JP4284135B2 - タンパク質分析方法 - Google Patents
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Description
従って、本発明の課題は、蛍光物質をタンパク質に大量に標識することができ、しかも、タンパク質が沈殿などの変性状態に陥らない高感度なタンパク質分析方法を提供することにある。
(b)希土類金属イオンと、
(c)一般式(I):
R−Y−(−X−Phe−COCH2COCnF2n+1)m (I)
(式中、Rは、−SO3H基、−OSO3基、−NH2基、式:
で表される親水性リガンドと
を接触させる工程、及び
(2)続いて、親水性リガンドと希土類金属との錯体である親水性リガンド−希土類金属錯体とタンパク質とを含む複合体と、タンパク質に吸着しなかった親水性リガンド−希土類金属錯体とが分離された状態で、前記複合体中の親水性リガンド−希土類金属錯体に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、タンパク質の分析方法により解決することができる。
本発明の分析方法の別の好ましい態様によれば、ゲル電気泳動で分画したタンパク質を、親水性リガンド−希土類金属錯体で染色し、タンパク質に吸着しなかった親水性リガンド−希土類金属錯体を泳動ゲルから洗浄除去した後、泳動ゲル中に残留する複合体の蛍光を分析する。
本発明の分析方法の更に別の好ましい態様によれば、タンパク質を親水性リガンド−希土類金属錯体で染色した後に、カラムクロマトグラフィーによって、タンパク質を分画する操作と、タンパク質に吸着しなかった親水性リガンド−希土類金属錯体をタンパク質から分離する操作とを同時に行い、複合体の蛍光を分析する。
本発明の分析方法によれば、蛍光物質をタンパク質に大量に標識することができ、しかも、タンパク質が沈殿などの変性状態に陥らない状態で分析することが可能である。
(1)(a)タンパク質を含む試料と、
(b)希土類金属イオンと、
(c)前記一般式(I)で表される親水性リガンドと
を接触させる工程、及び
(2)続いて、親水性リガンド−希土類金属錯体と分析対象タンパク質とを含む複合体と、分析対象タンパク質に吸着しなかった親水性リガンド−希土類金属錯体とが分離された状態で、前記複合体中の親水性リガンド−希土類金属錯体に由来する信号を分析する工程
を含む。
Yで表される複素環としては、例えば、置換されていてもよい芳香族複素単環(例えば、チオフェン環)、置換されていてもよい3〜8員の飽和複素単環(例えば、テトラヒドロフラン環)、置換されていてもよい不飽和複素単環(例えば、ピロリン環)、又は置換されていてもよい縮合複素環(例えば、ベンゾチオフェン環、ジベンゾチオフェン環、ベンゾフラン環、又はジベンゾフラン環)が挙げられる。
基Yは、希土類金属イオンと安定な錯体を形成し、しかも、その錯体が充分な蛍光強度及び蛍光寿命を有することができる点で、共役二重結合を含むことが好ましい。
Rで表される式:
(製造法1)
第1工程
R−Y−(−X−Phe−H)m + CH3COX →
R−Y−(−X−Phe−COCH3)m
[式中、Xはハロゲン原子(例えば塩素)であり、R、Y、X及びPheは前記式(I)と同義である]
この反応は、いわゆるフリーデル−クラフツアシル化(Friedel-Crafts acylation)であり、常法により行うことができる。溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルム等が用いられ、塩化アルミニウム等のルイス酸の存在下に反応を行う。
R−Y−(−X−Phe−COCH3)m + CnF2n+1COOR1 →
R−Y−(−X−Phe−COCH2COCnF2n+1)m
