JP5298390B2

JP5298390B2 - フルオラス化シアル酸誘導体およびその分析方法

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Publication number: JP5298390B2
Application number: JP2009264030A
Authority: JP
Inventors: 忠巴山; 政俊山口; 均能田; 秀幸吉田; 堅一郎轟木; 美紀糸山; 洋平坂口
Original assignee: Fukuoka University
Current assignee: Fukuoka University
Priority date: 2009-11-19
Filing date: 2009-11-19
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2029-11-19
Also published as: JP2011107033A

Description

この発明は、フルオラス化シアル酸誘導体およびその分析方法に関するものであり、更に詳細には、フルオラス化シアル酸誘導体およびフルオラス誘導体化法によるフルオラス化シアル酸の液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析（LC-MS/MS）方法に関するものである。

シアル酸は動物体内に広く存在する炭素9個からなるデオキシウロン酸の総称である。主に、N-アセチルノイラミン酸（NANA）、N-グリコリルノイラミン酸（NGNA）及びデアミノノイラミン酸（KDN）が3大分子種として知られており、他に水酸基がアセチル化、硫酸化、メチル化あるいはラクトン化されたものなど、これまでに約50種が同定されている。これらシアル酸は動物体内において遊離体あるいは糖タンパクや糖脂質における糖鎖の非還元末端として存在しており、受精、発生及び分化過程におけるリガンド-受容体及び細胞-細胞間相互作用において極めて重要な役割を果たしていることが知られている。

生体内シアル酸は、ピコモルからフェムトモルと極微量で存在しているにもかかわらず、その生物学的重要性は極めて高いことから、生命機能を解明する上でシアル酸解析を欠かすことはできない。また、生体内シアル酸は、シアル酸代謝異常症，炎症や癌などの疾患に深く関わっており、シアル酸の経時的な計測によりそれらの病因に迫ることができる可能性があることから臨床上測定意義が極めて高いと言える。

シアル酸は蛍光プレラベル化−高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析法によって高感度分析が可能であることから、この蛍光プレラベル化−HPLC分析法が広く利用されている（非特許文献１）。しかし、これまでに報告されている蛍光プレラベル化−HPLC分析法は、感度は高いもののHPLCでは保持時間のみでしか対象物質を同定できないため、定性面における信頼性にやや欠ける。また、対象物質類のHPLCカラム上での相互分離・単離が必要となるため、分析の長時間化が問題となる。一方、蛍光プレラベル化シアル酸あるいは非ラベル化シアル酸をLC-MS/MS装置により分析することが可能である（非特許文献２−４）。LC-MS/MS法では、HPLC分析では得ることのできない構造情報を含んだより高選択的な分析を可能となるが、イオン化効率及びイオン化干渉などといった問題により、高極性且つ極微量に存在するシアル酸の定量分析に必ずしも有効であるとは言えない。

フルオラスとは、パーフルオロアルキル鎖が持つ親フッ素性相互作用のことであり、水や有機溶媒と混ざらず、フルオラス化合物同士でのみ相互作用を示すという特異性質を持っていて、これまで主にコンビナトリアル有機合成などに利用されてきた。一方で対象物質をフルオラス誘導体化することにより、分離の改善を図るという分析技法が開発されている（非特許文献５、６）。この方法は、従来までの検出感度を高めることに主眼が置かれている誘導体化法とは異なり、試料中の共存成分と対象物質の超選択的な分離に主眼が置かれている。すなわち、このフルオラス誘導体化法を利用し、フルオラス化された対象物質のみをフルオラス基固定相を有するHPLCカラムにより、保持・分離することが可能となる。

LC-MS/MSは、試料中の成分から対象成分を分離するLC部と、対象成分の高感度分析を可能とするMS/MS部から構成される複合型分析手法であり、その有効性から生命科学分をはじめとする様々な研究分野において広く利用されている。LC-MS/MS法には、従来までのHPLC法とは異なり適当な発色団を持たない化合物でも検出することが可能ということのみならず、保持時間のみではなく対象物質の構造決定には不可欠な質量情報を持ったデータが得られるといった利点がある。しかしながら、LC-MS/MS法には、対象成分によっては十分な感度が得られないといった問題や、LC部における試料共存成分との不十分な分離に起因するイオン化干渉の問題などにより、その利用が制限される場合がある（非特許文献７）。

