JP5424506B2 - ８−イソプラスタンの定量方法 - Google Patents
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Description
本発明は、８−イソプラスタンの定量方法に関する。
８−イソプラスタンは、細胞膜やリポ蛋白に含まれるリン脂質がフリーラジカルで酸化されることによって生じるプロスタグランジン様の化合物である。尿や血清などの生体試料中に含まれる８−イソプラスタンを測定することにより、生体内における酸化ストレスを非浸襲的に評価することができ、免疫測定により８−イソプラスタンを測定するためのキットも市販されている。
特許文献１には、８−イソプラスタンの免疫測定に関する技術が記載されている。
特許文献２には、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法による８−イソプラスタンの分析に関する技術が記載されている。
しかしながら、従来の８−イソプラスタンの分析方法では、定量するための精度が極めて低かった。そこで、発明者が鋭意検討したところ、特許文献３記載のキノキサリン誘導体で８−イソプラスタンを蛍光ラベル化することで、定量分析が可能になることが期待された。しかしながら、特許文献３の技術では、尿などの生体試料等に含まれる微量な８−イソプラスタンを収率よくラベル化し、定量分析の精度を向上させるには、未だ改善の余地があった。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、精度よく８−イソプラスタンを定量できる技術を提供するものである。
本発明によれば、
下記一般式（１）で表されるキノキサリノン誘導体を、８−イソプラスタンの物質量に対して過剰に用いて８−イソプラスタンを蛍光ラベル化するステップと、
蛍光ラベル化された８−イソプラスタンと、未反応のキノキサリノン誘導体とを含む反応混合物を、スルホン酸又はスルホン酸塩が固定化された陽イオン交換担体に接触させて、蛍光ラベル化された８−イソプラスタンと前記未反応のキノキサリノン誘導体とを分離するステップと、
前記未反応のキノキサリノン誘導体と分離された、蛍光ラベル化された８−イソプラスタンを定量するステップと、
を含む、８−イソプラスタンの定量方法が提供される。
下記一般式（１）で表されるキノキサリノン誘導体を、８−イソプラスタンの物質量に対して過剰に用いて８−イソプラスタンを蛍光ラベル化するステップと、
蛍光ラベル化された８−イソプラスタンと、未反応のキノキサリノン誘導体とを含む反応混合物を、スルホン酸又はスルホン酸塩が固定化された陽イオン交換担体に接触させて、蛍光ラベル化された８−イソプラスタンと前記未反応のキノキサリノン誘導体とを分離するステップと、
前記未反応のキノキサリノン誘導体と分離された、蛍光ラベル化された８−イソプラスタンを定量するステップと、
を含む、８−イソプラスタンの定量方法が提供される。
〔式（１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、炭素数１〜６のアルキル基であり、ｎは、０〜６の整数である。〕
また、本発明によれば、上記の８−イソプラスタンの定量方法に用いられる、８−イソプラスタンを定量するためのキットが提供される。
この発明によれば、キノキサリノン誘導体を用いて８−イソプラスタンを蛍光ラベル化し、ラベル化後に陽イオン交換担体を用いて蛍光ラベル化された８−イソプラスタンとキノキサリノン誘導体とを分離するため、微量の８−イソプラスタンを用いた場合であっても、過剰のキノキサリノン誘導体を用いて収率よくラベル化させ、かつ、過剰のキノキサリン誘導体を陽イオン交換担体に吸着させて除去することができる。したがって、蛍光ラベル化された８−イソプラスタンを定量することで、精度よく８−イソプラスタンを定量分析することが可能になる。
本発明によれば、精度よく８−イソプラスタンを定量することができる。
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
（第１の実施形態）
図１は、本実施の形態の８−イソプラスタン（８−ＩＰ）の定量方法を示すフローチャートである。本実施の形態は、キノキサリノン誘導体として１，２，３，４‐テトラヒドロ‐６，７‐ジメトキシ‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐オキソキノキサリン‐３‐プロピオン酸ヒドラジド（ＤＭＥＱ−Ｈ、（上記式（１）において、Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３がいずれもメチルであり、ｎが２である化合物））を、８−ＩＰの物質量に対して過剰に用いて８−ＩＰを蛍光ラベル化するステップ（Ｓ１０１）と、蛍光ラベル化された８−イソプラスタン（ＤＭＥＱ−ＩＰ）と、未反応のＤＭＥＱ−Ｈとを含む反応混合物を、スルホン酸又はスルホン塩が固定化された陽イオン交換担体に接触させて、ＤＭＥＱ−ＩＰとＤＭＥＱ−Ｈとを分離するステップ（Ｓ１０２）と、未反応のＤＭＥＱ−Ｈと分離された、ＤＭＥＱ−ＩＰを定量するステップ（Ｓ１０３）とを含む。以下、各ステップについて詳細に説明する。
図１は、本実施の形態の８−イソプラスタン（８−ＩＰ）の定量方法を示すフローチャートである。本実施の形態は、キノキサリノン誘導体として１，２，３，４‐テトラヒドロ‐６，７‐ジメトキシ‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐オキソキノキサリン‐３‐プロピオン酸ヒドラジド（ＤＭＥＱ−Ｈ、（上記式（１）において、Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３がいずれもメチルであり、ｎが２である化合物））を、８−ＩＰの物質量に対して過剰に用いて８−ＩＰを蛍光ラベル化するステップ（Ｓ１０１）と、蛍光ラベル化された８−イソプラスタン（ＤＭＥＱ−ＩＰ）と、未反応のＤＭＥＱ−Ｈとを含む反応混合物を、スルホン酸又はスルホン塩が固定化された陽イオン交換担体に接触させて、ＤＭＥＱ−ＩＰとＤＭＥＱ−Ｈとを分離するステップ（Ｓ１０２）と、未反応のＤＭＥＱ−Ｈと分離された、ＤＭＥＱ−ＩＰを定量するステップ（Ｓ１０３）とを含む。以下、各ステップについて詳細に説明する。
［Ｓ１０１：８−ＩＰを蛍光ラベル化するステップ］
ステップＳ１０１では、８−ＩＰのカルボキシル基とＤＭＥＱのヒドラジド基とを反応させてアミド結合を形成し、ＤＭＥＱ−ＩＰを合成する。反応条件は特に制限されないが、溶媒中、塩基、及び、カルボン酸を活性化するための活性化剤存在下に反応させることが好ましい。溶媒としては、水、アルコール、非プロトン性極性溶媒を用いることが好ましく、ジメチルホルムアミドを用いると、より好ましい。塩基としては、脂肪族三級アミンや含窒素複素環化合物が好ましく、ピリジンがより好ましい。活性化剤としては、カルボジイミドが好ましく、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）がより好ましく、ＥＤＣが特に好ましい。
ステップＳ１０１では、８−ＩＰのカルボキシル基とＤＭＥＱのヒドラジド基とを反応させてアミド結合を形成し、ＤＭＥＱ−ＩＰを合成する。反応条件は特に制限されないが、溶媒中、塩基、及び、カルボン酸を活性化するための活性化剤存在下に反応させることが好ましい。溶媒としては、水、アルコール、非プロトン性極性溶媒を用いることが好ましく、ジメチルホルムアミドを用いると、より好ましい。塩基としては、脂肪族三級アミンや含窒素複素環化合物が好ましく、ピリジンがより好ましい。活性化剤としては、カルボジイミドが好ましく、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）がより好ましく、ＥＤＣが特に好ましい。
溶媒中で反応を行う場合、ラベル化させる８−ＩＰの濃度は特に限定されないが、例えば、０．０１〜０、５ｎｍｏｌ／ｍＬとすることができる。
ＤＭＥＱは、８−ＩＰに対して過剰に用いることが好ましく、８−ＩＰに対して、２×１０3倍モル以上用いることが好ましく、５×１０3倍モル以上用いることがより好ましく、１×１０５倍モル以上用いることが特に好ましい。上限は特にないが、２×１０５倍モル以下とすることができる。