[式中、R1は低級アルキル基(例えばメチル基又はエチル基)であり、R、Y、X、Phe、n及びmは前記式(I)と同義である]
この反応は、ケトン化合物とエステル化合物との縮合反応であり、常法により行うことができる。溶媒としては、シクロヘキサン、n−ヘキサン、ジエチルエーテル等が用いられ、水素化ナトリウム、金属アルコキシド等の存在下に反応を行う。
この製造法は、XがCH2である場合の製造法である。
第1工程
R−Y−(−CH2−Br)m + (HO)2B−Phe−COCH3 →
R−Y−(−CH2−Phe−COCH3)m
[式中、R、Y、Phe及びmは前記式(I)と同義である]
この反応は、テトラヒドロフラン−水混合溶媒等の溶媒中、PdCl2(dppf)・CH2Cl2(dppf=1,1'-Bis(diphenylphosphino)ferrocene)の存在下に反応を行う。
R−Y−(−CH2−Phe−COCH3)m + CnF2n+1COOR1 →
R−Y−(−CH2−Phe−COCH2COCnF2n+1)m
[式中、R1は低級アルキル基(例えばメチル基又はエチル基)であり、R、Y、Phe、n及びmは前記式(I)と同義である]
この反応は、製造法1の第2工程と同様に行うことができる。
この製造法は、XがOである場合の製造法である。
第1工程
R−Y−(−OH)m + F−Phe−COCH3 (又はBr−Phe−COCH3)→
R−Y−(−O−Phe−COCH3)m
[式中、R、Y、Phe及びmは前記式(I)と同義である]
この反応は、溶媒にK2CO3、NaOH又はNaH等を加え行う。
R−Y−(−O−Phe−COCH3)m + CnF2n+1COOR1 →
R−Y−(−O−Phe−COCH2COCnF2n+1)m
[式中、R1は低級アルキル基(例えばメチル基又はエチル基)であり、R、Y、Phe、n及びmは前記式(I)と同義である]
この反応は、製造法1の第2工程と同様に行うことができる。
例えば、親水性基Rがスルホン酸基及び硫酸エステルである場合には、pHが1以上の環境で解離(−SO3 -,−OSO3 -)し、負に荷電する。また、大部分のタンパク質は、pHが5以下の環境で正に荷電する。解離したスルホン酸基及び硫酸エステルは、正に荷電したタンパク質にイオン結合によって吸着する。
一方、環境のpHを8.5以上にすると、大部分のタンパク質は負に荷電する。親水性基Rがアミノ基である場合には、pHが9以下(四級アミンの場合には、より塩基性のpHにおいても)で正に荷電するので、このpH環境では、アミノ基又は四級アミンは、負に荷電したタンパク質にイオン結合によって吸着する。
本発明の分析方法のより具体的な態様としては、例えば、支持体に固定化されたタンパク質の分析方法、電気泳動により分離されたゲル内のタンパク質の分析方法、タンパク質に親水性リガンド又は親水性リガンド−希土類金属錯体を反応させた後に電気泳動を行い、ゲル内のタンパク質を分析する方法、あるいは、タンパク質に親水性リガンド又は親水性リガンド−希土類金属錯体を反応させた後にクロマトグラフィーを行い、溶離液中のタンパク質を分析する方法などを挙げることができる。以下、各態様について、更に詳細に説明する。
(1)タンパク質を支持体に固定化する工程、
(2)タンパク質を固定化した支持体へ親水性リガンドを反応させる工程、
(3)タンパク質に吸着しなかった親水性リガンドを洗浄除去する工程、
(4)希土類金属イオンを(所望により、他の配位子と共に)反応させて親水性リガンド−希土類金属錯体を形成させる工程、及び
(5)前記親水性リガンド−希土類金属錯体の濃度を蛍光検出法(好ましくは時間分解蛍光検出法)により測定して、タンパク質の濃度を分析する工程
