CN104797332A - 多元阴离子交换基质 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了分离基质，其包含固定在支持物上的通过式R1-L1-N(R3)-L2-R定义的多种分离配位体，其中R1是五元或六元的取代或未取代的环结构或羟乙基或羟丙基基团；L1是亚甲基基团或共价键；R2是五元或六元的取代或未取代的环结构；L2是亚甲基基团或共价键；R3是甲基基团；和其中如果R1是羟乙基基团并且L1是共价键，R2就是取代的芳香环结构或取代或未取代的脂族环结构。

Description

多元阴离子交换基质
发明技术领域
本发明涉及具有新配位体的分离基质，其可被用于纯化生物分子，例如蛋白。本发明基质例如对于抗体的纯化是有用的。因此，本发明也包括层析基质用于分离的用途，用层析基质从其它化合物中分离抗体的方法和合成分离配位体的方法。
发明背景
单克隆抗体(MAb)的临床成功是生物制药产业中最令人激动的成就之一，这导致在某些情况下几吨(将批量生产的绝对规模的胰岛素和血浆蛋白相加)的年度生产需求。MAb是市场上在生长因子后面的目前第二大类型的生物技术药物，但到目前为止是增长最快的类型并被许多人相信是生物技术产业的未来。为满足此需求，生物培养容量使用高至25000 l的反应器而增加。此外，表达水平(目前在3-5g/l的范围内)被期望进一步增加，这将对纯化工具例如高通量介质和过程解决方案的开发提出另外的要求。在大规模纯化(下游处理)中的主要关注点与在实验室规模中典型的那些关注点不同；在大规模纯化中的重点是开发稳健和成本有效的方案，和减少单元操作的数量以改善总体过程经济性。抗体制备中当前的趋势表明使用A蛋白介质的亲和性层析是用于捕获抗体的最成本有效的备选方案。
在A蛋白捕获步骤后保留的常见污染物是抗体聚集体、渗漏的A蛋白、DNA和宿主细胞蛋白。这些和任何偶生的病毒颗粒必须在进一步的纯化步骤，例如一个或多个层析步骤中除去。阴离子交换、阳离子交换和疏水性相互作用层析步骤都被用于此目的，以流通模式或以结合-洗脱模式。最近以来，多元离子交换基质显示给出对这些污染物的有效清除。具体而言，描述于WO 2006/043896(A1)中的多元阴离子交换基质对于除去聚集体、宿主细胞蛋白和其它污染物是有用的，例如采用流通模式，其中污染物与基质结合和抗体在流通物中回收并任选回收在洗涤缓冲液中。带有配位体N-甲基、N-苄基乙醇胺的这类基质作为CaptoTM adhere和Capto ImpRes adhere (GE Healthcare，瑞典)是商售可得的。
由于MAb的大制备体积和与基于Mab的疗法相关的高成本，在Mab纯化中存在增加制备效率和通量的相当大的压力。也需要在用于治疗用途的Mab中降低免疫原性和另外潜在有害的残余污染物的量。这意味着在具体步骤中在清除污染物方面的任何改善都是有价值的，既因为它可降低制品中污染物的水平，也因为它也可使得具有较少步骤的纯化过程有可能，这将导致较大的成本降低。
因此，需要对新的多元阴离子交换配位体，所述多元阴离子交换配位体具有对污染物的改善的清除，所述污染物例如，抗体聚集体、宿主细胞蛋白、DNA、渗漏的A蛋白和来自抗体和类似蛋白(例如抗体片段、抗体融合蛋白等)的DNA。
本发明概述
本发明的一个方面在于提供新基质，其在将抗体从液体的其它组分中分离方面是有用的。这用如权利要求1中限定的基质实现。
一个优点是，有效分离也可在高离子强度下实现。另外的优点是，抗体的收率和杂质的清除被改善。
本发明的第二个方面是在生物分子的分离中使用新基质。这通过如权利要求中所限定的方法实现。
本发明的第三个方面是从其它溶质中分离抗体。这用如权利要求中限定的方法实现。
本发明的第四个方面在于提供合成分离配位体的方法，所述分离配位体适合于要用于抗体分离中的基质的制备。这通过如权利要求中限定的方法实现。
本发明的另外合适的实施方案描述于从属权利要求中。
附图简述
图1.依据本发明的一个方面通过还原性胺化的叔胺配位体的合成。
图2.配位体合成的实例。
图3.将支持物(Su)与配位体偶合的实例，在此情况下通过溴化在支持物上的烯丙基基团。
图4.以从用PreDictor™板的初始筛选中选定的条件，本发明的原型基质的色谱曲线。
图5.对起始样品、流通物和剥离物级分的SEC分析的重叠线图
(呈红色的峰代表起始样品，蓝色峰代表流通物，黑色峰代表剥离物级分)。起始样品和流通物已经针对单体峰的高度进行归一化。
图6.带有N-甲基、N-苄基乙醇胺配位体的比较基质的色谱曲线。
图7.通过间隔基与配位体偶合的本发明的四种基质的结构。
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本说明书中可互换地使用。
术语“分离基质”在本文中用于表示由与一种或多种包含官能团的配位体偶合的支持物组成的材料。术语“树脂”时常用于本领域中的分离基质。
术语“多元”分离基质是指能够提供至少两种不同的但协作的位点的基质，所述位点与待结合的化合物相互作用。例如，这些位点之一可给出配位体和所关注的物质之间的吸引类型的电荷-电荷相互作用。另一位点可给出电子受体-供体相互作用和/或疏水和/或亲水相互作用。电子供体-受体相互作用包括诸如氢键键合、π-π、阳离子-π、电荷转移、偶极-偶极、诱导偶极等相互作用。“多元”分离基质也被称为“混合模式”分离基质。
术语“表面”在本文中意指所有外部表面，并在多孔支持物的情况下包括外侧表面和孔表面。
术语“洗脱液”以在本领域中其常规含义使用，即，用以从分离基质中释放一种或多种化合物的合适pH和/或离子强度的缓冲液。
术语“捕获步骤”在液体层析的语境下是指分离程序的初始步骤。最通常地，捕获步骤包括澄清、浓缩、稳定和从可溶性杂质中显著纯化。在捕获步骤之后，可接着中间纯化，其进一步降低杂质的剩余量，例如宿主细胞蛋白、DNA、病毒、内毒素、营养素、细胞培养基的组分(例如消泡剂和抗生素)和产物相关的杂质(例如聚集体、错折叠的物类和聚集体)。
