CN101939094A - 分离介质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用所谓的转盘技术制备分离介质的方法,其中珠子的孔隙率以可以从复杂样品中分离出所需的生物分子的方式优化。该方法包括以下步骤:a)将在65~75℃、具有在350~450mPas内的粘度的4~8%多糖溶液供给3001~3010rpm的一个或多个转盘以形成多糖珠子;b)将所述形成的多糖珠子捕获在捕获浴中;其中通过将该捕获的温度在15~27℃,优选17.5~24.6℃之间改变来控制多糖珠子的孔隙率。该方法产生了防止大于150000g/mol的分子扩散到珠子内的孔隙率。本发明还涉及通过该方法制备的分离介质及其用于纯化生物分子(特别是单克隆抗体)的用途。
Description
发明领域
本发明在色谱领域内。更精确地,其涉及使用所谓Spinning Disc(转盘)技术制备分离介质的方法,其中可以以可以将所需的生物分子从复杂样品中分离出来的方式选择珠子的孔隙率。
发明背景
在生物技术内,一种最广泛使用的分离方法是色谱法。该术语色谱法包括一族密切相关的分离方法。色谱法与大多数其他物理和化学分离方法不同的特征在于将两种相互不混溶的相接触,其中一个相是固定的,而另一个是移动的。将样品混合物引入该移动相中,随着该移动相将其运送通过系统而经过一系列相互作用,即在该固定相和移动相之间分配。相互作用利用了该样品中组分的物理或化学性质的差别。在移动通过包含固定相的柱的移动相的影响下,这些差别控制各个组分的移动速度。根据其与该固定相的相互作用,分离的组分以特定的顺序出现。最少阻挡的组分首先洗脱,最强保留的材料最后洗脱。随着样品组分从该柱中洗脱,当一种组分被充分阻挡以防止与相邻溶质的区域重叠时就实现了分离。
迄今为止建议的色谱方法都是基于与目标物的不同的相互作用方式。因此,例如在离子交换色谱法中,官能团是与其相反电荷的反离子永久结合的离子基团,而在疏水相互作用色谱法(HIC)中,固定相和待分离组分之间的相互作用是基于疏水性的。其他色谱分离原理是本领域技术人员公知的。
固定相,也称作分离基质,包括载体(其通常是多个基本为球形的颗粒)和结合到该载体上的配体。在大多数分离基质中,该载体是多孔的,以允许在各颗粒上有更大量的配体以及因此更多结合的目标化合物。该载体最通常是天然或合成聚合物,球形颗粒可以以多种不同方式制成。通常用于该目的的天然聚合物是多糖葡聚糖和琼脂糖。
转盘技术可以用于形成琼脂糖珠子。其包括转盘,在适合的条件下将液体供给到该转盘中心,并离心离开边缘。该盘边缘有齿以产生液滴。使用该技术,在该盘的边缘处产生均匀尺寸的液滴。使用转盘技术产生均匀滴尺寸的喷雾、薄雾和油是已有的技术。Walter和Prewett(Walton,W.H.;Prewett,W.C.(1949)Proc.Phys.Soc.B.62,341-350)早在1949年就总结出喷雾液滴的尺寸通过方程(1)近似给出:
其中
d=滴直径,D=盘直径,ω=盘的角速度,T=液体的表面张力,ρ=液体的密度。
为了通过色谱法和间歇式程序分离生物分子,珠子的孔隙率是非常重要的。聚合物介质的一个优点是孔尺寸可以在宽范围上变化。在所有文献中都接受的通用规则是使用具有大孔尺寸的介质用于大的分子。这些孔的传质是扩散过程而非对流的结果。得到具有窄孔尺寸分布的孔隙率以得到选择性介质将会是合意的。在使用转盘技术制备琼脂糖珠子中,使用通过其能够优化该珠子的孔隙率以排除超过特定选择的尺寸的分子(例如单克隆抗体)的程序将会是合意的。
发明内容
本发明提供了目标用于控制Spinning Disc介质(转盘介质)的孔隙率的方法,其使得针对渗透该珠子的小分子的珠子相互作用最大化并使针对不渗透该珠子的较大分子的珠子相互作用最小化。该介质优选是基于琼脂糖的,优化转盘介质的制备方法以得到具有排除大蛋白质(例如单克隆抗体)的孔隙率的珠子。
人源化单克隆抗体(mAb)作为生物药物具有重要的前景。在mAb的纯化中面临的一个最重要的挑战是将其从细胞培养介质中的宿主细胞蛋白质(HCP)中分离出来。本发明能够将纯的mAb与不希望的HCP分离开。
优选地,该转盘介质经进一步处理为所谓的盖子介质,即由Spinning Disc工艺(转盘工艺)得到的珠子构成了该珠子的核心,且用与该核心不同的另一组成的盖子或外层覆盖该核心。
