KR101299158B1 - 양이온-교환 치환 크로마토그래피 공정 및 양이온-교환치환 크로마토그래피 공정에서 디스플레이서 화합물들로서사용하기 위한 양이온성 유기 화합물들 - Google Patents

양이온-교환 치환 크로마토그래피 공정 및 양이온-교환치환 크로마토그래피 공정에서 디스플레이서 화합물들로서사용하기 위한 양이온성 유기 화합물들 Download PDF

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Abstract

본 발명은 치환 크로마토그래피 공정 및 그 공정에 사용되고, 하기 일반식(I)을 갖는 디스플레이서 화합물에 관한 것이다:
Figure 112008037113872-pct00014
여기서, 각각의 기 R1, R2, R3, R'1, R'2, 및 R'3는 독립적으로 알킬, 아릴 및 아랄킬로부터 선택될 수 있고, 여기서 1개 이상의 4급 질소를 함유하는 고리는 R1 및 R2, R1 및 R'1, R1 및 R4, R4 및 R'4, 또는 R4 및 R5 중의 임의의 1개 이상에 의해 형성될 수 있고; 각각의 R4, R'4, R5, 및 R'5는 독립적으로 알킬, 아릴, 아랄킬 및 -(CH2)a-(CHY)b-(CH2)c-N+R1R2R3 An-로부터 선택될 수 있고, 여기서 R1, R2 및 R3은 상기 정의된 바와 같고; 각각의 Y는 독립적으로, -H, -OH, -OR6, 할로, 알킬, 아릴 및 아랄킬로부터 선택될 수 있고, 여기서 -R6는 알킬 또는 -(CH2)a-(CHOH)b-(CH2)c-N+R1R2R3An-일 수 있고, 여기서 R1, R2 및 R3은 상기 정의된 바와 같고; 각각의 q 및 z는 독립적으로 0 내지 약 6의 임의의 정수일 수 있고, 단 q+z는 약 6 이하이고; 각각의 a, b 및 c는 독립적으로 0 내지 2의 임의의 정수일 수 있고, 단 임의의 단 편 중의 a+b+c의 합은 적어도 1이고; 각각의 An-은 독립적으로 중성 화합물을 얻기 위해 요구되는 바의 1개 이상의 유기 또는 무기 1가 또는 다가 음이온일 수 있다.

Description

양이온-교환 치환 크로마토그래피 공정 및 양이온-교환 치환 크로마토그래피 공정에서 디스플레이서 화합물들로서 사용하기 위한 양이온성 유기 화합물들 {CATION-EXCHANGE DISPLACEMENT CHROMATOGRAPHY PROCESS AND CATIONIC ORGANIC COMPOUNDS FOR USE AS DISPLACER COMPOUNDS IN CATION-EXCHANGE DISPLACEMENT CHROMATOGRAPHY PROCESS}
본 발명은 다중 4가 암모늄염(multiple quats)을 포함하는 조성물, 및 크로마토그래피 정제에서 디스플레이서(displacers)로서 상기 조성물의 사용 방법들에 관한 것이다.
크로마토그래피의 치환 모드는 먼저 Tswett에 의해 1906년에 인식되었고, 샘플 치환이 오버로드된 용출 크로마토그래피 조건 하에 발생되었음을 주지하였다. 1943년에, Tiselius는 크로마토그래피의 광의의 주제가 3개의 별개의 "모드들": 정면 모드, 용출 모드, 및 치환 모드 둘레로 조직화될 수 있음을 제안하였다. 그 이후로, 대부분의 개발 및 활용, 특히 분석 크로마토그래피에서 그들 반응은 용출 크로마토그래피 분야에서 발생하였다. 사실상, 추가의 조건 없이 "크로마토그래피"라는 용어는 오늘날 통상적으로 용출 모드의 크로마토그래피를 의미한다.
용출 모드 및 치환 모드는 이론 및 실행 모두에서 용이하게 구별된다. 용출 크로마토그래피에서, 정제되어야 할 샘플의 용액은 컬럼에서 통상적으로 정지 상(stationary phase)에 도포된다. 이동 상(mobile phase)은 샘플이 비가역적으로 흡수되지도 또는 전체적으로 흡수되지 않지도 않지만, 오히려 가역적으로 결합하도록 선택된다. 이동 상이 정지 상 위로 흐를 때, 이동 상과 정지 상 사이에 평형이 확립됨으로써, 정지 상에 대한 친화도(affinity)에 따라, 샘플은 원래 샘플(original sample)에 존재할 수 있는 다른 성분들에 상대적인 그의 친화도를 반영하는 속도로 컬럼을 따라 통과한다. 표준 용출 크로마토그래피에서 특히 주의할 것은 이소크래틱 용출에서 용출 용매 프론트 또는 제로 컬럼 부피는 항상 컬럼 너머로 샘플을 선행시킨다는 사실이다.
이소크래틱 용출 크로마토그래피의 변형 및 확장은 변화하는 조성물의 일련의 용출제들이 정지 상 위로 통과하는 단계 구배 크로마토그래피에서 발견된다. 예를 들면 이온-교환 크로마토그래피에서, 이동 상 염 농도 및/또는 pH의 단계 변화들은 분리되고 있는 분석물들(analytes)을 용출 또는 탈착시키기 위해 사용된다.
치환 크로마토그래피는 컬럼으로부터 혼합물의 성분들을 제거하기 위해 디스플레이서 화합물을 사용한다. 디스플레이서 화합물은 일반적으로 분리될 화합물들 중의 어떠한 성분들보다 정지 상에 대해 훨씬 더 큰 친화도를 갖는다. 이는 용출 크로마토그래피와 대조적이고, 여기서 용출제는 분리되어야 할 성분들보다 정지 상에 대해 더 낮은 친화도를 갖는다. 치환 크로마토그래피를 용출 또는 탈착 크로마토그래피로부터 구별하는 중요한 작용적 특징은 디스플레이서 화합물의 사용이다. 치환 크로마토그래피에서, 컬럼은 분리되어야 하는 성분들 모두가 정지 상에 대해 비교적 큰 친화도를 갖는 조건 하에 캐리어 용매와 먼저 평형을 이룬다. 대량으로 또는 약간 희석될 수 있는 일정 부피의 피드 혼합물이 컬럼 상으로 로드되고, 피드 혼합물 내의 개개의 성분들은 정지 상에 흡착될 것이다. 즉, 피드 혼합물의 성분들은 정지 상 위로 분배 및 흡착되어, 그곳에 체류한다. 모든 성분들이 치환에 의해 용해되어야 하는 경우, 캐리어 용매는 어떠한 샘플도 함유하지 않는 컬럼으로부터 부상한다(emerge). 피드 화합물의 성분들은 현재 정지 상 위에 체류하고, 컬럼 상의 각각의 성분의 위치는 초기 조건들 하에 정지 상에 대한 그의 상대적 친화도와 상관 관계이다. 원칙적으로, 임의의 성분의 분자는 정지 상 위의 주어진 부위에서 더 낮은 친화도를 갖는 임의의 다른 성분의 분자를 치환할 것이다. 결과적으로, 개개의 성분들은 궁극적으로 최고 친화도에서 최저 친화도까지 순차로 컬럼 상에 배열될 것이다.
때때로, 피드 혼합물의 일부 성분들, 예를 들면 정지 상에 대해 현저한 친화도를 갖지 않는 성분들이 캐리어 용매에 의해 컬럼을 통해 통과하게 하는 것이 유리하고; 이 경우, 보유된 피드 성분들만이 치환 크로마토그래피에 의해 용해될 것이다.
일단 샘플이 컬럼 상에 로드되면, 적절한 용매 중에 디스플레이서 화합물을 함유하는 용액은 정지 상을 통해 통과하도록 컬럼 내로 도입된다. 디스플레이서 화합물은 피드 혼합물의 어떤 성분들보다 정지 상에 대해 더 큰 친화도를 갖도록 선택된다. 디스플레이서 및 이동 상이 적절히 선택된다고 가정하면, 개개의 성분들은 흡수 친화도를 증가시키는 순으로 고도로 농축된 비교적 순수한 물질의 인접 한 구역들(zones)로서 컬럼을 빠져나간다. 정제된 개개의 성분들의 구역들에 따라, 디스플레이서는 컬럼으로부터 부상한다. 치환 크로마토그램은 디스플레이서 화합물이 샘플에 따르고 피드 성분들이 고도로 농축된 비교적 순수한 물질의 인접한 구역들로서 컬럼을 빠져나간다는 사실에 의해 용출 크로마토그램과 용이하게 구별된다.
치환 크로마토그래피는 프로세스 스케일 크로마토그래피를 위한 약간의 특히 유리한 특성들을 갖는다. 첫째, 치환 크로마토그래피는 단일 단계로 생성물 분리 및 농축을 달성할 수 있다. 비교하자면, 이소크래틱 용출 크로마토그래피는 분리하는 동안 현저한 생성물 용출을 초래한다. 둘째, 치환 공정은 평형 등온의 비선형 영역에서 작동하기 때문에 큰 컬럼 로딩이 가능하다. 이는 용출 크로마토그래피보다 훨씬 더 나은 컬럼 이용을 허용한다. 셋째, 컬럼 전개 및 성분 분리는 필적하는 용출 공정보다 적은 용매를 필요로 한다. 넷째, 치환 크로마토그래피는 낮은 분리 인자들을 갖는 혼합물들로부터 성분들을 농축 및 정제시킬 수 있는 한편, 비교적 큰 분리 인자들이 전형적인 용출 크로마토그래피에서 만족스러운 분해능(resolution)을 위해 요구된다.
이들 모든 장점들에 의해, 누구나 치환 크로마토그래피가 널리 이용될 수 있다고 가정할지도 모른다. 그러나 문제점들이 치환 크로마토그래피에 남아있다. 하나의 그러한 문제점은 컬럼을 재생시킬 필요성이고, 그 이유는 매회 사용 후 정지 상을 폐기하는 것이 경제적이지 않기 때문이다. 다른 그러한 문제는 합리적인(경제적인) 비용으로 용이하게 합성되고/되거나 상업적으로 입수할 수 있는 비교적 간단한 화합물들인 적절한 디스플레이서 화합물들을 얻는 것이다. 이들 두 가지 문제점들은 용출 크로마토그래피에 비해서 치환 크로마토그래피에 대해 현저한 단점들을 제공해 왔다.