术语“一次性”在本文中在层析柱和其它分离基质的语境下意指意图用于单次使用或有限次数使用的基质。一次性的产品有利地用于除去污染物(所述污染物甚至当处于非常少的量时都是有害的)，在此情况下将所述污染物吸附于基质并随后丢弃基质是方便的。期望一次性产品的另一情况是用于无菌处理，这种情况下基质是无菌的或至少消毒的。
术语“精制步骤”在液体层析的语境下是指最终纯化步骤，其中将痕量杂质除去以留下活性的、安全的产物。在精制步骤期间除去的杂质常常是靶分子的构象异构体或怀疑的渗漏产物。
术语“Fc-结合蛋白”意指能够与抗体的可结晶部分(Fc)结合的蛋白并包括例如A蛋白和G蛋白或保留所述结合性质的其任何片段或融合蛋白。
实施方案详述
在本发明的一个方面中公开了分离基质，其包含多种分离配位体。该分离配位体通过下式(I)定义。
R1 - L1 – N (R3) – L2 – R2　　　(I)
R1此处是羟乙基或羟丙基基团或五元或六元的取代或未取代的环结构；
L1是亚甲基基团或共价键；
R2是五元或六元的取代或未取代的环结构；
L2是亚甲基基团或共价键；
R3是甲基基团；
如果R1是羟乙基基团并且L1是共价键，那么R2是取代的芳族环结构或取代或未取代的脂族环结构。
如通过式(I)所示，配位体是带有亲核胺氮的叔胺，其适合与例如在支持物上的亲电基团偶合。在此偶合之后，所述氮变为季铵基团，其允许在广泛的pH区间内与蛋白的离子相互作用。R1、R2和R3基团提供适当水平的通过疏水性相互作用、氢键键合、π-电子相互作用等与蛋白的另外的相互作用。此外，R1、R2和R3基团在氮周围的立体排列可调节与蛋白的总相互作用强度和离子相互作用与另外的相互作用之间的平衡。当R1和R2之一或两者是取代的环结构时，所有在环上的取代基可合适地为一碳基团或二碳基团，例如甲基基团、甲氧基基团、三氟甲基基团、乙基基团和/或羟乙基基团。配位体可合适地具有低分子量，例如低于350 Da或在150-350 Da区间之内，这防止与蛋白过度强地结合。各配位体可合适地包括单一的氮，这是有利的，因为它允许如上面描述的相互作用强度的调节和因为它允许良好限定的偶合位点。
因此，固定的本发明的配位体被认为是多元阴离子交换配位体，因为除了带正电荷的季铵基团之外它也包含疏水性环结构。用于将配位体固定于多孔的或非多孔的表面的方法在本领域中是周知的，参见，例如Immobilized Affinity Ligands Techniques(固定的亲和性配位体技术), Hermanson等人, Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia和Paul K. Smith, Academic Press, INC, 1992。在某些实施方案中，配位体含量/ml基质是在与通常用于常规离子交换基质的范围接近的范围内。它可以是例如10-200 µmol/ml，例如20-150或25-100 µmol/ml。
在一些实施方案中，分离配位体通过胺基团固定。如上概述，这导致胺转化为季铵基团，所述季铵基团在用于蛋白分离的整个pH范围中是带正电荷的。固定化可合适地通过在支持物上引入亲电基团实现。这可例如通过在多糖或其它羟基官能支持物上的羟基基团活化完成。依据本领域中周知的方法，几种活化试剂可用于此目的，例如表氯醇、双-环氧化合物、烯丙基缩水甘油醚、对苯磺酰氯、三氟乙烷磺酰氯等。
在一些实施方案中，游离形式的配位体(即，在与支持物偶合之前的叔胺)具有1.8或更高，例如1.8-5、1.8-4、2-4、1.8-3或2-3的辛醇-水分配系数(lg P)。P的值在辛醇-水的两相系统中被定义为P = [X]org/[X]aq，其中[X]org是物质X在辛醇相中的平衡浓度和[X]aq是在水相中的平衡浓度。数据在室温(约25°C)下用正辛醇确定。Lg P值通常用于药学和环境科学中以评估不同化合物的相对疏水性。测量lg P的方法包括如在J Sangster: J Phys Chem Ref Data 18(3), 1111-1227 (1989)中描述的摇瓶法和柱法。Lg P也可根据有机化合物的结构式通过电脑软件，例如ACD/Labs LogP DB (Advanced Chemistry Development Inc)评价。
如在实施例中概述，带有固定的本发明配位体的基质区分抗体和聚集体或宿主细胞蛋白的能力当lg P为至少1.8时更高，并且在lg P 1.8-3的情况下获得最优的区分。
在一些实施方案中，R2是取代或未取代的苯基或环己基环结构。六元芳族或脂族环结构是紧密的并在无过度的立体位阻的情况下提供疏水性。
在某些实施方案中，R2包括一个或多个在环结构上的甲基、甲氧基或三氟碳取代基。这些取代基可进一步增加疏水性，这在特定情况下是有用的。
在一些实施方案中，R2是在对位上包括取代基的苯基环，取代基例如单个三氟碳取代基。三氟碳提供疏水性但是相当大体积的取代基，并且如果将它用在对位上是有利的。
在某些实施方案中，R1是羟乙基基团和L1是共价键。羟乙基基团可通过与蛋白的氢键键合提供另外的相互作用，并且也会平衡配位体的总疏水性。如上面描述，于是环结构R2是取代的芳族环结构或脂族环结构，这两者在抗体纯化方面与未取代芳族环相比都可提供更优的选择性。
在一些实施方案中，R1是取代或未取代的五元或六元的环结构。环结构可例如是芳族或非芳族并可以是全碳环或它可在环中加入一个或多个杂原子(例如硫、氧或氮)。在当各配位体包含单一氮的情况下，杂原子将不是氮。在这些实施方案中，配位体含有两个环结构，这在某些应用中是有利的。如果R1和R2两者都是芳环结构，可推测出它们能够通过阳离子-π-电子相互作用与季铵基团相互作用。这可以有利的方式调节与靶生物分子上的负反离子和负电荷的电荷相互作用。在某些实施方案中，R1是取代或未取代的苯基或噻吩环。
在一些实施方案中，L1是亚甲基基团-CH2-。当R1是环结构时，亚甲基基团的存在增加了环的活动性并且如果环是芳族的，亚甲基基团也可以有利的方式影响氮的电子结构。
在某些实施方案中，配位体通过式(II)、(III)、(IV)或(V)定义。
