TWI418406B - 陽離子交換性置換層析法及用於陽離子交換性置換層析法中作為置換劑化合物之陽離子有機化合物 - Google Patents

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Description

陽離子交換性置換層析法及用於陽離子交換性置換層析法中作為置換劑化合物之陽離子有機化合物
本發明係關於包含多四級銨鹽(多四級銨鹽(multiple quats))之組合物及在層析純化中使用該等組合物作為置換劑之方法。
層析法之置換模式在1906年首次由Tswett驗證，Tswett注意到在過載之溶洗層析條件下發生了試樣置換。1943年，Tiselius提出可圍繞三個不同「模式」：前沿模式、溶洗模式及置換模式來組織寬廣之層析主題。此後，大部分發展及應用(尤其係分析型層析法中之發展及應用)均在溶洗層析法領域進行。事實上，術語「層析法」若不予進一步敘述，則如今通常指呈溶洗模式之層析法。
溶洗模式及置換模式在原理及實踐上均容易區分。在溶洗層析法中，將待純化之試樣溶液施加至一般存於管柱中之固定相上。對流動相加以選擇以使試樣以可逆方式結合而非不可逆吸附亦非完全不吸附。當流動相流經固定相時，在流動相與固定相之間建立平衡，從而視對固定相之親和力而定，此試樣以能反映其相對於原試樣中可能存在之其他組份之親和力的速率沿管柱流動。在標準溶洗層析法方面需特別注意如下事實：溶洗溶劑前沿(或無梯度溶洗中之零管柱體積)總是比試樣先離開管柱。
無梯度溶洗層析法之修改及擴展見於分步梯度層析法，其中使一系列組成不同之溶洗劑流經固定相。在離子交換性層析法中，採用(例如)流動相鹽濃度及/或pH之步驟改變來溶洗或解吸附接受分離之分析物。
置換層析法採用置換劑化合物來自管柱上移除混合物的各組份。置換劑化合物對固定相具有之親和力一般較待分離之混合物各組份高得多。此與溶洗層析法相反，在溶洗層析法中溶洗劑與待分離之組份相比對於固定相具有更低之親和力。置換層析法區別於溶洗或解吸附層析法之關鍵作業特徵為置換劑化合物之使用。在置換層析法中，首先用載劑溶劑在其中所有待分離之組份對於固定相均具有相對較高親和力之條件下平衡管柱。將一定體積之進料混合物(其可很大量且相當稀釋)裝載至管柱後，進料混合物中的各組份會吸附至固定相上。即，進料混合物之各組份經分配並吸附至固定相上且留在固定相上。若所有組份均需由置換來解析，則載劑溶劑自管柱排出而不含任何試樣。進料混合物之各組份現已留在固定相上，且管柱上每一組份之位置與其在初始條件下對固定相之相對親和力有關。原則上，在固定相之指定位置上，某一組份之分子會置換具有較低親和力之另一不同組份之分子。因此，各個組份最終會依親和力由最高到最低之順序排列在管柱上。
有時允許進料混合物中的一些組份(例如，對固定相不具有明顯親和力之組份)與載劑溶劑一起流過管柱係有利的；在此情形中僅有保留下之進料組份可由置換層析法解析。
將試樣裝載至管柱上後，將含有存於適宜溶劑之置換劑化合物的溶液引入管柱使其流過固定相。對置換劑化合物加以選擇以使其較進料混合物中任何組份對固定相皆具有更高之親和力。假設置換劑及流動相經適當選擇，則各個組份能依漸增吸收親和力之順序以高度濃縮、相對純淨材料之毗連區形式排出管柱。置換劑在經純化之各個組份組成的各區之後排出管柱。根據置換劑化合物跟隨在試樣之後且進料組份以高度濃縮、相對純淨材料之毗連區形式排出管柱之事實，可易於將置換層析譜與溶洗層析譜加以區分。
置換層析法對於製程級層析法具有某些特別有利之特徵。首先，置換層析法可在單個步驟中達成產物分離及濃縮。比較而言，無梯度溶洗層析法在分離期間會引起明顯之產物稀釋。其次，由於置換法在平衡等溫線之非線性區作業，故能夠實現高管柱裝載量。此使得較溶洗層析法更好地利用管柱。其次，管柱形成及組份分離較可比擬之溶洗過程需要更少之溶劑。再者，置換層析法可自具有低分離因數之混合物濃縮及純化組份，而在典型溶洗層析法中對於合意解析需要相對較大之分離因數。
憑藉所有此等優點，人們或許會設想置換層析法能夠得到廣泛使用。然而，在置換層析法中仍存在一些難題。難題之一係需要再生管柱，此乃因每次使用後丟棄固定相會十分浪費。另一此種難題係需獲得適宜之置換劑化合物，該等置換劑化合物應為相對簡單之化合物，容易合成及/或以合理(經濟)價格購得。該兩種難題已成為置換層析法相比於溶洗層析法之明顯缺點。
對於再生，由於置換法使用對固定相具有極高親和力之置換劑化合物，故再生及再平衡管柱所需之時間與溶洗層析法現比要長。此外，再生期間經常需要相對較大量之溶劑。此等難題已極大降低了置換層析法相對於溶洗層析法之優勢。
第二個難題即如何獲得相對容易合成及/或可以合理(經濟)價格購得之有用置換劑化合物，其原因為需要不但對固定相具有高親和力而且亦需能相對容易地在再生期間自管柱上移除之置換劑化合物。先前技術已提供之各種化合物無法滿足此兩項重要標準中之一或二項。已提供多種作為低分子量置換劑之化合物，但此等化合物目前仍很難合成及純化且無法以合理價格購得或不易購得。
為使置換層析法成為主流層析技術，尚存在對有效置換劑之極大的未滿足之需求，該等有效置換劑的合成及純化需簡單易行且允許大規模生產及/或可購得，且其允許有效再生固定相以使固定相隨後可在置換層析法中重複使用。
目前已發現，一類帶正電荷之低分子量化合物可在置換層析法中非常有效地作為置換劑化合物發揮作用。因此，本發明係關於一種置換層析法及一組置換劑化合物。本發明之置換劑化合物在置換層析法中用作置換劑化合物之後可有效地自固定相上移除，從而允許固定相再生並在後續置換層析法中重複使用。此外，此等置換劑化合物可藉由相對簡單易行且價廉之合成方法以良好產率及高純度製成。因此，本發明可解決上述先前技術之置換層析法中存在的難題。
根據本發明一實施例之置換劑化合物屬於一類稱作有機四級銨鹽(多四級銨鹽)之化合物。多四級銨鹽係含有帶正電荷之氮原子的組合物。此等組合物含有脂族鏈，不過可在許多情形下溶於水。當溶於水時，此等化合物可展現具有不受pH變化影響之正電荷之有用特性。即，氮中心上之電荷並非為胺之簡單質子化的結果，故此等鹽之水溶液之pH可在寬範圍內加以調節而不引起氮中心上正電荷之損失。常見聚胺及相關化合物通常無法在陽離子交換性置換層析法中用作置換劑化合物。此乃因其無法在與置換層析樹脂相容之pH範圍內完全質子化且因此而不能形成足夠的正電荷。相反，本發明之置換劑化合物可在層析樹脂能保持穩定之任何pH範圍內使用。