재생에 관하여, 치환 공정은 정지 상에 대해 매우 큰 친화도를 갖는 디스플레이서 화합물을 사용하기 때문에, 컬럼을 재생시키고 재-평형화시키는데 필요한 시간은 용출 크로마토그래피에 비해 길어질 수 있다. 더욱이, 비교적 많은 양의 용매는 종종 재생 동안 요구된다. 이들 문제점들은 용출 크로마토그래피에 비해 치환 크로마토그래피의 장점들을 효과적으로 감소시킨다.
합리적인 (경제적인) 비용으로 상업적으로 입수할 수 있고/있거나 비교적 용이하게 합성될 수 있는 유용한 디스플레이서 화합물들을 얻는 제2의 문제점은 정지 상에 대한 큰 친화도를 갖지만 재생 중에 컬럼으로부터 비교적 용이하게 제거될 수도 있는 디스플레이서 화합물에 대한 필요성에 기인한다. 선행 기술에 의해 제공되어온 그러한 화합물들은 이들 2가지 중요한 기준 중의 하나 또는 모두에 부합하지 않는다. 여러 가지 화합물들이 저 분자량 디스플레이서들로서 제공되고 있지만, 이들은 합성되고 정제되기가 상당히 어렵고, 합리적인 비용으로 상업적으로 입수할 수 없거나, 또는 단순히 상업적으로 입수할 수 없다.
치환 크로마토그래피가 주류 크로마토그래피 기술이 되기 위해서는, 합성 및 정제가 직접적이고, 대량 생산에 따르고, 및/또는 상업적으로 입수할 수 있고, 정지 상이 치환 크로마토그래피 공정들에서 순차로 재사용될 수 있도록 정지 상의 효율적인 재생을 허용하는 효과적인 디스플레이서들에 대한 현저한 충족되지 않은 필 요성이 남아있다.
이하, 저 분자량의 양(positive)으로 하전된 화합물들의 부류가 치환 크로마토그래피 공정에서 디스플레이서 화합물들로서 매우 효율적으로 기능할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 치환 크로마토그래피 공정 및 디스플레이서 화합물의 그룹 모두에 관한 것이다. 본 발명에 따른 디스플레이서 화합물들은 치환 크로마토그래피 공정에서 디스플레이서 화합물로서 사용된 후 정지 상으로부터 효율적으로 제거될 수 있고, 후속 치환 크로마토그래피 공정들에서 정지 상의 재생 및 재사용을 허용한다. 더욱이, 이들 디스플레이서 화합물들은 비교적 직접적이고 저렴한 합성 방법들에 의해 양호한 수율 및 높은 순도로 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명은 선행 기술의 치환 크로마토그래피 공정들에서 상기 문제점들을 다룬다.
본 발명의 일 실시예에 따른 디스플레이서 화합물들은 유기 4급 암모늄 염(quat salts)으로 공지된 화합물들의 부류에 속한다. 쿼트(Quat) 염들은 양으로-하전된 질소 원자들을 포함하는 조성물들이다. 이들 조성물들은 지방족 사슬들을 포함하지만, 뿐만 아니라 많은 경우에 수용성일 수 있다. 물에 용해될 때, 이들 화합물들은 pH의 변화에 의해 영향받지 않는 양 전하들을 갖는 유용한 특성을 나타낸다. 즉, 질소 중심의 전하는 아민의 단순한 양자화의 결과가 아니므로, 이들 염들의 수용액들의 pH는 질소 중심 상의 양전하의 손실을 유발하지 않고 넓은 범위에 걸쳐 조절될 수 있다. 통상의 폴리아민류 및 관련된 화합물들은 보편적으로 양이온-교환 치환 크로마토그래피에서 디스플레이서 화합물들로서 유용하지 않다. 이는 이들이 치환 크로마토그래피 수지들에 양립할 수 있는 pH 범위들에서 완전히 양자화되지 않고 - 따라서 충분한 양전하를 전개시키지 않기 때문이다. 이와 대조적으로, 본 발명의 디스플레이서 화합물들은 크로마토그래피 수지가 안정한 임의의 pH 범위에서 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은
분리될 적어도 1개의 성분을 포함하는 혼합물을 적절한 정지 상 위로 로딩하는 단계; 및
하기 일반식(I)의 디스플레이서 화합물을 포함하는 혼합물을 정지 상에 도포함으로써 정지 상으로부터 상기 적어도 1개의 성분을 치환하는 단계를 포함하는 치환 크로마토그래피 공정에 관한 것이다:
Figure 112008037113872-pct00001
여기서, 각각의 기 R1, R2, R3, R'1, R'2, 및 R'3는 독립적으로 알킬, 아릴 및 아랄킬로부터 선택될 수 있고, 여기서 1개 이상의 4급 질소를 함유하는 고리는 R1 및 R2, R1 및 R'1, R1 및 R4, R4 및 R'4, 또는 R4 및 R5 중의 임의의 1개 이상에 의해 형성될 수 있고;
각각의 R4, R'4, R5, 및 R'5는 독립적으로 알킬, 아릴, 아랄킬 및 -(CH2)a-(CHY)b-(CH2)c-N+R1R2R3An-로부터 선택될 수 있고, 여기서 R1, R2 및 R3은 상기 정의된 바와 같고;
각각의 Y는 독립적으로, -H, -OH, -OR6, 할로, 알킬, 아릴 및 아랄킬로부터 선택될 수 있고, 여기서 -R6는 알킬 또는 -(CH2)a-(CHOH)b-(CH2)c-N+R1R2R3An-일 수 있고, 여기서 R1, R2 및 R3은 상기 정의된 바와 같고, 1개 이상의 Y는 1개 이상의 전자기적 방법들에 의해 검출될 수 있는 기일 수 있고;
각각의 q 및 z는 독립적으로 0 내지 약 6의 임의의 정수일 수 있고, 단 q+z는 약 6 이하이고;
각각의 a, b 및 c는 독립적으로 0 내지 2의 임의의 정수일 수 있고, 단 임의의 단편 중의 a+b+c의 합은 적어도 1이고; 및
각각의 An-은 독립적으로 중성 화합물을 얻기 위해 요구되는 바의 1개 이상의 유기 또는 무기 1가 또는 다가 음이온일 수 있다
일 구체예에서, 본 발명은 상기 일반식(I)로 정의된 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에서, 본 발명은 다음 구조식을 갖고, TBTQ-A로 언급되는 조성물에 관한 것이다:
Figure 112008037113872-pct00002
일 구체예에서, 일반식(I)에 따른 조성물은 DBQ, DMTQ, DBTQ, BTA 및 DBD 이외의 것이고, 각각 아래 정의되는 바의 구조를 갖는다.
일 구체예에서, 본 발명은 치환 크로마토그래피에 유용한 디스플레이서 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에서, 디스플레이서 조성물은 적절한 수용액 중에 상기 도시된 바의 일반식(I)의 화합물을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명은 치환 크로마토그래피에 유용하고 상기 구조를 갖고 TBTQ-A로서 확인되는 디스플레이서 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에서, 디스플레이서 조성물은 DBQ, DMTQ, DBTQ, BTA 및 DBD 이외의 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 치환 크로마토그래피에 적용되는 샘플 중의 추적 성분들의 한 개 이상의 검출, 수집 또는 정량화를 위한 공정을 제공한다.
따라서, 본 발명은 디스플레이서 화합물들, 조성물들 및 그의 합성 및 정제가 직접적이고 대량 생산에 적합하고, 정지 상이 효율적으로 재사용될 수 있도록 정지 상의 효율적인 재생을 허용하는 효과적인 디스플레이서 화합물들에 대한 필요를 다루는 치환 크로마토그래피를 위한 공정들을 제공한다. 또한, 본 발명은 샘플 또는 혼합물의 추적 성분들이 검출될 수 있고, 수집 및/또는 정량화될 수 있는 공정을 제공한다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라, 소의 시토크롬 C 및 말의 시토크롬 C의 혼합물의 치환 크로마토그래피 동안 각종 파장에서 UV/Vis HPLC 검출기의 출력을 나타내는 그래프.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라, 소의 시토크롬 C 및 말의 시토크롬 C의 혼합물의 치환 크로마토그래피 동안 수집된 분획들의 농도를 나타내는 그래프.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라, 소의 시토크롬 C 및 소의 α-키모트립시노겐 A C의 혼합물의 치환 크로마토그래피 동안 각종 파장에서 UV/Vis HPLC 검출기의 출력을 나타내는 그래프.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라, 소의 시토크롬 C 및 소의 α-키모트립시노겐 A C의 혼합물의 치환 크로마토그래피 동안 수집된 분획들의 농도를 나타내는 그래프.
상세한 설명
본원에 사용된 바의 "할로"는 클로로, 브로모, 플루오로, 또는 요오도(iodo) 등의 할로겐을 포함하는 기를 의미한다.
본원에 사용된 바의 "알킬" 및 "알킬렌"은 적절한 경우 1개 또는 2개의 수소 원자들을 제거함으로써 알칸 분자로부터 유도된 탄소 및 수소 원자들의 기를 의미한다. "알킬" 및 "알킬렌"은 직쇄, 환형 또는 분지된 부분을 갖는 포화된 1가 및 2가 탄화수소 라디칼들을 포함할 수 있다. "알킬" 또는 "알킬렌"기들은 임의의 탄소-탄소 이중 결합 또는 삼중 결합을 포함할 수 있고, 여기서 상기 알킬기는 적어도 2개의 탄소 원자들을 포함한다. 환형 부분에 대해, 적어도 3개의 탄소 원자들이 상기 알킬기에 요구됨을 이해해야 한다. 본 발명에서, 알킬 및 알킬렌기들은 임의의 수의 탄소 원자들을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 약 20개 이하의 탄소 원자들이 사용될 수 있다. 예를 들면, 일 구체예에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 탄소들의 알킬기들이 본 발명에 사용될 수 있다. 물론, 길이가 더 길거나 분지된 알킬기들이 본 발명에 사용될 수 있다. 알킬렌기들은 예를 들면 고리가 알킬기들일 수 있는 2개의 기들로부터 형성되어야 하는 일 구체예에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바의 "아릴"은 페닐, 나프틸, 플루오레닐, 페난트릴 등의 미치환 또는 치환된 방향족 구조물을 의미한다. 아릴기는 치환될 때 본원에 정의된 바의 할로기, 알킬기, 다른 아릴기 또는 아랄킬기에 의해 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바의 "아랄킬"은 아릴기가 알킬기의 수소 원자에 대해 치환된 라디칼을 의미한다. "아릴"은 상기 정의된 바와 같다. 본 발명에서, 아랄킬기들은 임의의 수의 탄소 원자들을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 아랄킬기는 약 20개 이하의 탄소 원자들을 함유한다. 예를 들면, 일 구체예에서, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 탄소들의 아랄킬기들이 본 발명에 사용될 수 있다. 물론, 그 이상의 탄소 원자들의 아랄킬기들이 본 발명에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바의 "An-"는 본 발명의 디스플레이서 화합물들과 연관된 1개 이상의 유기 또는 무기 1가 또는 다가 음이온들을 나타낸다. 본 발명의 4급 암모늄 이온들과 관련하여 음으로-하전된 음이온들의 전체 전하의 수는 혼합물의 pH 및 중성화를 위해 사용된 산 또는 산들의 음이온에 따라 변화할 것이다. 본 발명의 음이온들, An-,은 설포네이트, 트리플레이트, 트리필아미드, 카르복실레이트, F-, Cl-, Br-, I-, ClO3 -, HSO4 -, SO4 2 -, PO4 3 -, HPO4 2 -, H2PO4 -, PO3 2 -, HPO3 -, BF4 -, PF6 - 등의 1가, 2가 및 다가 음이온들을 포함하여, 당업계의 숙련자들에게 공지된 임의의 유기 또는 무기 1가 또는 다가 음이온일 수 있다. 일반적으로, An-의 원자가 및 수는 중성 화합물을 얻는데 요구되는 바와 같이 적절히 선택될 수 있다.