　　　(II)
　　　　　(III)
(IV)
　　　(V)。
支持物可由有机或无机材料制造，并可以是多孔或非多孔的。在一个实施方案中，支持物是由天然聚合物，例如交联的糖类材料(例如琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、寡壳多糖、魔芋、角叉菜聚糖、胞外多糖、藻酸酯、果胶、淀粉等)制备。天然聚合物支持物容易制备和任选依据标准方法例如反相悬浮液凝胶化(S Hjertén: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964)交联。在特别有利的实施方案中，支持物是一种相对刚性但多孔的琼脂糖，其通过增强其流动性质的方法而制备，参见例如US 6,602,990 (Berg)或SE 0402322-2 (Berg等人)。在备选的实施方案中，支持物由合成的聚合物或共聚物，例如交联的合成聚合物(例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等)制备。这些合成的聚合物容易被制备并任选依据标准方法交联，参见例如“Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization(通过悬浮液聚合开发的基于苯乙烯的聚合物支持物)”(R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988))。天然或合成的聚合物支持物也可得自商用来源(例如GE Healthcare，Uppsala，瑞典)，例如以多孔颗粒的形式。在另一备选的实施方案中，支持物由无机聚合物，例如二氧化硅制备。无机多孔和非多孔的支持物是在本领域中周知的并且依据标准方法容易地制备。支持物可进一步包括填料材料，例如磁性颗粒(例如分散于琼脂糖凝胶中的磁铁矿颗粒)或高密度颗粒(例如分散于琼脂糖凝胶中的金属合金或碳化钨颗粒)。这些实施方案分别对于磁性分离和膨胀床分离是有用的。
本发明分离基质的合适的粒度可以是在5-500 μm，例如10-100 μm，例如20-80 μm的直径范围内。在基本上球形的颗粒的情况下，平均粒度可以是在5-1000 μm，例如10-500的范围内。在具体的实施方案中，平均粒度是在10-200 μm的范围内。本领域技术人员可依据待使用的方法容易地选择合适的粒度和孔隙度。例如，对于大规模方法，为了经济原因，可优选更多孔的但刚性的支持物以允许对大体积的处理，特别是用于捕获步骤。在层析中，过程参数例如柱的大小和形状会影响选择。
在某些实施方案中支持物是多孔的。孔径可以在适合于适应和允许生物大分子例如蛋白质快速传质的范围内。通常，至少25%，例如至少50%的孔体积对于大分子而言可能是易接近的，所述大分子具有至少约12.5 nm的水合直径(实例有蛋白甲状腺蛋白或分子量110 kDa的葡聚糖)。具有这样的孔隙度的支持物可以是例如最大6%或最大4%琼脂糖浓度的琼脂糖凝胶，或描述于美国专利号6,602,990中的高刚性交联琼脂糖支持物。用于测量可进入的孔体积分数KD的方法描述于例如L Hagel等人: J Chromatogr A 743, 33-42 (1996)。
在一些实施方案中，基质呈具有非均匀结构的颗粒的形式。颗粒可具有主要或仅仅固定在各颗粒的核部分上的配位体，在核部分周围的各颗粒的外部壳中具有较低配位体含量或没有配位体。这些颗粒可例如构成至少90%的基质并且这些颗粒的核部分可占至少50%，例如至少90%的颗粒体积，同时外部壳可占小于50%，例如小于10%的颗粒体积。壳可具有与核相同的孔结构，但它也可具有较低的平均孔径，例如与核相比至少低10%的平均孔直径。这些颗粒是有用的，因为比壳的孔大的物类不会穿透入核并与配位体结合。这将另外的尺寸选择性的要素引入分离。考虑的其它非均匀颗粒类型包括主要在多孔壳内固体核上具有配位体的薄膜颗粒，或具有多种形式的径向配位体浓度和/或孔径梯度的颗粒。
如在式(VI)中定义和在图7中例示，在某些实施方案中，固定的分离配位体通过间隔基Sp固定在支持物Su上。
　　　　　(VI)。
在一些实施方案中，间隔基Sp包含2-8个碳原子的链，所述链任选被一个或多个醚基团间隔和/或以一个或多个醚基团结束和任选被一个或多个羟基基团取代。偶合可遵循任何常规共价偶合方法进行，例如通过使用表氯醇、表溴醇、烯丙基-缩水甘油醚、双-环氧化物例如丁二醇二缩水甘油醚、卤素取代的脂族物质例如二氯丙醇，其中活化/偶合试剂形成间隔基。
在具体的实施方案中，本发明的配位体通过也称为增链剂的更长的间隔基分子与支持物偶合。增链剂在本领域中是周知的，并通常用于立体上增加配位体和支持物之间的距离。增链剂有时表示为触手或可弯曲的臂，对于可能的化学结构的更详细的描述而言，参见例如US6,428,707，其藉此通过引用并入本文中。简单而言，增链剂可以采用聚合物例如均聚物或共聚物的形式。亲水聚合的增链剂可以来自合成来源(即具有合成的骨架)或生物来源(即具有天然存在的骨架的生物聚合物)。典型的合成聚合物是聚乙烯醇、聚丙烯酰胺和聚异甲基丙烯酰胺、聚乙烯醚等。典型的生物聚合物是多糖，例如淀粉、纤维素、葡聚糖、琼脂糖。
在某些实施方案中，支持物包括颗粒，例如多孔颗粒。颗粒可以是基本上球形的、伸长的或不规则成形的颗粒。在具体的实施方案中，分离基质是干燥的，例如干燥的颗粒，当使用时将所述颗粒在液体中浸湿以保持它们最初的形态。在说明性的实施方案中，这些干燥的分离基质由干燥的琼脂糖颗粒组成。然而，本发明的基质可备选地采用常规用于分离的任何其它形状，例如整料；滤器或膜；毛细管；小片；表面等。支持物也可采用纳米颗粒或甚至配位体-聚合物轭合物的形式，其可通过超滤、沉淀或含水两相系统的形成而从液体分离。
在一些实施方案中，支持体包括多孔膜。膜可例如为单一膜片、空心纤维、堆叠的片、空心纤维卷或捆的形式。膜可以合适地为微滤膜，例如具有在0.1 µm-10 µm范围内，例如在1-5 µm范围内的平均孔径的微滤膜。它可以是纤维素膜，例如交联的纤维素膜。