を含む。あるいは、前記工程(2)において、親水性リガンドの代わりに、親水性リガンド−希土類金属錯体を反応させ、前記工程(4)を省略することもできる。
(1)ゲル電気泳動によりタンパク質を分離する工程、
(2)タンパク質を含む電気泳動ゲルへ親水性リガンドを反応させる工程、
(3)タンパク質に吸着しなかった親水性リガンドを洗浄除去する工程、
(4)希土類金属イオンを(所望により、他の配位子と共に)反応させて親水性リガンド−希土類金属錯体を形成させる工程、及び
(5)前記親水性リガンド−希土類金属錯体の濃度を蛍光検出法(好ましくは時間分解蛍光検出法)により測定して、タンパク質の濃度を分析する工程
を含む。あるいは、前記工程(2)において、親水性リガンドの代わりに、親水性リガンド−希土類金属錯体を反応させ、前記工程(4)を省略することもできる。
(1)タンパク質を親水性リガンドと反応させて標識する工程、
(2)標識されたタンパク質を電気泳動により分離する工程、
(3)分離された標識タンパク質に希土類金属イオンを(所望により、他の配位子と共に)反応させて親水性リガンド−希土類金属錯体を形成させる工程、及び
(4)前記親水性リガンド−希土類金属錯体の濃度を蛍光検出法(好ましくは時間分解蛍光検出法)により測定して、タンパク質の濃度を分析する工程
を含む。あるいは、前記工程(1)において、タンパク質に親水性リガンド−希土類金属錯体を反応させ、前記工程(3)を省略することもできる。
(1)タンパク質を親水性リガンドと反応させて標識する工程、
(2)標識されたタンパク質をクロマトグラフィーにより分離する工程、
(3)分離された標識タンパク質に希土類金属イオンを(所望により、他の配位子と共に)反応させて親水性リガンド−希土類金属錯体を形成させる工程、
(4)前記親水性リガンド−希土類金属錯体の濃度を蛍光検出法(好ましくは時間分解蛍光検出法)により測定して、タンパク質の濃度を分析する工程
とを含む。あるいは、前記工程(1)において、タンパク質に親水性リガンド−希土類金属錯体を反応させ、前記工程(3)を省略することもできる。
また、染色剤との反応は、温和な条件で充分安定な標識が可能である。必要により、適当な時間、例えば、加温及び/又は攪拌することにより、反応を促進完了させることができる。
(1)親水性リガンド水溶液の調製
本実施例及び以下の実施例2〜4では、親水性リガンドとして、一般式(1)においてRがスルホン酸基であり、nが3である化合物を使用した。前記親水性リガンドの0.0005%溶液を、50%メタノール/7.5%酢酸水溶液を用いて調製した。
1次元電気泳動は、市販のポリアクリルアミドゲル[NuPAGE(4−12%ポリアクリルアミドゲル、MOPS/SDS);Novex社製]を用いて、添付の取扱説明書に従って実施した。
また、泳動試料としては、ウシ血清アルブミン(SIGMA社製)を、市販のサンプル調製溶液(Novex社製)で希釈して使用した。レーン当たりの試料添加量は10μLとし、レーン当たり1ng、10ng、100ng、及び1000ngを添加した。
電気泳動終了後、プラスチックコンテナ内で、市販のゲル固定化液(スルホサリチル酸/トリクロロ酢酸溶液;Novex社製)20mLに、室温で30分間ゲルを浸した。コンテナから固定化液を除き、次いで、ゲルを50%メタノール/7.5%酢酸水溶液20mLに室温で10分間浸した。メタノール/酢酸水溶液を除き、実施例1(1)で調製した親水性リガンド溶液20mLに、ゲルを室温で1時間浸した。親水性リガンド溶液を除き、ゲルを10%メタノール/7.5%酢酸水溶液20mLに室温で10分間浸し、この操作を3回繰り返した。メタノール/酢酸水溶液を除き、0.1mol/Lトリス−塩酸緩衝液(pH9.1)で調製した100μg/mLの塩化ユーロピウム(ナカライテスク社製)溶液20mLに、ゲルを室温で10分間浸した。最後に、ゲルを0.1mol/Lトリス−塩酸緩衝液(pH9.1)20mLで洗浄した。