在一實施例中，本發明係關於一種置換層析法，其包括：將一含有至少一種待分離組份之混合物裝載至一適宜固定相上；藉由向該固定相施加一含有具有通式(I)之置換劑化合物之混合物來自該固定相上置換該至少一種組份： 其中：每一基團R1 、R2 、R3 、R'1 、R'2 及R'3 可獨立選自烷基、芳基及芳烷基，且其中含有一或多個四價氮之環可由R1 及R2 、R1 及R'1 、R1 及R4 、R4 及R'4 或R4 及R5 中的任一個或多個形成；每一R4 、R'4 、R5 及R'5 可獨立選自烷基、芳基、芳烷基及－(CH2 )a －(CHY)b －(CH2 )c －N＋ R1 R2 R3 An－ ，其中R1 、R2 及R3 如上文所定義；每一Y可獨立選自－H、－OH、－OR6 、鹵基、烷基、芳基及芳烷基，其中－R6 可為烷基或－(CH2 )a －(CHOH)b －(CH2 )c －N＋ R1 R2 R3 An－ ，其中R1 、R2 及R3 如上文所定義，且一或多個Y可為可由一或多個電磁法檢測之基團；每一q及z可獨立為選自0至約6之任一整數，但限制條件為q＋z等於或小於約6；每一a、b及c可獨立為選自0至2之任一整數，但限制條件為任何片段中a＋b＋c之總和至少為1；且每一An－ 可獨立為得到一中性化合物所需之一或多個有機或無機、單價或多價陰離子。
在一實施例中，本發明係關於一種由上述通式(I)定義之組合物。在一實施例中，本發明係關於一種具有下列結構並稱作TBTQ－A之組合物：
在一實施例中，根據通式(I)之組合物非為DBQ、DMTQ、DBTQ、BTA及DBD，其各具有如下文定義之結構。
在一實施例中，本發明係關於一種可用於置換層析法之置換劑組合物。在一實施例中，該置換劑組合物包含呈適宜水溶液形式之如上所示通式(I)之化合物。在一實施例中，本發明係關於一種可用於置換層析法之具有上述結構且定名為TBTQ－A的置換劑組合物。在一實施例中，該置換劑組合物非為DBQ、DMTQ、DBTQ、BTA及DBD。
在一實施例中，本發明提供一種用於進行經受置換層析之試樣中微量組份之檢測、收集或定量中一或多種之方法。
因此，本發明提供用於置換層析法之置換劑化合物、組合物及方法，其可解決對有效置換劑化合物之需要，該等有效置換劑化合物之合成及純化簡單易行且可允許大規模生產，其允許有效再生固定相以使固定相可有效地重複使用。此外，本發明提供一種方法，藉助該方法試樣或混合物中之微量組份可得到檢測、收集及/或定量。
本文所用「鹵基」係指含有鹵素(例如氯、溴、氟或碘)之基團。
本文所用「烷基」及「伸烷基」係指源自烷烴分子在適宜處移除一或兩個氫原子之含有碳及氫原子之基團。「烷基」及「伸烷基」可包括具有直鏈、環狀或有支鏈部分之飽和單價及二價烴基。「烷基」或「伸烷基」基團可包含一可選碳－碳雙鍵或三鍵，其中該烷基基團包含至少兩個碳原子。應瞭解，對於環狀部分在該烷基基團中至少需要三個碳原子。在本發明中，烷基及伸烷基基團可包含任何數目之碳原子。在本發明一實施例中，可使用約20或以下之碳原子。舉例而言，在一實施例中，本發明中可採用含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個碳之烷基基團。當然，本發明可採用更長或有支鏈之烷基基團。在其中欲由兩個原本為烷基之基團形成一環之實施例中可採用伸烷基基團。
本文所用「芳基」係指未經取代或經取代之芳族結構，例如苯基、萘基、茀基、菲基等。芳基基團在取代時可經本文所定義之鹵基、烷基、另一芳基或芳烷基所取代。
本文所用「芳烷基」係指其中芳基一氫原子經一烷基取代之基團。「芳基」係如上文所定義。在本發明中，芳烷基可包含任何數目之碳原子。在本發明一實施例中，芳烷基含有約20或以下之碳原子。舉例而言，在一實施例中，本發明可採用含有7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個碳之芳烷基。當然，本發明可採用含有更多碳原子之芳烷基。
本文所用「An－ 」代表一或多個與本發明之置換劑化合物結合之有機或無機、單價或多價陰離子。與本發明四級銨離子結合之帶負電荷之陰離子的數目及總電荷會隨混合物之pH及用於中和之一或多種酸之陰離子而變化。本發明之陰離子An－ 可為熟習此項技術者已知的任何有機或無機、單價或多價陰離子，包括單價、二價及多價陰離子，例如磺酸根、三氟甲磺酸根、三氟甲磺醯胺、羧酸根、F－ 、Cl－ 、Br－ 、I－ 、ClO3 － 、HSO4 － 、SO4 2 － 、PO4 3 － 、HPO4 2 － 、H2 PO4 － 、PO3 2 － 、HPO3 － 、BF4 － 、PF6 － 及諸如此類。一般而言，需要時An－ 之化合物價及數目需經適當選擇以得到中性化合物。
若任一較低值與任一較高值間至少相差2個單位，則本文所引用之任何數值均包括以一個單位增加之自較低值至較高值間之全部數值。舉例而言，若一組份之量或一過程變量(例如，溫度、壓力、時間及諸如此類)之值為(例如)介於1至90之間，較佳介於20至80之間，更佳介於30至70之間，則吾人希望如15至85、22至68、43至51、30至32等值均明確列舉於本專利說明書中。對於小於1之數值而言，將1單位視情況定為0.0001、0.001、0.01或0.1。上述僅係特別希望之實例，介於所列舉之最低值與最高值間之數值的所有可能組合均被認為以類似方式明確闡釋於本申請案中。
陽離子置換劑化合物
本發明之陽離子置換劑化合物包括具有下式(I)之化合物： 其中每一基團R1 、R2 、R3 、R'1 、R'2 及R'3 可獨立選自烷基、芳基及芳烷基，且其中含有四價氮之環可由R1 及R2 、R1 及R'1 、R1 及R4 、R4 及R'4 或R4 及R5 中的任一個或多個形成；每一R4 及R5 係獨立選自烷基、芳基、芳烷基及－(CH2 )a －(CHY)b －(CH2 )c －N＋ R1 R2 R3 An－ ，其中R1 、R2 及R3 如上文所定義；每一Y可獨立選自－H、－OH、－OR6 、鹵基、烷基、芳基及芳烷基，其中－R6 可為烷基或－(CH2 )a －(CHOH)b －(CH2 )c －N＋ R1 R2 R3 An－ ，其中R1 、R2 及R3 如上文所定義，且一或多個Y可為可由一或多個電磁法檢測之基團；q及z各自可為選自0至約6之任一整數，但限制條件為q＋z等於或小於約6；a、b及c各自可為選自0至2之任一整數，但限制條件為任何片段中a＋b＋c之總和至少為1；且An－ 可為得到一中性化合物所需之一或多個有機或無機、單價或多價陰離子。
