其产生纯的产物。在该反应中，初级烷基氯化物相当好地起作用，且为了完全反应，需要将反应时间略微延长。在使用各种ⁿC₅-ⁿC₁₂烷卤化物的同时，使用各种伯胺成功地进行该反应：二甲胺、N-甲基乙基胺、二乙基胺、二正丙基胺、二正丁基胺、吡咯烷、哌啶、N-甲基苄基胺、N-乙基苄基胺、N-甲基苯胺的50％水溶液。对于上述反应，选择1:3的比例以使二癸基吡咯烷鎓溴化物副产物的产生最小化。可以通过如下使过量的仲胺再生并循环：向用过的反应混合物添加无机碱(NaOH小球，50％NaOH、LiOH水溶液，无水Na₂CO₃、Na₃PO₄)，以再生游离胺，随后蒸馏以回收胺或胺/溶剂混合物。

实施例11：N-(4-氟苄基)-N-癸基吡咯烷鎓氯化物(fw＝355.97)的制备

在装配有加热套、机械搅拌器、500mL加料漏斗、回流冷凝器和特氟龙涂布的热电偶的2L4-颈圆底烧瓶中，向720mL搅拌的乙腈中添加380.5g纯化的N-癸基吡咯烷(1.8mole,fw＝211.39)。反应在氮气氛下进行，伴随缓慢的N₂吹扫。将反应混合物加热至50℃，并在约60分钟的期间内逐滴添加289.1g新鲜蒸馏的4-氟苄氯(2.0mole，fw＝144.58)。然后将反应混合物加热至约80℃，保持8-12小时，并且通过HPLC周期性的监测(方法10a)，以确保起始的胺被完全消耗。将反应混合物冷却至室温，经由烧结的玻璃过滤，并置于旋转蒸发仪上以除去溶剂(乙腈)。在机械搅拌下将1.0L甲基叔丁基醚(MTBE)分批添加至粘性的橙黄色反应残余物。一旦该混合物完全悬浮在溶剂中，即将其转移至干净的4L锥形瓶中，并在搅拌下缓慢添加另外量的MTBE(1.9L)。使混合物在环境温度下静置过夜，经由大的烧结玻璃过滤器过滤，用MTBE洗涤两次，然后通过使干N₂经过产物而干燥。注：该晶体状物质非常吸湿且从空气中快速吸收水分，在数分钟内使白色晶体转变成无色液体的浆。因此常规过滤是很难的，且应当在干燥箱中进行或者在干N₂或干空气的覆盖下进行。最后将产物在真空烘箱中干燥(55℃，20托，3hr；95℃，20托，15hr)，冷却并保存在干燥器中P₂O₅上的密封容器中。该操作得到约576g(90％)的白色晶体状产物(小片)，其纯度为>99％。当在90-140℃之间以1.0℃/分钟的加热速率测量时，在137-138℃测量到玻璃毛细管中的尖锐熔点。该化合物看起来以具有不同熔点的多种多晶型晶体形式存在。由乙腈/MTBE中结晶的该物质形成晶体，该晶体会在120℃或以下熔解，在约137℃下再结晶和再熔解。缓慢加热似乎促进多晶型的热互换。若使其在90℃下老化足够长时间(数天)，该物质被转化为更高熔点的形式。注意，表观熔点被少量水分的存在而显著降低。

使用热的DME/MTBE实现重结晶。将100g的上述产物溶解在450g热的(～75℃)不含过氧化物的1,2-二甲氧基乙烷(DME)并迅速经由烧结的玻璃过滤器过滤至干净的1L过滤烧瓶中。使用55g热的DME来洗涤过滤器。将过滤烧瓶的臂塞住，并将烧瓶中的混合物加热至约75℃，然后使其冷却至约50℃。然后向搅拌的混合物添加约270gMTBE，并将混合物再次短暂加热至50℃。然后将烧瓶盖上，并允许温的溶液不受干扰地冷却至室温。在环境温度下，在三小时内从溶液中结晶出大量大的白色片状物。最后，将混合物在4℃下静置过夜(15-18hr)，以便完成结晶。采取适当的预防措施以保护其不接触大气水分(见上文)，将冷的混合物经烧结的玻璃过滤器过滤，用MTBE洗涤两次(环境温度)并如上在过滤器上干燥。将产物在真空烘箱中再次干燥过夜，冷却并保存在干燥器中P₂O₅上的密封容器中。该操作得到约76g(76％)的白色晶体状氧(HPLC纯度为99.7-99.9％)。滤液含有相当大量的纯产物。将溶剂完全除去，并使用相同的方法将白色残余物再次重结晶，或者将其与下一批产物合并用于重结晶。重结晶的总收率为87-95％。