糖鎖やタンパク質などの分析及びその構造解析などを目的としてフルオラス誘導体化法及び質量分析法を組み合わせた手法が試みられている。これまでに報告されている方法では、試料中の対象物質をフルオラス化し、フルオラス固相抽出やフルオラスLCカラムによる分離・精製後、質量分析（MALDIやDIOS）の測定に供する方法である（例えば非特許文献８及び９）。さらには、生物由来サンプルの選択的処理のためのフルオラス標識化において、フルオラスカラムクロマトグラフィーを実行すること、ならびにタンデムＭＳによる質量分析を行う分析方法が開示されている（特許文献１）。ただし、この先行技術文献には、シアル酸については教示も示唆もされていない。

特表２００７−５１５６２５号公報

S. Hara, Y. Takemori,M. Yamaguchi, M. Nakamura, Y. Ohkura: Anal. Biochem., 164, 138 (1987) N.Morimoto, M. Nakano, M. Kinoshita, A. Kawabata, M. Morita, Y. Oda, R. Kuroda,K. Kakehi: Anal. Chem., 73, 5422 (2001) G. G.Pan, L. D. Melton: J. Chromatogr. A, 1077, 136 (2005) M. vander Ham, B. H. C. M. T. Prinsen, J. G. M. Huijmans, N. G. G. M. Abeling, B.Dorland, R. Berger, T. J. de Koning, M. G. M. de Sain-ven der Velden: J. Chromatogr.B, 848, 251 (2007) Y.Sakaguchi, H. Yoshida, K. Todoroki, H. Nohta, M. Yamaguchi: Anal. Chem., 81,5039 (2009) K.Todoroki, H. Eto, H. Yoshida, H. Nohta, M. Yamaguchi: Anal. Bioanal. Chem.,394, 321 (2009) T. M.Annesley: Clin. Chem., 49, 1041 (2003) S. M.Brittain, S. B. Ficarro, A. Brock, E. C. Peters: Nat. Biotechnol., 23, 463(2005) E. P.Go, W. Uritboonthai, J. V. Apon, S. A. Trauger, A. Nordstrom, G. O’Maille, S.M. Brittain, E. C. Peters, G. Siuzdak: J. Proteome Res., 6, 1492 (2007)

そこで、本発明者らは、フルオラス誘導体化及びLC-MS/MSを組み合わせた手法をシアル酸分析に特化させることにより、試料中のシアル酸をフルオラス試薬で直接誘導体化し、フルオラスLCカラム分離後、その溶出液を直接MS/MSへと導入して検出することによって、従来までのLC-MS/MS分析上問題となっていたイオン化効率やイオン化干渉の問題を解決し、シアル酸を超高感度且つ選択的に分析できることを見出して、本発明を完成させた。

したがって、本発明は、下記一般式 [I] で表されるフルオラス化シアル酸誘導体を提供することを目的としている。

本発明は、その別の形態として、試料中のシアル酸をフルオラス試薬で直接誘導体化し、フルオラスLCカラムで分離後、その溶出液を直接MS/MSへと導入して、シアル酸誘導体を検出することからなるシアル酸誘導体の検出方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は、一般式 [I]：
｛式中、R₁は、ＯＨ基、アセチル基またはグリコリル基を意味し、
R2、R3及びR4は、同一または異なっていて、水素原子、メチル基、アセチル基またはスルフェート基を意味し、
Phはフェニレン基を意味し、
ａは１〜３の整数を意味し、
ｂは０または１の整数を意味し、
ｃは１〜３の整数を意味し、
Rfは一般式 [II]：
（式中、R_９およびR_１０は、フッ素原子を意味し、
ｄは４〜１０の整数を意味する。）
で表されるフルオロアルキル基を意味する。}
で表されるフルオラス化シアル酸誘導体を提供する。

本発明は、その別の形態として、試料中のシアル酸をフルオラス試薬で直接誘導体化し、フルオラスLCカラムで分離後、その溶出液を直接MS/MSへと導入して、シアル酸誘導体を検出することからなるシアル酸誘導体の検出方法を提供する。

本発明に係るフルオラス誘導体化−LC-MS/MS法は、試料中のシアル酸を、逆相系フルオラスLCカラムに極端に保持させることにより試料中に存在する共存成分と超選択的に分離し、さらにMS/MSとの組合せにより超高感度に検出・定量することができるという大きな効果がある。