在第一方面,本发明提供用于在转盘工艺中选择性制备聚合物珠子的方法,其中该珠子具有防止大于150000g/mol的分子扩散到该珠子中的孔隙率,包括以下步骤:
a)将在65~75℃粘度为350~450mPas的4~8%多糖溶液供给3001~3010rpm的一个或多个转盘,以形成多糖珠子;
b)将所述形成的多糖珠子捕获在捕获浴中;其中通过将该捕获的温度在15~27℃,优选17.5~24.6℃之间改变来控制该多糖珠子的孔隙率。
上述参数是用于将珠子的孔隙率控制到所需界限(即提供大于150000g/mol的分子例如单克隆抗体扩散到该珠子中的界限)所必要的。
多糖珠子优选选自琼脂糖、角叉菜聚糖、葡聚糖、藻酸盐、果胶、淀粉和半乳甘露聚糖。这类多糖已知冷却时就自发形成物理交联网络。
优选地,该多糖珠子包括琼脂糖,步骤a)中的该琼脂糖溶液是在65~75℃,优选约70℃的4~8%,优选6%的琼脂糖溶液,粘度在350~450mPas内,优选在397~421mPas。
为了纯化单克隆抗体,选择防止大于150000g/mol的分子扩散到该珠子内的孔隙率。
优选地,将步骤a)中的所述多糖溶液供给所述一个或多个转盘是以120~170ml/min的流速进行的。
在优选实施方案中,活化该多糖溶液,例如用CNBr、N-羟基-琥珀酰亚胺酯、二乙烯基砜、环氧化物活化(例如烯丙基化和溴化,如以下实施例中所述)或本领域技术人员已知的任意其他活化方法活化。
在步骤b)之后可以将该多糖珠子交联以得到刚性更强的珠子。
优选地,在步骤b)之后为该多糖珠子提供盖子或外层。在优选实施方案中,将该多糖珠子烯丙基化并部分溴化,并用NaOH处理以在该核心聚糖珠子上形成盖子。
优选地,为该核心聚糖珠子提供配体,但不为该盖子提供任何配体。该盖子防止较大的分子与该核心聚糖珠子上的配体反应。这是有利地,因为能够选择移动相以优化不希望的蛋白质和该核心配体之间的相互作用,以及因为没有该不希望的蛋白质被该核心配体捕获的风险。因此,可以选择任何移动相用于色谱分离,或可以选择任何上清液用于间歇分离。例如,能够完全消除该配体和IgG(单克隆抗体)之间的相互作用。这是与其中需要将该大分子捕获在孔内的现有技术不同的方法。令人惊奇的是,本发明人能够发现以非常精确的方式从希望的分子中排除不希望的分子的孔隙率,即珠子内的所希望的分子或流过液或上清液中的不希望的分子不发成重叠。
能够将任何类型配体结合到该珠子的核心上,例如阴离子交换、阳离子交换、亲和力、疏水相互作用或其任意组合。可以非必要地为该配体提供增充剂(extender)。
优选地,该配体是离子交换配体。
在优选实施方案中,离子交换配体是具有增充剂的弱阴离子交换配体,以提高多糖珠子与配体之间的距离并提高配体的可接近性以及提高配体密度。
在第二方面,本发明提供了依照上述方法制备的分离介质,其中该配体是离子交换剂。优选地,弱阴离子交换剂配有增充剂。
在优选实施方案中,该多糖是琼脂糖,该弱阴离子交换剂是DEAE,该增充剂是葡聚糖。
在第三方面,本发明涉及依照本发明的分离介质用于将所需生物分子与不需要的生物分子的色谱分离或间歇式分离的用途。
在一种实施方案中,不需要的分子扩散到珠子中,而所需的分子不扩散。在这种情况中,该所需生物分子可以是IgG或单克隆抗体或其他大的所需生物分子,例如病毒或质粒。
本发明并不限制于生物过程应用,例如单克隆抗体的纯化,而是也可以用于样品制备,例如体液的蛋白质组学(proteomic)分析。
在可替代的实施方案中,所需的分子扩散到珠子中,而不需要的不扩散。在这种情况中,所需的分子是具有<60000g/mol的分子量的低丰度蛋白质,例如生物标记物。然后将该低丰度蛋白质在例如2D电泳上进一步纯化,并优选使用LC-MS分析。
附图说明
图1是描述使用转盘工艺制备琼脂糖珠子的示意图。圆顶=下落液滴周围的封闭空间。捕获=在其中发生凝胶化的充水池。
图2描述了用于转盘珠子(原型Q1、Q2和Q3,参见下面)的活化和配体(TMA=-N+(CH3)3)结合程序。
图3是在珠子的核心中用DEAE-葡聚糖(DEAE-DX)取代的样品的示意图。
发明详述