在第二个方面中，本发明公开了如上面描述的分离基质在生物分子分离，例如蛋白分离中的用途。在第一个实施方案中，本发明将如上面描述的分离基质用于蛋白分离。在本发明用途的有利实施方案中，蛋白是抗体；抗体片段；或包含抗体的融合蛋白。在另一实施方案中，本发明将如上面描述的分离基质用于任何其它化合物(例如选自多肽；核酸，例如DNA、RNA或它们的寡聚核苷酸、质粒；病毒；朊病毒；细胞，例如原核或真核细胞；脂质；糖类；有机分子，例如小有机分子；药物靶；诊断性标记物分子的一种化合物)的分离。该用途将在下面更详细地讨论。如本领域中的技术人员会明白，在本申请中，术语分离用于化合物的纯化、分离和除去，但它也包含靶化合物例如用于诊断性目的的靶化合物的鉴定。
在第三方面中，本发明公开了在液体样品中从一种或多种其它化合物分离一种或多种抗体的方法，其中将包含所述抗体和化合物的移动相与如上面描述的分离基质接触。在有利的实施方案中，本发明方法使用液体层析的原理，即通过使移动相通过包含本发明的分离基质的层析来柱实施。在另一备选的实施方案中，本发明方法使用分批式的层析方法实施，其中将分离基质加入包含液体样品的容器。在具体的实施方案中，按分批式模式加入的分离基质包含干燥的颗粒，例如干燥的琼脂糖颗粒。在另一实施方案中，该方法使用膨胀床层析的原理，即通过将移动相加入膨胀床而进行，例如呈基本上球形颗粒形式，包含高密度填料的分离基质的流化床。该方法也可通过磁性分离进行，其中分离基质为包含磁性填料的颗粒形式。
在本发明方法的第一个实施方案中，不期望的化合物被吸附于分离基质，同时期望的化合物(例如抗体)保留在移动相中没有被吸附。如本领域技术人员所理解，吸附的化合物的性质和特征会取决于液体样品的来源。在其中期望的抗体没有被吸附的实施方案中吸附的化合物的实例是细胞和细胞碎片；蛋白和肽；核酸，例如DNA和RNA；来自培养基的内毒素、病毒、残余物等。在具体的实施方案中，本发明分离基质提供在层析柱中并让移动相通过重力和/或泵送通过所述柱，抗体在柱的流通物中回收。因此，此实施方案的优点是它不需要抗体产物从柱上的任何洗脱。就过程观点而言，避免具体的洗脱步骤是有吸引力的，因为更少的步骤会导致更快速的纯化方案并因此降低过程成本。此外，抗体对于某些条件是敏感的，所述某些条件将例如引起聚集、损害它们的折叠形式；或通过攻击它们的肽键将它们降解。因此，即使用于阴离子交换剂的洗脱条件通常不涉及任何极端化学品，但是盐和/或pH的改变可影响敏感抗体，所述影响根据pI、电荷分布等在物类与物类之间不同。因此，本实施方案的另一优点是它避免将洗脱液加入期望的化合物中和避免将洗脱条件应用于期望的化合物。为提供对于化合物的吸附最适合的条件，将液体样品与合适的缓冲液或其它液体混合以提供移动相。本发明实施方案可以在常规用于阴离子交换层析的条件下进行，所述条件通常涉及在相对低的盐浓度下的吸附。因此，在本发明方法的一个实施方案中，移动相的电导率是在0-25，例如10-15 mS/cm的范围内。在备选的实施方案中，盐浓度可高于正常用于离子交换层析的盐浓度。则移动相的电导率可以是至少10 mS/cm，例如在10-50的范围内，例如10-30、15-30或20-30 mS/cm。在一个实施方案中，移动相的pH是约4-9，例如4-7、5-7、5-6或6-7。如果例如为了基质的重新使用期望随后释放吸附的化合物，可在较高的盐浓度下，例如通过渐增盐梯度的使用进行洗脱。pH值可同样或备选地改变，例如为递减的pH梯度，以洗脱吸附的化合物。
在本方法的第二个和备选的实施方案中，与常规液体层析一样，期望的化合物被吸附于基质。那就是说，分离基质提供在层析柱中并且让移动相通过重力和/或泵送通过柱并且至少一部分抗体吸附于柱。在进一步的步骤中，随后让洗脱缓冲液通过柱并且抗体回收于通过柱之后的洗脱缓冲液中。随后基质可在产物的选择性洗脱之后重新使用。洗脱通过让合适的缓冲液通过柱容易地实施，其中所述缓冲液可例如具有引起期望的化合物从基质上解吸附的盐含量和/或pH。缓冲液也可包含取代剂或氢键破坏剂(例如尿素)以诱导解吸附。如果必要，一个或多个洗涤步骤可以应用在任何这样的通过之前或之间。在一个实施方案中，此实施方案的运作条件与在常规离子交换中一样，即如上面所述的使用具有低电导率的移动相吸附并通过使用高电导率的缓冲液洗脱。本领域中的技术人员可通过测试不同条件而容易地调控条件并分析吸附的化合物和流通物。在具体的实施方案中，期望的化合物是抗体。
当在上面的第一种和第二种实施方案之间选择时，本领域中的技术人员可容易地使条件适应于吸附具体的化合物，有利地通过控制pH和/或电导率。例如，在抗体的分离中，不同类型的抗体具有不同的电荷和电荷分布形式，所述不同的电荷和电荷分布型式连同分离目的将决定它是否更优选吸附抗体或让它们通过柱而不被吸附。
分离也可通过分批吸附实施。在一些实施方案中，将基质颗粒的悬浮液与步骤b)中的移动相接触。在进一步的步骤c)中，随后将基质颗粒和移动相通过沉降、离心或在磁场的影响下(如果基质颗粒是磁性的)彼此分离。在一个实施方案中，不期望的化合物与基质结合并且抗体可在进一步的步骤d)中随后回收在分离的移动相中。在其它的实施方案中，抗体与基质结合并可通过将分离的基质颗粒与洗脱缓冲液混合来回收。
依据本发明的一个实施方案分离的抗体可源自任何周知的来源，例如在表面培养的细胞或来自桶、袋或其它容器中的分批或连续的细胞培养物的细胞。因此，在一个实施方案中，液体是从细胞培养物中获得的上清液。那么抗体需要与其分离的化合物的实例是蛋白、DNA、病毒、内毒素、营养素、细胞培养基的组分(例如消泡剂和抗生素)以及产物相关的杂质(例如错折叠的物类和聚集体)。移动相和本发明分离基质之间的接触步骤(即吸附步骤)可在在机械过滤、离心和/或层析步骤之后。例如，如果液体样品是发酵肉汤，有利的是，在使用本发明基质的步骤之前机械地除去细胞碎片、全细胞和其它相对大的组分。