式(I)之置換劑化合物可含有一額外取代基，該取代基可使式(I)之置換劑化合物易於由紫外/可見光光譜法、螢光或熟習此項技術者已知的任何其他方法檢測。此一取代基亦或許影響該化合物對陽離子交換性層析之親和力，使其之結合更弱或更強。在一些情形中，不具有會妨礙檢測藉由置換層析法純化之該化合物之標準方式之取代基係有利的。後者情形的一實例可為在280奈米下不吸收UV光之式I置換劑化合物，280奈米為某些生物聚合物(蛋白質、寡肽、抗體等)之特徵吸收波長。用於增強檢測能力之適宜衍生劑為熟習此項技術者已知且可由熟習此項技術適當選擇。
在一實施例中，本發明之置換劑化合物中的一或多個Y可為一可由一或多個電磁法檢測之基團。該等電磁法包括(例如)紫外/可見光分光光度法、螢光分光光度法及放射性檢測法。適宜Y基團及用於檢測該等Y基團之適宜方法為熟習使用該等方法之技術者熟知。
適宜的例示性陽離子置換劑化合物包括(例如)下列具體實例，其中在每一情形中An－ 可為一或多個有機或無機、單價或多價陰離子，每一An－ 之數目及化合價經適當選擇以產生中性化合物(即，每一分子應具有零淨電荷，各個離子上之正負電荷應平衡)。下列具體化合物係作為由上文所示之通式(I)(包含其中定義之取代基)定義之置換劑化合物的實例給出。下列實例不欲限制根據本發明各種實施例之置換劑化合物，相反地僅欲提供對其加以舉例說明之具體實例。
DBQ，具有結構式： DMTQ，具有結構式： DBTQ，具有結構式： TBTQ－A，具有結構式： BTA，具有結構式： DBD，具有結構式： 其中在每一結構(即，DBQ、DMTQ、DBTO、TBTQ－A、BTA及DBD)中，An－ 可為一或多個有機或無機、單價陰離子或An－ 可為一多價陰離子，在該情形中，存在適宜數目之該等部分以產生中性分子。此An－ 之定義及用途適用於整個該說明書。
包含一含有四價氮之環的例示性置換劑化合物具有以下結構式，其中R4 經由一伸乙基與R'4 鍵合，其中R1 、R2 、R3 、R'1 、R'2 、R'3 、R5 及R'5 均為甲基，An－ 如上文定義，且其中Y＝－OH：
在一實施例中，本發明之置換劑化合物在該分子中不含醚基團。在一實施例中，本發明之置換劑化合物不含與相鄰的四價氮原子有關之醚基團。在一實施例中，本發明之置換劑化合物包含聚四級基團，其中相鄰的聚四級基團不是由含醚部分連接。在一實施例中，本發明之置換劑化合物不含樹枝狀聚醚。在一實施例中，本發明之置換劑化合物含有四級氮原子，該等氮原子未與由醚或聚醚得到之基團連在一起。
根據本發明一實施例，適宜固定相係一陽離子交換樹脂。適宜陽離子交換樹脂為業內已知，且一般包括如下樹脂：例如甲基丙烯酸酯、矽石、聚苯乙烯或聚苯乙烯－二乙烯基苯，該等樹脂已用一其上吸引有陽離子之陰離子部分(例如羧甲基、磺丙基、磺酸、碳酸等)衍生化。適宜陽離子交換材料可由熟習此項技術者根據待分離材料之類型加以選擇。在一實施例中，適宜與本發明一起使用之陽離子交換樹脂包括(例如)購自Tosoh公司，Tokyo，Japan及Montgomeryville，PA之Tosoh SP－5PW、Tosoh CM－650、SP－650及SP－550、TOYOPEARLSuper－Q 650S、TOYOPEARLCM 650S及TSK Gel SP－5PW陽離子交換樹脂。額外適宜陽離子交換樹脂包括(例如)購自Bio－Rad Laboratories(Hercules，CA)之UnoSphere S及MacroPrep S/MacroPrep High－S；購自Advanced Seperation Technology(Whippany,NJ)之CHIROBIOTIC；購自Waters Corporation(Mitford，MA)之SP－8HR及SP－15 HR；購自GE－Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)之Mini S、Source 15S、Mono S、SP SEPHAROSEHP及SP SEPHAROSEFF；購自Showa Denko(New York，NY)之SHOWDEXIEC SP－825及SHOWDEXIEC SP－2025；購自Polymer Laboratories(Amherst,MA)之PL－SCX；購自Alltech Laboratories(Deerfield,IL)之Macrosphere300；購自PolyLC公司(Columbia,MD)之PolySulfoEthylA；以及購自EMD Chemicals公司(Gibbstown、NJ)之FRACTOGELEMD SE Hicap及FRACTOGELEMD S03。亦可使用其他適宜陽離子交換樹脂。
根據本發明一實施例，該置換層析法可用於分離及純化蛋白質及多肽。本文所用蛋白質在廣義上定義為分子量大於約5 kDa(千道爾頓)之聚胺基酸，且多肽係分子量小於約5 kDa之聚胺基酸。熟習此項技術者會瞭解，蛋白質與多肽之間的差異不只一個程度。一般而言，蛋白質展現三級結構，而多肽通常不會。
在一實施例中，本發明特別適用於自含有各組份之混合物中分離該等組份，例如蛋白質及多肽。在一實施例中，該混合物中該一或多個組份包括一或多個多肽、一或多個蛋白質或一任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。即，本發明之方法適用於分離蛋白質之混合物、多肽之混合物及蛋白質與多肽二者之混合物。在一實施例中，該一或多個蛋白質具有約5 kD或更高之分子量。在一實施例中，該混合物包含兩個或兩個以上蛋白質、兩個或兩個以上多肽或其一混合物。
在一實施例中，來自該混合物之蛋白質及/或多肽係以液份形式置換出該固定相，該液份中該蛋白質及/或多肽大體上富集及/或該蛋白質及/或多肽大體上與其他蛋白質及/或多肽組份分開。即，在一實施例中，在將一含有感興趣蛋白質或多肽之混合物施加至固定相上，在將該蛋白質或多肽置換出固定相並以一或多個液份之形式收集時，該蛋白質及/或多肽係以富集(即，更濃縮)形式或以大體上與原始混合物中其他不同蛋白質及/或多肽組份分開之形式或以上述兩種形式於液份中獲得。因此，很明顯該混合物可包含兩個或兩個以上待分離之組份。如下文所述，在一些實施例中，接受根據本發明之置換層析之混合物可包含來自多種不同來源之許多不同材料的組合，且本發明之方法可有效地應用於該等複合混合物上以分離其各組份。