본원에 인용된 임의의 수치 값들은 하위 값으로부터 상위 값에 이르기까지 1 유닛 증분의 모든 값들을 포함하고, 단 임의의 하위 값과 임의의 상위 값 사이는 적어도 2 유닛으로 분리된다. 일 예로써, 예를 들면 온도, 압력, 시간 등의 공정 변수의 값 또는 성분의 양이 예를 들면 1 내지 90, 바람직하게는 20 내지 80, 더욱 바람직하게는 30 내지 70인 것으로 진술된 경우, 15 내지 85, 22 내지 68, 43 내지 51, 30 내지 32 등의 값들이 본원 명세서에 명확히 계산되는 것으로 의도된다. 1 이하인 값들에 대해, 1 유닛은 적절한 경우 0.0001, 0.001, 0.01 또는 0.1인 것으로 고려된다. 이들은 단지 특별히 의도된 것들의 예이고, 계산된 최저값과 최고값 사이의 수치 값들의 모든 가능한 조합들은 유사한 방식으로 본원에 명확히 진술되 는 것으로 고려될 것이다.
양이온성 디스플레이서 화합물들
본 발명의 양이온성 디스플레이서 화합물들은 다음 식(I)을 갖는 것들을 포함한다:
Figure 112008037113872-pct00003
여기서, 각각의 기 R1, R2, R3, R'1, R'2, 및 R'3는 독립적으로 알킬, 아릴 및 아랄킬로부터 선택될 수 있고, 여기서 4급 질소-함유 고리는 R1 및 R2, R1 및 R'1, R1 및 R4, R4 및 R'4, 또는 R4 및 R5 중의 임의의 1개 이상에 의해 형성될 수 있고;
각각의 R4 및 R5는 독립적으로 알킬, 아릴, 아랄킬 및 -(CH2)a-(CHY)b-(CH2)c-N+R1R2R3An-로부터 선택될 수 있고, 여기서 R1, R2 및 R3은 상기 정의된 바와 같고;
각각의 Y는 독립적으로, -H, -OH, -OR6, 할로, 알킬, 아릴 및 아랄킬로부터 선택될 수 있고, 여기서 -R6는 알킬 또는 -(CH2)a-(CHOH)b-(CH2)c-N+R1R2R3An-일 수 있고, 여기서 R1, R2 및 R3은 상기 정의된 바와 같고, 1개 이상의 Y는 1개 이상의 전자기적 방법들에 의해 검출될 수 있는 기일 수 있고;
각각의 q 및 z는 독립적으로 0 내지 약 6의 임의의 정수일 수 있고, 단 q+z 는 약 6 이하이고;
각각의 a, b 및 c는 0 내지 2의 임의의 정수일 수 있고, 단 임의의 단편 중의 a+b+c의 합은 적어도 1이고; 및
An-은 중성 화합물을 얻기 위해 요구되는 바의 1개 이상의 유기 또는 무기 1가 또는 다가 음이온일 수 있다.
식(I)의 디스플레이서 화합물은 UV/Vis 분광법, 형광, 또는 당업계의 숙련자들에게 공지된 임의의 다른 방법에 의해 용이하게 검출되게 하는 추가의 치환체를 함유할 수 있다. 그러한 치환체는 양이온-교환 크로마토그래피에 대한 화합물의 친화도에 영향을 미칠 수도 있고, 덜 강하게 결합하게 하거나 더욱 강하게 결합하게 한다. 몇몇 경우, 치환 크로마토그래피에 의해 정제되고 있는 화합물들을 검출하는 통상의 수단에 의해 간섭될 수 있는 어떠한 치환체도 갖지 않는 것이 유리할 수 있다. 이러한 후자의 경우의 예는 특정 바이오폴리머들(단백질들, 올리고펩티드들, 항체들 등)이 특징적으로 흡수하는 파장인 280 nm에서 UV 광선을 흡수하지 않는 식(I)의 디스플레이서 화합물일 수 있다. 검출 능력을 증진시키기 위한 적절한 유도제들은 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있고, 그들에 의해 적절히 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 디스플레이서 화합물 중의 1개 이상의 Y는 1개 이상의 전자기적 방법들에 의해 검출될 수 있는 기일 수 있다. 그러한 전자기적 방법들은 예를 들면 UV/가시광선 분광계(UV/visible spectrophotometry), 형광 분광계, 및 방사선 검출 방법들을 포함한다. 적절한 Y 기들 및 그러한 Y 기들을 검출하는 적절한 방법들은 그러한 방법들을 사용하는 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있다.
적절한 예시적인 양이온성 디스플레이서 화합물들은 예를 들면 다음 특정 예들을 포함하고, 여기서, 각각의 경우에 An-은 1개 이상의 유기 또는 무기 1가 또는 다가 음이온일 수 있고, 각각의 An-의 원자가 및 수는 중성 화합물을 제공하도록 적절히 선택된다 (즉, 각각의 분자는 균형을 이룬 각각의 이온들에 대해 양전하들 및 음전하들인 0의 순수 전하를 가져야 함). 다음 특정 화합물들이 본원에 정의된 바의 치환체들을 포함하여, 상기 일반식(I)로 정의된 디스플레이서 화합물들의 예들로서 제공된다. 다음 예들은 제한되도록 의도되지 않고, 대신에 본 발명의 여러 구체예들에 따라 디스플레이서 화합물들을 예시하는 특정 예들을 제공하도록 의도된다.
DBQ, 다음 구조식을 가짐:
Figure 112008037113872-pct00004
DMTQ, 다음 구조식을 가짐:
Figure 112008037113872-pct00005
DBTQ, 다음 구조식을 가짐:
Figure 112008037113872-pct00006
TBTQ-A, 다음 구조식을 가짐:
Figure 112008037113872-pct00007
BTA, 다음 구조식을 가짐:
Figure 112008037113872-pct00008
DBD, 다음 구조식을 가짐:
Figure 112008037113872-pct00009
여기서, 각각의 그러한 구조물(즉, DBQ, DMTQ, DBTQ, TBTQ-A, BTA 및 DBD)에서, An-은 1개 이상의 유기 또는 무기 1가 음이온일 수 있거나 An-은 다가 음이온일 수 있고, 여기서 그러한 잔기들의 적절한 수는 중성 분자를 얻기 위해 제공된다. An-의 이러한 정의 및 사용은 본원 명세서 전반에 적용된다.
4급 질소-함유 고리를 포함하는 전형적인 디스플레이서 화합물은 다음 구조식을 갖고, 여기서 R4는 에틸렌기를 통해 R'4에 결합되고, 여기서 R1, R2, R3, R'1, R'2, R'3, R5 및 R'5는 메틸이고, An-은 상기 정의된 바와 같고, Y=-OH이다.
Figure 112008037113872-pct00010
일 구체예에서, 본 발명의 디스플레이서 화합물은 분자 내에 에테르 기들이 없다. 일 구체예에서, 본 발명의 디스플레이서 화합물들은 인접한 4급 질소 원자들에 접속하는 에테르기들이 없다. 일 구체예에서, 본 발명의 디스플레이서 화합물들은 인접한 다중 4급 기들이 에테르-함유 모이어티들에 의해 접속되지 않은 다중 4급 기들을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 디스플레이서 화합물들은 수지상 폴리에테르가 없다. 일 구체예에서, 본 발명의 디스플레이서 화합물들은 에테르 또는 폴리에테르로부터 얻어진 기에 의해 함께 링크되지 않는 4급 질소 원자들을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 적절한 정지 상은 양이온-교환 수지이다. 적절한 양이온-교환 수지들은 당업계에 공지되어 있고, 일반적으로 양이온들이 유인되는 음이온성 모이어티, 예를 들면 카르복시메틸, 술포프로필, 술폰산, 카르본산 등을 구비하여 유도된 메타크릴레이트, 실리카, 폴리스티렌 또는 폴리스티렌-디비닐벤젠 등의 수지들을 포함한다. 적절한 양이온-교환 물질들은 분리될 물질들의 유형에 기초하여 당업계의 숙련자들에 의해 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명에 사용하기에 적절한 양이온-교환 수지들은 예를 들면 일본 도쿄 및 펜실베니아주 Montgomeryville 소재 Tosoh Corp.사로부터 입수할 수 있는 Tosoh SP-5PW, Tosoh CM-650, SP-650 및 SP-550, TOYOPEARL® Super-Q 650S, TOYOPEARL® CM 650S 및 TSK Gel SP-5PW 양이온-교환 수지들을 포함한다. 추가의 적절한 양이온-교환 수지들은 예를 들면 Bio Rad Laboratories(캘리포니아주 Hercules)로부터 입수할 수 있는 UnoSphere S 및 MacroPrep S/MacroPrep High-S; Advanced Separation Technology(뉴저지주 Whippany)로부터 입수할 수 있는 CHIROBIOTIC®; Waters Corporation(매사츠세츠주 Milford)로부터 입수할 수 있는 SP-8HR 및 SP-15HR; GE-Amersham Biosciences(뉴저지주 Piscataway)로부터 입수할 수 있는 Mini S, Source 15S, Mono S, SP SEPHAROSE® HP, 및 SP SEPHAROSE® FF; Showa Denko(뉴욕주 New York)로부터 입수할 수 있는 SHOWDEX® IEC SP-825 및 SHOWDEX® IEC SP-2025; Polymer Laboratories(매사츠세츠주 Amherst)로부터 입수할 수 있는 PL-SCX; Alltech Laboratories(일리노이주 Deerfield)로부터 입수할 수 있는 Macrosphere300; PolyLC, Inc.(매릴랜드주 Columbia)로부터 입수할 수 있는 PolySulfoEthylA; 및 EMD 케미컬스 Inc.(뉴저지주 Gibbstown)으로부터 입수할 수 있는 FRACTOGEL® EMD SE Hicap 및 FRACTOGEL® EMD SO3을 포함한다. 다른 적절한 양이온-교환 수지들이 마찬가지로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 치환 크로마토그래피 공정은 단백질들 및 폴리펩티드들을 분리 및 정제하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바의 단백질은 약 5 kDa (킬로 달톤) 이상의 분자량을 갖는 폴리아미노산으로서 광의로 정의되고, 폴리펩티드는 약 5 kDa 이하의 분자량을 갖는 폴리아미노산이다. 당업계의 숙련자들에게 잘 이해될 수 있듯이, 단백질과 폴리펩티드 사이의 차이는 1도 이상이다. 일반적으로, 단백질은 3차 구조를 나타내는 한편, 폴리펩티드는 일반적으로 그렇지 않다.