在一个实施方案中，本发明方法构成纯化方案的捕获步骤。在具体的实施方案中，液体样品是粗进料，其在与本发明的层析基质接触之前被过滤。因此，此实施方案仍会构成捕获步骤，即使液体样品已经通过机械方式预纯化。如周知，产生抗体的宿主细胞也会包含通常被称为宿主细胞蛋白(HCP)的一些其它蛋白。这些HCP包括酶(例如蛋白酶)和由宿主细胞产生的其它蛋白。因此，在一个实施方案中，液体样品的基本上所有宿主细胞蛋白通过本方法，例如通过吸附于分离基质除去。
在备选的实施方案中，本发明方法用作清除方案中的第二、第三或甚至第四层析步骤，例如中间纯化或精制步骤。因此，在一个实施方案中，应用于本发明分离基质的移动相包含来自分离基质的含抗体的洗脱物，所述分离基质可以是例如亲和性层析基质、离子交换基质、疏水性相互作用层析基质或多元基质。在一个实施方案中，液体样品是来自在先的亲和性层析基质的洗脱物。此亲和性层析基质可包含例如肽或蛋白质性配位体，例如A蛋白或其变体、G蛋白、L蛋白或单链camelide抗体衍生的配位体。在有利的实施方案中，从其获得洗脱物的分离基质包含一种或多种Fc结合蛋白配位体，例如A蛋白配位体。术语A蛋白配位体在此语境中包括天然的和重组的A蛋白，或它们的功能片段。在此语境中，术语“功能”片段意指保留蛋白的最初结合性质的片段。这些亲和性基质是例如从GE Healthcare商售可得的MabSelectTM或MabSelect SuRe。因此，在此实施方案中，除去的、优选被吸附的化合物可以是选自以下的一种或多种：释放的蛋白质性配位体；蛋白质性配位体和抗体之间形成的复合物，例如蛋白质性配位体-MAb复合物，所述复合物可在蛋白质性配位体分子中包括数个抗体，例如1-4个抗体与一个蛋白质性配位体分子复合；和释放的蛋白质性配位体或抗体的聚集体。如本领域中的技术人员会理解，根据应用于在先步骤(例如亲和性层析)中的具体条件，洗脱物可需要通过合适的添加或调节而调整。因此，将洗脱物与合适的缓冲液或液体混合以提供移动相。
本发明方法对于分离或纯化任何单克隆或多克隆抗体(例如源自哺乳动物或鸟类宿主，例如小鼠、啮齿类、灵长类和人的抗体，或源自杂交瘤或血浆的抗体)是有用的。在一个实施方案中，分离的抗体是人或人化抗体。抗体可以是任何种类的抗体，即选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgY和IgM的抗体。在一个实施方案中，抗体是能够与A蛋白或含Fc的抗体片段或融合蛋白结合的抗体。在具体的实施方案中，抗体是免疫球蛋白G(IgG)，例如IgG1。在一个实施方案中，本方法用于纯化具有在6-9的范围内，例如在7-8的范围内的pI的抗体。在具体的实施方案中，纯化的抗体的pI是约9。在此语境中，应该理解的是，术语“抗体”也包括抗体片段和包含抗体或抗体片段的任何融合蛋白。因此，本发明也包括对上面提及的抗体的任一种的片段和包含这些抗体的融合蛋白的分离。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在具体的实施方案中，抗体是人化的抗体。要通过分离或纯化从抗体中除去的化合物可以是非产物相关物质，例如HCP、DNA、病毒、渗漏的蛋白质性配位体、细胞培养基组分、抗生素等，或它们可以是产物相关的物质例如聚集的抗体、错折叠的抗体、抗体片段、抗体亚型等。产物相关的物质的除去由于与抗体的结构类似性通常被认为更具有挑战性。然而，有除去它的需要，特别是因为例如聚集的抗体可以是免疫原性的。
如从上面看起来，在本发明方法中，未吸附的抗体的基本上纯的级分被回收。在此语境中，术语“基本上纯的”理解为意指基本上所有非抗体化合物都已经被除去。最有利地，污染物的总量的至少约80%、例如至少约95%(即在95-100%的区间内)、例如至少约98%(即在98-100%的区间内)和优选至少约99%(即在99-100%的区间内)在本发明分离基质上除去。然而，本领域中的技术人员会理解的是，获得的纯度会取决于应用于分离基质的液体样品中的抗体和/或污染物的浓度和使用的其它条件。因此，在一个实施方案中，依据本发明方法分离的抗体是制药级的抗体。因此，依据本发明纯化的抗体在研究中和也对于抗体药物例如MAb药物的制备是有用的。纯化的抗体的备选用途是用于诊断性用途。此外，纯化的抗体在食品产品(例如人的食品添加剂)中也是有用的。例如，依据本发明纯化的牛抗体在食品产品中是有用的。
在第四方面中，本发明公开了合成分离基质的方法，其包括以下步骤：
a) 提供仲胺R5-NH-CH3作为起始化合物，其中R5包括羟乙基基团、羟丙基基团或五元或六元的取代或未取代的环结构；
b) 将起始化合物与亲电试剂R4-X反应，以形成叔胺R5-N(CH3)-R4，其中R4包括五元或六元的取代或未取代的环结构；
c) 任选纯化叔胺；和
d) 将叔胺通过在支持物上的胺基团固定以形成分离基质。
此方法允许带有适合于生物分子的不同分离的多元阴离子交换配位体的多种分离基质的合成。该基质包含允许离子相互作用的季铵的官能度，并且它们进一步包含一个或两个环结构，其在维持紧密的配位体结构的同时提供了另外的相互作用，特别是疏水性相互作用。在氮上的甲基基团小到足以允许在偶合期间与氮立体接近并且也允许在使用期间合适程度的与氮的接近。许多仲胺R5-NH-CH3可使用，特别是商售可得的材料例如2-(甲氨基)乙醇和N-苄基-甲胺。亲电试剂R4-X可以是例如卤化物例如苄基氯或下面描述的醛R’4-CHO。在卤化物的情况下，步骤b)可以是单一的反应步骤，而在醛的情况下，步骤b)可以涉及如下概述的席夫碱形成和还原的两个序贯的子步骤。纯化可例如通过提取、快速层析、离子交换或其它周知的方法而实现。那纯化的一个目的可在于除去任何剩余的仲胺或可与期望的配位体一起偶合在支持物上的其它亲核杂质。
在某些实施方案中，试剂R4-X是醛R’4-CHO，其中R’4是五元或六元的取代或未取代的环结构并且步骤b)包括让起始化合物与R4-CHO反应以形成席夫碱和使席夫碱还原以形成叔胺R5-N(CH3)-CH2-R’4。许多醛R’4-CHO也是可得的并且可容易地与胺的任一种反应以产生相应的席夫碱。可随后例如通过使用三乙酰氧基硼氢化钠或本领域中已知的另一合适的还原剂例如NaBH4或NaBH3CN实施还原。