实施例12：N-(4-氟苄基)-N-癸基吡咯烷鎓氢氧化物(fw＝337.53)的制备

在聚丙烯烧瓶中，在不含CO₂的N₂气氛中将178g重结晶的N-(4-氟苄基)-N-癸基吡咯烷鎓氯化物(500mmole，fw＝355.97)溶解在445mL脱气的去离子水中。向溶液中添加61.4g氧化银(I)(265mmole，fw＝231.74)，并在室温下用机械聚丙烯螺旋桨剧烈搅拌48小时。在氮气覆盖下，在聚丙烯布氏过滤器中将混合物经由聚丙烯过滤器/毛毡过滤进入聚丙烯接收烧瓶中。将清水溶液置于旋转蒸发仪上，并在36-48小时的期间内在真空下部分除去水，同时使用外部加热浴将产物(粘稠液体)保持在约50℃。酸-碱滴定(氢氧化物)和HPLC分析(阳离子)显示最终的溶液含有约41％的季铵盐氢氧化物(quathydroxide)；原子吸收显示残余的Cl-低于2ppm。将溶液保存在环境温度下的密封的、干净的聚丙烯容器中。收率接近定量。

修改：该方法普遍适用于本文所述的大多数季铵盐氯化物/溴化物盐。当然，具有碱-敏感性基团的化合物(醇、酰胺、酯等)作为氢氧化物盐经常不稳定。使用其它方法，例如离子交换、电解或电渗析，将稳定的季铵盐也转化成氢氧化物盐。

实施例13：N-(4-氟苄基)-N-癸基吡咯烷鎓三氟乙酸盐(fw＝433.53)的制备

方法A.将35.6g纯化且重结晶的N-(4-氟苄基)-N-癸基吡咯烷鎓氯化物(100mmole，fw＝355.97)置于100mL分液漏斗中，随后添加35.6g脱气的去离子水。摇动烧瓶，直至形成澄清的粘稠溶液(～1.5M溶液)。向混合物中添加17.1g三氟乙酸(150mmole，fw＝114.02)，将其剧烈混合。立即形成两相，其在60分钟后完全分离。季铵三氟乙酸盐包含在下层中，且水、HCl和过量的CF₃CO₂H在上层中。将各层分离，将下层中的产物置于旋转蒸发仪上，以便在真空下除去残余的水、HCl和CF₃CO₂H(浴温度＝50℃，真空度＝20托)。该存在得到40.8g(94％)纯的、澄清的粘稠油(离子液体)。该物质适于用作置换剂。季铵阳离子的HPLC纯度与起始物质基本相同。残余的氯化物含量为约1mole％(氯化物滴定)且以游离三氟乙酸计的过量三氟乙酸盐为2-5mole％(酸滴定)。按照相同的操作用等重量的30％(w/w)三氟乙酸水溶液进行的第二次萃取得到相同的产物，其含有相同量的残余三氟乙酸但且氯化物含量下降至<0.1mole％。尽管三氟乙酸盐(TFA)在纯水中的溶解度(～120mM)低于氯化物盐的溶解度(2.0M)，但对于置换剂应用(10-50mM)，TFA盐的溶解性足够。