在使用转盘技术形成琼脂糖珠子中,旋转速度对于实现具有特定尺寸的珠子是重要的变量。尽管交联的珠子目标是用于分离目的,但珠子的胶凝机理受到关注,这是因为最终的凝胶结构限定了孔隙率。以下是公知的:琼脂糖溶液的快速冷却速率将导致在任意可观量的有序聚集体形成之前相分离,从而导致差的孔隙率。珠子中的孔尺寸还取决于该琼脂糖溶液所用的浓度。随着浓度降低,孔尺寸增大。
实验部分
本发明的实施例仅提供用于示例性的目的,不应当解释为限制由后附权利要求限定的本发明的范围。下面以及本说明书中别处给出的所有参考文献都由此通过引用包括在此处。
实施例1:制备转盘介质
使用6%的琼脂糖溶液作为原料。研究温度、冷却速度、粘度、速度和琼脂糖流速(流向盘的)的孔隙率响应。图1中描绘了转盘工艺的示意图(现有技术)。
实验
该转盘装置是由ABB Industriservice依照给定规格(参见以下)制备的:
钢品质:SS 2343-02(对于所有指定项目)
聚合物材料:PTFE、聚碳酸酯(圆顶保护)、EPDM(乙烯丙烯二烯烃单体)、硅橡胶
圆顶高度:900mm
捕获池直径:2400mm,包括排水通道
捕获池斜度:3°
盘数:6
盘直径:200mm
一般盘厚度:最大5.2mm
边缘处盘厚度:12.4mm,包括135°斜度
上部压力补偿腔直径(用于液体琼脂糖溶液):73mm
上部压力补偿腔高度:6mm
分配针的数目:6
针的内径:0.7mm
将该琼脂糖溶液通过针供给六个盘。通过使用六个而非一个盘,提高了容量。该琼脂糖流量对于该六个盘中的各个都相同。这意味着由各个盘得到的珠子尺寸相同。将该盘的速度范围在3001~3010rpm内调节,该圆顶内的相对湿度为100%。如果该相对湿度小于100%,存在水将从该琼脂糖液滴中蒸发掉的风险。将调节到69.7℃的、具有在397~421mPas内的粘度的烯丙基化的6%琼脂糖溶液用于供给该旋转盘。琼脂糖溶液到盘的流速在120~170mL/min之间调节。捕获水温度为17.5~24.6℃。
制备5个原型,表1中呈现了珠子在与表氯醇交联之后的孔隙率。用不同的葡聚糖估计该原型的孔隙率,使用蓝色葡聚糖2000得到空隙体积。制备该Spinning Disc原型(转盘原型)以得到不允许免疫球蛋白渗透该珠子的孔隙率。这意味着具有超过约150000g/mol的分子量的分子不应当扩散到珠子中。
表1.用于不同转盘原型(A~E)的
五个不同葡聚糖标样的Kav值
1Kav值是如下计算的:(VR-VO)/(VC-VO),其中VR=葡聚糖标样的保留体积,VO=空隙体积,VC=柱的几何体积。
所有五个原型选择的粒度都是190μm±5μm。表1中的三个原型(A、D和E)用于制备如下介质:其用于捕获具有小于约70000g/mol的分子量的蛋白质,而更大的分子(例如免疫球蛋白)(人体IgG)不应当能够扩散到珠子中并与珠子的核心中的配体相互作用。
实施例2:制备基于经设计用于捕获宿主细胞蛋白质的转盘珠子的强阴
离子交换介质
基质的体积是指沉降床的体积。以克给出的基质的重量表示抽吸干重量。认识到这些基质仍是水溶剂化的材料。对于大规模应用,反应搅拌表示悬挂的电机驱动的搅拌器,因为磁棒搅拌器的使用促使对该珠子造成损伤。小规模反应(不超过20mL或g凝胶)在封闭小瓶中进行,搅拌表示使用摇动台。
使用常规方法分析功能性并测定烯丙基化、环氧化的程度或者离子交换剂基团在珠子上的取代程度。在图2中,呈现了用于产生OH-盖子并在珠子的核心中连接带正电荷的配体(=-N+(CH3)3)的一般合成程序。
A.基于转盘原型A制备原型Q1(参见图2)
制备OH-盖子-烯丙基凝胶
转盘原型A的烯丙基活化。用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤转盘原型A。将25mL该凝胶在该过滤器上排水,并称重到三颈圆底烧瓶中。添加NaOH(12.5mL,50%溶液)并开始机械搅拌。在该烧瓶中添加0.1g硼氢化钠和2.9g硫酸钠,并在水浴中将该浆液加热到50℃。在约1小时之后,添加27.5mL AGE。然后将该浆液在剧烈搅拌下保持整晚。在约20小时之后,将该浆液转移到玻璃过滤器中,用乙酸(60%)将pH值调节到约7。然后用蒸馏水(×4)、乙醇(×4)和蒸馏水(×4)洗涤该凝胶。然后通过滴定测定烯丙基含量:262μmol/mL。