일 구체예에서, 본 발명은 그러한 성분들을 함유하는 혼합물들로부터 단백질들 및 폴리펩티드들과 같은 성분들의 분리에 특별히 적용할 수 있다. 일 구체예에서, 혼합물 중의 1개 이상의 성분은 1개 이상의 폴리펩티드, 1개 이상의 단백질 또 는 임의의 2개 이상의 그러한 단백질 및/또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함한다. 즉, 본 발명의 공정은 단백질들의 혼합물들, 폴리펩티드들의 혼합물들 및 단백질 및 폴리펩티드 둘의 혼합물의 분리에 적용할 수 있다. 일 구체예에서, 1개 이상의 단백질은 약 5 kD 이상의 분자량을 포함한다. 일 구체예에서, 혼합물은 2개 이상의 단백질들, 2개 이상의 폴리펩티드들 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
일 구체예에서, 혼합물로부터 단백질 및/또는 폴리펩티드는 이 단백질 및/또는 폴리펩티드가 실질적으로 보강되고/되거나 단백질 및/또는 폴리펩티드가 다른 단백질 및/또는 폴리펩티드 성분들로부터 실질적으로 분리되는 분획 내의 정지 상으로부터 치환된다. 즉, 일 구체예에서, 관심있는 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하는 혼합물이 정지 상에 도포될 때, 단백질 또는 폴리펩티드가 정지 상으로부터 치환되고, 1개 이상의 분획에서 수집될 때, 단백질 및/또는 폴리펩티드는 보강된, 즉 더욱 농축된 형태의 분획에서 얻어지거나, 또는 원래 혼합물 중의 다른 상이한 단백질 및/또는 폴리펩티드 성분들로부터 실질적으로 분리되어 얻어진다. 따라서, 분명히, 이 혼합물은 분리되어야 할 2개 이상의 성분들을 포함할 수 있다. 다음에 고찰되는 바와 같이, 일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 치환 크로마토그래피에 적용된 혼합물은 각종 상이한 소스들로부터 많은 상이한 물질들의 조합을 포함할 수 있고, 본 발명의 공정은 그의 여러 가지 성분들을 분리하기 위해 그러한 착물 혼합물들에 유용하게 도포될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 성분(예를 들면, 아래 정의된 바와 같이 단백질, 폴리펩티드, 등) 및 적어도 하나의 불순물을 함유하는 혼합물에 적용할 수 있다. 이 구체예에서, 본 발명의 공정은 불순물들로부터 성분을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 불순물들의 그러한 제거는 (1) 구하거나 또는 목적하는 성분이 치환된 후 정지 상 위의 부동화 또는 체류 (예, 정지 상이 필터로서 작용하는 경우), 또는 (2) 정지 상으로부터 씻겨지거나 또는 용출됨으로써 (여기서, 불순물은 "전통적인" 용출 크로마토그래피와 더욱 유사한 수단에 의해 제거됨) 이루어질 수 있다. 이 구체예에서, 불순물이 컬럼 상에 고정되거나 또는 그로부터 제거될 때, 목적 성분은 본원에 개시된 바의 치환 크로마토그래피에 의해 컬럼으로부터 제거될 수 있다.
본 발명은 상기 언급된 단백질들, 폴리펩티드들, 및 불순물들 뿐만 아니라 많은 다른 성분들을 포함하여 광범위한 각종 성분들에 적용할 수 있다. 일 구체예에서, 이 혼합물은 1개 이상의 천연 또는 재조합 항체 또는 임의의 2개 이상의 이들 항체들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 혼합물은 1개 이상의 천연 또는 재조합 효소 또는 임의의 2개 이상의 그러한 효소들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 혼합물은 진단용의 1개 이상의 천연 또는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 임의의 2개 이상의 그러한 단백질 및/또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 혼합물은 인간 치료용 또는 수의학적 치료용의 1개 이상의 천연 또는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 임의의 2개 이상의 그러한 단백질 및/또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 혼합물은 1개 이상의 천연 또는 재조합, 동물 또는 인간 혈장으로부터 유도된 1개 이상의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 임의의 2개 이상의 그러한 단백질 및/또는 폴 리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 혼합물은 1개 이상의 천연 또는 재조합 식물 재료로부터 유도된 1개 이상의 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 임의의 2개 이상의 그러한 단백질 및/또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 혼합물은 1개 이상의 동물 또는 인간의 우유 또는 재조합 동물로부터 유도된 우유로부터 유도된 1개 이상의 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 임의의 2개 이상의 그러한 단백질 및/또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 혼합물은 1개 이상의 천연 또는 재조합 새의 알로부터 유도된 1개 이상의 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 임의의 2개 이상의 그러한 단백질 및/또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 혼합물은 1개 이상의 천연 또는 재조합, 세균, 효모, 진균, 바이러스 또는 곤충으로부터 유도된 1개 이상의 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 임의의 2개 이상의 그러한 단백질 및/또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 혼합물은 1개 이상의 천연 또는 재조합, 포유 동물 세포 배양액 또는 동물 조직으로부터 유도된 1개 이상의 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 임의의 2개 이상의 그러한 단백질 및/또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 혼합물은 1개 이상의 유기 화합물, 약물 또는 약물 중간체, 또는 임의의 2개 이상의 그들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 1개 이상의 유기 화합물, 약물 또는 약물 중간체의 1개 이상은 키랄이다. 일 구체예에서, 혼합물은 상기한 바의 임의의 것의 혼합물 또는 조합물, 예를 들면 항체와 효소의 혼합물, 또는 식물 재료 및 새의 알로부터 얻어진 단백질들 및/또는 폴리펩티드들의 혼합물, 또는 본 발명의 공정이 적용될 수 있는 상기 전형적 인 성분들 중의 임의의 것의 임의의 혼합물을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 공정은, 정지 상으로부터 나올 때 디스플레이서 화합물을 검출하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 검출은 UV/가시 광선 흡수 분광법, 형광 방출 분광법, 질량 분광계, pH, 도전성, 및 1개 이상의 전기 화학적 방법 중 하나 이상에 의해 이루어진다. 상기한 바는 디스플레이서 화합물을 검출하는 가장 통상적인 적용 가능한 방법이고; 다른 적절한 방법은 당업계에 공지된 바와 같이 사용될 수 있다. 이러한 검출은 앞에서 논의된 1개 이상의 "Y" 치환체일 수 있다.
일 구체예에서, 정지 상으로부터 치환되고 있는 성분(들)을 검출하기 위해 사용된 방법은 구하는 특정 성분에 기초하여 적절히 검출될 수 있다. 따라서, 예를 들면 단백질들 및 폴리펩티드들은 이들의 UV/가시 광선 흡수 스펙트럼 또는 특정 흡수 파장에 기초하여, 또는 이들을 가시화제로 유도함으로써 결정될 수 있다. 유사하게, 약물들 및 약물 중간체들은 이들의 UV/가시 광선 흡수 스펙트럼 또는 특정 흡수 파장에 기초하여 결정될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 공정은 정지 상을 재생시키는 1개 이상의 단계들을 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 재생은 예를 들면 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 수산화물, 알칼리 토금속 염, 유기산, 알킬 술폰산, 4급 암모늄 수산화물, 4급 암모늄 염, 알킬 아민 중의 1개 이상의 용액으로 정지 상을 처리하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 용액은 적절한 pH 완충액을 추가로 포함할 수 있다. 필요에 따라서 및 적절한 경우 정제수에 의한 간단한 세척을 포 함하여, 다른 적절한 재생 단계들이 부가될 수 있다. 일 구체예에서, 재생은 물과 함께 유기 공-용매(co-solvent)의 사용을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 치환 크로마토그래피에 적용된 샘플 내의 추적 성분들의 검출, 수집 또는 정량화 중의 1개 이상을 위한 공정을 제공한다. 본 발명의 공정은 일반적으로 이전 구체예들에 개시된 바의 예비 정제 방법으로서 사용될 수 있지만, 치환 크로마토그래피는 또한 샘플 내의 추적 성분들의 간편한 검출, 수집 및 정량화를 가능하게 하는 강력한 샘플 제조 기술이기도 하다. 그의 농도가 임의의 시점에서 크로마토그래피 수지의 용량을 포화시키기에 불충분한 샘플 성분들은 치환 열(train)에 참여하지 않고, 대신에 샘플 내의 주성분들 사이 및 최종 주성분과 디스플레이서 사이의 좁은 전이 구역들을 따라 이동될 수 있다. 이는 도 2에서 A, B 및 C로 라벨된 전이 구역들에 의해 분명히 도시된다. 이론적으로 구속되지 않더라도, 이들 추적 성분들은 치환 크로마토그래피 공정에 완전히 참여하지 않을 것임이 명백하다. 임의의 경우에, 추적 성분들은 컬럼에서 벗어나게 되고, 따라서 검출, 수집 및/또는 정량화될 수 있다.