実施例1(3)で染色処理を施したゲルから、各レーン毎に、ウシ血清アルブミンが含まれる領域(直径約5mmの円形領域)を切り取り、測定用マイクロプレート(フルオロヌンク透明プレート;Nunc社製)へ移した。次いで、ユーロピウム錯体の時間分解蛍光強度を時間分解蛍光検出器(DELFIA Fluorometer;Wallac社製)を用いて測定した。表1に測定条件を示す。
項目 条件
フラッシュレート(Flash Rate) 1.00ms
待機時間(Delay Time) 0.20ms
測定時間(Window Time) 0.40ms
間隙時間(Dead Time) 10.0ns
エミッションフィルタ(Emission Filter) 1
エキサイテーションフィルタ(Excitation Filter) 1
この結果から、本発明で使用する、タンパク質に吸着させることのできる親水性リガンドは、タンパク質を含まないゲルに対する吸着が少なく、しかも、タンパク質に結合することが明らかになった。ユーロピウム錯体の蛍光強度(特には時間分解蛍光強度)は、デンシトメーターなどの装置を用いることで、容易に画像化することが可能であり、ゲル内タンパク質の局在も容易に画像として入手可能である。
(1)親水性リガンド−ユーロピウム錯体溶液の調製
アセトニトリルに、実施例1で使用したのと同じ親水性リガンドを溶解することにより、最終濃度0.02mol/Lの親水性リガンド溶液を調製した。この溶液100μLと塩化ユーロピウム水溶液(0.1mol/L)10μLとを混合した後、7%酢酸水溶液20mLを添加することにより、親水性リガンド−ユーロピウム錯体溶液を調製した。
1次元電気泳動は、実施例1(2)と同様に実施した。
泳動試料としては、市販のタンパク質マーカー(Mark12TM;Novex社製)を使用した。前記タンパク質マーカーは、ミオシン(200kDa)、β−ガラクトシダーゼ(116.3kDa)、ホスホリラーゼb(97.4kDa)、ウシ血清アルブミン(66.3kDa)、グルタミンデヒドロゲナーゼ(55.4kDa)、乳酸デヒドロゲナーゼ(36.5kDa)、カルボン酸アンヒドラーゼ(31kDa)、トリプシンインヒビター(21.5kDa)、リゾチーム(14.4kDa)、アプロチニン(6kDa)、インスリンB鎖(3.5kDa)、及びインスリンA鎖(2.5kDa)を含む。タンパク質マーカー溶液5μL中には、前記各タンパク質がそれぞれ0.5μgずつ含まれる。
レーン当たりの試料添加量は5μLとし、レーン当たり5ng(各タンパク質量として。以下、同じ)、10ng、50ng、100ng、500ng、及び1000ngを添加した。
電気泳動終了後、ゲルを7%酢酸水溶液20mLの入ったプラスチックコンテナへ移し、室温で5分間振とうした。酢酸水溶液を除き、前記酢酸水溶液で同じ操作を2回繰り返した。酢酸水溶液を除去後、実施例2(1)で調製した親水性リガンド−ユーロピウム錯体溶液(染色液)20mLを加え、室温で45分間振とうした。染色液を除去後、0.1%トリトンX−100水溶液30mLで10分間ずつ3回ゲルを洗浄後、更に、蒸留水30mLで10分間ずつ2回ゲルを洗浄した。
ゲルの斜め上方から波長365nmの紫外線ランプ[Blak−Ray(商標) Lamp Model UNL−56]を照射し、YA3フィルター(Kenko)をつけたポラロイドカメラ(Polaroid MP4 Instant Camera System)で、絞りf4.5及び露光1秒間の条件で撮影して記録した。この写真をスキャナー(EPSON GT−9000;露出20及びガンマ200設定)で600dpiにて取り込み、デジタル化した。