部分溴化和NaOH处理。将22mL烯丙基化的凝胶称重到烧瓶中,添加80mL蒸馏水和1g硫酸钠。然后在剧烈搅拌过程中用移液管添加89μL的0.3当量的溴。在约5分钟之后(当该溴已经消耗掉时),用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶。
用水将该部分溴化的凝胶转移到烧瓶中。然后添加NaOH(50%溶液)直到pH>13,将该浆液加热到50℃,保持搅拌整晚。在约18小时之后,用乙酸(60%溶液)将pH值调节到约7。然后用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶。
然后通过滴定测定剩余的烯丙基含量:200μmol/mL。
将Q基团连接到珠子的核心上
Q连接(三甲基氯化铵)。将10mL排水过的凝胶(经过部分溴化和NaOH处理的凝胶)与蒸馏水混合到烧瓶中,开始剧烈的高架搅拌。添加溴直至该浆液具有残余的深橙/黄色。在搅拌10分钟之后,添加甲酸钠(约1.5g)直至该浆液完全脱色。然后用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶。
将排过水的溴化凝胶称重到烧瓶中,添加5mL三甲基氯化铵(TMA-氯化物,65%水溶液)和5mL 2M的NaOH。然后用NaOH(50%溶液)将pH值调节到约12.5。然后将该混合物在50℃保持搅拌整晚。在20小时之后,用蒸馏水洗涤该凝胶,并通过滴定测定原型Q1的氯离子容量:160μmol/mL。
B.分别基于转盘原型E和D制备原型Q2和Q3
基于转盘原型E和D制备OH-盖子-烯丙基凝胶
转盘原型E的烯丙基活化。用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤转盘原型E。将100mL该凝胶在该过滤器上排水,并称重到三颈圆底烧瓶中。添加NaOH(50mL,50%溶液)并开始机械搅拌。在该烧瓶中添加0.4g硼氢化钠和11.4g硫酸钠,并在水浴中将该浆液加热到50℃。在约1小时之后,添加110mL AGE。然后将该浆液在剧烈搅拌下保持整晚。在约20小时之后,将该浆液转移到玻璃过滤器中,用乙酸(60%)将pH值调节到约7。然后用蒸馏水(×4)、乙醇(×4)和蒸馏水(×4)洗涤该凝胶。然后通过滴定测定烯丙基含量:292μmol/mL。
烯丙基化的转盘原型E的部分溴化和NaOH处理。将60mL烯丙基化的凝胶称重到烧瓶中,添加300mL蒸馏水和5g硫酸钠。然后在剧烈搅拌过程中用移液管添加269μL的0.3当量的溴。在约5分钟之后(当该溴消耗时),用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶。
用水溶液将该部分溴化的凝胶转移到烧瓶中。然后添加NaOH(50%溶液)直到pH>13,将该浆液加热到50℃,保持搅拌整晚。在约18小时之后,用乙酸(60%溶液)将pH值调节到约7。然后用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶。
然后通过滴定测定剩余的烯丙基含量:245μmol/mL。
转盘原型D的烯丙基活化。用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤转盘原型D。将50mL该凝胶在该过滤器上排水,并称重到三颈圆底烧瓶中。添加NaOH(25mL,50%溶液)并开始机械搅拌。在该烧瓶中添加0.2g硼氢化钠和5.7g硫酸钠,并在水浴上将该浆液加热到50℃。在约1小时之后,添加55mL AGE。然后将该浆液在剧烈搅拌下保持整晚。在约20小时之后,将该浆液转移到玻璃过滤器中,用乙酸(60%)将pH值调节到约7。然后用蒸馏水(×4)、乙醇(×4)和蒸馏水(×4)洗涤该凝胶。然后通过滴定测定烯丙基含量:330μmol/mL。
烯丙基化的转盘原型D的部分溴化和NaOH处理。将10mL烯丙基化的凝胶称重到烧瓶中,添加90mL蒸馏水和1g硫酸钠。然后在剧烈搅拌过程中用移液管添加51μL的0.3当量的溴。在约5分钟之后(当该溴被消耗时),用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶。