이들 전이 구역들에 대응하는 분획들의 고립은 추적 성분들이 현저하게 보강되고(10-400X) 주성분(들)이 현저하게 결핍된 샘플들을 제공한다. 이러한 조합은 원래 샘플에 비해 소량 성분들 및 불순물들의 훨씬 더 용이한 식별 및 정량화를 허용한다. 이들 보강된 샘플들의 분석은 치환 크로마토그래피에 대해 사용된 것과 동일한 수지에 대한 용출 크로마토그래피를 포함하여 임의의 적절한 방법에 의해 행해질 수 있다. 대안으로, 충분한 양의 추적 성분들이 수집되는 경우, 이들 화합 물들은 치환 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 이 실시예는 최종 생성물 분석, 바이오마커 발견, 공정 제어 및 공정 최적화에 유용하다. 본원에 사용된 바의 "추적 성분(trace component)"이라는 용어는 치환 크로마토그래피에 적용된 혼합물 중에 존재하는 비교적 소량의 성분들을 의미하고, 각각의 그러한 추적 성분은 본 발명의 치환 크로마토그래피 공정에 초기에 적용된 혼합물의 약 0.01 중량% 내지 약 10중량%를 구성할 수 있다.
다음 실시예들에서, 전형적인 합성 절차들이 제공되고, 그에 의해 이들 전형적인 양이온성 디스플레이서 화합물들이 합성될 수 있다. 본 발명의 범위 내의 다른 적절한 양이온성 디스플레이서 화합물들은 당업계의 숙련자들이 이해하는 바와 같이 상기한 바에 공지되고 및/또는 그로부터 적응된 방법들에 의해 합성될 수 있다.
다음 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예들을 나타내도록 포함된다. 당업계의 숙련자들이라면 이어지는 실시예들에 개시된 기술들이 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 발명자에 의해 발견된 기술들을 나타내고, 따라서 그의 실시를 위해 바람직한 모드들을 구성하도록 고려될 수 있다. 그러나 본원 개시 내용의 견지에서, 당업계의 숙련자들은 개시된 특정 실시예들에서 많은 변화들이 이루어질 수 있고, 본 발명의 정신 및 범위에서 벗어나지 않는 동일하거나 또는 유사한 결과를 여전히 얻고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위에 의해서만 제한됨을 인식해야 한다.
실시예 1 - 테트라쿼트, DBQ의 합성
1,3-디클로로-2-프로판올(DCP)은 본질적으로 Perrine(J. Organic Chemistry, 제18권, 1137-1141페이지(1953))에 의해 개시된 바와 같이, 2당량의 디메틸 아민과의 반응에 의해 1,3-비스(N,N-디메틸아미노)-2-프로판올("BDAP")로 전환된다. 이어서, 갓 증류된 BDAP(146g, 1몰) 및 약 170 mL의 물이 환류 응축기(reflux condenser)가 장착된 둥근 바닥 플라스크에 충전된다. N-(2-히드록시-3-클로로프로필)-N-벤질-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(905g @ 59.8% 고체 = 541g = 2몰)의 수용액을 3시간에 걸쳐 적하(dropwise addition)한다. 결과의 용액은 실온에서 11시간 동안 교반된다. 이어서, 이 용액은 50℃로 가열되고 연속적인 교반 하에 1시간 동안 이 온도에서 유지되고, 그 후, 실온으로 냉각된다. DBQ의 결과의 수용액은 양이온-교환 매질(media)과 같은 정지 상 위의 디스플레이서 화합물로서 사용하기 적절하다. 또한 디스플레이서 화합물로서 사용하기 적절한 고체 DBQ는 회전 증발에 의해서 물을 제거하고, 이어서 2-프로판올로부터 반복적으로 침전시키고, 높은 진공 하에 용매를 최종적으로 제거함으로써 회수될 수 있다.
실시예 2 - 트리쿼트, DMTQ의 합성
72.9 중량%의 활성 에폭시 종들을 함유하는 것으로 적정 분석(titrimetric assay)(테트라부틸암모늄 요오다이드/과염소산 법)에 의해 밝혀진 글리시딜트리메틸암모늄 클로라이드 (GMAC)(Aldrich, CAS# 3033-77-0)의 수용액이 사용된다. 약 400 mL의 물 중의 디메틸아민 히드로클로라이드(408g, 5몰, Aldrich)의 용액이 환류 응축기가 장착된 둥근 바닥 플라스크에서 격렬히 교반된다. 이 용액에 GMAC 용액(=758g 활성=5몰) 1040g이 외부 가열이나 냉각 없이 약 1시간 동안 적하된다. 이러한 부가는 일반적으로 어떠한 감지될 수 있는 발열도 유발하지 않는다. 결과의 용액은 부가가 완료된 후 1시간 동안 실온에서 교반된다. 이 시점에서 GMAC 용액 (5몰)의 다른 동량부(equal portion)의 적하가 시작된다. 이러한 부가는 강한 발열을 유발하고, GMAC 용액의 연속되는 부가는 결과적으로 용액이 환류되게 할 것이다. 이러한 제2 GMAC 충전물의 부가 속도는 조절 중인 발열을 유지하도록 조절된다. 부가가 완료될 때, 용액은 그것이 냉각되는 동안 교반된다. 그의 온도가 약 70℃에 도달할 때(약 3시간 후), 외부 가열은 70℃의 세트포인트에서 전자 조절기(J-Kem Electronics)에 의해 조절된 가열 맨틀에 의해 인가된다. 용액은 약 24시간 동안 70℃에서 유지된다. 실온으로 냉각됨에 따라, DMTQ의 용액은 양이온-교환 매질 등의 적절한 정지 상 위의 디스플레이서 화합물로서 사용하기 적절하다.
실시예 3 - 트리쿼트, TBTQ-A의 합성
또한 POLYCAT®77로서 공지된 트리아민 N-[3-(디메틸아미노)프로필]-N,N',N'-트리메틸-1,3-프로판디아민의 스탁 용액을 2-프로판올 중에서 제조하고, 무수 N2 하에 수일 동안 CaH2에 의해 교반함으로써 건조시킨다. 테플론-코팅된 써모커플 및 고무 격벽이 장착된 250 mL 들이 3-목 둥근 바닥 플라스크에 POLYCAT® 77 (0.06몰) 12.5g을 함유하는 이 여과된 용액 107mL 및 자기 교반 막대를 충전시킨다. 플라스크는 질소로 씻어내고, 양(positive)의 질소 압력 하에 밀봉된다. 벤질 브로마이드 (35g, 0.2몰, Aldrich)가 시린지 펌프에 의해 일정 속도로 테플론 바늘을 통해 교반된 플라스크로 약 3시간에 걸쳐 부가된다. 가벼운 발열이 주목되 고, 내부 온도를 약 30℃로 상승시킨다. 벤질 브로마이드의 부가가 완료될 때, 용액은 40-45℃에서 14시간 동안 가열되고, 실온으로 냉각되고, 회전 증발기 상에서 점성 오일로 증발되고, 메탄올에 용해되어, 시클로헥산 60mL 부로 3회 추출되고, 탄소로 탈색되고, 여과되고 증발 건조되어 회백색 고체로서 TBTQ-A를 수득한다. 이 물질은 양이온-교환 매질 등의 적절한 정지 상 위의 디스플레이서 화합물로서 사용하기 적절하다.
실시예 4 - 디쿼트, BTA의 합성:
DCP (80g, 0.6몰) 및 40% 수성 트리메틸아민 (188g @ 40중량% = 75g = 1.27 몰)은 환류 응축기가 장착된 500 mL 들이 둥근 바닥 플라스크에 충전된다. 이 혼합물은 75℃로 가열되고, 48시간 동안 격렬한 자기 교반 하에 이 온도에서 유지된다. 이 시점의 마지막에, 투명한 무색 용액이 실온으로 냉각된다. BTA의 수율은 >98%이다. 실온으로 냉각됨에 따라, BTA의 용액은 양이온-교환 매질 등의 적절한 정지 상 위의 디스플레이서 화합물로서 사용하기 적절하다.
실시예 5 - 디쿼트, DBD의 합성:
벤질 브로마이드(87g, 0.5몰, Aldrich), 100 mL의 아세토니트릴 (HPLC 등급, Fisher), 및 자기 교반 막대를 써모커플이 장착된 500 mL 들이 3-목 둥근 바닥 플라스크에 충전시키고, 이어서 N2 하에 밀봉시킨다. 증류된 BDAP (35g, 0.24몰)을 눈금 실린더 내로 칭량하고, 이어서 60 mL의 부가 깔대기에 충전시키고, 무수 아세토니트릴 20 mL로 헹군다. 결과의 BDAP 용액의 적하는 80분에 걸쳐 수행된다. 강 한 발열이 즉각적으로 주지되고; 연속되는 부가는 용액 온도를 약 45℃로 서서히 증가시킨다. 부가는 약 45℃의 온도를 유지하도록 거의 마지막에 가속화될 수 있다. BDAP 용액의 부가가 완료될 때, 가열 맨틀이 제 위치에 놓이고, 용액은 55℃에서 3시간 동안 가열되고, 이어서 70℃에서 15시간 동안 가열된다. 용액은 실온으로 냉각되고, 회수 플라스크로 옮겨지고, 회전 증발되어 점성 액체가 얻어진다. 이 액체는 아세톤/물에 용해되어, 회전 증발기 상에서 다시 스트립되어, 본질적으로 분석 HPLC에 의해 100% 순수한 황갈색 고체로서 DBD 122.7g(100% 수율)을 얻는다. 이 재료는 양이온-교환 매질 등의 적절한 정지 상 위의 디스플레이서 화합물로서 사용하기 적절하다.