方法B.这是基于两相二乙醚-水萃取中的分配行为而对方法A的修改。季铵氯化物盐强烈地分配在水层中，而季铵三氟乙酸盐强烈地分配在醚层中。53.4g纯化的和重结晶的N-(4-氟苄基)-N-癸基吡咯烷鎓氯化物(150mmole，fw＝355.97)置于250mL分液漏斗中，然后添加53.4g脱气的去离子水。摇动烧瓶，直至形成澄清的粘稠溶液(～1.5M溶液)。向混合物中添加25.6g三氟乙酸(225mmole，fw＝114.02)，将其剧烈混合。立即形成两层，产物在下层中。将110mL不含过氧化物的二乙醚添加到分液漏斗中，并将混合物再次剧烈混合。2小时后，各相完全分离，产物在上层醚相中。将下层相弃去并保留上层。添加55mL蒸馏水中的1％三氟乙酸，将混合物剧烈混合且再次使各相分离。同样，保留上层相，用无水硫酸镁干燥，过滤，并置于旋转蒸发仪上，以便除去醚以及残余的HCl、三氟乙酸和水。该操作得到59.2g(91％)纯的澄清粘稠的油(离子液体)。该物质适于用作置换剂。季铵盐阳离子的HPLC纯度与起始物质基本相同。残余氯化物的含量为<0.1mole％(氯化物滴定)且以游离三氟乙酸计的过量三氟乙酸盐为1-3mole％(酸滴定)。

方法C.在250mL锥形瓶中，将35.6g纯化的和重结晶的N-(4-氟苄基)-N-癸基吡咯烷鎓氯化物(100mmole,fw＝355.97)溶解在75mL蒸馏水中。向溶液中添加23.1g三氟乙酸银(I)(105mmole，fw＝220.88)和100mL不含过氧化物的二乙醚，并将其在室温下剧烈地机械搅拌48小时。将混合物过滤，以除去银盐，将两个液相分离，将上层产物相干燥，然后再次过滤。将醚溶液置于旋转蒸发仪上，以除去醚以及残余的水。该操作得到41.2g(95％)纯的澄清的粘稠油(离子液体)。该物质适于用作置换剂。季铵阳离子的HPLC纯度与起始物质的基本相同。残余的氯化物含量为<0.01mole％。

方法D.将84.6gN-(4-氟苄基)-N-癸基吡咯烷鎓氢氧化物溶液(100mmole，39.9％，fw＝337.53)置于经校准的1000mL容量瓶中，添加约800mL不含CO₂的蒸馏水并混合。不作任何耽搁，搅拌和pH监测的同时，小心地滴加三氟乙酸(～11.4g，fw＝114.2)。当已添加95％的酸时，一次一滴地添加酸的小滴，直至达到未缓冲的终点(pH＝5-8)。添加额外的不含CO₂的蒸馏水，直至体积恰好为1000mL。该100mM储液适于用作置换剂。

使用该方法可以很容易制备大范围的盐，包括甲酸盐、乙酸盐、溴化物、硝酸盐、碘化物、甲烷磺酸盐、三氟甲烷磺酸盐(triflate)、三氯乙酸盐和高氯酸盐。

方法E.将84.6gN-(4-氟苄基)-N-癸基吡咯烷鎓氢氧化物溶液(100mmole，39.9％，fw＝337.53)和100mL不含过氧化物的二乙醚置于250mL锥形瓶中。不作任何耽搁，将混合物剧烈地机械搅拌，并小心地滴加三氟乙酸(～11.4g，fw＝114.2)，其滴加速率使得温度的升高最小化。室温混合物分成两个液相，将上层产物相干燥并过滤，将醚溶液置于旋转蒸发仪上，除去醚以及残余的三氟乙酸和水。该操作得到42.0g(97％)纯的澄清的粘稠油(离子液体)。该物质适于用作置换剂。季铵阳离子的HPLC纯度与起始物质基本相同。残余的氯化物含量为<0.01mole％。

方法F.在装配有加热套、机械搅拌器、50mL加料漏斗和回流冷凝器的250mL4-颈圆底烧瓶中，将38.1g纯化的N-癸基吡咯烷(0.18mole，fw＝211.39)添加到75mL搅拌的乙腈中。反应在氮气氛下进行。将搅拌的混合物升温至约50℃，且在约60分钟的期间内逐滴添加44.4g新鲜蒸馏的4-氟苄基三氟乙酸盐⁴(0.20mole，fw＝222.14)。然后将反应混合物在回流条件下加热约24小时，并通过HPLC周期性地监测，以确保起始的胺被完全消耗。将反应混合物冷却至室温，经由烧结的玻璃过滤，并置于旋转蒸发仪上以除去溶剂(乙腈)。在机械搅拌下向黄色的反应残余物中分批添加100mL正戊烷。一旦该混合物与溶剂完全混合，则将上层完全除去并丢弃。向油状产物层添加等体积的不含过氧化物的二乙醚并充分混合。添加100mL正戊烷，将混合物充分混合并使其沉降，并分离和弃去上层。利用二乙醚和戊烷的该研磨过程再充分两次，以除去尽可能多的有色和有机杂质。最后，将混合物在真空线上加热过夜(0.5托，80℃)以除去最后痕量的挥发物。该操作得到约55g(71％)的淡黄色油状产物，其纯度为98.5-99.0％(HPLC)。使用色谱法很容易将该油状产物纯化，但难以通过其它方法纯化；因此，该制备方法不那么优选。