塩基（ピリジンなど）を用いる場合は、ＤＭＥＱに対して、５０〜１０００倍モル用いることが好ましく、１００〜５００倍モル用いることがより好ましい。
活性化剤（水溶性カルボジイミドなど）を用いる場合は、８−ＩＰに対して過剰に用いることが好ましく、８−ＩＰに対して、１×１０２〜５×１０５倍モル用いることが好ましく、２×１０３〜５×１０４倍モル用いることがより好ましい。
反応温度は、室温（１５〜３０℃）以上であればよいが、反応効率を上げるため、５０〜９０℃加熱して行うことが好ましく、６０〜８０℃がより好ましい。反応時間は、制限されないが、例えば、１０〜６０分とすることができる。
上記反応条件下における８−ＩＰのラベル化収率は、５０〜１００％とすることができる。
［Ｓ１０２：ＤＭＥＱ−ＩＰとＤＭＥＱ−Ｈとを分離するステップ］
ステップＳ１０２で用いる陽イオン交換担体は、スルホン酸又はスルホン酸塩が固定化されたものであればよいが、下記式（２）で表されるアルキルベンゼンスルホン酸又はその塩が固定化されたものが好ましい。
ステップＳ１０２で用いる陽イオン交換担体は、スルホン酸又はスルホン酸塩が固定化されたものであればよいが、下記式（２）で表されるアルキルベンゼンスルホン酸又はその塩が固定化されたものが好ましい。
〔式（２）中、ｍは、１〜６であり、Ｂ１は、樹脂基材又はシリカゲルである。〕
また、式（２）で表される陽イオン交換担体としては、ｍが３のプロピルベンゼンスルホン酸又はその塩が固定化されたものがより好ましい。また、式（２）中、Ｂ１は、例えば、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体等からなる樹脂基材又はシリカゲルであるが、シリカゲルがより好ましい。使用する陽イオン交換担体の量は、ステップＳ１０１において使用したＤＭＥＱに対して、スルホン酸又はスルホン酸塩の含量（ｅｑ）を１〜１０００倍にすることが好ましい。
ＤＭＥＱ−ＩＰとＤＭＥＱ−Ｈとを含む液体と、陽イオン交換担体との接触方法は特に限られず、バッチ法でもカラム法でもよいが、カラム法が好適である。陽イオン交換担体としてスルホン酸塩を用いる場合は、スルホン酸塩の対イオンをナトリウムイオンにしておくことが好ましい。水酸化ナトリウム水溶液や食塩水等を陽イオン交換担体に接触させることで、スルホン酸塩の対イオンをナトリウムイオンにすることができる。陽イオン交換担体は、充分な水及びアルコール、所定の緩衝液で平衡化しておくことが好ましい。緩衝液として、たとえばｐＨ５．５〜８．５、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５に調節された緩衝液が挙げられる。本明細書において、緩衝液は、所定の酸を水に溶解したものであり、その種類は、ｐＨによって適宜選択することができる。例えば、ｐＨ５．５〜５．６の範囲では酢酸緩衝液、ｐＨ５．５〜６．２の範囲ではクエン酸緩衝液、ｐＨ５．５〜７．０の範囲では、クエン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ５．５〜８．５の範囲では、リン酸緩衝液、ｐＨ７．２〜８．５の範囲では、トリスリン酸緩衝液を用いることができる。また、この緩衝液は、０〜１００体積％、好ましくは１０〜８０体積％の水溶性有機溶媒（特にエタノール）を含有することが好ましい。なお、本明細書において、ｐＨは、２５℃で測定したものをいう。
カラム法の場合、コンディショニングされた陽イオン交換担体にＤＭＥＱ−ＩＰと未反応のＤＭＥＱ−Ｈとを含む反応混合物を通液し、ＤＭＥＱ−ＩＰ及びＤＭＥＱ−Ｈを陽イオン交換担体に保持させる。このとき、反応混合物は、エタノール等の水溶性有機溶媒、緩衝液又はこれらの混合液で反応混合物を希釈されていてもよい。
その後、洗浄液によって、陽イオン交換担体に捕捉されていないアニオン物質や非イオン物質を洗い流す。洗浄液としては、水溶性有機溶媒と水とを主成分とするものが好ましく、水溶性有機溶媒としては、エタノール、アセトニトリル、メタノール等を用いることができ、その濃度は、洗浄液中、１０〜１００体積％、好ましくは、３０〜１００体積％とすることができる。洗浄液は、緩衝液を含んでいることが好ましく、緩衝液のｐＨは、例えば、５．５〜８．５、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５とすることができる。エタノールとリン酸緩衝液との混合液がより好ましく、洗浄液中、０〜１００体積％、好ましくは３０〜１００体積％、より好ましくは５０〜１００体積％のエタノールを含有することがより好ましい。洗浄液の量は、０．１〜１００ｍＬ、好ましくは０．１〜５０ｍＬ、より好ましくは０．１〜２０ｍＬとすることができる。
洗浄後、水溶性有機溶媒と水とを主成分とする溶出液を用いて、陽イオン交換担体に保持したＤＭＥＱ−ＩＰを陽イオン交換担体から溶離する（Ｓ１０３）。溶出液は、エタノール、アセトニトリル、メタノール等の水溶性有機溶媒を含有することができ、その濃度は、溶出液中、１０〜１００体積％、好ましくは、３０〜１００体積％とすることができる。溶出液は、緩衝液を含むことが好ましく、緩衝液のｐＨは、例えば、５．５〜８．５、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５とする。また、エタノールとリン酸緩衝液との混合液がより好ましく、溶出液中、０〜１００体積％、好ましくは３０〜１００体積％、より好ましくは５０〜１００体積％のエタノールを含有することがより好ましい。溶出液は、０．１〜１０ｍＬを通液させ、最初に通液された溶出液を約０．２〜０．３ｍＬまで回収する。なお、溶出液量及び回収液量は、使用する担体の大きさ、サンプル量等に応じて、増減可能である。このようにして、ＤＭＥＱ−ＩＰを得る。ＤＭＥＱ−Ｈは、陽イオン交換樹脂への吸着性が強いため、回収された液体中には、ＤＭＥＱ−ＩＰが含まれるが、ＤＭＥＱ−Ｈを含んでいない。このようにして、ＤＭＥＱ−ＩＰとＤＭＥＱ−Ｈとを分離することができる。
［Ｓ１０３：ＤＭＥＱ−ＩＰを定量するステップ］
ステップＳ１０２で得られたＤＭＥＱ−ＩＰを用い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法によりＤＭＥＱ−ＩＰを定量する。Ｓ１０２において陽イオン交換樹脂から回収された回収液中の溶媒は、ＨＰＬＣを行う前に適宜除去されてもよい。このＨＰＬＣ法では、逆相カラムを用いた逆相カラムクロマトグラフィー法を用いることができる。また、カラムは、加熱することが好ましく、４０〜６０℃に加熱することが好ましい。移動相は、アルコールと緩衝液との混合液が好ましく、具体的には、メタノールと酢酸緩衝液との混合液が好ましい。移動相のｐＨは、弱酸性が好ましく、ｐＨ４〜６がより好ましい。アイソクラティックでも勾配をかけてもよいが、定量の精度を向上させるという観点から、アイソクラティックが好ましい。蛍光励起スペクトルは、最大３６７ｎｍ、蛍光発光スペクトルは、最大４４５ｎｍが好ましい。ＤＭＥＱ−ＩＰの蛍光強度を測定することで、ＨＰＬＣ装置に注入したＤＭＥＱ−ＩＰを定量することができる。
ステップＳ１０２で得られたＤＭＥＱ−ＩＰを用い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法によりＤＭＥＱ−ＩＰを定量する。Ｓ１０２において陽イオン交換樹脂から回収された回収液中の溶媒は、ＨＰＬＣを行う前に適宜除去されてもよい。このＨＰＬＣ法では、逆相カラムを用いた逆相カラムクロマトグラフィー法を用いることができる。また、カラムは、加熱することが好ましく、４０〜６０℃に加熱することが好ましい。移動相は、アルコールと緩衝液との混合液が好ましく、具体的には、メタノールと酢酸緩衝液との混合液が好ましい。移動相のｐＨは、弱酸性が好ましく、ｐＨ４〜６がより好ましい。アイソクラティックでも勾配をかけてもよいが、定量の精度を向上させるという観点から、アイソクラティックが好ましい。蛍光励起スペクトルは、最大３６７ｎｍ、蛍光発光スペクトルは、最大４４５ｎｍが好ましい。ＤＭＥＱ−ＩＰの蛍光強度を測定することで、ＨＰＬＣ装置に注入したＤＭＥＱ−ＩＰを定量することができる。