用水将该部分溴化的凝胶转移到烧瓶中。然后添加NaOH(50%溶液)直到pH>13,将该浆液加热到50℃,保持搅拌整晚。在约18小时之后,用乙酸(60%溶液)将pH值调节到约7。然后用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶。
然后通过滴定测定剩余的烯丙基含量:277μmol/mL。
将Q基团连接到珠子的核心上
转盘原型D的Q连接(原型Q2)。将10mL排过水的凝胶(经过部分溴化和NaOH处理的转盘原型D)与蒸馏水混合到烧瓶中,开始剧烈的高架搅拌。添加溴直至该浆液呈现出持续的深橙/黄色。在搅拌10分钟之后,添加甲酸钠(约1.5g)直至该浆液完全脱色。然后用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶。
将排过水的溴化的凝胶称重到烧瓶中,添加5mL三甲基氯化铵(TMA-氯化物,65%水溶液)和5mL 2M的NaOH。然后用NaOH(50%溶液)将pH值调节到约12.5。然后将该混合物在50℃保持搅拌整晚。在20小时之后,用蒸馏水洗涤该凝胶,并通过滴定测定该凝胶的氯离子容量:172μmol/mL。
转盘原型E的Q连接(原型Q3)。将10mL排过水的凝胶(经过部分溴化和NaOH处理的转盘原型E)与蒸馏水混合到烧瓶中,开始剧烈的高架搅拌。添加溴直至该浆液呈现出持续的深橙/黄色。在搅拌10分钟之后,添加甲酸钠(约1.5g)直至该浆液完全脱色。然后用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶。
将排过水的溴化凝胶称重到烧瓶中,添加5mL三甲基氯化铵(TMA-氯化物,65%水溶液)和5mL 2M的NaOH。然后用NaOH(50%溶液)将pH值调节到约12.5。然后将该混合物在50℃保持搅拌整晚。在20小时之后,用蒸馏水洗涤该凝胶,并通过滴定测定该凝胶的氯离子容量:182μmol/mL。
实施例3:基于转盘原型E制备三种弱阴离子交换介质(原型DEAE
I-III)
基于转盘原型E制备OH-盖子-烯丙基凝胶
转盘原型E的烯丙基活化。用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤转盘原型E。将100mL该凝胶在该过滤器上排水,并称重到三颈圆底烧瓶中。添加NaOH(50mL,50%溶液)并开始机械搅拌。在该烧瓶中添加0.4g硼氢化钠和11.4g硫酸钠,并在水浴上将该浆液加热到50℃。在约1小时之后,添加110mL AGE。然后将该浆液在剧烈搅拌下保持整晚。在约20小时之后,将该浆液转移到玻璃过滤器中,用乙酸(60%)将pH值调节到约7。然后用蒸馏水(×4)、乙醇(×4)和蒸馏水(×4)洗涤该凝胶。然后通过滴定测定烯丙基含量:292μmol/mL。
烯丙基化的转盘原型E的部分溴化和NaOH处理。将60mL烯丙基化的凝胶称重到烧瓶中,添加300mL蒸馏水和5g硫酸钠。然后在剧烈搅拌过程中用移液管添加269μL的0.3当量的溴。在约5分钟之后(当该溴被消耗时),用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶。
用水溶液将该部分溴化的凝胶转移到烧瓶中。然后添加NaOH(50%溶液)直到pH>13,将该浆液加热到50℃,保持搅拌整晚。在约18小时之后,用乙酸(60%溶液)将pH值调节到约7。然后用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶。
然后通过滴定测定剩余的烯丙基含量:245μmol/mL。
将DEAE葡聚糖连接到该珠子的核心上-原型DEAE I-III
将15mL排过水的凝胶(经过部分溴化和NaOH处理的转盘原型E)与蒸馏水混合到烧瓶中,进行剧烈的高架搅拌。添加溴直至该浆液呈现出持续的深橙/黄色。在搅拌10分钟之后,添加甲酸钠(约1.5g)直至该浆液完全脱色。然后用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶。
依照下述方案将5mL部分的该排过水的溴化凝胶与DEAE葡聚糖溶液(15g DEAE葡聚糖溶解在25mL水中,总体积:37mL)混合,并在室温下搅拌0.5h,然后添加0.6mL的50%NaOH和0.1g NaBH4,在50℃搅拌17h。在用水、0.5M HCl和1mM HCl洗涤之后,通过滴定测定Cl-容量(参见表4)。