在另一實施例中，本發明適用於一含有至少一種組份(例如蛋白質、多肽或其他，如下文所定義)與至少一種雜質的混合物。在此實施例中，本發明之方法可用於自雜質中純化組份。該種雜質之移除可如下實現：(1)已置換所尋找或所需組份後使雜質固定或保留在固定相上(例如，在固定相作為過濾器發揮作用之情形中)，或(2)在雜質可藉由更類似於「傳統」溶洗層析法之方法移除之情形中將雜質自固定相中漂洗出或溶洗出。在此實施例中，在雜質已固定在管柱上或已自管柱上移除時，隨後藉由本文所述置換層析法將期望組份自管柱上移除。
本發明適用於多種組份，不僅包括上述蛋白質、多肽及雜質，而且適用於許多其他組份。在一實施例中，該混合物可包含一或多個天然或重組抗體或一任意兩個或兩個以上該等抗體之混合物。在一實施例中，該混合物可包含一或多個天然或重組酵素或一任意兩個或兩個以上該等酵素之混合物。在一實施例中，該混合物可包含一或多個用於診斷用途之天然或重組蛋白質或多肽或一任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。在一實施例中，該混合物可包含一或多個用於人類或獸醫治療用途之天然或重組蛋白質或多肽或一任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。在一實施例中，該混合物可包含一或多個源自一或多個天然或重組動物或人類血漿之蛋白質或多肽或任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。在一實施例中，該混合物可包含一或多個源自一或多個天然或重組植物材料之蛋白質或多肽或任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。在一實施例中，該混合物可包含一或多個源自動物或人類乳汁或源自重組動物之乳汁中一或多個的蛋白質或多肽或任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。在一實施例中，該混合物可包含一或多個源自一或多個天然或重組禽蛋之蛋白質或多肽或任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。在一實施例中，該混合物可包含一或多個源自一或多個天然或重組細菌、酵母、真菌、病毒或昆蟲之蛋白質或多肽或任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。在一實施例中，該混合物可包含一或多個源自一或多個天然或重組哺乳動物細胞培養物或動物組織之蛋白質或多肽或任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。在一實施例中，該混合物可包含一或多個有機化合物、藥物或藥物中間體或其任意兩個或兩個以上之混合物。在一實施例中，該一或多個有機化合物、藥物或藥物中間體中的一或多個係對掌性的。在一實施例中，該混合物可包括一任合上述者之混合物或組合，例如一抗體與酵素之混合物或一由植物材料及禽蛋得到之蛋白質及/或多肽的混合物或本發明之方法可對其適用之任何上述例示性組份的混合物。
在一實施例中，本發明之方法進一步包括在該置換劑自該固定相中排出時對其加以檢測之步驟，其中該檢測係藉由紫外/可見光吸收光譜、螢光發射光譜、質譜、pH、電導率及一或多個電化學法中的一或多個達成。上述者係檢測置換劑化合物時最常用之方法；可如業內所知使用其他適宜方法。該檢測會涉及一或多個如上所述之「Y」取代基。
在一實施例中，用於檢測該(等)自固定相置換出之組份的方法可適當根據所尋找之具體組份加以確定。因此，舉例而言，蛋白質及多肽可根據其紫外/可見光吸收光譜或特徵吸收之波長或顯像劑對其之衍生化來確定。類似地，藥物及藥物中間體可根據其紫外/可見光吸收光譜或特徵吸收之波長加以確定。
在一實施例中，本發明之方法進一步包括一或多個再生該固定相之步驟。在一實施例中，該再生可包括(例如)用一或多個下列各物處理該固定相：鹼金屬氫氧化物、鹼金屬鹽、鹼土金屬氫氧化物、鹼土金屬鹽、有機酸、烷基磺酸、四級銨氫氧化物、四級銨鹽、烷基胺，其中該溶液可進一步包含一適宜之pH緩衝液。需要時或適宜時可增加其他適宜再生步驟，包括用純水簡單漂洗。在一實施例中，該再生包括與水一起使用有機共溶劑。
在一實施例中，本發明提供一種用於進行經受置換層析之試樣中微量組份之檢測、收集或定量中一或多個之方法。儘管如先前實施例所述，本發明之方法一般可用作製備型純化方法，但置換層析法亦為一種有效之試樣製備技術，其可實現試樣中微量組份之簡便檢測、收集及定量。其濃度不足以在任一點使層析樹脂之容量飽和的試樣組份會無法參與到置換鏈中，但可改為沿介於試樣中主要組份之間及最後一主要組份與置換劑之間的狹窄過渡區實施。此清楚顯示於圖2中，其中過渡區標記為A、B及C。但不欲受理論限制，似乎為此等微量組份可能無法完全參與置換層析。在任何情形中，微量組份均離開管柱且因此可得到檢測、收集及/或定量。
對應於此等過渡區之液份的分離可得到對於微量組份大體上富集(10至400×)且主要組份明顯貧化之試樣。此組合允許較原始試樣更容易地辨別及定量次要組份及雜質。此等經富集試樣之分析可藉由任何適宜方法實施，包括在與用於置換層析相同之樹脂上進行溶洗層析。另一選擇為，若收集到足夠量之微量組份，則此等組份可經受置換層析。此實施例可用於最終產物分析、生物標記物之發現、過程控制及過程最佳化。本文所用術語「微量組份」係指經受置換層析之混合物中存在的相對較次要之組份，且每一該微量組份可佔起初經受本發明置換層析法之混合物的約0.01重量%至約10重量%。
在下列實例中，提供例示性合成程序，藉由該等程序可合成此等例示性陽離子置換劑化合物。本發明範圍內之其他適宜陽離子置換劑化合物可藉由熟習此項技術者已知及/或可如熟習此項技術者所瞭解根據上述方法改寫之方法合成。
本發明包括下列實例以闡述本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，下列實例中揭示的技術代表本發明之發明者發現可良好用於本發明實踐之技術，從而可認為該等技術構成本發明實踐之較佳模式。然而，熟習此項技術者借助於本揭示內容應瞭解，在所揭示之具體實施例中可實施多種改變且仍可獲得一相同或相似結果，此並不背離本發明之精神及範圍，其僅受隨附申請專利範圍之範圍限制。
實例1－Tetraquat即DBQ之合成：