ＤＭＥＱ−ＩＰの蛍光強度を定量の精度は、変動係数を２０％以下にすることができる。また、１〜１０００ｐｍｏｌの範囲であれば、ピークの高さとＤＭＥＱ−ＩＰの量とが比例関係にあり、相関係数を０．９９以上にすることができる。
このようにして、求められたＤＭＥＱ−ＩＰの量に基づきＳ１０１において使用した８−イソプラスタンの量を求めることができる。Ｓ１０３において得られたＤＭＥＱ−ＩＰの物質量を、そのままラベル化に使用した８−ＩＰの物質量としてもよいし、ラベル化収率を考慮して、使用した８−ＩＰの物質量を算出してもよい。こうした本実施形態の８−ＩＰの定量方法によれば、ＤＭＥＱを用いて８−イソプラスタンを蛍光ラベル化し、ラベル化後に陽イオン交換担体を用いてＤＭＥＱ−ＩＰとＤＭＥＱとを分離するため、１００ｐｍｏｌ以下、さらには、５０ｐｍｏｌ以下の微量の８−イソプラスタンを用いた場合であっても、過剰のＤＭＥＱを用いて収率よくラベル化させ、かつ、過剰のＤＭＥＱを陽イオン交換担体に吸着させて除去することができる。したがって、ＤＭＥＱ−ＩＰを定量することで、精度よく８−イソプラスタンを定量分析することが可能になる。
上記本実施の形態に係る８−イソプラスタンを定量する方法に用いられる、８−イソプラスタンを定量するためのキットは、ＤＭＥＱ−Ｈと、スルホン酸が固定化された陽イオン交換担体と、所定の洗浄液及び溶出液とを含むものであればよいが、ＤＭＥＱ−Ｈは、ジメチルホルムアミド溶液であることが好ましく、陽イオン交換担体には、プロピルベンゼンスルホン酸又はその塩がシリカゲルに固定化された陽イオン交換担体であることが好ましく、洗浄液及び溶出液としては、エタノールとリン酸緩衝液との混合液であることが好ましい。この溶出液は、エタノールとリン酸緩衝液とを別々に包装し、ユーザにおいて調製する形態であってもよい。また、ピリジン等の塩基と、ＥＤＣ等のカルボジイミド又はこれらの溶液を含んでいるとさらに好ましい。なお、こうしたキットには、本実施の形態に係る８−イソプラスタンの定量方法が記載された使用説明書が添付されている。
（第２の実施形態）
図２は、本実施の形態の８−イソプラスタン（８−ＩＰ）の定量方法の一部を示すフローチャートである。本実施の形態は、生体試料中の８−ＩＰの定量方法である。本実施の形態では、生体試料中の８−ＩＰを分離するステップ（Ｓ２０１）と、分離された８−ＩＰを陰イオン交換担体を用いて精製するステップ（Ｓ２０２）とを含み、分離・精製された８−ＩＰを用いて、第１の実施の形態で説明したステップＳ１０１、Ｓ１０２、Ｓ１０３を実行する。本実施の形態では、第１の実施の形態と異なる点のみを説明する。
図２は、本実施の形態の８−イソプラスタン（８−ＩＰ）の定量方法の一部を示すフローチャートである。本実施の形態は、生体試料中の８−ＩＰの定量方法である。本実施の形態では、生体試料中の８−ＩＰを分離するステップ（Ｓ２０１）と、分離された８−ＩＰを陰イオン交換担体を用いて精製するステップ（Ｓ２０２）とを含み、分離・精製された８−ＩＰを用いて、第１の実施の形態で説明したステップＳ１０１、Ｓ１０２、Ｓ１０３を実行する。本実施の形態では、第１の実施の形態と異なる点のみを説明する。
［Ｓ２０１：生体試料中の８−ＩＰを分離するステップ］
Ｓ２０１において用意される生体試料としては、尿、血液、唾液等の体液が挙げられるが、以下、試料が尿である場合を例に説明する。採取する尿の量は、測定をより確実に行う観点から、たとえば０．５〜５０ｍＬ、好適には１．０〜１０ｍＬ、より好適には１．５〜５．０ｍＬとする。採取された原尿そのものを使うことが可能である。また、尿を所定の緩衝液又は水で希釈して用いてもよい。このとき、他の添加剤、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等のキレート剤を加えても良い。尿は採取後直ちに濃縮されることが好ましいが、数時間から数日後であってもよい。
Ｓ２０１において用意される生体試料としては、尿、血液、唾液等の体液が挙げられるが、以下、試料が尿である場合を例に説明する。採取する尿の量は、測定をより確実に行う観点から、たとえば０．５〜５０ｍＬ、好適には１．０〜１０ｍＬ、より好適には１．５〜５．０ｍＬとする。採取された原尿そのものを使うことが可能である。また、尿を所定の緩衝液又は水で希釈して用いてもよい。このとき、他の添加剤、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等のキレート剤を加えても良い。尿は採取後直ちに濃縮されることが好ましいが、数時間から数日後であってもよい。
Ｓ２０１において用いる逆相担体は、官能基として炭素数１〜３０の直鎖の炭化水素基をもつ材料により構成されていることが好ましく、生体試料中の８−イソプラスタンをより効率的に処理する観点から、炭素数８〜２２の直鎖の炭化水素基がより好ましく、炭素数１０〜２０の直鎖の炭化水素基が特に好ましい。逆相担体の量は、尿の重量に対して０．１〜１０倍量とすることができる。
逆相担体の材料として、具体的には、オクタデシルシリル（ＯＤＳ）基を化学結合させたシリカゲルが挙げられる。このとき、オクタデシルシリル（ＯＤＳ）基を化学結合させたシリカゲルにおけるシリル化剤の結合様式は、シリル化剤がシリカゲル中のシラノール基と１対１で結合している様式、つまりモノメリックな結合様式とするとよい。これにより、逆相系充填剤が過度に疎水性とならないようにすることができる。また、逆相担体は、さらに好適な疎水性を有するという観点から、担体表面の炭素（Ｃ）の含有量が、元素比で１８％以下が好ましく、１５％以下とするとより好ましい。
また、逆相担体は、フロー式粒子像分析装置で測定される円相当径０．５〜１０μｍの粒子を粒子数として１〜２０累積％含むことがより好ましい。また、さらに上記装置で測定される円相当径２０〜１００μｍの粒子を粒子数として６５〜９９累積％含んでいてもよく、より好ましくは、７８〜９９累積％含んでいてもよい。こうすることで、分子量や性質等の性状が８−ＩＰとわずかに異なる夾雑物が含まれている場合にも、これらを簡便で確実に分離することができる。この理由としては、粒子径が異なる粒子を特定の比率で配合することにより、大きな粒子の間に小さな粒子が入り込み、単位体積あたりの担体の表面積が最大となり、８−ＩＰの保持力が向上することが考えられる。
さらに、８−ＩＰの分離を効率よく行う観点から、フロー式粒子像分析装置で測定される円相当径０．５〜１０μｍの粒子を粒子数として含む割合は、好ましくは４〜１９累積％、さらに好ましくは４〜１３累積％、特に好ましくは６〜１３累積％である。また、上記装置で測定される円相当径２０〜１００μｍの粒子を粒子数として含む割合は、好ましくは６８〜９５累積％、さらに好ましくは７８〜９３累積％、特に好ましくは８５〜９１累積％である。
なお、フロー式粒子像分析装置は、測定対象の粒子を含む試料が流れるフローセルにストロボ光等の光を照射して、通過中の粒子の画像を取得し、画像解析により円相当径等の粒子形状を示すパラメータを算出する装置である。実際には隋円形などに崩れた粒子が存在するため、円相当径とは、実際に測定した粒子の粒子投影面積と同じ投影面積を持つ球を想定し、その球の直径と定義している。フロー式粒子像分析装置の具体例としては、シスメックス社製ＦＰＩＡ−３０００が挙げられる。
また、逆相担体には、沈降法で測定される粒径３５〜６０μｍの粒子と、コールター法で測定される粒径１０〜３０μｍの粒子との重量比が、８０：２０〜９５：５の範囲にある粒子を含んでいても良い。このようにすれば、８−ＩＰの回収率をさらに向上させることができる。粒径３５〜６０μｍの粒子と粒径１０〜３０μｍの粒子との重量比は、８−ＩＰの回収率と分離時間とのバランスを向上させる観点から、好ましくは９０：１０とする。
生体試料は、予め水及びアルコールで十分にコンディショニングされた逆相担体と接触させることが好ましく、エタノール及び純水でコンディショニングされているとより好ましい。また、ｐＨ５．５〜８．５の緩衝液を用いてコンディショニングすることもできる。生体試料と逆相担体との接触方法は特に限られず、バッチ法でもカラム法でもよいが、効率よく８−イソプラスタンを濃縮できるという観点から、カラム法が好適である。ステップＳ２０１では、逆相担体と移動相との組み合わせとして、例えばオクタデシル（ＯＤＳ）基を化学結合させたシリカゲルとリン酸緩衝液−エタノールの混合液との組み合わせが用いられる。