在一些实施方案中，起始化合物是2-(甲氨基)乙醇或N-苄基-甲胺，其是商售可得的并且可用作用于产生多元阴离子交换配位体的多种多样的库的原材料。
在一些实施方案中，将2-(甲氨基)乙醇与对三氟甲基苯甲醛或环己烷甲醛反应以分别形成通过式(II)和式(III)定义的配位体。在一些实施方案中，将N-苄基-甲胺与3,4,5-三甲氧基苯甲醛或噻吩-2-甲醛反应以分别形成通过式(IV)和式(V)定义的配位体。
在某些实施方案中，步骤d)进一步包括将合成的分离配位体物类通过在支持物上的胺基团固定以形成分离基质。合适的固定方法已经在上面讨论。步骤d)可也在一些实施方案中包括将分离基质与包含蛋白质(例如抗体)和一种或多种其它化合物的移动相接触和测量所述蛋白质和一种或多种其它化合物与基质的结合程度。测量数据可随后用于选择对于从特定移动相中分离特定蛋白或抗体的合适基质。
在一些实施方案中，该方法在步骤d)之后进一步包括如下步骤：
e)用起始化合物和亲电试剂R4-X(例如醛R’4-CHO)的新组合重复步骤a)-d)。这产生分离基质的库，其在对于特定分离问题选择合适基质中是有用的。
在某些实施方案中，步骤e)重复至少五次，例如至少十次。
实施例
实施例1. 配位体合成
2-(甲氨基)乙醇和N-苄基甲胺是容易可得的并且可将这些胺在还原性胺化条件下与不同醛反应以得到相应的叔胺。从可用于还原性胺化的不同试剂(如NaBH4、NaBH3CN和NaBH(OAc)3)中，我们选择NaBH(OAc)3，因为NaBH4还原醛和酮，这产生副产物，NaBH3CN是高毒性的并且在后处理时产生毒性产物例如HCN和NaCN而且有产物被氰化物污染的可能性。NaBH(OAc)3是温和的试剂，其作为还原剂展现出显著的选择性。醛和酮不大可能被NaBH(OAc)3还原。还原性胺化流程描绘于图1中。Ac在这里表示乙酰基基团。
图2显示在三乙酰氧基硼氢化钠存在于作为溶剂的THF中的情况下，2-(甲氨基)乙醇与3,4,5-三甲氧基苯甲醛的例示性反应。反应的后处理以97%的产率提供期望产物(14.2)。将此反应扩展至其它醛以产生表1的相应的例示性叔胺。
表1
方法：
A：将胺(1摩尔当量)、醛(1.2摩尔当量)和三乙酰氧基硼氢化钠(STAB)(1.5-1.6摩尔当量)在THF中的混合物在室温下搅拌达表1中给定的时间。将反应混合物用1M NaOH(用NaCl饱和)猝灭直到pH 10-11。将反应混合物用乙酸乙酯(6×100 mL)提取。将乙酸乙酯层干燥和蒸发。将粗制产物通过硅胶层析纯化。
B：反应按方法A完成。将来自方法A的乙酸乙酯层用1M HCl (3×20 mL)处理。将各层分开并且将含水层冷却和用1M NaOH (用NaCl饱和)中和。获得的产物用乙酸乙酯(6 x 100 mL)提取。将乙酸乙酯层干燥并蒸发。将粗制产物通过硅胶层析纯化。
C：与方法A相同并在反应混合物中加入AcOH (1-2摩尔当量)。
*对于产物14.2-14.12而言，在后处理期间将含水层用固体NaCl另外饱和以得到更好的收率。
2-(N-(环己基甲基)-N-甲氨基)乙醇(14.3)：
2-(甲氨基)乙醇(1.25g，16.64毫摩尔)、环己基甲醛(2.24g，19.97毫摩尔)和STAB (5.64g, 26.62mmol)在THF (60 mL)中的混合物按方法A反应。
通过使用(100:1乙酸乙酯/异丙胺作为洗脱液)的硅胶层析纯化提供无色油。收率：2.72g (95%), Rf: 0.3 (100:1乙酸乙酯/异丙胺)。谱数据：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 3.55 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.49 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.21 (s, 3H), 2.17 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.79 – 1.60 (m, 5H), 1.54 – 1.40 (m, 1H), 1.30 – 1.09 (m, 4H), 0.94 – 0.76 (m, 2H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 64.68, 59.28, 58.22, 42.07, 35.64, 31.58, 26.74, 26.00. HRMS (ESI, m/z) [M+H]+对于C10H21NO计算值172.1695实测值172.1692。
2-(N-(4-(三氟甲基)苄基)-N-甲氨基)乙醇(14.8)
将2-(甲氨基)乙醇(0.71g，9.53毫摩尔)、4-三氟甲基苯甲醛(2.00g，11.44毫摩尔)、STAB (3.02g，14.29mmol)和乙酸(0.55 mL，9.53毫摩尔)在THF (40mL)中的混合物按照方法C反应。通过使用(17:17:1乙酸乙酯/庚烷/异丙胺作为洗脱液)的硅胶层析的纯化提供无色油。收率: 2.00g (90%)，Rf: 0.27 (17:17:1乙酸乙酯/庚烷/异丙胺)。谱数据：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.59 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.70 – 3.62 (m, 4H), 2.64 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 2.27 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ142.75, 129.47 (q, 2JCF = 32.5 Hz), 129.07, 125.26 (q, 3JCF = 3.7 Hz), 124.40 (q, 1JCF = 273.4 Hz), 61.81, 58.53, 58.45, 41.56. HRMS (ESI, m/z) [M+H]+对于C11H14F3NO计算值234.1100实测值234.1099。