藉由與兩當量二甲胺反應將1,3－二氯－2－丙醇(DCP)轉化為1,3－雙(N,N－二甲基胺基)－2－丙醇(「BDAP」)，基本如Perrine(J.Organic Chemistry，第18卷，第1137至1141頁(1953))所述。然後將新鮮蒸餾之BDAP(146克，1莫耳)及約170毫升水添裝入配有回流冷凝器之圓底燒瓶中。在3小時時間內逐滴加入N－(2－羥基－3－氯丙基)－N－苄基－N,N－二甲基氯化銨(905克，@59.8%固體＝541克＝2莫耳)之水溶液。在室溫下攪拌所得溶液11小時。然後將溶液加熱至50℃並在此溫度下保持1小時並持續攪拌，之後將其冷卻至室溫。所得之DBQ水溶液適合在如陽離子交換介質等適宜固定相上用作置換劑化合物。亦適合用作置換劑化合物之固體DBQ可藉由借助旋轉蒸發去除水隨後藉由自2－丙醇中重複沉澱並最終在高真空下去除溶劑來回收。
實例2－Triquat即DMTQ之合成：
使用藉由滴定分析(四丁基碘化銨/高氯酸法)發現含有72.9重量%活性環氧物質之縮水甘油三甲基氯化銨(GMAC)(Aldrich，CAS # 3033－77－0)之水溶液。將二甲胺鹽酸鹽(408克，5莫耳，Aldrich)溶於約400毫升水之溶液在配有回流冷凝器之圓底燒瓶中劇烈攪拌。在此溶液中於約1小時內逐滴加入1040克GMAC溶液(＝758克活性物質＝5莫耳)，不施加外部加熱或冷卻。此添加一般不會引起顯著放熱。添加完成後將所得溶液在室溫攪拌1小時。此時開始逐滴添加另一等份之GMAC溶液(5莫耳)。此添加引超強烈放熱，且GMAC溶液之持續添加最終會使溶液回流。調節此第二份GMAC之加入速率以使放熱處於控制中。在添加完成時對溶液加以攪拌同時將其冷卻。當其溫度達到約70℃(約3小時後)時，用由電子控制器(J－Kem Electronics)控制之加熱夾套施加外部加熱，設置點為70℃。將溶液在70℃下保持約24小時。冷卻至室溫後，DMTQ溶液適合在如陽離子交換介質等適宜固定相上用作置換劑化合物。
實例3－Triquat即TBTQ－A之合成：
在2－丙醇中製備三胺即N－[3－(二甲基胺基)丙基]－N,N,N'－三甲基－1,3－丙二胺(亦稱作POLYCAT77)之儲存溶液，並藉由在乾燥N2 下與CaH2 一起攪拌若干天來乾燥。在配有塗有鐵氟龍之熱電偶及橡膠隔片之250毫升3頸圓底燒瓶中填裝入107毫升含有12.5克POLYCAT77(0.06莫耳)的此經過濾之溶液及一磁力攪拌棒。該燒瓶用氮氣沖掃並於正壓氮氣下密封。在約3小時內向經攪拌之燒瓶中藉助鐵氟龍針以恒速由注射幫浦加入苄基溴(35克，0.2莫耳，Aldrich)。注意到有輕微放熱，使內部溫度升至約30℃。添加完苄基溴時，將溶液在40至45℃下加熱14小時，冷卻至室溫，在旋轉蒸發器上蒸發成黏性油，吸收於甲醇中並用三份各60毫升之環己烷萃取，用炭脫色，過濾並蒸發至乾燥狀態，得到灰白色固體狀TBTQ－A。該材料適合在如陽離子交換介質等適宜固定相上用作置換劑化合物。
實例4－Diquat即BTA之合成：
將DCP(80克，0.6莫耳)及40%水性三甲胺(188克，@40重量%＝75克＝1.27莫耳)填裝入配有回流冷凝器之500毫升圓底燒瓶中。將此混合物加熱至75℃並在此溫度下保持48小時同時施加劇烈磁力攪拌。此時間段結束時，將澄清無色溶液冷卻至室溫。BTA之產率係>98%。冷卻至室溫後，BTA之溶液適合在如陽離子交換介質等適宜固定相上用作置換劑化合物。
實例5－Diquat即DBD之合成：
將苄基溴(87克，0.5莫耳，Aldrich)、100毫升乙腈(HPLC級，Fisher)及一磁力攪拌棒添裝入配有熱電偶之500毫升3頸圓底燒瓶中，隨後將其在N2 下密封。蒸餾之BDAP(35克，0.24莫耳)於量筒稱量，然後添裝至60毫升加料漏斗中並用20毫升無水乙腈漂洗。在80分鐘內實施所得BDAP溶液之逐滴添加。立即注意到有強放熱；持續添加使溶液溫度緩慢升高至約45℃。可在接近結束時加快添加以將溫度保持在約45℃。在BDAP溶液之添加完成時，放上加熱夾套並將溶液在55℃下加熱3小時，然後在70℃下加熱15小時。將溶液冷卻至室溫，轉移至回收燒瓶中並旋轉蒸發成黏性液體。將此液體吸收於丙酮/水中並再次在旋轉蒸發器上汽提，得到122.7克(100%產率)棕褐色固體狀DBD，藉由分析型HPLC檢測其為實質100%純。該材料適合在如陽離子交換介質等適宜固定相上用作置換劑化合物。
實例6－蛋白質混合物之置換層析
材料及設備 按原樣使用牛細胞色素C(Sigma，#C3131，m.w.12,327)及馬細胞色素C(Sigma，#C7752，m.w.12,384)。藉由HPLC分析，二者分別為約87%純及約86%純，其餘部分為在280及430奈米處有吸收之受損細胞色素分子或同種型。所有其他化學製劑為ACS試劑級或更優級別，且除非另有說明，否則均按原樣使用。緩衝溶劑為HPLC級蒸餾水。裝載/平衡緩衝液含有25 mM MOPSO(2－羥基－3－(N－嗎啉基)丙磺酸)，用NaOH調節至pH＝7.0。藉由用裝載緩衝液將濃縮之儲存溶液稀釋至期望濃度來製備置換劑溶液。所有緩衝溶液在使用前經氦氣淨化並經由0.2微米過濾器過濾。置換實驗用Knauer HPLC系統(型號K－1001幫浦、型號K－2600 UV檢測器、4－通道脫氣器以及溶劑組織器)實施。液份分析用Waters HPLC系統(型號600幫浦及控制器、型號996 PAD及型號717加具有冷凍試樣盤之自動取樣器)實施。
管柱準備 利用方法C(下文)清洗並再生固定相(陽離子交換樹脂，Tosoh SP－5PW，裝載於6.0×150毫米管柱上)且隨後以鈉型保存在裝載/平衡緩衝液中。使管柱之輸出流經在264奈米處監測之紫外/可見光流動檢測器，包括一電導率流動池及一pH流動池。用流速為0.17毫升/分鐘之裝載緩衝液平衡管柱。所有三個信號(UV吸光率、電導率、pH)形成穩定水平基線(約25分鐘，1 CV)後，立即起始置換實驗。避免過度平衡時間，以防止將管柱頂端由鈉型轉化為氫型。
穿透實驗 用牛細胞色素C溶於裝載緩衝液及馬細胞色素C溶於裝載緩衝液之4 mM溶液以介於0.1至0.5毫升/分鐘之間的多種流速實施穿透實驗。由該等實驗發現，合意及可重現之數據可在0.17毫升/分鐘時獲得。發現牛細胞色素C之管柱飽和容量為148毫克(34.7毫克/毫升基質)，且馬細胞色素C之管柱飽和容量為150毫克(35.2毫克/毫升基質)。