その後、所定の緩衝液等を洗浄液として逆相担体に流し、逆相担体に捕捉されない物質を洗い流す。Ｓ２０２における洗浄液には、水溶性有機溶媒と水とを主成分とするものを用いることができる。水溶性有機溶媒には、エタノール、アセトニトリル、メタノール等を用いることができ、その濃度は、洗浄液中、１０〜１００体積％、好ましくは、３０〜１００体積％とすることができる。例えば、ｐＨは、５．５〜８．５、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５に調節された緩衝液を用いることができる。中でも、エタノールとリン酸緩衝液との混合液が好ましく、洗浄液中、０〜７０体積％、好ましくは０〜５０体積％、より好ましくは０〜３０体積％のエタノールを含有することがより好ましい。洗浄液の量は、１〜１００ｍＬ、好ましくは１〜５０ｍＬ、より好ましくは１〜２０ｍＬとすることができる。また、エタノールの含量を徐々に増加させるとより好ましく、０〜２０体積％含有エタノール／リン酸緩衝液で洗浄した後、２０〜４０体積％含有エタノール／リン酸緩衝液で洗浄し、さらに、４０〜６０体積％含有エタノール／リン酸緩衝液で洗浄するとより好ましい。
洗浄後、溶出液を用いて、逆相担体に保持した８−ＩＰを逆相担体から溶離する。溶出液には、水溶性有機溶媒と水とを主成分とするものを用いることができる。水溶性有機溶媒には、エタノール、アセトニトリル、メタノール等を用いることができ、その濃度は、溶出液中、１０〜１００体積％、好ましくは、３０〜１００体積％とすることができる。溶出液は、ｐＨが、例えば、５．５〜８．５、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５の緩衝液を含むことが好ましい。また、エタノールとリン酸緩衝液との混合液がより好ましく、溶出液中、１０〜１００体積％、好ましくは３０〜１００体積％、より好ましくは５０〜１００体積％のエタノールを含有することがより好ましい。溶出液は、０．５〜１０ｍＬを通液させ、０．７〜１．７ｍＬにかけて溶出する約１ｍＬを回収する。なお、溶出液量及び回収液量は使用する逆相担体の大きさ、サンプル量等に応じて、増減可能である。このようにして、生体試料から８−イソプラスタンを分離することができる。
［Ｓ２０２：８−ＩＰを精製するステップ］
ステップＳ２０２では、生体試料から分離した８−ＩＰを、陰イオン交換担体を用いて精製する。陰イオン交換担体は、第一又は二級アミンが固定化された弱陰イオン交換担体、芳香族又は脂肪族第四級アンモニウムが固定化された陰イオン交換担体等が用いられるが、第四級アンモニウム塩が固定化された陰イオン交換担体が好ましい。第四級アンモニウム塩としては、式（３）で表されるテトラアルキルアンモニウム塩が好ましい。
ステップＳ２０２では、生体試料から分離した８−ＩＰを、陰イオン交換担体を用いて精製する。陰イオン交換担体は、第一又は二級アミンが固定化された弱陰イオン交換担体、芳香族又は脂肪族第四級アンモニウムが固定化された陰イオン交換担体等が用いられるが、第四級アンモニウム塩が固定化された陰イオン交換担体が好ましい。第四級アンモニウム塩としては、式（３）で表されるテトラアルキルアンモニウム塩が好ましい。
〔式（３）中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６が炭素数１〜６のアルキル基であり、ｐが１〜５であり、Ｂ２が樹脂基材又はシリカゲルであり、Ｘ−が塩化物イオンである。〕
式（３）で表される陰イオン交換担体としては、中でもＲ４、Ｒ５、Ｒ６がメチル基であり、ｐが３のトリメチルアンモニウムプロピル基が固定化されているとより好ましい。また、式（３）中、Ｂ２は、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体等からなる樹脂基材又はシリカゲルであるが、シリカゲルがより好ましい。使用する陰イオン交換担体の量は、第四級アンモニウム塩の含量（ｅｑ）が、８−ＩＰの物質量に対して、１〜１０万倍にすることが好ましいが、例えば、尿中の８−ＩＰを精製する場合、１ｍＬの尿に対して、０．０１〜１ｅｑとなる量にすることができる。
８−ＩＰと陰イオン交換担体との接触方法は特に限られず、バッチ法でもカラム法でもよいが、カラム法が好適である。陰イオン交換担体として第四級アンモニウム塩を用いる場合、対イオンを塩化物イオンにしておくことが好ましい。塩酸や食塩水等を陰イオン交換担体に接触させることで、第四級アンモニウム塩の対イオンを塩化物イオンにすることができる。その後、充分な水及びアルコール、所定の緩衝液で平衡化しておく。緩衝液として、たとえばｐＨ５．５〜８．５、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５に調節された緩衝液が挙げられる。また、この緩衝液は、０〜１００体積％、好ましくは１０〜８０体積％の水溶性有機溶媒（特に、エタノール）を含有することが好ましい。
カラム法の場合、コンディショニングされた陰イオン交換担体に液体試料を流し、８−ＩＰを陰イオン交換担体に保持させた後、水溶性有機溶媒と水とを主成分とする洗浄液によって、陰イオン交換担体に捕捉されていないカチオン物質や非イオン物質を洗い流す。洗浄液として、水溶性有機溶媒と水とを主成分とするものを用いることができる。水溶性有機溶媒としては、エタノール、アセトニトリル、メタノール等を用いることができ、その濃度は、洗浄液中、１０〜１００体積％、好ましくは、３０〜１００体積％とすることができる。また、洗浄液は、緩衝液を含むことが好ましく、ｐＨが、例えば、５．５〜８．５、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５の緩衝液を用いることができる。また、エタノールとリン酸緩衝液との混合液がより好ましく、洗浄液中、０〜１００体積％、好ましくは３０〜１００体積％のエタノールを含有することがより好ましい。洗浄液の量は、１〜１００ｍＬ、好ましくは１〜５０ｍＬ、より好ましくは１〜２０ｍＬとすることができる。
洗浄後、溶出液を用いて、陰イオン交換担体に保持した８−ＩＰをイオン交換担体から溶離する。この溶出液は、水溶性有機溶媒と水とを主成分とするものが好ましい。水溶性有機溶媒は、エタノール、アセトニトリル、メタノール等を用いることができ、その濃度は、溶出液中、１０〜１００体積％、好ましくは、３０〜１００体積％とすることができる。溶出液は、ｐＨが、例えば、５．５〜８．５、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５の緩衝液を含むことが好ましい。中でも、エタノールとリン酸緩衝液との混合液がより好ましく、溶出液中、０〜１００体積％、好ましくは３０〜１００体積％、より好ましくは５０〜１００体積％のエタノールを含有することがより好ましい。溶出液は、０．１〜１０ｍＬを通液させ、１．５〜２．５ｍＬにかけて溶出する約１ｍＬを回収する。なお、溶出液量及び回収液量は、使用する担体の大きさ、サンプル量等に応じて、増減可能である。このようにして、８−ＩＰの精製をすることができる。
回収された液体中には、８−ＩＰが濃縮されており、これを８−ＩＰのラベル化（Ｓ１０１)に供することができる。なお、８−ＩＰの分析前に回収液中の溶媒を、適宜除去してもよい。
上記本実施の形態に係る８−ＩＰの定量方法に用いられる、生体試料中に含まれる８−ＩＰを定量するためのキットは、第一の実施形態で説明したものに加え、逆相担体と、水溶性有機溶媒と水とを主成分とする溶出液とをさらに備えるものとすることができる。この溶出液は、エタノールとリン酸緩衝液との混合液が好ましい。この溶出液もまた、エタノールとリン酸緩衝液とを別々に包装し、ユーザにおいて調製する形態であってもよい。また、第四級アンモニウム塩が固定化された陰イオン交換担体と、洗浄液と溶出液とをさらに含んでいてもよく、陰イオン交換担体として、トリメチルアンモニウムプロピル基がシリカゲルに固定化されたイオン交換担体、洗浄液及び溶出液として、エタノールとリン酸緩衝液との混合液が好ましい。この溶出液もまた、エタノールとリン酸緩衝液とを別々に包装し、ユーザにおいて調製する形態であってもよい。なお、こうしたキットには、本実施の形態に係る８−イソプラスタンを精製する方法が記載された使用説明書が添付されている。