实施例14：N,N-二庚基-1,2,3,4-四氢异喹啉鎓溴化物(fw＝410.49)的制备

在装配有磁力搅拌棒、加热套、250mL加料漏斗、回流冷凝器和特氟龙涂布的热电偶的500mL3-颈圆底烧瓶中，将48.0g新鲜蒸馏的1,2,3,4-四氢异喹啉(360mmole，fw＝133.19)和49.1g二异丙基乙基胺(380mmole，fw＝129.25)添加到120mL乙腈中。反应在氮气氛下进行，伴随缓慢的N₂吹扫。将搅拌的混合物加热至50℃，并在约60分钟的期间内逐滴添加143.3g新鲜蒸馏的1-溴庚烷(0.80mole，fw＝179.11)。然后将反应混合物加热至约80℃，保持10-12小时，并通过HPLC周期性地监测，以确保起始的胺被完全消耗。将反应混合物冷却至室温，并在强烈搅拌下滴加50％氢氧化钠水溶液。用pH试纸监测水层的pH。当混合物变得足够碱性时(～29gNaOH)，除去下层水相，将有机溶液过滤并置于旋转蒸发仪中，以便在真空下部分地除去挥发性组分(乙腈、水、二异丙基乙基胺)。当产物开始从溶液中结晶时，在搅拌下分批添加约300mL二乙醚。在4℃下使混合物静置过夜。经由烧结的玻璃过滤冷的混合物，用二乙醚洗涤固体，并通过使干氮气经过而将其在过滤器上干燥。最后将其在真空烘箱中(50℃，20托)干燥过夜。通过如下将该粗产物重结晶：将其溶解在最小量的热(70℃)乙腈中，将热溶液迅速经由烧结的玻璃过滤并使其冷却。结晶在室温下静置时发生并通过在冷却下添加二乙醚而完全。如前述处理产物。该操作获得约102g(69％)纯的晶体状产物，其纯度为>99％(HPLC)。实施例15：3,5-双(N,N-二甲基癸基铵甲基)-1-氟苯二溴化物(fw＝652.68)的制备

在装配有加热套、机械搅拌器、500mL加料漏斗、回流冷凝器和特氟龙涂布的热电偶的2L4-颈圆底烧瓶中，将77.9g新鲜蒸馏的N,N-二甲基癸基胺(420mmole，fw＝185.36)添加到1L搅拌的乙腈中。反应在氮气氛下进行，伴随缓慢的N₂吹扫。将搅拌的混合物加热至50℃，并在约60分钟的期间内逐滴添加200mL乙腈中的56.4g新鲜重结晶的3,5-双(溴甲基)-1-氟苯⁵(200mmole，fw＝281.96)；反应为温和放热。然后将反应混合物加热至约80℃，保持3-5小时，然后趁热快速经由烧结玻璃过滤器过滤进入2L干净的过滤器烧瓶中。在冷却至室温后，在溶液中形成大量白色晶体。通过在室温下静置约3小时使产物从溶液中结晶，然后在4℃下使混合物静置过夜。将冷的混合物经由烧结玻璃过滤器过滤，用冷的乙腈洗涤和随后用正戊烷洗涤，最后通过使干N₂经过产物而干燥。最后将产物在真空烘箱中(50℃，20托)干燥过夜，冷却并保存在密封的容器中。该操作得到约125g(96％)白色晶体状产物。将其从热乙腈中重结晶(9-10g溶剂每克产物)，得到120g纯化的产物(99.5-99.8％纯度，HPLC)。

Claims (23)