置換實驗 於裝載緩衝液中製備牛細胞色素C(4.12毫克/毫升，Sigma #C3131，m.w.＝12,327)及馬細胞色素C(4.10毫克/毫升，Sigma #C7752，m.w.＝12,384)之溶液。使用BCA－Copper及Bradford分析測定蛋白質濃度將等體積的兩種細胞色素溶液混合，裝載至20.0微升試樣環路中且隨後以0.17毫升/分鐘之恆定流速在120分鐘內泵至經清洗並適當平衡之陽離子交換管柱上。將該環路與吸入流通路斷開，並在25分鐘內以0.17毫升/分鐘之流速用幫浦使裝載緩衝液流過管柱。最後，將溶於裝載緩衝液之4.0 mM DBQ置換劑溶液以0.17毫升/分鐘之流速泵至管柱上，且使管柱之輸出流過紫外/可見光流動檢測器(10微升流動池，在264、280、430奈米處監測)進入液份收集器。在圖1中再現與時間成函數關係之紫外/可見光檢測器之輸出。
在置換劑溶液開始流入管柱後約70分鐘內於管柱流出物中沒有檢測到蛋白質材料，故在該段時間內沒有收集液份。在置換劑流動開始後約70分鐘時收集液份1，且以1分鐘為間隔收集後續液份。電導率及pH流動池(見上文)通常位於紫外/可見光檢測器後方之輸出通路上以監測置換實驗之過程；然而在收集液份時，將該兩個池與流動通路斷開以防止加寬置換峰間之過渡。收集總共108個液份。收集後，將各液份封存並冷凍以用於後續HPLC分析。置換實驗在環境溫度即22℃下實施。
置換實驗液份之HPLC分析 使置換實驗中收集之全部108個液份接受HPLC分析以確定各自內容物。此分析之條件如下：管柱： 不銹鋼，4.6(I.D.)×200毫米，PolySULFOETHYL A，強陽離子交換性、以矽石為主之基質，5微米粒徑，300埃孔徑，由PolyLC製造(Columbia,MD)緩衝溶劑： HPLC級蒸餾水溶洗緩衝液： A－25 mM NaH2 PO4 ，pH＝6.8，用NaOH調節B－500 mM NaCl＋25 mM NaH2 PO4 ，pH＝6.8，用NaOH調節
溶洗緩衝液經由0.2微米過濾器過濾以移除顆粒。
流速： 恆定在1.0毫升/分鐘。梯度法： 0至2分鐘 100% A，無梯度溶洗2至62分鐘 100% A至100% B，線性62至72分鐘 100% B，無梯度溶洗UV檢測器： 264奈米－DBQ＋總蛋白，280奈米－總蛋白，430奈米－僅有細胞色素蛋白試樣製備： 將30微升液份試樣及30微升新鮮製備之10 mM 1,4－二硫蘇糖醇(DTT)混合。將50微升該混合物注射至管柱上。
每一液份中各組份之濃度藉由積分分析型HPLC峰來確定。將該等結果彙編成在圖2中以圖式方式顯示之直方圖。將純淨液份聚集在一起以得到彙編在表1中之數據。來自管柱之總蛋白回收率為98%。
實例7－蛋白質混合物之置換層析
材料及設備 按原樣使用牛細胞色素C(Sigma，#C3131，近似分析＝89%)及牛α－胰凝乳蛋白酶原A(Sigma，#C4879，近似分析＝65%)。所有其他化學製劑為ACS試劑級或更優級別，且除非另有說明，否則均按原樣使用。緩衝溶劑為HPLC級蒸餾水。裝載/平衡緩衝液含有25 mM MOPSO(2－羥基－3－(N－嗎啉基)丙磺酸)，用NaOH調節至pH＝7.0。藉由用裝載緩衝液將濃縮之儲存溶液稀釋至期望濃度來製備置換劑溶液。所有緩衝溶液在使用前經氦氣淨化並經由0.2微米過濾器過濾。置換實驗用Knauer HPLC系統(型號K－1001幫浦、型號K－2600 UV檢測器、4－通道脫氣器以及溶劑組織器)實施。液份分析用Waters HPLC系統(型號600幫浦及控制器、型號996 PAD及型號717加具有冷凍試樣盤之自動取樣器)實施。
管柱準備 利用方法C(下文)清洗及再生管柱(Amersham Mono S，5.0×200毫米)且隨後以鈉型保存於氯化鈉緩衝液(2.0 M NaCl＋25 mM MOPSO，用NaOH調節至pH＝7.0)中。使管柱之輸出流經在264奈米處監測之紫外/可見光流動檢測器，包括一電導率流動池及一pH流動池。用流速為0.20毫升/分鐘之裝載緩衝液(見上文)平衡管柱。所有三個信號(UV吸光率、電導率、pH)形成穩定水平基線(約20分鐘，1 CV)後，立即起始置換實驗。避免過度平衡時間，以防止將管柱頂端由鈉型轉化為氫型。
穿透實驗 用牛細胞色素C溶於裝載緩衝液及牛α－胰凝乳蛋白酶原A溶於裝載緩衝液之4.0毫克/毫升溶液以介於0.1至0.5毫升/分鐘之間的多種流速實施穿透實驗。裝載緩衝液由25 mM MOPSO(2－羥基－3－(N－嗎啉基)丙磺酸)製備並用NaOH調節至pH＝7.0。在0.20毫升/分鐘時得到良好之可重現數據。細胞色素C之管柱飽和容量為約198毫克(50.4毫克/毫升基質)，且胰凝乳蛋白酶原之管柱飽和容量為約376毫克(95.7毫克/毫升基質)。在此等實驗中，未純化之蛋白質從瓶中取出後直接使用。
置換實驗 在裝載緩衝液(見上文)中製備牛細胞色素C(5.04毫克/毫升，Sigma#C3131)及牛α－胰凝乳蛋白酶原A(9.96毫克/毫升，Sigma#C4879)之溶液。使用BCA－Copper及Bradford分析測定蛋白質濃度將等體積的兩種細胞色素溶液混合，裝載至20.0微升試樣環路中且隨後以0.40毫升/分鐘之恆定流速在60分鐘內泵至經清洗並適當平衡之陽離子交換管柱上(見上文)。將該環路與吸入流通路斷開，並在20分鐘內以0.20毫升/分鐘之流速用幫浦使裝載緩衝液流過管柱。最後，將溶於裝載緩衝液之4.0 mM DBQ置換劑溶液以0.20毫升/分鐘之流速泵至管柱上，且使管柱之輸出流過紫外/可見光流動檢測器(10微升流動池，在264、280奈米處監測)進入液份收集器。每隔1.00分鐘收集一次液份。電導率及pH流動池(見上文)通常位於紫外/可見光檢測器後方之輸出通路上以監測置換實驗之過程；然而在收集液份時，將該兩個池與流動通路斷開以防止加寬置換峰間之過渡。收集後，將各液份封存並冷凍以用於後續HPLC分析。置換實驗在環境溫度即22℃下實施。置換跡線示於圖3中。
蛋白質之HPLC分析 HPLC液份分析之細節在下方給出。
管柱： 不銹鋼管柱，4.6×200毫米內部尺寸由PolyLC製造(Columbia，MD)PolySULFOETHYL A，強陽離子交換性、以矽石為主之基質5 μ粒徑，300埃孔徑緩衝溶劑： HPLC級蒸餾水溶洗緩衝液： A－25 mM NaH2 PO4 ，pH＝6.8，用NaOH調節B－0.50 M NaCl＋25 mM NaH2 PO4 ，pH＝6.8，用NaOH調節
溶洗緩衝液經由0.2微米過濾器過濾以移除顆粒。