シアル酸のフルオラス誘導体化法を示す図。 HFUAによるフルオラス誘導体化シアル酸のMS/MSスペクトルを示す図。 HFUAによるフルオラス誘導体化シアル酸のMRMクロマトグラムを示す図。 HFUAフルオラス化シアル酸の検出限界及び検量線を示す図。 HFBAによるフルオラス誘導体化シアル酸のMS/MSスペクトルを示す図。 HFBAによるフルオラス誘導体化シアル酸のMRMクロマトグラムを示す図。 HFBAフルオラス化シアル酸の検出限界及び検量線を示す図。

本発明に係るフルオラス化シアル酸誘導体は、一般式 [I]：
｛式中、R₁は、ＯＨ基、アセチル基またはグリコリル基を意味し、
R₂、R₃及びR₄は、同一または異なっていて、水素原子、メチル基、アセチル基またはスルフェート基を意味し、
Phはフェニレン基を意味し、
ａは１〜３の整数を意味し、
ｂは０または１の整数を意味し、
ｃは１〜３の整数を意味し、
Rfは一般式 [II]：
（式中、R_９およびR_１０は、フッ素原子を意味し、
ｄは４〜１０の整数を意味する。）
で表されるフルオロアルキル基を意味する。}
で表される。

本発明のフルオラス化シアル酸誘導体 [I] は、一般式 [III]：
（式中、｛式中、R₁、R₂、R₃及びR₄は、前記と同じ意味を有する）
で表されるシアル酸誘導体と、一般式 [IV]：
（式中、Rfは前記と同じ意味を有する）
で表されるフルオラス化試薬を反応させることによって得ることができる。

この発明に使用可能なシアル酸 [III] としては、NANA、NGNA及びKDNの他、それらのO-アセチル化体、O-メチル化体などが挙げられ、さらにはシアル糖鎖（例えば3’-シアリルラクトースや6’-シアリルラクトースなど）などが挙げられる。

この発明に使用できるフルオラス化試薬 [ IV ] は、フルオラスであるフッ素性部位及びカルボキシル基との反応部位（１級アミノ基）から構成されている。具体的には、フルオラス化試薬 [ IV ] は、フッ素性部位（Rf）が、炭素数4ないし10個の直鎖状もしくは分岐状のフッ素原子で完全にもしくは部分的に置換されたフルオラスアルキル基を有する１級アミン化合物であって、例えば、4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11-ヘプタデカフルオロウンデシルアミン（HFUA）や4-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-ヘプタデカフルオロデシル)ベンジルアミン（HFBA）などが挙げられるが、これらに限定されない。

この発明に使用可能な試料としては、特に限定されるものではなく、試料中にシアル酸が含有されているものであればいずれでもよく、遊離型あるいはシアル酸を有する糖鎖型の状態（糖タンパクや糖脂質から遊離）で存在していることが望ましい。かかる試料としては、例えばシアル酸を有する医薬品や食品、サプリメント試料や、生体試料として血液や尿試料などが挙げられる。

この発明に係る誘導体化方法は、上記反応式でも示すように、カルボン酸とアミンのアミド化反応を利用したものであり、カルボジイミドなどの縮合剤（例えば4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロライド（DMT-MM））の存在下、試料中のシアル酸を室温において緩和な条件で誘導体化することができる（図１）。このようにして得られたフルオラス化シアル酸は、直接LC-MS/MS分析へ供することができる。ここでフルオラス化シアル酸は、逆相系フルオラスLCカラムにおいて超選択的に保持することができる。逆相系フルオラスLCカラムとしては、Fluofix-II（2.1×50 mm、粒子径5 μm、和光純薬製）やFluophase（2.1×100 mm、粒子径5 μm、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。

逆相系フルオラスLCカラムから溶出した溶出液は、MS/MS部へと送液されて、エレクトロスプレーイオン（ESI）源においてイオン化された後、検出される。MS/MS部導入の際のLC溶出液の組成としては0.01%~0.1%のギ酸やトリフルオロ酢酸などを含む水、メタノール及びアセトニトリルなどの混合液を用い、流速としては0.2 ~0.7 mL/minに設定することが望ましい。