デジタル化した画像ファイルは、市販の画像処理ソフト(Adobe Photoshop)を用いて位置及び角度を調整した後、二階調化の処理を行い、TIFFファイル形式に変換した。
この結果から明らかなように、親水性リガンド−ユーロピウム錯体は、何れの分子量のタンパク質に対しても染色可能であった。この画像から、適用なプログラム(例えば、Scion Image)によって容易にエレクトロフェログラムを作成することが可能であり、既知量のタンパク質の分析から得られた検量線を用いることによって、容易に定量分析することが可能である。また、ユーロピウム錯体の蛍光強度(特には時間分解蛍光強度)は、デンシトメーターなどの装置を用いることで、容易に画像化することが可能であり、ゲル内タンパク質の局在も容易に画像として入手可能である。
(1)親水性リガンド−ユーロピウム錯体溶液の調製
アセトニトリルに、前記親水性リガンドを溶解することにより、最終濃度0.02mol/Lの親水性リガンド溶液を調製した。この溶液100μLと塩化ユーロピウム水溶液(0.1mol/L)10μLとを混合した後、30%メタノール水溶液20mLを添加することにより、親水性リガンド−ユーロピウム錯体溶液を調製した。
2次元電気泳動は、ミクロ2次元電気泳動システム(富士理研社製)を用いて、添付の取扱説明書に従って実施した。
また、泳動試料としては、ヒト血漿に終濃度40%となるようにショ糖を添加したものを使用した。試料添加量は、5μL(ショ糖添加血漿として)とした。
パワーサプライとして、V−C Stabilizer SJ−1055A(アトー社製)を使用した。
2次元目泳動液として0.025mol/Lトリス−0.192mol/Lグリシン(pH8.3)を使用した。2次元目の電気泳動は、モールド一枚あたり、10mAの定電流(初期電圧200V)で50分間泳動した。
電気泳動後のゲルを、20%トリクロロ酢酸水溶液20mLの入ったプラスチックコンテナへ移し、室温で20分間振とうした。前記溶液を除去し、30%メタノール水溶液20mLで10分間ずつ3回ゲルを洗浄した。メタノール水溶液を除去し、実施例3(1)で調製した親水性リガンド−ユーロピウム錯体溶液(染色液)20mLを加え、60分間振とうした後、蒸留水30mLで5分間ずつ3回洗浄を行った。
白−黒反転しないこと以外は、実施例2(4)と同じ操作によって、ゲルに分布したタンパク質の蛍光画像を取得した。ゲルに紫外線を照射し、蛍光観察した結果を、図4に示す。
この結果から明らかなように、親水性リガンド−ユーロピウム錯体は、何れの分子量及び等電点のタンパク質に対しても染色可能であった。図4の2次元目の電気泳動は、タンパク質の非変性下電気泳動であるが、本発明の染色法は、変性剤を添加された条件下での電気泳動ゲル内のタンパク質の染色(実施例2)、非変性条件下での電気泳動ゲル内のタンパク質の染色(実施例3)の何れにおいても可能であった。また、ユーロピウム錯体の蛍光強度(特には時間分解蛍光強度)は、デンシトメーターなどの装置を用いることで、容易に画像化することが可能であり、ゲル内タンパク質の局在も容易に画像として入手可能である。
(1)親水性リガンド−ユーロピウム錯体溶液の調製
アセトニトリルに、前記親水性リガンドを溶解することにより、最終濃度0.02mol/Lの親水性リガンド溶液を調製した。この溶液100μLと塩化ユーロピウム水溶液(0.1mol/L)10μLとを混合した後、100mmol/L塩化ナトリウムを含む100mmol/L酢酸緩衝液(pH3.7)20mLを添加することにより、親水性リガンド−ユーロピウム錯体溶液を調製した。