流速： 恆定流速為1.0毫升/分鐘。梯度法： 0至2分鐘 100% A，無梯度溶洗2至62分鐘 100% A至100% B，線性梯度溶洗62至72分鐘100% B，無梯度UV檢測器： 264奈米－DBQ＋蛋白質，波長： 280奈米－蛋白質，430奈米－細胞色素試樣製備： 將50微升試樣混合物注射至管柱上。
由上述方法對所有125個收集之試樣加以分析，且將來自264奈米、280奈米及430奈米之組合數據顯示於圖4及下表中。來自管柱之蛋白質回收率接近定量(>97%)。
管柱清洗及再生程序
一或多個下列方法可用於清洗及/或再生用於以置換劑化合物(例如DBQ)進行之置換程序中的陽離子交換管柱。「再生效率」表示為程序完成後恢復之原始管柱穿透容量之百分比。在每一方法中，該等步驟以所列示順序實施且流速為約0.64毫升/分鐘。
方法A： 清洗＋再生(再生效率98%)2.0 M KCl＋0.1 M KOH 180分鐘 27 CV＊ 0.1 M KH2 PO4 ，pH＝6.5 w/KOH 20分鐘 3 CV 15%冰乙酸 27分鐘 4 CV 0.1 M KH2 PO4 ，pH＝6.5 w/KOH 20分鐘 3 CV 2.0 M NaCl＋25 mM MOPSO，pH＝7.0 34分鐘 5 CV＊ CV＝管柱體積
方法B： 僅再生(再生效率95%)2.0 M KCl＋0.1 M KH2 PO4 ，pH＝6.5 200分鐘 30 CV＊ 0.1M KH2 PO4 ，pH＝6.5 w/KOH 20分鐘 3 CV 2.0 M NaCl＋25 mM MOPSO，pH＝7.0 34分鐘 5 CV＊ 得到100%再生效率會需要100 CV至150 CV(過夜再生)。
方法C： 清洗＋再生(再生效率100%)2.0 M KCl＋0.1 M KOH 80分鐘 12 CV 0.1 M KH2 PO4 ，pH＝6.5 w/KOH 20分鐘 3 CV 1.5 M BaCl2 20分鐘 3 CV 0.1 M KH2 PO4 ，pH＝6.5 w/KOH 20分鐘 3 CV 15%乙酸＋25 mM 18－冠－6 27分鐘 4 CV 0.1 M KH2 PO4 ，pH＝6.5 w/KOH 20分鐘 3 CV 2.0 M NaCl＋25 mM MOPSO，pH＝7.0 34分鐘 5 CV
方法D： 清洗＋再生(再生效率100%)2.0 M KCl＋0.1 M KOH 80分鐘 12 CV 0.1 M MOPS，pH＝7.2 w/NaOH 20分鐘 3 CV 1.5 M CaCl2 27分鐘 4 CV 0.1 M MOPS，pH＝7.2 w/NaOH 20分鐘 3 CV 0.1 M Na2 H2 EDTA，pH＝8.0 w/NaOH 20分鐘 3 CV 0.1 M MOPS，pH＝7.2 w/NaOH 20分鐘 3 CV 15%冰乙酸 27分鐘 4 CV 0.1 M MOPS，pH＝7.2 w/NaOH 20分鐘 3 CV 2.0 M NaCl＋25 mM MOPSO，pH＝7.0 34分鐘 5 CV
方法E： 僅再生(再生效率100%)2.1 M KCl 80分鐘 12 CV 0.1 M MOPS，pH＝7.2 w/NaOH 20分鐘 3 CV 1.5 M CaCl2 27分鐘 4 CV 0.1 M MOPS，pH＝7.2 w/NaOH 20分鐘 3 CV 0.1 M Na2 H2 EDTA，pH＝8.0 w/NaOH＊ 20分鐘 3 CV 0.1 M MOPS，pH＝7.2 w/NaOH 20分鐘 3 CV 2.0 M NaCl＋25 mM MOPSO，pH＝7.0 34分鐘 5 CV＊ 0.1 M檸檬酸三鉀，在此步驟中可採用pH＝7.0。
方法F： 清洗＋再生(再生效率100%) ＊ BDAP為1,3－雙(二甲基胺基)－2－羥基丙烷。除BDAP以外，在需要時可根據成本及/或實用性之考慮因素改為使用下列胺：1,3－二胺基－2－羥基丙烷；1,3－雙(二甲基胺基)丙烷；雙(3－胺基丙基)胺；[雙(3－(二甲基胺基)丙基)]胺基甲烷；1－[雙(3－(二甲基胺基)丙基)]胺基－2－羥基丙烷；及1,3－二胺基丙烷。
方法G： 清洗＋再生(再生效率100%)
方法H： 僅再生(再生效率99%)
方法I： 僅再生(再生效率99%)
熟習此項技術者無需過度實驗即可根據本發明揭示內容及該等技術者所瞭解之知識製造及實施本文所揭示及申請之所有組合物及方法。雖然本發明之組合物及方法已根據較佳實施例予以闡述，但熟習此項技術者可明瞭，可改變該等組合物及/或方法及本文所述方法之步驟或步驟之順序，此並不背離本發明之概念、精神及範圍。更具體而言，應明瞭，某些在化學特性或生理上相關之某些試劑可替代本文所述試劑並同時可達成相同或相似的結果。熟習此項技術者所顯見的所有該等類似替代物及修改皆被視為涵蓋於隨附申請專利範圍所界定的本發明之精神、範圍及概念內。
圖1係一繪示根據本發明一實施例之牛細胞色素C與馬細胞色素C之混合物之置換層析過程中紫外/可見光HPLC檢測器在各種波長下之輸出的圖式。
圖2係一繪示根據本發明一實施例之牛細胞色素C與馬細胞色素C之混合物之置換層析過程中收集之液份濃度的圖式。
圖3係一繪示根據本發明一實施例之牛細胞色素C與牛α－胰凝乳蛋白酶原AC之混合物之置換層析過程中各種波長下紫外/可見光HPLC檢測器之輸出的圖式。
圖4係一繪示根據本發明一實施例之牛細胞色素C與牛α－胰凝乳蛋白酶原AC之混合物之置換層析過程中收集之液份濃度的圖式。

Claims (34)

  1. 一種置換層析法，其包括：將一含有一或多個待分離之組份之混合物施加至一適宜固定相上；藉由向該固定相施加一含有具有通式(I)之置換劑化合物之混合物自該固定相上置換該一或多個組份中的至少一個： 其中：每一基團R1 、R2 、R3 、R'1 、R'2 及R'3 可獨立選自烷基、芳基及芳烷基，且其中含有一或多個四價氮之環可由R1 及R2 、R1 及R'1 、R1 及R4 、R4 及R'4 或R4 及R5 中的任一個或多個形成；每一R4 、R'4 、R5 及R'5 可獨立選自烷基、芳基、芳烷基及-(CH2 )a -(CHY)b -(CH2 )c -N+ R1 R2 R3 An- ，其中R1 、R2 及R3 如上文所定義；每一Y可獨立選自-H、-OH、-OR6 、鹵基、烷基、芳基及芳烷基，其中-R6 可為烷基或-(CH2 )a -(CHOH)b -(CH2 )c -N+ R1 R2 R3 An- ，其中R1 、R2 及R3 如上文所定義，且一或多個Y可為可由一或多個電磁法檢測之基團；每一q及z可獨立為選自0至約6之任一整數，但限制條 件為q+z等於或小於約6；每一a、b及c可獨立為選自0至2之任一整數，但限制條件為任何片段中a+b+c之總和至少為1；且每一An- 可獨立為得到一中性化合物所需之一或多個有機或無機、單價或多價陰離子。