실시예 6 - 단백질 혼합물의 치환 크로마토그래피
재료 및 장비. 소의 시토크롬 C (Sigma, #C3131, m.w. 12,327) 및 말의 시토크롬 C (Sigma, #C7752, m.w. 12,384)가 수득된 바와 같이 사용된다. HPLC 분석에 의해, 이들은 각각 약 87% 순도 및 약 86% 순도이고, 나머지는 280 및 430 nm에서 흡수되는 손상되고 있는 시토크롬 분자들 또는 이소형태들이다. 모든 다른 화학물질들은 ACS 시약 등급 이상이고, 달리 주지되지 않는 한 수득된 대로 사용된다. 완충제 용매는 HPLC 등급 증류수이다. 로딩/평형화 완충액은 25 mM MOPSO (2-히드록시-3-(N-모르폴리노)프로판술폰산)을 함유하고, NaOH에 의해 pH=7.0으로 조절된다. 디스플레이서 용액은 농축된 스톡 용액을 목적하는 농도까지 로딩 완충액으로 희석시킴으로써 제조된다. 모든 완충 용액들은 헬륨 퍼지되고, 사용 전에 0.2㎛ 필터를 통해 여과된다. 치환 실험들은 Knauer HPLC 시스템(모델 K-1001 펌 프, 모델 K-2600 UV 검출기, 4-채널 탈가스기, 및 용매 오거나이저)를 사용하여 수행된다. 분획 분석들은 Waters HPLC 시스템 (모델 600 펌프 및 조절기, 모델 996 PAD, 및 냉장된 샘플 트레이를 갖춘 모델 717 플러스 오토샘플러)를 사용하여 수행된다.
컬럼 제조. 6.0 x 150 mm 컬럼 상에 로드된 정지 상인 양이온-교환 수지, Tosoh SP-5PW가 세정되고, 방법 C(아래)를 사용하여 재생되고, 이어서 로딩/평형화 완충액 중에서 고체 형태로 저장된다. 컬럼의 출력은 264nm, 도전성 플로우-셀 및 pH 플로우-셀에서 모니터된 UV/Vis 플로우-검출기를 통해 통과된다. 컬럼은 0.17 mL/분의 유동률로 로딩 완충액에 의해 평형화된다. 일단 3개의 신호들(UV 흡수, 도전성, pH) 모두가 안정한 레벨의 베이스라인들(약 25분, 1CV)을 형성하면, 치환 실험이 즉시 개시된다. 과도한 평형 시간은 나트륨 형태로부터 수소 형태로 컬럼의 상부를 전환시키지 않도록 피한다.
비약(breakthrough) 실험. 로딩 완충액 증의 소의 시토크롬 C 및 로딩 완충액 중의 말의 시토크롬 C의 4 mM 용액을 사용하여, 비약 실험들은 0.1-0.5 mL/분 사이의 여러 유동률로 수행된다. 이들 실험들로부터, 만족스럽고 재생 가능한 데이터가 0.17 mL/분에서 얻어질 수 있는 것으로 밝혀졌다. 컬럼 포화 용량은 소의 시토크롬 C에 대해 148mg (34.7 mg/mL 매트릭스), 말의 시토크롬 C에 대해 150 mg(35.2 mg/mL 매트릭스)인 것으로 밝혀졌다.
치환 실험. 소의 시토크롬 C (4.12 mg/mL, Sigma #C3131, m.w. 12,327) 및 말의 시토크롬 C (4.10 mg/mL, Sigma #C7752, m.w. 12,384)의 용액들이 로딩 완충 액 중에서 제조된다. 단백질 농도는 BCA-구리 및 Bradford 분석을 사용하여 측정된다. 동일한 부피의 2개의 시토크롬 용액이 혼합되고, 20.0 μL 샘플 루프 내로 로드되고, 이어서 120분 동안 0.17mL/분의 일정한 유동률로 세정되고 적절히 평형을 이룬 양이온-교환 컬럼 상으로 펌프된다. 이 루프는 입력 플로우 경로 밖으로 스위치되고, 로딩 완충액은 0.17mL/분으로 25분 동안 컬럼을 통해 펌프된다. 마지막으로, 로딩 완충액 중의 4.0 mM DBQ 디스플레이서 용액은 0.17mL/분으로 컬럼 상으로 펌프되고, 컬럼의 출력은 UV/Vis 플로우-검출기(10μL 플로우-셀, 264, 280, 430 nm)를 통해 분획 수집기 내로 통과된다. 시간의 함수로서 UV/vis 검출기의 출력은 도 1에 재생된다.
디스플레이서 용액이 컬럼 내로 흐르기 시작한 후 약 70분 동안 컬럼 유출물 내에 어떠한 단백질 물질도 검출되지 않고, 따라서 이 시간 동안 어떠한 분획들도 수집되지 않는다. 분획 1은 디스플레이서 유동 시작 후 약 70분에 수집되고, 후속 분획들은 1분 간격으로 수집된다. 도전성 및 pH 플로우-셀(상기 참조)은 치환 실험 과정에서 모니터하기 위해 UV/Vis 검출기 뒤의 출력 경로에서 일반적이지만; 분획들이 수집될 때, 이들 2개의 셀들은 치환 피크들 간의 전이를 확대시키지 않도록 흐름 경로 외부로 스위치된다. 전체 108 분획들이 수집된다. 일단 수집되면, 분획들은 후속 HPLC 분석을 위해 밀봉되고, 냉장된다. 이 치환 실험은 22℃의 주변 온도에서 수행된다.
치환 실험 분획들의 HPLC 분석. 치환 실험에서 수집된 108개의 분획들 모두가 각각의 함량을 측정하기 위해 HPLC 분석에 적용된다. 이 분석의 조건은 다음과 같다:
컬럼: 스테인레스강, 4.6(I.D.) x 200 mm, PolySULFOETHYL A, 강한
양이온-교환 실리카-베이스 매트릭스, 5㎛ 입자 크기, 300Å
공극 크기, PolyLC (매릴랜드주 Columbia) 제조
완충액 용매: HPLC 등급 증류수
용출 완충액들: A - 25mM NaH2PO4, NaOH에 의해 pH=6.8
B - 500mM NaCl + 25mM NaH2PO4, NaOH에 의해 pH=6.8
용출 완충액들은 미립자들을 제거하기 위해 0.2㎛ 필터를 통해 여과되었다.
유동률: 1.0 mL/분에서 일정
구배법: 0-2분 100% A, 이소크래틱
2-62분 100% A 내지 100% B, 선형
62-72분 100% B, 이소크래틱
UV 검출기: 264nm - DBQ + 전체 단백질들,
280 nm - 전체 단백질들,
430 nm - 시토크롬 단백질만
샘플 제조: 분획 샘플 30μL 및 갓 제조된 10 mM 1,4-디티오트레이톨(DTT)
30μL를 혼합하였다. 이 혼합물 50μL를 컬럼 상으로 주입한다.
각각의 분획 내의 성분들의 농도는 분석 HPLC 피크들의 통합에 의해 결정된다. 그 결과는 도 2에 그래프로 디스플레이된 히스토그램 내로 컴파일된다. 순수 한 분획들이 표 1에 컴파일된 데이터를 얻도록 푸울(pool)된다. 컬럼으로부터 전체 단백질의 회수는 98%이다.
표 1. 디스플레이서 DBQ를 사용한 치환 크로마토그래피의 결과
정제된 단백질: 소의 시토크롬 C 말의 시토크롬 C
샘플 푸울: 20-39 55-95(초기 + 후기)
HPLC 순도: >99.9% >99.9%
회수율: 63.4% 78.3%
측정된 DBQ:* ND (<6ppm) ND(<6ppm)
추정된 DBQ:* <0.5ppm 2.5ppm
ND = 검출되지 않음 * 투석(dialysis) 전
실시예 7 - 단백질 혼합물의 치환 크로마토그래피
재료 및 장비. 소의 시토크롬 C (Sigma, #C3131, 대략. 분석 = 89%) 및 소의 α-키모트립시노겐 A (Sigma, #C4879, 대략. 분석 = 65%)가 수득된 바와 같이 사용된다. 모든 다른 화학물질들은 ACS 시약 등급 이상이고, 달리 주지되지 않는 한 수득된 대로 사용된다. 완충제 용매는 HPLC 등급 증류수이다. 로딩/평형화 완충액은 25 mM MOPSO (2-히드록시-3-(N-모르폴리노)프로판술폰산)을 함유하고, NaOH에 의해 pH=7.0으로 조절된다. 디스플레이서 용액은 농축된 스톡 용액을 목적하는 농도까지 로딩 완충액으로 희석시킴으로써 제조된다. 모든 완충 용액들은 헬륨 퍼지되고, 사용전에 0.2㎛ 필터를 통해 여과된다. 치환 실험들은 Knauer HPLC 시스템(모델 K-1001 펌프, 모델 K-2600 UV 검출기, 4-채널 탈가스기, 및 용매 오거나이 저)를 사용하여 수행된다. 분획 분석들은 Waters HPLC 시스템 (모델 600 펌프 및 조절기, 모델 996 PAD, 및 냉장된 샘플 트레이를 갖춘 모델 717 플러스 오토샘플러)를 사용하여 수행된다.
컬럼 제조. 컬럼(Amersham Mono S, 5.0 x 200 mm)은 방법 C(아래)를 사용하여 세정 및 재생되고, 염화 나트륨 완충액, 2.0M NaCl + 25mM MOPSO 중에서 나트륨 형태로 저장되고, NaOH에 의해 pH=7.0으로 된다. 컬럼의 출력은 264nm, 도전성 플로우-셀 및 pH 플로우-셀에서 모니터된 UV/Vis 플로우-검출기를 통해 통과된다. 컬럼은 0.20 mL/분의 유동률로 로딩 완충액(상기 참조)에 의해 평형화된다. 일단 3개의 신호들(UV 흡수, 도전성, pH) 모두가 안정한 레벨의 베이스라인들(약 20분, 1CV)을 형성하면, 치환 실험이 즉시 개시된다. 과도한 평형 시간은 나트륨 형태로부터 수소 형태로 컬럼의 상부를 전환시키지 않도록 피한다.
비약 실험. 로딩 완충액 증의 소의 시토크롬 C 및 로딩 완충액 중의 소의 α-키모트립시노겐 A 의 4.0 mg/mL 용액을 사용하여, 비약 실험들은 0.1-0.5 mL/분 사이의 여러 유동률로 수행된다. 로딩 완충액은 25 mM MOPSO (2-히드록시-3-(N-모르폴리노)프로판술폰산)으로부터 제조되고, NaOH에 의해 pH=7.0으로 조절된다. 양호한 재생 가능한 데이터가 0.20 mL/분에서 얻어진다. 컬럼 포화 용량은 시토크롬 C에 대해 약 198g (50.4 mg/mL 매트릭스), 키모트립시노겐에 대해 약 376 mg(95.7 mg/mL 매트릭스)이다. 이들 실험에서, 정제되지 않은 단백질들은 병 밖에서 바로 사용된다.