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
たとえば、上記の実施形態では、キノキサリノン誘導体として、ＤＭＥＱを用いる例をあげて説明したが、式（１）で表されるキノキサリノン誘導体であれば、本発明の実施形態に記載された技術を用いることができる。例えば、１，２，３，４‐テトラヒドロ‐６，７‐ジメトキシ‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐オキソキノキサリン‐３‐カルボキシヒドラジド（式（１）において、Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３がいずれもメチルであり、ｎが０である化合物）を用いることもできる。
たとえば、上記の実施形態では、キノキサリノン誘導体として、ＤＭＥＱを用いる例をあげて説明したが、式（１）で表されるキノキサリノン誘導体であれば、本発明の実施形態に記載された技術を用いることができる。例えば、１，２，３，４‐テトラヒドロ‐６，７‐ジメトキシ‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐オキソキノキサリン‐３‐カルボキシヒドラジド（式（１）において、Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３がいずれもメチルであり、ｎが０である化合物）を用いることもできる。
また、第２の実施形態では、生体試料から８−イソプラスタンを分離する方法と、分離した８−イソプラスタンを精製する方法とについて説明した。しかしながら、生体試料から分離した８−イソプラスタンを精製せずにステップＳ１０１〜Ｓ１０３を実行してもよい。また、化学的に合成した８−イソプラスタン、ステップＳ２０１以外の方法で生体試料から分離された８−イソプラスタンを用いてステップＳ２０２の８−イソプラスタンの精製を行い、ステップＳ１０１〜Ｓ１０３を実行してもよい。
また、第２の実施形態では、尿中の８−イソプラスタンを精製する場合を例に説明したが、血清中の８−イソプラスタンを精製する場合は、８−イソプラスタンの正常値が尿中の１００分の１程度であるため、定量前に、濃縮操作を行ってもよい。たとえば、血清サンプルを５０℃のヒートブロックにセットし、窒素気流下で溶媒を除去するなど、１００倍の濃縮操作を追加する。こうすることで、ステップＳ１０１〜１０３を実行し、蛍光ラベル化された８−イソプラスタンをＨＰＬＣ分析するとき、血清中の８−イソプラスタンのピークを明瞭に観察することができる。
以下、本発明の参考形態を付記する。
＜１＞下記一般式（１）：
〔式（１）中、Ｒ １ 、Ｒ ２ 及びＲ ３ は、炭素数１〜６のアルキル基であり、ｎは、０〜６の整数である。〕
で表されるキノキサリノン誘導体を、８−イソプラスタンの物質量に対して過剰に用いて８−イソプラスタンを蛍光ラベル化するステップと、
蛍光ラベル化された８−イソプラスタンと、未反応のキノキサリノン誘導体とを含む反応混合物を、スルホン酸又はスルホン酸塩が固定化された陽イオン交換担体に接触させて、蛍光ラベル化された８−イソプラスタンと前記未反応のキノキサリノン誘導体とを分離するステップと、
前記未反応のキノキサリノン誘導体と分離された、蛍光ラベル化された８−イソプラスタンを定量するステップと、
を含む、８−イソプラスタンの定量方法。
＜２＞前記キノキサリノン誘導体が１，２，３，４‐テトラヒドロ‐６，７‐ジメトキシ‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐オキソキノキサリン‐３‐プロピオン酸ヒドラジドである、＜１＞に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜３＞８−イソプラスタンを蛍光ラベル化する前記ステップにおいて、８−イソプラスタンに対して５×１０ ３ 倍モル以上の前記キノキサリノン誘導体を用いて、８−イソプラスタンを蛍光ラベル化する、＜１＞又は＜２＞に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜４＞８−イソプラスタンを蛍光ラベル化する前記ステップにおいて、５０〜９０℃に加熱して前記キノキサリノン誘導体と８−イソプラスタンとを反応させることにより蛍光ラベル化する、＜１＞乃至＜３＞いずれか１に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜５＞蛍光ラベル化された８−イソプラスタンを定量する前記ステップにおいて、逆相カラムを用いたアイソクラティックによる高速液体クロマトグラフィー法を用いて蛍光ラベル化された８−イソプラスタンを分析する、＜１＞乃至＜４＞いずれか１に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜６＞前記陽イオン交換担体が、下記式（２）で表されるアルキルベンゼンスルホン酸又はその塩が固定化されたものである、＜１＞乃至＜５＞いずれか１に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
〔式（２）中、ｍは、１〜６であり、Ｂ １ は、樹脂基材又はシリカゲルである。〕
＜７＞生体試料中の８−イソプラスタンを分離するステップをさらに含み、分離された８−イソプラスタンを用いて、蛍光ラベル化する前記ステップを実行する、＜１＞乃至＜６＞いずれか１に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜８＞前記生体試料中の８−イソプラスタンを分離する前記ステップにおいて、前記生体試料と逆相担体とを接触させて、前記生体試料から８−イソプラスタンを分離する、＜７＞に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜９＞前記逆相担体が、官能基として炭素数１〜３０の直鎖の炭化水素基を有し、担体表面の炭素含有量が元素比で１８％以下である材料により構成されている、＜８＞に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１０＞前記逆相担体が、フロー式粒子像分析装置で測定される円相当径０．５〜１０μｍの粒子を粒子数として１〜２０累積％含む、＜９＞に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１１＞前記逆相担体が、さらに、フロー式粒子像分析装置で測定される円相当径２０〜１００μｍの粒子を粒子数として６５〜９９累積％含む、＜１０＞に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１２＞前記逆相担体の材料が、オクタデシルシリル基を有するシリカゲルである、＜８＞乃至＜１１＞いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１３＞前記逆相担体が、沈降法で測定される粒径３５μｍ以上６０μｍ以下の粒子とコールター法で測定される粒径１０μｍ以上３０μｍ以下の粒子とを含み、
粒径３５μｍ以上６０μｍ以下の前記粒子と、粒径１０μｍ以上３０μｍ以下の前記粒子との重量比が、８０：２０〜９５：５の範囲である、＜８＞乃至＜１３＞いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１４＞前記生体試料が尿、唾液又は血液である、＜７＞乃至＜１３＞いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１５＞８−イソプラスタンを陰イオン交換担体を用いて精製するステップをさらに含み、精製された８−イソプラスタンを用いて、蛍光ラベル化する前記ステップを実行する、＜１＞乃至＜１４＞いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１６＞前記陰イオン交換担体が、第四級アンモニウム塩が固定化された陰イオン交換担体である、＜１５＞に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１７＞＜１＞乃至＜１６＞いずれか１に記載の８−イソプラスタンの定量方法に用いられる、８−イソプラスタンを定量するためのキット。