原型DEAE-I:1mL DEAE葡聚糖溶液+9mL水
原型DEAE-II:4mL DEAE葡聚糖溶液+6mL水
原型DEAE-III:10mL DEAE葡聚糖溶液
实施例4:基于转盘原型A制备弱阳离子交换剂(原型COO
-
)
基于转盘原型A制备OH-盖子-烯丙基凝胶
转盘原型A的烯丙基活化。用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤转盘原型A。将25mL该凝胶在该过滤器上排水,并称重到三颈圆底烧瓶中。添加NaOH(12.5mL,50%溶液)并开始机械搅拌。在该烧瓶中添加0.1g硼氢化钠和2.9g硫酸钠,并在水浴上将该浆液加热到50℃。在1小时的平衡时间之后,添加27.5mL AGE。然后将该浆液在剧烈搅拌下保持整晚。在约20小时之后,将该浆液转移到玻璃过滤器中,用乙酸(60%)将pH值调节到约7。然后用蒸馏水(×4)、乙醇(×4)和蒸馏水(×4)洗涤该凝胶。然后通过滴定测定烯丙基含量:262μmol/mL。
烯丙基化的转盘原型A的部分溴化和NaOH处理。将22mL烯丙基化的凝胶称重到烧瓶中,添加80mL蒸馏水和1g硫酸钠。然后在剧烈搅拌过程中用移液管添加89μL的0.3当量的溴。在约5分钟之后(当该溴已经被消耗掉时),用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶。
用水将该部分溴化的凝胶转移到烧瓶中。然后添加NaOH(50%溶液)直到pH>13,将该浆液加热到50℃,保持搅拌整晚。在约18小时之后,用乙酸(60%溶液)将pH值调节到约7。然后用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶。
然后通过滴定测定剩余的烯丙基含量:200μmol/mL。
将配体连接到珠子的核心上
连接N-苯甲酰基-DL-高半胱氨酸。将10mL排过水的凝胶(经过部分溴化和NaOH处理的Spinning Disc原型A)与蒸馏水混合到烧瓶中,进行剧烈的高空搅拌。添加溴直至该浆液呈现出持续的深橙/黄色。在搅拌10分钟之后,添加甲酸钠(约1.5g)直至该浆液完全脱色。然后用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶。
将N-苯甲酰基-DL-高半胱氨酸硫代内酯(3.64g,16.47mmol)称重到圆底烧瓶中,在搅拌过程中添加NaOH(6mL,50%溶液)和蒸馏水(40mL)。然后将该溶液加热到40℃,并保持搅拌3小时。然后将排过水的溴化凝胶转移到该溶液中(测定该混合物的pH值为12.9),将温度升高到50℃。在约22小时之后,用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤该凝胶(4×100mL)。滴定该介质的离子容量(参见下面的核心配体的结构);184μmol/mL。
基于经设计用于捕获宿主细胞蛋白质的转盘介质纯化单克隆抗体
图2中描述了连接Q基团(-N+(CH3)3)的合成程序。该测试程序的主要目的是验证具有小于约70000g/mol的分子量的蛋白质能够扩散到珠子的核心中而IgG在色谱条件下不能扩散到珠子中。因此,用不同尺寸的蛋白质测试该转盘原型的贯穿容量(breakthrough capacity)。使用了四种不同的测试蛋白质(IgG、BSA、卵清蛋白和乳清蛋白)。
实验
将待研究贯穿容量的介质装填在HR 5/5柱中,将样品溶液以0.3mL/min的流速泵送通过在用缓冲溶液平衡之后的该柱。在最大UV检测器信号(280nm)的10%处评价贯穿容量。该最大UV信号是通过将该测试溶液直接泵送到该检测器中估算的。在最大吸光率的10%处的贯穿容量(Qb10%)是依照下式计算的:
Qb10%=(TR10%-TRD)×C/Vc
其中TR10%是在最大吸光率的10%处的保留时间(min),TRD是在该系统中的空隙体积时间(min),C是该样品的浓度(4mg蛋白质/mL),Vc是柱体积(mL)。
根据连接在该珠子的核心中的配体,使用两种不同的吸附缓冲剂:
1.用于阴离子交换剂的吸附缓冲剂:25mM TRIS(pH 8.0)
2.用于阳离子交换剂的吸附缓冲剂:50mM乙酸盐(pH 4.0)+另外的0.15M NaCl。