N-苄基-N-甲基(噻吩-2-基)甲胺(14.15)：
将N-苄基甲胺(1.24g，10.18毫摩尔)、噻吩-2-甲醛(1.37g，12.21毫摩尔)和STAB (3.23 g，15.27毫摩尔)在THF (35 mL)中的混合物按照方法B反应。通过使用(100:1:1，庚烷/乙酸乙酯/异丙胺)的硅胶层析纯化提供无色油。收率：2.12g (96%), Rf: 0.23 (100:1:1，庚烷/乙酸乙酯/异丙胺)。谱数据: 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.40 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.35 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.30 – 7.25 (m, 2H), 6.99 – 6.96 (m, 1H), 6.96 (bs, 1H), 3.79 (s, 2H), 3.57 (s, 2H), 2.28 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 142.83, 138.97, 128.87, 128.22, 126.97, 126.32, 125.60, 124.82, 61.06, 56.02, 42.10. HRMS (ESI, m/z) [M+H] +对于C13H15NS计算值218.0998实测值218.0996。
N-苄基(3,4,5-三甲氧基苯基)-N-甲基甲胺(14.19)
将N-苄基甲胺(0.89g，7.35毫摩尔)、3,4,5-三甲氧基苯甲醛(1.74g，8.82毫摩尔)和STAB (2.33 g，10.99毫摩尔)在THF (30 mL)中的混合物按照方法B反应。通过使用(50:1.5:1，庚烷/乙酸乙酯/异丙胺)的硅胶层析纯化提供无色油。收率：1.2g (60%), Rf: 0.21 (50:1.5:1，庚烷/乙酸乙酯/异丙胺)。谱数据：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.38 – 7.29 (m, 5H), 6.62 (s, 2H), 3.87 (s, 6H), 3.84 (s, 3H), 3.51 (s, 2H), 3.47 (s, 2H), 2.22 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 153.07, 139.15, 136.73, 134.96, 128.85, 128.20, 126.94, 105.49, 62.16, 61.61, 60.82, 56.05, 42.41. . HRMS (ESI, m/z) [M+H] +对于C18H23NO3计算值302.1750实测值302.1751。
实施例2.配位体的固定
基础基质：按照美国专利6,602,990中描述的方法制备高刚性交联的琼脂糖珠粒。平均珠粒直径是80 µm，且通过反相尺寸排阻色谱使用葡聚糖作为探针分子确定的孔隙度对于分子量110kDa的葡聚糖对应于0.54的KD值，这表示珠粒体积的54%对于葡聚糖分子是可用的。用于孔隙度确定的方法描述于L Hagel等人：J Chromatogr A 743, 33-42 (1996)。
烯丙基化：将250g的用蒸馏水洗涤5次的琼脂糖珠粒(250ml的沥干的凝胶)经由穿过在玻璃滤器漏斗中的凝胶的真空抽吸干燥低至210 g并随后放入1L圆形烧瓶中。随后向烧瓶中加入50% NaOH (340 mL)和1 g的硼氢化钠。将烧瓶在50℃下浸入水浴中并施加搅拌。在30 min之后，加入68 mL的烯丙基缩水甘油醚(AGE)。随后反应进行16.5小时。将凝胶用蒸馏水(3xGV)、乙醇(3xGV)和最后蒸馏水(8xGV)洗涤。
固定：为了将带有亲核基团的配位体与烯丙基化的凝胶偶合，必须将烯丙基基团活化。活化通过将烯丙基化的凝胶珠粒(珠粒在图3中标示为Su)与水中的Br2反应来进行(图3)，这导致在凝胶上的溴基团和溶液中的溴离子的形成。溴离子与HBr反应形成溴代醇，其在用NaOH处理之后进而转化为环氧化物。最后此环氧化物与亲核配位体反应得到固定的凝胶。
将带有固定的配位体的分离基质在表2中列出。此表也列出了在固定之前各配位体的辛醇-水分配系数，其如通过软件ACD/Labs Log P DB v. 9.0根据结构评价。此外，该表列出了基质原型的离子容量(IC)，其如通过用硝酸银的氯离子容量滴定确定。在对于给定配位体列出了多个IC值的情况下，具有不同配位体含量的一种以上的原型通过主要改变烯丙基含量制备，但在某些情况下也改变配位体浓度或固定温度。
实施例3.对分离基质原型的评价
样品制备:样品是在第一步骤的A蛋白纯化之后获得的mAb进料。首先将样品用0.2 µm的滤器过滤。接着用HiPrepTM脱盐柱将缓冲液交换成2.5 mM 磷酸盐缓冲液, pH 7.0。所述试验用ÄKTA ExplorerTM 100 层析系统(GE Healthcare，瑞典)实施。对于所有的实验而言，将样品通过使用具有30 kDa的分子量截留的Centricon滤器浓缩至需要的浓度。
缓冲液制备：使用自动化的Freedom EvoTM Tecan Freedom EVO-2 200机器人系统制备用于板实验的缓冲液。
板制备：在最初的筛选阶段中，将96孔PreDictorTM滤器板(GE Healthcare，瑞典)用不同原型介质装填，各孔含有6 µl的介质。板使用Gibson机器人系统装填，该机器人系统经编程以从2 %浆液中取出300 µl的介质，所述300 µl的介质由各孔中的6µl介质组成。
1.将板颠倒几次，小心进行使得介质不漏出。