以下、本発明の参考形態を付記する。
＜１＞下記一般式（１）：
で表されるキノキサリノン誘導体を、８−イソプラスタンの物質量に対して過剰に用いて８−イソプラスタンを蛍光ラベル化するステップと、
蛍光ラベル化された８−イソプラスタンと、未反応のキノキサリノン誘導体とを含む反応混合物を、スルホン酸又はスルホン酸塩が固定化された陽イオン交換担体に接触させて、蛍光ラベル化された８−イソプラスタンと前記未反応のキノキサリノン誘導体とを分離するステップと、
前記未反応のキノキサリノン誘導体と分離された、蛍光ラベル化された８−イソプラスタンを定量するステップと、
を含む、８−イソプラスタンの定量方法。
＜２＞前記キノキサリノン誘導体が１，２，３，４‐テトラヒドロ‐６，７‐ジメトキシ‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐オキソキノキサリン‐３‐プロピオン酸ヒドラジドである、＜１＞に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜３＞８−イソプラスタンを蛍光ラベル化する前記ステップにおいて、８−イソプラスタンに対して５×１０ ３ 倍モル以上の前記キノキサリノン誘導体を用いて、８−イソプラスタンを蛍光ラベル化する、＜１＞又は＜２＞に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜４＞８−イソプラスタンを蛍光ラベル化する前記ステップにおいて、５０〜９０℃に加熱して前記キノキサリノン誘導体と８−イソプラスタンとを反応させることにより蛍光ラベル化する、＜１＞乃至＜３＞いずれか１に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜５＞蛍光ラベル化された８−イソプラスタンを定量する前記ステップにおいて、逆相カラムを用いたアイソクラティックによる高速液体クロマトグラフィー法を用いて蛍光ラベル化された８−イソプラスタンを分析する、＜１＞乃至＜４＞いずれか１に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜６＞前記陽イオン交換担体が、下記式（２）で表されるアルキルベンゼンスルホン酸又はその塩が固定化されたものである、＜１＞乃至＜５＞いずれか１に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜７＞生体試料中の８−イソプラスタンを分離するステップをさらに含み、分離された８−イソプラスタンを用いて、蛍光ラベル化する前記ステップを実行する、＜１＞乃至＜６＞いずれか１に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜８＞前記生体試料中の８−イソプラスタンを分離する前記ステップにおいて、前記生体試料と逆相担体とを接触させて、前記生体試料から８−イソプラスタンを分離する、＜７＞に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜９＞前記逆相担体が、官能基として炭素数１〜３０の直鎖の炭化水素基を有し、担体表面の炭素含有量が元素比で１８％以下である材料により構成されている、＜８＞に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１０＞前記逆相担体が、フロー式粒子像分析装置で測定される円相当径０．５〜１０μｍの粒子を粒子数として１〜２０累積％含む、＜９＞に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１１＞前記逆相担体が、さらに、フロー式粒子像分析装置で測定される円相当径２０〜１００μｍの粒子を粒子数として６５〜９９累積％含む、＜１０＞に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１２＞前記逆相担体の材料が、オクタデシルシリル基を有するシリカゲルである、＜８＞乃至＜１１＞いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１３＞前記逆相担体が、沈降法で測定される粒径３５μｍ以上６０μｍ以下の粒子とコールター法で測定される粒径１０μｍ以上３０μｍ以下の粒子とを含み、
粒径３５μｍ以上６０μｍ以下の前記粒子と、粒径１０μｍ以上３０μｍ以下の前記粒子との重量比が、８０：２０〜９５：５の範囲である、＜８＞乃至＜１３＞いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１４＞前記生体試料が尿、唾液又は血液である、＜７＞乃至＜１３＞いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１５＞８−イソプラスタンを陰イオン交換担体を用いて精製するステップをさらに含み、精製された８−イソプラスタンを用いて、蛍光ラベル化する前記ステップを実行する、＜１＞乃至＜１４＞いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１６＞前記陰イオン交換担体が、第四級アンモニウム塩が固定化された陰イオン交換担体である、＜１５＞に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
＜１７＞＜１＞乃至＜１６＞いずれか１に記載の８−イソプラスタンの定量方法に用いられる、８−イソプラスタンを定量するためのキット。
実施例１
８−イソプラスタンの標準品（Ｃａｙｍａｎ社製）２ｎｇを８％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍＬに溶解して１０ｎｇ／ｍＬ（３０ｐｍｏｌ／ｍＬ）８−イソプラスタン溶液を調製した。これを１５０μＬとり、７５μＬの試薬Ｉ（８−イソプラスタンに対して５×１０４倍モル）と、６０μＬの試薬ＩＩ（ＤＭＥＱ−Ｈに対して５００倍モル）と、１５μＬの試薬ＩＩＩ（８−イソプラスタンに対して２．５×１０５倍モル）とに混合し、７０℃で２０分間反応させた。その後、１０分間流水で冷却した。Ｖａｒｉａｎ製のＳＣＸ（イオン交換容量：０．８ｍｅｑ／ｇ、充てん剤量０．２５ｇ、カラムサイズ４ｍＬ、カラム形状注射筒型、ポリプロピレン）をエタノール及び純水により順にコンディショニングして準備し、冷却した反応液を導入した。８％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍＬで洗浄した後、８％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍＬを通液して得られるフラクションを８−イソプラスタンの分析サンプルとして回収した。回収した分析サンプルは、そのままＨＰＬＣに注入した。
＜試薬＞
・試薬I：１０ｍＭ １，２，３，４‐テトラヒドロ‐６，７‐ジメトキシ‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐オキソキノキサリン‐３‐プロピオン酸ヒドラジド（ＤＭＥＱ−Ｈ）／ジメチルホルムアミド
・試薬II：１０％（ｖ／ｖ）ピリジン／２０ｍＭ塩酸含有エタノール
・試薬III：０．５Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミド塩酸塩／精製水
＜ＨＰＬＣ条件＞
流速 １．２ｍＬ／分
カラムオーブン ５０℃
分析カラム Ｄｉｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ ＭＧ５（２５０ｍｍ、φ４．６ｍｍ）
注入量 １０μＬ
蛍光検出器 Ｅｘ：３６７ｎｍ、Ｅｍ：４４５ｎｍ
移動相 メタノール：２５ｍＭ 酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）＝５５：４５（アイソクラティック）