样品
所用的样品是人体免疫球蛋白(IgG,Gammanorm)、牛血清清蛋白(BSA)、卵清蛋白和乳清蛋白。将蛋白质以4mg/mL的浓度溶解在该吸附缓冲剂中,每次仅将一种蛋白质施加到该柱中。
仪器
装置
LC系统:explorer 10XT或等价物
软件:UNICORN
柱:HR 5/5
仪器参数
流速:0.3mL/min
检测器单元:10mm
波长:280nm
UNICORN方法
下面显示了所用的主要方法:
0.00 Base CV 1.00{mL}#柱体积{mL}任意
0.00 块开始条件
0.00 Base SameAsMain
0.00 波长280{nm}254{nm}215{nm}
0.00 平均时间2.56{sec}
0.00 警报压力容许3.00{MPa}0.00{MPa}
0.00 结束块
0.00 块柱位置
0.00 块平衡
0.00 Base SameAsMain
0.00 泵A入口A1
0.00 缓冲阀A1 A11
0.00 流速0.3{mL/min}
1.00 设定标记()#柱名称
3.9 AuroZeroUV
5.0 #平衡体积结束块
0.00 块样品装载
0.00 基准体积
0.00 流速(1)#流速{mL/min}
0.00 设定标记()#样品
0.00 注射阀注射
0.00 观察UV高于(100)#20%最大绝对值{mAu}结束块
49.00 注射阀装载
49.00 结束块
0.00 块柱清洗
0.00 Base SameAsMain
0.00 注射阀装载
0.00 观察OffUV
0.00 泵A入口A1
0.00 缓冲阀A1 A11
0.00 观察UV小于(20)#5%{mAu}结束块
20.00 结束块
0.00 块梯度洗脱
0.00 Base SameAsMain
0.00 泵B入口B1
0.00 梯度100{%B}2.00{基准}
0.00 流速0.30{mL/min}
10.00 梯度0.00{%B}0.00{基准}
10.00 结束块
块重新平衡
0.00 结束方法
实施例5:强阴离子交换原型的贯穿容量
依照图2制备基于转盘原型A(表1)并在珠子的核心中具有Q基团的一种原型(Q1)。测试对四种蛋白质的贯穿容量,结果呈现在表2中。对于两种最大的蛋白质IgG和BSA的容量低(<2mg/mL),对于卵清蛋白和乳清蛋白的容量分别为68和89mg/mL。
表2.四种蛋白质在如图3中所示设计并基于转盘
原型A的阴离子交换原型(原型Q1)上的贯穿容量
蛋白质 | 分子量(g/mol) | 贯穿容量(mg/mL) |
IgG | 150000 | 1.6 |
BSA | 68000 | 1.9 |
卵清蛋白 | 43500 | 68.0 |
乳清蛋白 | 14400 | 89.7 |
该结果清楚地显示了IgG不扩散到珠子中,并因此其贯穿容量低。这与表1中呈现的结果相符合,其显示了具有超过126000g/mol的分子量的葡聚糖表现出低于0.021的Kav值。该结果还表明具有小于约44000g/mol的分子量的宿主细胞蛋白质将被珠子的核心中的配体所捕获。还测试了两种分别基于转盘原型D和E(表1)的原型(Q2和Q3)。依照图2用珠子的核心中的Q基团对两种原型进行改性(细节参见合成部分)。
表3.三种蛋白质在如图2中所示设计并分别基于转盘原型
D和E的阴离子交换原型Q2和Q3上的贯穿容量(Qb10%)
蛋白质 | 分子量(g/mol) | Q2的Qb10%(mg/mL) | Q3的Qb10%(mg/mL) |
IgG | 150000 | 2.1 | 2.3 |
BSA | 68000 | 3.9 | 8.8 |
卵清蛋白 | 43500 | 41.2 | 58.1 |
甚至这些原型都排除IgG,并对卵清蛋白显示出高的贯穿容量。还证实了对于基于转盘原型E的阴离子交换剂得到了相对高的容量(8.8mg/mL)。这与表1中呈现的数据相符合,其显示了该盘原型对于具有66700g/mol的分子量的葡聚糖与原型D相比导致更高的Kav值。来自原型E的结果显示BSA能够扩散到珠子中并与该阴离子交换配体相互作用。因此,制备了包括优化的配体结构以得到更高BSA贯穿容量的新的阴离子交换剂(参见下面)。
实施例6:弱阴离子交换原型的贯穿容量