MS/MS部の測定条件としては、イオン化にはESI法をポジティブモードで、スプレー電圧を4500~5500 V、イオン源温度を400~600℃に設定し、定量分析を行う場合は、検出モードとして、最も高感度な測定を可能とするマルチプルリアクションモニタリング（MRM）モードで行うことが望ましい。

（HFUAによる誘導体化）
シアル酸は以下のようにHFUAにより誘導体化される。試料溶液10
μLに、100 mM HFUA／DMF溶液 50 μL及び100 mM DMT-MM／96% DMF溶液 40 μLを加え、室温で15分間放置した。反応後、1%ギ酸溶液で2倍に希釈し、LC-MS/MS用の試料とした。図２に本誘導体化反応により得られたHFUAフルオラス化シアル酸（NANA及びNGNA）のMS/MSスペクトルを示す。

HFUAによりフルオラス化したシアル酸類のLC-MS/MS測定条件は以下のとおりである。
LC部条件
分離カラム：Fluophase RP (内径2.1 mm×長さ10 cm、粒子径5 μm、ThermoFisher Scientific社製)
移動相：0.1%ギ酸を含む水、メタノール及びアセトニトリルの混合液
流速：0.5 mL/min
カラム温度：40℃
MS/MS部
イオン化：エレクトロスプレーイオン化ポジティブモード
スプレー電圧：5500 V
イオン源温度：500℃
検出：MRMモード

上記条件によってNANA及びNGNAを分析したときのMRMクロマトグラムを図３に示す。また、NANA及びNGNAをそれぞれ、0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM、0.2 μM及び0.5 μMとなるように調製し、上記条件によって分析したときの検出限界及び検量線を図４に示す。

（HFBAによる誘導体化）
シアル酸は以下のようにHFBAにより誘導体化される。試料溶液10
μLに、20 mM HFBA／DMF溶液 130 μL及び400 mM DMT-MM／96% DMF溶液 10 μLを加え、室温で5分間放置した。反応後、10% トリフルオロ酢酸（TFA）50 μLを加え、LC-MS/MS用の試料とした。図５に本誘導体化反応により得られたHFBAフルオラス化シアル酸（NANA、NGNA及びKDN）のMS/MSスペクトルを示す。

HFBAによりフルオラス化したシアル酸類のLC-MS/MS測定条件は以下のとおりである。
LC部条件
分離カラム：Fluofix-II（内径2.1 mm×長さ5 cm、粒子径5 μm、和光純薬社製）
移動相：0.1% ギ酸及び0.01% TFAを含む水、メタノール及びアセトニトリルの混合液
流速：0.7 mL/min
カラム温度：40℃
MS/MS部
イオン化：エレクトロスプレーイオン化ポジティブモード
スプレー電圧：5500 V
イオン源温度：400℃
検出：MRMモード

上記条件によってNANA、NGNA及びKDNを分析したときのMRMクロマトグラムを図６に示す。また、NANA、NGNA及びKDNをそれぞれ、0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM、0.2 μM、0.5 μM、1.0 μM及び10 μMとなるように調製し、上記条件によって分析したときの検出限界及び検量線を図７に示す。

この発明に係るフルオラス誘導体化−LC-MS/MS法は、試料中に含まれるシアル酸を、極めて簡便な誘導体化処理を行うだけで超高感度且つ超選択的に検出・分離できることから、例えば医療及び食品・サプリメント分野などで、臨床検査及び品質検査部門などにおいて有効利用することができる。

Claims

一般式 [I]：

｛式中、R₁は、ＯＨ基、アセチル基またはグリコリル基を意味し、
R₂、R₃及びR₄は、同一または異なっていて、水素原子、メチル基、アセチル基またはスルフェート基を意味し、
Phはフェニレン基を意味し、
ａは１〜３の整数を意味し、
ｂは０または１の整数を意味し、
ｃは１〜３の整数を意味し、
Rfは一般式 [II]：

（式中、R_９およびR_１０は、フッ素原子を意味し、
ｄは４〜１０の整数を意味する。）
で表されるフルオロアルキル基を意味する。}
で表されるフルオラス化シアル酸誘導体。
請求項１に記載のフルオラス化シアル酸誘導体をLC-MS/MS法で検出することを特徴とするフルオラス化シアル酸誘導体の検出方法。