８−イソプラスタンの標準品（Ｃａｙｍａｎ社製）２ｎｇを８％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍＬに溶解して１０ｎｇ／ｍＬ（３０ｐｍｏｌ／ｍＬ）８−イソプラスタン溶液を調製した。これを１５０μＬとり、７５μＬの試薬Ｉ（８−イソプラスタンに対して５×１０４倍モル）と、６０μＬの試薬ＩＩ（ＤＭＥＱ−Ｈに対して５００倍モル）と、１５μＬの試薬ＩＩＩ（８−イソプラスタンに対して２．５×１０５倍モル）とに混合し、７０℃で２０分間反応させた。その後、１０分間流水で冷却した。Ｖａｒｉａｎ製のＳＣＸ（イオン交換容量：０．８ｍｅｑ／ｇ、充てん剤量０．２５ｇ、カラムサイズ４ｍＬ、カラム形状注射筒型、ポリプロピレン）をエタノール及び純水により順にコンディショニングして準備し、冷却した反応液を導入した。８％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍＬで洗浄した後、８％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍＬを通液して得られるフラクションを８−イソプラスタンの分析サンプルとして回収した。回収した分析サンプルは、そのままＨＰＬＣに注入した。
＜試薬＞
・試薬I：１０ｍＭ １，２，３，４‐テトラヒドロ‐６，７‐ジメトキシ‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐オキソキノキサリン‐３‐プロピオン酸ヒドラジド（ＤＭＥＱ−Ｈ）／ジメチルホルムアミド
・試薬II：１０％（ｖ／ｖ）ピリジン／２０ｍＭ塩酸含有エタノール
・試薬III：０．５Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミド塩酸塩／精製水
＜ＨＰＬＣ条件＞
流速 １．２ｍＬ／分
カラムオーブン ５０℃
分析カラム Ｄｉｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ ＭＧ５（２５０ｍｍ、φ４．６ｍｍ）
注入量 １０μＬ
蛍光検出器 Ｅｘ：３６７ｎｍ、Ｅｍ：４４５ｎｍ
移動相 メタノール：２５ｍＭ 酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）＝５５：４５（アイソクラティック）
実施例２
逆相担体として、ＹＭＣ社製ＯＤＳ−ＡＱの粒径５０μｍ及び２０μｍを、５０μｍ：２０μｍ＝９０：１０の重量比で、均質になるように混合して、逆相カラム充填材を調製した。粒径５０μｍは沈降法、粒径２０μｍはコールター法により測定した。調製した逆相カラム充填材は、フロー式粒子像分析装置（シスメックス社製ＦＰＩＡ−３０００）で測定される円相当径０．５〜１０μｍの粒子径を粒子数として１０累積％含み、上記装置で測定される円相当径２０〜１００μｍの粒子を粒子数として９０累積％含んでいた。この充填材を８００ｍｇ充填した逆相カラムを準備し、エタノール、水の順で通液し、コンディショニングを行った。この逆相カラムに、１．４ｍＬの尿（産業技術総合研究所ボランティア（ヒト）、産業技術総合研究所倫理審査委員会承認番号１５０００−Ａ−２００８１２１５−００１）と、０．６ｍＬの８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、４ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）含有）とを混ぜ合わせた合計２ｍＬのサンプルを導入した。そして、洗浄液として、下記（i）、（ii）、（iii）を用い、順に洗浄した。
（i）２％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）：６．０ｍＬ
（ii）３０％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）：４．０ｍＬ
（iii）５０％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）：０．８ｍＬ
その後、５０％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．７ｍＬを通液して得られるフラクションを８−イソプラスタンを含有するフラクションとして回収した。ついで、イオン交換担体として、Ｖａｒｉａｎ製のＳＡＸ（イオン交換容量：０．８ｍｅｑ／ｇ、充てん剤量０．５ｇ、カラムサイズ３ｍＬ、カラム形状注射筒型、ポリプロピレン）を準備し、逆相担体から回収した８−イソプラスタンを含有するフラクションをコンディショニングしたＳＡＸに導入した。ＳＡＸのコンディショニンングは、エタノール及び純水を順に通液して行った。８−イソプラスタンが導入されたＳＡＸは、０．４ｍＬの５０％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、５０％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．８ｍＬを通液して得られるフラクションを８−イソプラスタンを含有するフラクションとして回収した。このフラクションを１５０μＬとり、７５μＬの試薬I、６０μＬの試薬ＩＩ、１５μＬの試薬ＩＩＩを加えて、実施例１と同様に、ＳＣＸによる処理を経てＨＰＬＣ分析を行った。
逆相担体として、ＹＭＣ社製ＯＤＳ−ＡＱの粒径５０μｍ及び２０μｍを、５０μｍ：２０μｍ＝９０：１０の重量比で、均質になるように混合して、逆相カラム充填材を調製した。粒径５０μｍは沈降法、粒径２０μｍはコールター法により測定した。調製した逆相カラム充填材は、フロー式粒子像分析装置（シスメックス社製ＦＰＩＡ−３０００）で測定される円相当径０．５〜１０μｍの粒子径を粒子数として１０累積％含み、上記装置で測定される円相当径２０〜１００μｍの粒子を粒子数として９０累積％含んでいた。この充填材を８００ｍｇ充填した逆相カラムを準備し、エタノール、水の順で通液し、コンディショニングを行った。この逆相カラムに、１．４ｍＬの尿（産業技術総合研究所ボランティア（ヒト）、産業技術総合研究所倫理審査委員会承認番号１５０００−Ａ−２００８１２１５−００１）と、０．６ｍＬの８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、４ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）含有）とを混ぜ合わせた合計２ｍＬのサンプルを導入した。そして、洗浄液として、下記（i）、（ii）、（iii）を用い、順に洗浄した。
（i）２％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）：６．０ｍＬ
（ii）３０％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）：４．０ｍＬ
（iii）５０％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）：０．８ｍＬ
その後、５０％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．７ｍＬを通液して得られるフラクションを８−イソプラスタンを含有するフラクションとして回収した。ついで、イオン交換担体として、Ｖａｒｉａｎ製のＳＡＸ（イオン交換容量：０．８ｍｅｑ／ｇ、充てん剤量０．５ｇ、カラムサイズ３ｍＬ、カラム形状注射筒型、ポリプロピレン）を準備し、逆相担体から回収した８−イソプラスタンを含有するフラクションをコンディショニングしたＳＡＸに導入した。ＳＡＸのコンディショニンングは、エタノール及び純水を順に通液して行った。８−イソプラスタンが導入されたＳＡＸは、０．４ｍＬの５０％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、５０％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．８ｍＬを通液して得られるフラクションを８−イソプラスタンを含有するフラクションとして回収した。このフラクションを１５０μＬとり、７５μＬの試薬I、６０μＬの試薬ＩＩ、１５μＬの試薬ＩＩＩを加えて、実施例１と同様に、ＳＣＸによる処理を経てＨＰＬＣ分析を行った。