ニトロセルロース膜(ポアサイズ0.45μm;東洋濾紙社製)を40mm×30mmに裁断し、リゾチーム(SIGMA社製)、ヒトアルブミン(SIGMA社製)、及びヒトγ−グロブリン(SIGMA社製)を各々生理食塩水で20pg/μLから20ng/μLまで4段階のタンパク質濃度の希釈列を作製し、それぞれ5μLずつ膜上に滴下した。次いで、乾熱滅菌器にて110℃で20分間熱処理を行って膜を乾燥させた。各スポットの直径は、約3.6mmの円形であった。
タンパク質を固定化したニトロセルロース膜を、100mmol/L塩化ナトリウムを含む100mmol/L酢酸緩衝液(pH3.7)20mLの入ったプラスチックコンテナへ移し、室温で5分間振とうした。前記溶液を除去し、100mmol/L塩化ナトリウムを含む100mmol/L酢酸緩衝液(pH3.7)20mLで10分間ずつ2回膜を洗浄した。前記緩衝液を除去し、実施例4(1)で調製した親水性リガンド−ユーロピウム錯体溶液(染色液)20mLを加え、30分間振とうした後、蒸留水30mLで5分間ずつ3回洗浄を行った。
白−黒反転しないこと以外は、実施例2(4)と同じ操作によって、ニトロセルロース膜上のタンパク質の蛍光画像を取得した。ゲルに紫外線を照射し、蛍光観察した結果を、図5に示す。
この結果から、ニトロセルロース膜上に固定化されたタンパク質の染色にも、本発明の染色法は応用可能であることが示された。また、ユーロピウム錯体の蛍光強度(特には時間分解蛍光強度)は、デンシトメーターなどの装置を用いることで、容易に画像化することが可能であり、ゲル内タンパク質の局在も容易に画像として入手可能である。
Claims (6)
- (1)(a)タンパク質を含む試料と、
(b)希土類金属イオンと、
(c)一般式(I):
R−Y−(−X−Phe−COCH2COCnF2n+1)m (I)
(式中、Rは、−SO3H基、−OSO3基、−NH2基、式:
で表される親水性リガンドと
を、共有結合による標識化が起こらない条件下で接触させ、親水性リガンドと希土類金属との錯体である親水性リガンド−希土類金属錯体とタンパク質とを含む複合体を形成させる工程、及び
(2)続いて、親水性リガンドと希土類金属との錯体である親水性リガンド−希土類金属錯体とタンパク質とを含む前記複合体と、タンパク質に吸着しなかった親水性リガンド−希土類金属錯体とが分離された状態で、前記複合体中の親水性リガンド−希土類金属錯体に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、タンパク質の分析方法。 - 支持体にブロットしたタンパク質を親水性リガンド−希土類金属錯体で染色し、タンパク質に吸着しなかった親水性リガンド−希土類金属錯体を支持体から洗浄除去した後、支持体上に残留する複合体の蛍光を分析する、請求項1又は2に記載のタンパク質分析方法。
- ゲル電気泳動で分画したタンパク質を、親水性リガンド−希土類金属錯体で染色し、タンパク質に吸着しなかった親水性リガンド−希土類金属錯体を泳動ゲルから洗浄除去した後、泳動ゲル中に残留する複合体の蛍光を分析する、請求項1又は2に記載のタンパク質分析方法。
- タンパク質を、親水性リガンド−希土類金属錯体で染色した後に電気泳動を行い、タンパク質を分画する操作と、タンパク質に吸着しなかった親水性リガンド−希土類金属錯体をタンパク質から分離する操作とを同時に行い、複合体の蛍光を分析する、請求項1又は2に記載のタンパク質分析方法。
- タンパク質を親水性リガンド−希土類金属錯体で染色した後に、カラムクロマトグラフィーによって、タンパク質を分画する操作と、タンパク質に吸着しなかった親水性リガンド−希土類金属錯体をタンパク質から分離する操作とを同時に行い、複合体の蛍光を分析する、請求項1又は2に記載のタンパク質分析方法。
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