1.通过反相置换色谱法从混合物分离有机化合物的方法，包括：

提供疏水性固定相；

向所述疏水性固定相施加包含待分离的有机化合物的混合物；

通过向所述疏水性固定相施加包含非表面活性疏水性阳离子置换剂分子和10wt％以下的有机溶剂的水性组合物而从所述疏水性固定相置换所述有机化合物；以及

收集从所述疏水性固定相洗脱的含有被分离的有机化合物的多个馏分；

其中所述非表面活性疏水性阳离子置换剂分子包含疏水性阳离子和反离子CI，其具有通式A或B：

其中在所述通式A和B中，各CM或CM’独立地为带有形式电荷的疏水性化学部分，所述化学部分选自：季铵(I)、季鏻(II)、锍(III)、氧化锍(IV)、咪唑啉鎓(脒鎓)(V)、胍鎓(VI)、咪唑鎓(VII)、1,2,3,4-四氢异喹啉鎓(VIII)、1,2,3,4-四氢喹啉鎓(IX)、异吲哚啉鎓(X)、吲哚啉鎓(XI)、苯并咪唑鎓(XII)、吡啶鎓(XIIIa、XIIIb、XIIIc、XIIId)、喹啉鎓(XIV)、异喹啉鎓(XV)、羧酸盐(XVI)、N-酰基-α-氨基酸(XVII)、磺酸盐(XVIII)、硫酸盐单酯(XIX)、磷酸盐单酯(XX)、磷酸盐二酯(XXI)、膦酸盐单酯(XXII)、膦酸盐(XXIII)、四芳基硼酸盐(XXIV)、硼酸盐(XXV)、硼酸盐酯(XXVI)；其中所述化学部分(I)-(XXVI)具有以下化学结构：

其中在通式B中，CM和CM’独立地为带有相同或相反的形式电荷的带电荷的化学部分，且通过双连接的化学部分R*而彼此化学地连接，其中R*替换CM上的一个R¹、R²(若存在)、R³(若存在)或R⁴(若存在)化学部分且替换CM’上的一个R¹、R²(若存在)、R³(若存在)或R⁴(若存在)化学部分；

其中各R¹、R²、R³和R⁴是独立地由下式定义的直链或支链的化学部分，

-C_xX_2x-2r-AR¹-C_uX_2u-2s-AR²，

R*是直接化学键或是由下式定义的双连接的直链或支链的化学部分，

-C_xX_2x-2r-AR¹-C_uX_2u-2s-，

且R⁵为由下式定义的直链或支链的化学部分，

-C_xX_2x-2r-AR²；

其中各AR¹独立地为衍生自甲烷的双连接的亚甲基部分-CX¹X²-、衍生自苯的双连接的亚苯基部分-C₆G₄-、衍生自萘的双连接的亚萘基部分-C₁₀G₆-或衍生自联苯的双连接的亚联苯基部分-C₁₂G₈-；

其中AR²独立地为氢(-H)、氟(-F)、苯基(-C₆G₅)、萘基(-C₁₀G₇)或联苯基(-C₁₂G₉)；

其中各X、X¹和X²各自独立地为-H、-F、-Cl或-OH；

其中任意-C_xX_2x-2r-内或任意-C_uX_2u-2s-内或任意-(CX¹X²)_p-内的任意亚甲基部分(-CX¹X²-)可以各自独立地被独立的醚-氧原子-O-、独立的硫醚-硫原子-S-、或独立的酮-羰基-C(O)-替换，其方式为使得各醚-氧原子、各硫醚-硫原子或各酮-羰基的每一侧与脂肪族碳原子或芳香族碳原子键合；

其中任何-C_xX_2x-2r-或任何-C_uX_2u-2s-内可替换有不超过两个醚-氧原子、不超过两个硫醚-硫原子和不超过两个酮-羰基；

其中m_x是各-C_xX_2x-2r-中被醚-氧原子、硫醚-硫原子和酮-羰基替换的亚甲基的总数目，且m_u是各-C_uX_2u-2s-中被醚-氧原子、硫醚-硫原子和酮-羰基替换的亚甲基的总数目；

其中G各自独立地为-H、-F、-Cl、-CH₃、-OH、-OCH₃、-N(CH₃)₂、-CF₃、-CO₂Me、-CO₂NH₂；-CO₂NHMe、-CO₂NMe₂的任意组合；