  2. 如請求項1之方法，其中該固定相係一陽離子交換材料。
  3. 如請求項1之方法，其中該一或多個組份包括一或多個多肽、一或多個蛋白質或其一任意兩個或兩個以上之混合物。
  4. 如請求項3之方法，其中該一或多個蛋白質具有約5kD或更高之分子量。
  5. 如請求項3之方法，其中來自該混合物之蛋白質及/或多肽係以液份形式置換出該固定相，在該液份中該蛋白質及/或多肽大體上富集及/或該蛋白質及/或多肽大體上與其他蛋白質及/或多肽組份分開。
  6. 如請求項1之方法，其中該混合物包含兩個或兩個以上蛋白質、兩個或兩個以上多肽或其一混合物。
  7. 如請求項1之方法，其中該混合物包含至少兩個待分離之組份。
  8. 如請求項1之方法，其中該混合物包含該至少一個組份及至少一個雜質。
  9. 如請求項1之方法，其進一步包括在該置換劑自該固定相中排出時對其加以檢測，其中該檢測係藉由紫外/可見 光吸收光譜、螢光發射光譜、質譜、pH、電導率及一或多個電化學法中之一或多個進行。
  10. 如請求項1之方法，其進一步包括再生該固定相。
  11. 如請求項10之方法，其中該再生包括用一或多個下列各物處理該固定相：鹼金屬氫氧化物、鹼金屬鹽、鹼土金屬氫氧化物、鹼土金屬鹽、有機酸、烷基磺酸、四級銨氫氧化物、四級銨鹽、烷基胺，其中該溶液可進一步包含一適宜pH緩衝液。
  12. 如請求項10之方法，其中該再生包括用含有水及一有機共溶劑之溶液處理該固定相。
  13. 如請求項1之方法，其中該置換劑化合物為DBQ。
  14. 如請求項1之方法，其中該置換劑化合物為DMTQ。
  15. 如請求項1之方法，其中該置換劑化合物為DBTQ。
  16. 如請求項1之方法，其中該置換劑化合物為TBTQ-A。
  17. 如請求項1之方法，其中該置換劑化合物為BTA。
  18. 如請求項1之方法，其中該置換劑化合物為DBD。
  19. 如請求項1之方法，其中該混合物包含一或多個天然或重組抗體或一任意兩個或兩個以上該等抗體之混合物。
  20. 如請求項1之方法，其中該混合物包含一或多個天然或重組酵素或一任意兩個或兩個以上該等酵素之混合物。
  21. 如請求項1之方法，其中該混合物包含一或多個用於診斷用途之天然或重組蛋白質及/或多肽或一任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。
  22. 如請求項1之方法，其中該混合物包含一或多個用於人 類或獸醫治療用途之天然或重組蛋白質或多肽或一任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。
  23. 如請求項1之方法，其中該混合物包含一或多個源自一或多個天然或重組動物或人類血漿之蛋白質或多肽或一任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。
  24. 如請求項1之方法，其中該混合物包含一或多個源自一或多個天然或重組植物材料之蛋白質或多肽或一任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。
  25. 如請求項1之方法，其中該混合物包含一或多個源自動物或人類乳汁或源自重組動物之乳汁中之一或多個蛋白質或多肽或一任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。
  26. 如請求項1之方法，其中該混合物包含一或多個源自一或多個天然或重組禽蛋之蛋白質或多肽或一任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。
  27. 如請求項1之方法，其中該混合物包含一或多個源自一或多個天然或重組細菌、酵母、真菌、病毒或昆蟲之蛋白質或多肽或一任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。
  28. 如請求項1之方法，其中該混合物包含一或多個源自一或多個天然或重組哺乳動物細胞培養物或動物組織之蛋白質或多肽或一任意兩個或兩個以上該蛋白質及/或多肽之混合物。
  29. 如請求項1之方法，其中該混合物包含一或多個有機化 合物、藥物或藥物中間體或其一任意兩個或兩個以上之混合物。
  30. 如請求項29之方法，其中該一或多個有機化合物、藥物或藥物中間體中的一或多個係對掌性的。
  31. 如請求項1之方法，其中該混合物包含一或多個微量組份，且該方法進一步包括該混合物中微量組份之檢測、收集或定量中的一或多個。
  32. 一種可用於置換層析法之置換劑組合物，其呈適宜水溶液形式，包含：一具有通式(I)之置換劑化合物： 其中：每一基團R1 、R2 、R3 、R'1 、R'2 及R'3 可獨立選自烷基、芳基及芳烷基，且其中含有一或多個四價氮之環可由R1 及R2 、R1 及R'1 、R1 及R4 、R4 及R'4 或R4 及R5 中的任一個或多個形成；每一R4 、R'4 、R5 及R'5 可獨立選自烷基、芳基、芳烷基及-(CH2 )a -(CHY)b -(CH2 )c -N+ R1 R2 R3 An- ，其中R1 、R2 及R3 如上文所定義；每一Y可獨立選自-H、-OH、-OR6 、鹵基、烷基、芳基及芳烷基，其中-R6 可為烷基或-(CH2 )a -(CHOH)b - (CH2 )c -N+ R1 R2 R3 An- ，其中R1 、R2 及R3 如上文所定義，且一或多個Y可為可由一或多個電磁法檢測之基團；每一q及z可獨立為選自0至約6之任一整數，但限制條件為q+z等於或小於約6；每一a、b及c可獨立為選自0至2之任一整數，但限制條件為任何片段中a+b+c之總和至少為1；且每一An- 可獨立為得到一中性化合物所需之一或多個有機或無機、單價或多價陰離子。
  33. 如請求項32之置換劑組合物，其中該置換劑化合物非為DBQ、DMTQ、DBTQ、BTA及DBD。
  34. 如請求項32之置換劑組合物，其中該置換劑化合物具有下列結構：
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