実施例３
実施例２において、異なる検体から得られた尿サンプルを用いた以外は、同様にして行った。
実施例２において、異なる検体から得られた尿サンプルを用いた以外は、同様にして行った。
実施例１、２で得られたＨＰＬＣチャートを図３に示す。図３中、Ａ（破線）が実施例１、Ｂ（実線）が実施例２である。実施例２は２回行い、図３（ａ）のＢは、１回目に行った実施例１のチャート図を示し、図３（ｂ）のＢは、２回目に行った実施例１のチャート図を示した。また、実施例１、３で得られたＨＰＬＣチャートを図４に示す。Ａ（破線）が実施例１であり、Ｃ（実線）が実施例３である。実施例３も２回行い、図４（ａ）のＣは、１回目に行った実施例３のチャート図を示し、図４（ｂ）のＣは、２回目に行った実施例３のチャート図を示した。図３、４中、８−イソプラスタンの保持時間は約１９分である。なお、実施例１のサンプルは、実施例２又は３のサンプルと同時に注入し、保持時間約１９分のピークが重なることを確認した。
実施例２について、尿の代わりに、８−イソプラスタン溶液を１、２、５、１０、２０、５０ｎｇ／ｍＬにふって調製したものを用い、それぞれについて同様な操作を行って検量線を作成した。なお、８−イソプラスタン溶液は、８−イソプラスタンの標準品（Ｃａｙｍａｎ社製）を８％（ｖ／ｖ）エタノール含有１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解して調製した。また、１０、５０ｎｇ／ｍＬの８−イソプラスタン溶液については、それぞれｎ＝１０の平均値を用い、１、２、５、２０ｎｇ／ｍＬの８−イソプラスタン溶液については、それぞれｎ＝５の平均値を用いて検量線を作成した。変動係数は、２．８〜８．５％であった。また、検量線の相関係数は、Ｒ２＝０．９９８４であった。
なお、実施例１について、８−イソプラスタン溶液の調製を２、４、１０、２０、４０、１００ｎｇ／ｍＬにして行っても、同様な検量線が得られることも確認した。
実施例２、３の分析結果、及び、得られた検量線から、この結果から、実施例２で使用した尿に含まれる８−イソプラスタンの量は、１５ｐｍｏｌ／ｍｌであり、実施例３で使用した尿に含まれる８−イソプラスタンの量は、１１ｐｍｏｌ／ｍｌであることが求められた。
なお、実施例１について、８−イソプラスタン溶液の調製を２、４、１０、２０、４０、１００ｎｇ／ｍＬにして行っても、同様な検量線が得られることも確認した。
実施例２、３の分析結果、及び、得られた検量線から、この結果から、実施例２で使用した尿に含まれる８−イソプラスタンの量は、１５ｐｍｏｌ／ｍｌであり、実施例３で使用した尿に含まれる８−イソプラスタンの量は、１１ｐｍｏｌ／ｍｌであることが求められた。
Claims (16)
- 下記一般式（１）：
で表されるキノキサリノン誘導体を、８−イソプラスタンの物質量に対して過剰に用いて８−イソプラスタンを蛍光ラベル化するステップと、
蛍光ラベル化された８−イソプラスタンと、未反応のキノキサリノン誘導体とを含む反応混合物を、スルホン酸又はスルホン酸塩が固定化された陽イオン交換担体に接触させて、蛍光ラベル化された８−イソプラスタンと前記未反応のキノキサリノン誘導体とを分離するステップと、
前記未反応のキノキサリノン誘導体と分離された、蛍光ラベル化された８−イソプラスタンを定量するステップと、
を含む、８−イソプラスタンの定量方法。 - 前記キノキサリノン誘導体が１，２，３，４‐テトラヒドロ‐６，７‐ジメトキシ‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐オキソキノキサリン‐３‐プロピオン酸ヒドラジドである、請求項１に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
- ８−イソプラスタンを蛍光ラベル化する前記ステップにおいて、８−イソプラスタンが１００ｐｍｏｌ以下であって、前記８−イソプラスタンに対して５×１０３倍モル以上の前記キノキサリノン誘導体を用いて、８−イソプラスタンを蛍光ラベル化する、請求項１又は２に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
- ８−イソプラスタンを蛍光ラベル化する前記ステップにおいて、５０〜９０℃に加熱して前記キノキサリノン誘導体と８−イソプラスタンとを反応させることにより蛍光ラベル化する、請求項１乃至３いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
- 蛍光ラベル化された８−イソプラスタンを定量する前記ステップにおいて、逆相カラムを用いたアイソクラティックによる高速液体クロマトグラフィー法を用いて蛍光ラベル化された８−イソプラスタンを分析する、請求項１乃至４いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
- 前記陽イオン交換担体が、下記式（２）で表されるアルキルベンゼンスルホン酸又はその塩が固定化されたものである、請求項１乃至５いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
- 生体試料中の８−イソプラスタンを分離するステップをさらに含み、分離された８−イソプラスタンを用いて、蛍光ラベル化する前記ステップを実行する、請求項１乃至６いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
- 前記生体試料中の８−イソプラスタンを分離する前記ステップにおいて、前記生体試料と逆相担体とを接触させて、前記生体試料から８−イソプラスタンを分離する、請求項７に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
- 前記逆相担体が、官能基として炭素数１〜３０の直鎖の炭化水素基を有し、担体表面の炭素含有量が元素比で１８％以下である材料により構成されている、請求項８に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
- 前記逆相担体が、フロー式粒子像分析装置で測定される円相当径０．５〜１０μｍの粒子を粒子数として１〜２０累積％含む、請求項９に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
- 前記逆相担体が、さらに、フロー式粒子像分析装置で測定される円相当径２０〜１００μｍの粒子を粒子数として６５〜９９累積％含む、請求項１０に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
- 前記逆相担体の材料が、オクタデシルシリル基を有するシリカゲルである、請求項８乃至１１いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
- 前記逆相担体が、沈降法で測定される粒径３５μｍ以上６０μｍ以下の粒子とコールター法で測定される粒径１０μｍ以上３０μｍ以下の粒子とを含み、
粒径３５μｍ以上６０μｍ以下の前記粒子と、粒径１０μｍ以上３０μｍ以下の前記粒子との重量比が、８０：２０〜９５：５の範囲である、請求項８乃至１３いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。 - 前記生体試料が尿、唾液又は血液である、請求項７乃至１３いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
- ８−イソプラスタンを陰イオン交換担体を用いて精製するステップをさらに含み、精製された８−イソプラスタンを用いて、蛍光ラベル化する前記ステップを実行する、請求項１乃至１４いずれか１項に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
- 前記陰イオン交換担体が、第四級アンモニウム塩が固定化された陰イオン交換担体である、請求項１５に記載の８−イソプラスタンの定量方法。
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