其中G*各自独立地为-F、-Cl、-R²、-OH、-OR²、-NR²R³、-CF₃、-CO₂Me、-CO₂NH₂；-CO₂NHMe、-CO₂NMe₂的任意组合；

其中一对R²、R³和R⁴可以包含单独的化学部分，从而R²/R³、R²/R⁴、R³/R⁴、R^2’/R^3’、R^2’/R^4’或R^3’/R^4’各自独立地为-(CX¹X²)_p-，其中p＝3、4、5或6；

其中对于各R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R*，各x、r、u、s、m_x、m_u的整数值独立地选择，整数值r和s是所含的分离的顺式/反式烯类(烯烃)基团的总数加上所含的简单单环结构的总数且落在以下范围内：0≤r≤2和0≤s≤2，数值x+u-m_x-m_u落在以下范围内：0≤x+u-m_x-m_u≤11；

其中在A或B的CM或CM’内含有至少一个芳香族化学部分、杂环芳香族化学部分、咪唑啉化学部分、脒化学部分或胍化学部分；

其中各R化学部分的基团-疏水-指数n在数值上等于脂肪族碳原子的数目加上烯类碳原子的数目加上硫醚-硫原子的数目加上氯原子的数目加上氟原子的数目的五分之一加上醚-氧原子的数目的一半加上酮-碳原子的数目的一半加上数目超过六个的芳香族碳原子的数目的一半的总和减去超过一个的羟基氧原子的数目；

其中各[CM]或[CM-R*-CM’]的总-疏水-指数N在数值上等于脂肪族碳原子的数目加上烯类碳原子的数目加上硫醚-硫原子的数目加上氯原子的数目加上氟原子的数目的五分之一加上醚-氧原子的数目的一半加上酮-碳原子的数目的一半加上数目超过六个的芳香族碳原子的数目的一半的总和减去超过一个的羟基氧原子的数目；

其中R¹和R^1’的基团-疏水-指数¹n和^1’n落在以下范围内：4.0<¹n,^1’n<12.0，当存在时，R²、R^2’、R³、R^3’、R⁵、R^5’、R*的基团-疏水-指数²n、^2’n、³n、^3’n、⁵n、^5’n和*n落在以下范围内：0.0≤²n、^2’n、³n、^3’n、⁵n、^5’n、*n<12.0，且当存在时，R⁴和R^4’的基团-疏水-指数⁴n和^4’n落在以下范围内：0.0≤⁴n,^4’n≤5.0；

其中总-疏水-指数N除以g的值落在以下范围内：10.0≤N/g<24.0；

其中在A中，当带电荷的部分CM具有形式正电荷或形式负电荷时，g＝1，且在B中，当CM和CM’具有形式正电荷时或者当CM和CM’具有形式负电荷时，g＝2，且在B中，当CM具有形式正电荷且CM’具有形式负电荷时，g＝1；

其中对于环状化学部分所计算的基团-疏水-指数的数值平均分配在两个分别的R化学部分之间；

其中当仅有一个R化学部分连接至CM或CM’时，R¹被识别为该R化学部分；其中当有超过一个R化学部分连接至CM或CM’时，R¹被识别为具有基团-疏水-指数最大值的该R化学部分；其中当有超过三个R化学部分连接至CM或CM’时，R⁴被识别为具有基团-疏水-指数最小值的该R化学部分；且

其中CI是非干扰性的、带相反电荷的反离子或这样的反离子的混合物，且d的值为零、正整数或正分数，从而保持整个疏水性化合物的电中性。

2.如权利要求1所述的方法，其中包含非表面活性疏水性置换剂分子的所述水性组合物除了pH缓冲剂之外不含有添加的盐。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式I或II：

其中在所述通式I或II中，R¹是C₈-C₁₁烃基部分，R²和R³独立地为C₁-C₄烃基部分或苄基，且R⁴选自苄基、卤素取代的苄基、4-烷基苄基、4-三氟甲基苄基、4-苯基苄基、4-烷氧基苄基、4-乙酰氨基苄基、H₂NC(O)CH₂-、PhHNC(O)CH₂-、二烷基-NC(O)CH₂-，其中烷基为C₁-C₄，条件是在CM中存在不超过一个苄基基团。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式I或II：