치환 실험. 소의 시토크롬 C (5.04 mg/mL, Sigma #C3131) 및 소의 α-키모 트립시노겐 A (9.96 mg/mL, Sigma #C4879)의 용액들이 로딩 완충액 중에서 제조된다(상기 참조). 단백질 농도는 BCA-구리 및 Bradford 분석을 사용하여 측정된다. 동일한 부피의 2개의 시토크롬 용액이 혼합되고, 20.0 mL 샘플 루프 내로 로드되고, 이어서 60분 동안 0.40mL/분의 일정한 유동률로 세정되고 적절히 평형을 이룬 양이온-교환 컬럼(상기 참조) 상으로 펌프된다. 이 루프는 입력 플로우 경로 밖으로 스위치되고, 로딩 완충액은 0.20mL/분으로 20분 동안 컬럼을 통해 펌프된다. 마지막으로, 로딩 완충액 중의 4.0 mM DBQ 디스플레이서 용액은 0.20mL/분으로 컬럼 상으로 펌프되고, 컬럼의 출력은 UV/Vis 플로우-검출기(10μL 플로우-셀, 264, 280 nm에서 모니터된)를 통해 분획 수집기 내로 통과된다. 분획들은 1.00분마다 수집된다. 도전성 및 pH 플로우-셀(상기 참조)은 치환 실험 과정에서 모니터하기 위해 UV/Vis 검출기 뒤의 출력 경로에서 일반적이지만; 분획들이 수집될 때, 이들 2개의 셀들은 치환 피크들 간의 전이를 확대시키지 않도록 흐름 경로 외부로 스위치된다. 일단 수집되면, 분획들은 후속 HPLC 분석을 위해 밀봉되고, 냉장된다. 이 치환 실험은 22℃의 주변 온도에서 수행된다. 치환 추적은 도 3에 도시된다.
단백질들의 HPLC 분석. HPLC 분획 분석의 세부 사항들이 아래 주어진다.
컬럼: 스테인레스강 컬럼, 4.6 x 200 mm 내부 치수,
PolyLC (매릴랜드주 Columbia)에 의해 제조
PolySULFOETHYL A, 강한 양이온-교환 실리카-베이스 매트릭스,
5μ 입자 크기, 300Å 공극 크기,
완충액 용매: HPLC 등급 증류수
용출 완충액들: A - 25mM NaH2PO4, NaOH에 의해 pH=6.8
B - 0.50M NaCl + 25mM NaH2PO4, NaOH에 의해 pH=6.8
용출 완충액들은 미립자들을 제거하기 위해 0.2㎛ 필터를 통해 여과되었다.
유동률: 일정한 유동률은 1.0 mL/분이었다
구배법: 0-2분 100% A, 이소크래틱
2-62분 100% A 내지 100% B, 선형 구배
62-72분 100% B, 이소크래틱
UV 검출기 264nm - DBQ + 단백질들,
파장들: 280 nm - 단백질들, 430 nm - 시토크롬
샘플 제조: 샘플 혼합물 50μL가 컬럼 상으로 주입된다.
125개의 수집된 샘플들 모두 상기 방법에 의해 분석되고, 264 nm, 280 nm, 및 430 nm로부터 결합된 데이터는 도 4 및 아래 표에 디스플레이된다. 컬럼으로부터 단백질의 회수는 거의 정량적이다(>97%).
표 2.
정제된 단백질: 소의 키모 A 소의 시토 C
샘플 푸울: 30-50 63-69, 80-93
HPLC 순도: >99.9% >99.9%
회수: 43.6mg 23.6mg
주요 피크의 66% 주요 피크의 52%
전체 단백질의 44% 전체 단백질의 47%
측정된 DBQ:* ND (<6ppm) ND(<6ppm)
추정된 DBQ:* <0.5ppm <0.5ppm
ND = 검출되지 않음 * 투석 전
컬럼 세정 및 재생 절차들.
다음 방법들 중의 1개 이상이 DBQ와 같은 디스플레이서 화합물들에 의해 치환 절차들에 사용된 양이온-교환 컬럼들을 세정 및/또는 재생하기 위해 사용될 수 있다. "재생 효율"은 절차의 완료 후 회수되는 원래 컬럼 비약 용량의 백분율로서 표현된다. 각각의 방법에서, 그 단계들은 열거된 순서로 수행되고, 유동률은 약 0.64 mL/분이다.
방법 A: 세정 + 재생 (재생 효율 98%)
2.0 M KCl + 0.1 M KOH 180 분 27 CV*
0.1 M KH2PO4, pH=6.5 w/KOH 20 분 3 CV
15% 빙초산 27 분 4 CV
0.1 M KH2PO4, pH=6.5 w/KOH 20 분 3 CV
2.0 M NaCl + 25 mM MOPSO, pH=7.0 34 분 5 CV
* CV = 컬럼 부피
방법 B: 재생 단독 (재생 효율 95%)
2.0 M KCl + 0.1 M KH2PO4, pH=6.5 200 분 30 CV*
0.1 M KH2PO4, pH=6.5 w/KOH 20 분 3 CV
2.0 M NaCl + 25 mM MOPSO, pH=7.0 34 분 5 CV
* 100 CV - 150 CV 사이에 (철야 재생)이 100% 재생 효율을 얻기 위해 요구될 수 있다.
방법 C: 세정 + 재생 (재생 효율 100%)
2.0 M KCl + 0.1 M KOH 80 분 12 CV
0.1 M KH2PO4, pH=6.5 w/KOH 20 분 3 CV
1.5 M BaCl2 20 분 3 CV
0.1 M KH2PO4, pH=6.5 w/KOH 20 분 3 CV
15% 아세트산 + 25 mM 18-크라운-6 27 분 4 CV
0.1 M KH2PO4, pH=6.5 w/KOH 20 분 3 CV
2.0 M NaCl + 25 mM MOPSO, pH=7.0 34 분 5 CV
방법 D: 세정 + 재생 (재생 효율 100%)
2.0 M KCl + 0.1 M KOH 80 분 12 CV
0.1 M MOPS, pH=7.2 w/NaOH 20 분 3 CV
1.5 M CaCl2 27 분 4 CV
0.1 M MOPS, pH=7.2 w/NaOH 20 분 3 CV
0.1 M Na2H2EDTA, pH=8.0 w/NaOH 20 분 3 CV
0.1 M MOPS, pH=7.2 w/NaOH 20 분 3 CV
15% 빙초산 27 분 4 CV
0.1 M MOPS, pH=7.2 w/NaOH 20 분 3 CV
2.0 M NaCl + 25 mM MOPSO, pH=7.0 34 분 5 CV
방법 E: 재생 단독 (재생 효율 100%)
2.0 M KCl 80 분 12 CV
0.1 M MOPS, pH=7.2 w/NaOH 20 분 3 CV
1.5 M CaCl2 27 분 4 CV
0.1 M MOPS, pH=7.2 w/NaOH 20 분 3 CV
0.1 M Na2H2EDTA, pH=8.0 w/NaOH* 20 분 3 CV
0.1 M MOPS, pH=7.2 w/NaOH 20 분 3 CV
2.0 M NaCl + 25 mM MOPSO, pH=7.0 34 분 5 CV
* 0.1 M K3시트레이트, pH=7.0이 이 단계에서 사용될 수 있다.
방법 F: 세정 + 재생 (재생 효율 100%)
2.0 M KCl + 0.1 M KOH 80 분 12 CV
0.1 M KH2PO4, pH=6.5 w/KOH 20 분 3 CV
2.0 M BDAP* + 50 mM 아세트산, 34 분 4 CV
pH=4.6 w/HCl
1 M KH2PO4, pH=6.5 w/KOH 20 분 3 CV
2.0 M KCl + 0.1 M KOH 20 분 3 CV
0.1 M KH2PO4, pH=6.5 w/KOH 20 분 3 CV
15% 빙초산 27 분 4 CV
0.1 M KH2PO4, pH=6.5 w/KOH 20 분 3 CV
2.0 M NaCl + 25 mM MOPSO, pH=7.0 34 분 5 CV
* BDAP는 1,3-비스(디메틸아미노)-2-히드록시프로판이다. BDAP 외에, 다음 아민류가 비용 및/또는 유효도를 고려하여 필요에 따라 치환될 수 있다: 1,3-디아미노-2-히드록시프로판; 1,3-비스(디메틸아미노)프로판; 비스(3-아미노프로필)아민; [비스(3-(디메틸아미노)프로필)]아미노메탄; 1-[비스(3-(디메틸아미노)프로필)]아미노-2-히드록시프로판; 및 1,3-디아미노프로판.
방법 G: 세정 + 재생 (재생 효율 100%)
2.0 M [(Me3NCH2)2CHOH]Cl2 80 분 12 CV
+ 0.1 M [Me4N]OH
0.1 M KH2PO4, pH=6.5 w/KOH 20 분 3 CV
1.5 M BaCl2 20 분 3 CV
0.1 M KH2PO4, pH=6.5 w/KOH 20 분 3 CV
15% 아세트산 + 25 mM 18-크라운-6 27 분 4 CV
0.1 M KH2PO4, pH=6.5 w/KOH 20 분 3 CV
2.0 M NaCl + 25 mM MOPSO, pH=7.0 34 분 5 CV
방법 H: 재생 단독 (재생 효율 99%)
2.0 M [(Me3NCH2)2CHOH]Cl2 160 분 24 CV
+ 0.1 M H3PO4, pH=6.5w/[Me4N]OH
0.1 M KH2PO4, pH=6.5 w/KOH 20 분 3 CV
2.0 M NaCl + 25 mM MOPSO, pH=7.0 34 분 5 CV
방법 I: 재생 단독 (재생 효율 99%)
2.0 M KBr + 0.1 M KH2PO4, pH=6.5w/KOH 180 분 27 CV
용매=80/20 v/v 물/아세토니트릴
0.1 M KH2PO4, pH=6.5 w/KOH 20 분 3 CV
2.0 M NaCl + 25 mM MOPSO, pH=7.0 34 분 5 CV
본원에 개시되고 특허 청구된 모든 조성물들 및 공정들은 본원 개시 내용에 비추어 불필요한 실험 없이 당업계의 통상의 기술을 가진 자들에 의해 그들의 지식에 기초하여 이루어질 수 있고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물들 및 공정들이 특정한 바람직한 구체예들의 견지에서 개시되었지만, 당업계의 숙련자들에게 본 발명의 개념, 정신 및 범위에서 벗어나지 않고 본원에 개시된 조성물들 및/또는 공정 들 및 그 공정들의 단계들 또는 그 단계들의 순서에서 변화들이 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 더욱 상세하게는, 화학적으로 또는 생리학적으로 연관된 특정 작용제들이 본원에 개시된 작용제들에 대해 치환될 수 있는 한편, 동일하거나 또는 유사한 결과들이 달성될 수 있음이 명백할 것이다. 당업계의 숙련자들에게 명백한 그러한 유사한 치환제들 및 변형들 모두는 첨부된 특허 청구의 범위에 의해 정의되는 바와 같이 본 발명의 정신, 범위 및 개념 내에 속하는 것으로 간주된다. 더욱이, 본원에 개시된 모든 또는 임의의 특정 실시예들의 모든 가능한 조합은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다.