通过将DEAE-葡聚糖结合到珠子的内部将配体(DEAE)经过增充剂连接到基质上。在这种情况中,葡聚糖是增充剂,DEAE(二乙基氨基乙基)是配体。制备其中DEAE-葡聚糖结合到珠子内部的三种原型(表4)(细节参见合成部分),所有原型都具有如图3中所示的OH盖子。
表4.三种DEAE原型的配体密度(测定为Cl-容量)
DEAE原型 | 配体密度(μmol/mL) |
DEAE-I | 11 |
DEAE-II | 62 |
DEAE-III | 190 |
依照表5,所有原型都产生了非常好的结果。对于最好的原型(DEAE-III),IgG、BSA和卵清蛋白的贯穿容量分别为0.9、181和>190mg/mL。表5中呈现的结果是优秀的,而且还表明甚至比BSA更大的蛋白质都将具有高的贯穿容量,而IgG的贯穿容量低于2mg/mL。
表5.三种蛋白质在如图3中所示设计并基于转盘原型E的阴离子交换原型DEAE-I、DEAE-II和DEAE-III上的贯穿容量(Qb10%)
实施例7:阳离子交换原型(原型COO
-
)的贯穿容量
测试在珠子(转盘原型A,表1)的核心中包括高盐配体(参见合成部分)的原型(原型COO-)。研究对于IgG和卵清蛋白的贯穿容量,移动相为加有盐(0.15M NaCl)的乙酸盐缓冲液(pH 4.0)。添加该盐以证实在相对高的离子强度下对于卵清蛋白仍能够得到高的贯穿容量。IgG的容量记录为1.7mg/mL,对于卵清蛋白约为39mg/mL。珠子的核心中的高盐配体如预期那样吸附卵清蛋白,并观察到较高的容量。此外,如预期那样,IgG的贯穿容量低。
Claims (20)
1.在转盘工艺中选择性制备聚合物珠子的方法,其中所述珠子具有防止大于150000g/mol的分子扩散到所述珠子中的孔隙率,包括以下步骤:
a)将处于65~75℃粘度为350~450mPas的4~8%多糖溶液供给3001~3010rpm的一个或多个转盘,以形成多糖珠子;
b)将所述形成的多糖珠子捕获在捕获浴中;其中通过将该捕获的温度在15~27℃,优选17.5~24.6℃之间改变来控制所述多糖珠子的孔隙率。
2.权利要求1的方法,其中该多糖选自琼脂糖、角叉菜聚糖、葡聚糖、藻酸盐、果胶、淀粉和半乳甘露聚糖。
3.权利要求2的方法,其中步骤a)中的所述多糖珠子是处于约70℃且粘度为397~421mPas的6%的琼脂糖溶液。
4.上述权利要求中的一项或多项的方法,其中步骤a)中将所述多糖溶液供给所述一个或多个转盘是以120~170mL/min的流速进行的。
5.上述权利要求中的一项或多项的方法,其中将所述多糖珠子活化。
6.上述权利要求中的一项或多项的方法,其中在步骤b)之后将所述多糖珠子交联。
7.权利要求5或6的方法,其中在步骤b)之后为所述多糖珠子提供盖子或外层。
8.权利要求7的方法,其中将所述多糖珠子烯丙基化并部分溴化,并用NaOH处理以在所述核心多糖珠子上形成盖子。
9.权利要求7或8的方法,其中为所述核心多糖珠子提供配体。
10.权利要求9的方法,其中所述配体是离子交换配体。
11.权利要求10的方法,其中所述多糖珠子是琼脂糖珠子,且所述离子交换配体是配有增充剂的弱阴离子交换配体。
12.根据权利要求8~11中一项或多项制备的分离介质,其中该配体是离子交换剂。
13.权利要求12的分离介质,其中该配体是配有增充剂的弱阴离子交换剂。
14.权利要求13的分离介质,其中所述多糖珠子是琼脂糖珠子,以及该弱阴离子交换剂是大尺寸的带电聚合物,例如DEAE(mw500000),以及该增充剂是葡聚糖。
15.权利要求12~14中的一项或多项的分离介质用于将所需生物分子与不需要的生物分子进行色谱分离或间歇式分离的用途。
16.权利要求15的用途,其中所述不需要的分子扩散到所述珠子中,而所需的分子不扩散到所述珠子中。
17.权利要求15或16的用途,其中所述所需生物分子是IgG或单克隆抗体。
18.权利要求15的用途,其中所述所需的分子扩散到所述珠子中,而不需要的分子不扩散到所述珠子中。
19.权利要求18的用途,其中所述所需的分子是具有<60000g/mol的分子量的低丰度蛋白质。
20.权利要求19的用途,其中该低丰度分子是生物标记物。
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