其中在所述通式I或II中，R¹和R²独立地为C₄-C₈烷基或环己基，R³为C₁-C₄烷基，且R⁴为苯基、2-、3-或4-卤代苯基、苄基、2-、3-或4-卤代苄基、2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-或3,5-二卤代苄基、2,4,6-或3,4,5-三卤代苄基、C₆H₅CH₂CH₂-或2-、3-或4-三氟甲基苄基。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式VIII、IX、X或XI，R¹为C₅-C₁₁烷基且R²为C₁-C₈烷基。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式I或II：

其中在所述通式I或II中，R¹为C₆-C₁₁烷基，R²和R³独立地为C₁-C₄烷基，且R⁴为PhC(O)CH₂-、4-FC₆H₄C(O)CH₂-、4-CH₃C₆H₄C(O)CH₂-、4-CF₃C₆H₄C(O)CH₂-、4-ClC₆H₄C(O)CH₂-、4-BrC₆H₄C(O)CH₂-、dl-PhC(O)CH(Ph)-、Ph(CH₂)₂-、Ph(CH₂)₃-、Ph(CH₂)₄-、dl-PhCH₂CH(OH)CH₂-、t-PhCH＝CHCH₂-、1-(CH₂)亚萘基、9-(CH₂)蒽基、2-、3-或4-FC₆H₄CH₂-或苄基。

7.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式I或II：

其中在所述通式I或II中，R¹为C₆-C₁₁烷基，R²和R³一起为-(CH₂)₄-，且R⁴为PhC(O)CH₂-、4-FC₆H₄C(O)CH₂-、4-CH₃C₆H₄C(O)CH₂-、4-CF₃C₆H₄C(O)CH₂-、4-ClC₆H₄C(O)CH₂-、4-BrC₆H₄C(O)CH₂-、dl-PhC(O)CH(Ph)-、Ph(CH₂)₂-、Ph(CH₂)₃-、Ph(CH₂)₄-、dl-PhCH₂CH(OH)CH₂-、t-PhCH＝CHCH₂-、2-、3-或4-FC₆H₄CH₂-、苄基、3-ClC₆H₄CH₂-、2,6-F₂C₆H₃CH₂-、3,5-F₂C₆H₃CH₂-、4-CH₃C₆H₄CH₂-、4-CH₃CH₂C₆H₄CH₂-、4-CH₃OC₆H₄CH₂-、(CH₃)₂NC(O)CH₂-或(CH₃CH₂)₂NC(O)CH₂-。

8.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式I或II：

其中在所述通式I或II中，R¹为C₄-C₆烷基、苄基或2-、3-或4-FC₆H₄CH₂-，R²和R³独立地为C₁-C₈烷基、CH₃(OCH₂CH₂)₂-、CH₃CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂-或CH₃CH₂OCH₂CH₂-，且R⁴为Ph(CH₂)₄-、4-PhC₆H₄CH₂-、4-FC₆H₄CH₂-、4-CF₃C₆H₄CH₂-、PhC(O)CH₂-、4-FC₆H₄C(O)CH₂-、4-PhC₆H₄C(O)CH₂-、4-PhC₆H₄CH₂-、亚萘基-1-CH₂-、蒽基-9-CH₂-或Ph(CH₂)_n-，其中n＝5-8。

9.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式[(R¹R²R³NCH₂)₂C₆H₃G]²⁺，其中R¹为C₄-C₁₁烷基，R²和R³独立地为C₁-C₆烷基或者R²和R³一起为-(CH₂)₄-，且G为H或F。

10.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式[R¹R²R³NCH₂C₆H₄-C₆H₄CH₂NR¹R²R³]²⁺，其中R¹为C₄-C₁₁烷基，R²和R³独立地为C₁-C₆烷基或者R²和R³一起为-(CH₂)₄-。

11.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式III或IV：

其中在所述通式III或IV中，R¹为C₈-C₁₁烷基或4,4’-CH₃(CH₂)₄C₆H₄-C₆H₄CH₂-，R²为C₁-C₆烷基或4-FC₆H₄CH₂-，且R³为C₁-C₆烷基。

12.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式XIV或XV：

其中在所述通式XIV或XV中，R¹为C₈-C₁₁烷基。

13.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式XIIIa、XIIIb、XIIIc、XIIId或XIIIe：

其中在所述通式XIIIa、XIIIb、XIIIc、XIIId或XIIIe中，R¹为C₈-C₁₁烷基或C₈-C₁₁4-苯基，R²为H、C₁-C₆烷基或烷氧基、2-吡啶基、C₁-C₆烷基取代的2-吡啶基或吡咯烷基。