Claims (35)

  1. 치환 크로마토그래피 방법(displacement chromatography process)으로서,
    분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 혼합물을 적절한 정지 상(stationary phase)에 로딩(loading)하는 단계와,
    다음 일반식(I)을 갖는 디스플레이서 화합물(displacer compound)을 포함하는 혼합물을 상기 정지 상에 가하여 상기 정지 상으로부터 하나 이상의 성분 중 적어도 하나를 치환하는 단계를
    포함하는, 치환 크로마토그래피 방법에 있어서,
    Figure 112013017029434-pct00019
    상기 식에서,
    각각의 기 R1, R2, R3, R'1, R'2, 및 R'3는 알킬, 아릴, 및 아랄킬(aralkyl)로부터 독립적으로 선택될 수 있고, 여기서 하나 이상의 4급 질소(quaternary nitrogen)를 함유하는 고리(ring)는 R1와 R2, R1과 R'1, R1과 R4, R4와 R'4, 또는 R4와 R5 중 임의의 하나 이상에 의해 형성될 수 있고,
    각각의 R4, R'4, R5, 및 R'5는 알킬, 아릴, 아랄킬, 및 -(CH2)a-(CHY)b-(CH2)c-N+R1R2R3An-로부터 독립적으로 선택될 수 있으며, 여기서, R1, R2, 및 R3은 상기 정의된 바와 같고,
    각각의 Y는 -H, -OH, -OR6, 할로겐, 알킬, 아릴, 및 아랄킬로부터 독립적으로 선택될 수 있고, 여기서, -R6는 알킬 또는 -(CH2)a-(CHOH)b-(CH2)c-N+R1R2R3An-일 수 있으며, 여기서, R1, R2, 및 R3은 상기 정의된 바와 같고, 하나 이상의 Y는 하나 이상의 전자기 방법으로 검출 가능한 기일 수 있으며,
    각각의 q와 z는 독립적으로 0 내지 6의 임의의 정수일 수 있고, 단 q+z는 6 이하이며,
    각각의 a, b, 및 c는 독립적으로 0 내지 2의 정수일 수 있으며, 단 임의의 단편에서 a+b+c의 합은 적어도 1이고,
    각각의 An-은, 독립적으로, 중성 화합물을 얻기 위해 필요한 하나 이상의 유기 또는 무기, 1가 또는 다가 음이온일 수 있는, 치환 크로마토그래피 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 정지 상은 양이온-교환 물질인, 치환 크로마토그래피 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 성분은 하나 이상의 폴리펩티드, 하나 이상의 단백질 또는 이들의 임의의 두 개 이상의 혼합물을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질은 5 kD 이상의 분자량을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물로부터 단백질 또는 폴리펩티드는, 상기 단백질 또는 폴리펩티드가 실질적으로 풍부하고/풍부하거나 상기 단백질 또는 폴리펩티드가 다른 단백질 또는 폴리펩티드 성분으로부터 실질적으로 분리된 분획(fraction)에서 상기 정지 상으로부터 치환되는, 치환 크로마토그래피 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물은 두 개 이상의 단백질, 두 개 이상의 폴리펩티드 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  7. 삭제
  8. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물은 분리될 적어도 두 개의 성분을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  9. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물은 적어도 하나의 성분과 적어도 하나의 불순물을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  10. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정지 상으로부터 나올 때 상기 디스플레이서 화합물을 검출하는 단계를 더 포함하고, 상기 검출 단계는, UV/가시 광선 흡수 분광법, 형광 방출 분광법, 질량 분광법, pH, 도전성, 및 하나 이상의 전기 화학 방법 중 하나 이상에 의해 이루어지는, 치환 크로마토그래피 방법.
  11. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정지 상을 재생하는 단계를 더 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 재생 단계는, 상기 정지 상을, 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 금속염, 알칼리 토금속 수산화물, 알칼리 토금속 염, 유기산, 알킬 술폰산, 4급 암모늄 수산화물, 4급 암모늄 염, 알킬 아민 중 하나 이상의 용액으로 처리하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 용액은 적절한 pH 완충액을 더 포함할 수 있는, 치환 크로마토그래피 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 재생 단계는, 물과 유기 공-용매(co-solvent)를 포함하는 용액으로 상기 정지 상을 처리하는 단계를 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  14. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이서 화합물은 다음 구조식을 갖는 DBQ인, 치환 크로마토그래피 방법.
    Figure 112013017029434-pct00020
    (DBQ)
  15. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이서 화합물은 다음 구조식을 갖는 DMTQ인, 치환 크로마토그래피 방법.
    Figure 112013017029434-pct00021
    (DMTQ)
  16. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이서 화합물은 다음 구조식을 갖는 DBTQ인, 치환 크로마토그래피 방법.
    Figure 112013017029434-pct00022
    (DBTQ)
  17. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이서 화합물은 다음 구조식을 갖는 TBTQ-A인, 치환 크로마토그래피 방법.
    Figure 112013017029434-pct00023
    (TBTQ-A)
  18. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이서 화합물은 다음 구조식을 갖는 BTA인, 치환 크로마토그래피 방법.
    Figure 112013017029434-pct00024
    (BTA)
  19. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이서 화합물은 다음 구조식을 갖는 DBD인, 치환 크로마토그래피 방법.
    Figure 112013017029434-pct00025
    (DBD)
  20. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물은 하나 이상의 천연 또는 재조합형 항체 또는 임의의 두 개 이상의 상기 항체의 혼합물을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  21. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물은 하나 이상의 천연 또는 재조합형 효소 또는 임의의 두 개 이상의 상기 효소의 혼합물을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  22. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물은 진단용의 하나 이상의 천연 또는 재조합형 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 임의의 두 개 이상의 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  23. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물은 인간 치료용 또는 수의학적 치료용의 하나 이상의 천연 또는 재조합형 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 임의의 두 개 이상의 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  24. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물은 하나 이상의 천연 또는 재조합형 동물 또는 인간 혈장으로부터 유도된 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 임의의 두 개 이상의 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  25. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물은 하나 이상의 천연 또는 재조합형 식물성 재료로부터 유도된 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 임의의 두 개 이상의 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  26. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물은 하나 이상의 동물 또는 인간의 우유 또는 재조합형 동물로부터 유도된 우유로부터 유도된 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 임의의 두 개 이상의 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  27. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물은 하나 이상의 천연 또는 재조합형 조류 알로부터 유도된 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 임의의 두 개 이상의 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  28. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물은 하나 이상의 천연 또는 재조합형 세균(bacterium), 효모(yeast), 진균(fungus), 바이러스 또는 곤충으로부터 유도된 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 임의의 두 개 이상의 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  29. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물은 하나 이상의 천연 또는 재조합형 포유동물 세포 배양액 또는 동물 조직으로부터 유도된 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 임의의 두 개 이상의 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  30. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물은 하나 이상의 유기 화합물, 약물 또는 약물 중간체, 또는 임의의 두 개 이상의 그 혼합물을 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 하나 이상의 유기 화합물, 약물 또는 약물 중간체 중 하나 이상은 키랄(chiral)인, 치환 크로마토그래피 방법.
  32. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 하나 이상의 성분을 포함하는 상기 혼합물은 하나 이상의 추적 성분(trace component)을 포함하고, 상기 방법은, 혼합물에서 상기 추적 성분의 검출, 수거, 또는 정량화 단계 중 하나 이상을 더 포함하는, 치환 크로마토그래피 방법.
  33. 적절한 수용액에, 다음 일반식(I)을 갖는 디스플레이서 화합물을 포함하는, 치환 크로마토그래피에 유용한 디스플레이서 조성물에 있어서,
    Figure 112013017029434-pct00026
    상기 식에서,
    각각의 기 R1, R2, R3, R'1, R'2, 및 R'3은 알킬, 아릴, 및 아랄킬로부터 독립적으로 선택된 유기 부분(organic moiety)이고,
    각각의 R4, R'4, R5, 및 R'5는 알킬, 아릴, 아랄킬, 및 -(CH2)a-(CHY)b-(CH2)c-N+R1R2R3An-로부터 독립적으로 선택된 유기 부분으로, 여기서, R1, R2, 및 R3은 상기 정의된 바와 같으며,
    적어도 하나의 R1, R2, R3, R'1, R'2, R'3, R4, R'4, R5, 및 R'5는 아릴 또는 아랄킬이고,
    각각의 Y는 -H, -OH, -OR6, 할로겐, 알킬, 아릴, 및 아랄킬로부터 독립적으로 선택되며, 여기서, -R6는 알킬 또는 -(CH2)a-(CHOH)b-(CH2)c-N+R1R2R3An-일 수 있고, 여기서, R1, R2, 및 R3은 상기 정의된 바와 같으며, 적어도 하나의 Y는 -OH 또는 -OR6과 다르고,
    각각의 q와 z는 독립적으로 0 내지 6의 임의의 정수일 수 있고, 단 q+z는 1 내지 6이며,
    각각의 a, b, 및 c는 독립적으로 0 내지 2의 임의의 정수일 수 있으며, 단 임의의 단편에서 a+b+c의 합은 3 내지 6이고,
    각각의 An-은, 독립적으로, 중성 화합물을 얻기 위해 필요한 유기 또는 무기, 1가 또는 다가 음이온 중 하나 이상이거나 혼합물일 수 있으며,
    알킬은 1 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 분지(branched) 또는 분지되지 않은 기이고, 아릴은 6 내지 12개의 탄소 원자를 포함하는 방향족 기이며, 아랄킬은 아릴-치환 알킬기로, 아릴과 알킬은 상기 정의된 바와 같은, 디스플레이서 조성물.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 디스플레이서 화합물은 다음 구조,
    Figure 112013017029434-pct00027
    을 갖는, 디스플레이서 조성물.
  35. 삭제
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