14.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式VII：

其中在所述通式VII中，R¹为C₅-C₁₁烷基，R²和R⁵独立地为H或C₁-C₆烷基或苯基。

15.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式XII：

其中在所述通式XII中，R¹为C₅-C₁₁烷基，R²和R⁵独立地为H或C₁-C₆烷基或苯基。

16.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式XXIV或XXV：

其中在所述通式XXIV中，R¹是苯基、4-EtC₆H₄-、4-ⁿPrC₆H₄-、4-ⁿBuC₆H₄-、4-MeOC₆H₄-、4-FC₆H₄-、4-MeC₆H₄-、4-MeOC₆H₄-、4-EtC₆H₄-、4-ClC₆H₄-或C₆F₅-；且各R²、R³和R⁴独立地为苯基、4-FC₆H₄-、4-MeC₆H₄-、4-MeOC₆H₄-、4-EtC₆H₄-、4-ClC₆H₄-或C₆F₅-；且

其中在所述通式XXV中，R¹是4-(4-ⁿBuC₆H₄)C₆H₄-或4-(4-ⁿBuC₆H₄)-3-ClC₆H₃-。

17.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有选自以下的通式：4-R¹C₆H₄SO₃H、5-R¹-2-HO-C₆H₃SO₃H、4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-4’-SO₃H和4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-3’-SO₃H，其中R¹是CH₃(CH₂)_n，其中n＝4-10且X是H或OH。

18.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式XVIII或XXIII：

其中在所述通式XVIII中和在所述通式XXIII中，R¹是C₆H₅(CH₂)_n-，其中n＝5-11。

19.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有选自以下的通式：5-R¹-2-HO-C₆H₃CO₂H和R¹C(O)NHCH(C₆H₅)CO₂H，其中R¹是CH₃(CH₂)_n-，其中n＝4-10。

20.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式4-R¹C₆H₄PO₃H₂其中R¹是CH₃(CH₂)_n-，其中n＝4-10。

21.如权利要求1或2所述的方法，其中CI是选自以下的非干扰性阴离子或非干扰性阴离子的混合物：Cl^-、Br^-、I^-、OH^-、F^-、OCH₃ ^-、d,l-HOCH₂CH(OH)CO₂ ^-、HOCH₂CO₂ ^-、HCO₂ ^-、CH₃CO₂ ^-、CHF₂CO₂ ^-、CHCl₂CO₂ ^-、CHBr₂CO₂ ^-、C₂H₅CO₂ ^-、C₂F₅CO₂ ^-、ⁿC₃H₇CO₂ ^-、ⁿC₃F₇CO₂ ^-、CF₃CO₂ ^-、CCl₃CO₂ ^-、CBr₃CO₂ ^-、NO₃ ^-、ClO₄ ^-、BF₄ ^-、PF₆ ^-、HSO₄ ^-、HCO₃ ^-、H₂PO₄ ^-、CH₃OCO₂ ^-、CH₃OSO₃ ^-、CH₃SO₃ ^-、C₂H₅SO₃ ^-、NCS^-、CF₃SO₃ ^-、H₂PO₃ ^-、CH₃PO₃H^-、HPO₃ ^2-、CH₃PO₃ ^2-、CO₃ ^2-、SO₄ ^2-、HPO₄ ^2-、PO₄ ^3-。

22.如权利要求1或2所述的方法，其中CI是选自以下的非干扰性无机阳离子或这样的非干扰性阳离子的混合物：碱金属离子、碱土金属离子、二价过渡金属离子和NH₄ ⁺；其中CI是选自以下的非干扰性有机阳离子或这样的非干扰性阳离子的混合物：质子化的伯胺(1+)、质子化的仲胺(1+)、质子化的叔胺(1+)、质子化的二胺(2+)、季铵盐离子(1+)、锍离子(1+)、氧化锍离子(1+)、鏻离子(1+)、双-季铵盐离子(2+)，其可以含有C₁-C₆烷基和/或C₂-C₄羟基烷基。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述碱金属离子是Li⁺、Na⁺、K⁺、Rb⁺或Cs⁺；碱土金属离子是Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺或Ba²⁺；二价过渡金属离子是Mn²⁺或Zn²⁺。