2.将顶部和底部密封轻轻除去并且使用真空将储存溶液除去，所述储存溶液是20%乙醇。
3.擦拭板的底部以除去痕量的储存溶液。
平衡
1.将96孔的每个孔用200 µl的相应缓冲液装填并在振荡器中在1100 rpm下保持2分钟。
2.用真空除去缓冲液。
3.重复步骤1和2两次。
4.再次重复第一步骤，但缓冲液通过在500*g下离心一分钟除去。
5.在所有实验中缓冲液和体积是相同的。所述缓冲液是双倍浓缩的，因为样品必须在这些缓冲液中稀释。
样品的上样和收集
1.将200 µl的样品加入各孔。因为样品在缓冲液交换之后是双倍浓缩的，将它用双倍浓缩的缓冲液稀释。
2.一旦将样品上样入所有的96个孔中，就用箔覆盖PreDictor 板并在振荡器中在1100 rpm下温育60分钟。
3.通过在500*g下离心1分钟在收集板中收集流通物。
松弛结合的蛋白的除去
1.为充分回收剩余的靶蛋白，用平衡缓冲液实施一次或两次洗涤(2*200µl)。
2.通过在500*g下离心一分钟在收集板中收集洗涤物。
最佳条件的筛选：对于此研究，分析了20种不同的原型，其中一些原型用不同的配位体密度进行。将mAb样品缓冲液交换，其后mAb样品的终浓度是大约5 g/l。对于所有的实验，使用两种缓冲液系统(25 mM柠檬酸盐和50 mM磷酸盐)，对于每种缓冲系统有3种pH。25 mM柠檬酸盐的pH从4.6至6.0变化和50 mM磷酸盐从6.0-7.4变化。氯化钠(NaCl)浓度从0 mM至350 mM变化。将每种实验条件重复一次。将两种不同原型介质填充在各个PreDictorTM板中，每种各占板的一半。
将在缓冲液交换成2.5 mM磷酸盐之后的mAb样品的浓度通过使用UV分光光度计测量在280 nm下的吸收率来确定。mAb的消光系数是1.50。要上样入板的mAb样品的浓度是大约5 g/l。
通过尺寸排阻色谱进行的分析：本研究中的所有分析在ÄKTATM Explorer 10系统中运行，所述ÄKTATM Explorer 10系统与两个相互连接的Superdex 200 5/150 GL柱连接。对于各个分析，将10 µl的样品上样入柱中并将磷酸盐缓冲液(PBS)用作移动相，使用0.35 ml/min的流速经15分钟。
依据用尺寸排阻色谱分析获得的数据，使用等式1计算针对各实验条件的单体和聚集体两者的容量(Q)。
等式1:
Q是单体容量(Qm)或聚集体容量(Qa)，Cini是初始浓度，CFT是单体或聚集体的流通物的浓度。V样品标示在PreDictorTM板中的每个孔中加入的样品的体积和V介质是在每个孔中的介质的体积。
柱预测：将来自SEC分析的结果用于预测柱的性能。对每一种原型介质的不同上样量计算收率和纯度针，以查出产生期望的收率(等式2)和纯度(等式3)的特定实验条件。
等式2:
等式3:
来自等式1的Q表示单体或聚集体在给定实验条件下的容量，V上样是按ml计的上样，Cini是初始的单体或聚集体浓度且CV是柱体积。
自动化数据评价和柱预测：针对所有条件来自PreDictorTM板的单体和聚集体峰的自动化积分在微软Excel宏的帮助下进行。所述宏允许针对不同条件的大量数据的便利和更快速的分析。预测随后使用在微软Excel中的内部函数实施。
宿主细胞蛋白(HCP)分析：使用Gyrolab Bioaffy 20 HC微实验室圆盘用商用抗-CHO抗体测量HCP水平。所述实验在称为GyrolabTM workstation LIF (Gyros AB，瑞典)的自动化免疫测定仪器中实施。
结果：典型的两步法基于MabSelect SureTM(一种A蛋白衍生介质，作为初始捕获步骤)和CaptoTM adhere(作为用于聚集体除去和HCP减少的第二步骤)。此处我们研究了作为CaptoTM adhere的备选物的不同的多元配位体，并研究了它们对聚集体的除去和HCP减少的作用。对于这些研究，含有大约15%的聚集体的单克隆抗体进料用作所有原型介质的第二步骤的样品。过程条件的筛选和优化带着如下目的实施：在终产物中以可接受的收率和以相当大的HCP减少水平获得少于1%的聚集体。
筛选使用PreDictorTM板的初始条件：初始筛选阶段的目的之一在于确定对于采用并行格式的每一种原型介质的最佳实验条件。
用PreDictorTM板的流通实验：使用含有约15%聚集体的IgG样品。在将样品上样到PreDictorTM板上之后，将流通物级分与洗涤液一起收集并使它们经历SEC分析。来自SEC分析的结果用于计算容量(Q) (等式1)。为根据板的数据计算估算的柱收率和纯度，使用等式2和3。
对所有原型，针对最佳条件，实施对收率和纯度的这些柱预测。对收率和纯度的预测使用微软ExcelTM针对不同上样量计算。
对高纯度和不同收率以及不同条件下的原型的预测展示于表1中。
配位体 配位体含量(µmol/ml) 缓冲液 pH 盐(mM) 纯度(%) 收率(%) 上样量(g/l)
4-ABA* 54 柠檬酸盐 4.6 0 98.9 96.7 60.2
14.8 63 柠檬酸盐 4.6 233 99 96.6 69.1
14.23 54 柠檬酸盐 5.3 0 98.8 95.9 80.5
14.15 25 柠檬酸盐 4.6 117 98.9 94.8 79.6
14.3 69 柠檬酸盐 6 117 99.4 94.6 31.4
14.7 109 柠檬酸盐 5.3 350 99.1 94.6 20.6
14.12 25 柠檬酸盐 5.3 0 99.1 94.1 46.8
14.17 67 柠檬酸盐 5.3 117 98.7 93.9 76.8
14.19 25 柠檬酸盐 4.6 0 99 92.9 76
14.16 57 柠檬酸盐 4.6 0 98.8 87.2
14.21 75 柠檬酸盐 5.3 0 98.8 85.4
14.21 93 柠檬酸盐 4.6 0 98.6 79
14.10 65 柠檬酸盐 4.6 0 98.5 54.5
14.4 105 柠檬酸盐 5.3 0 99 50.4 113.7
14.3 55 磷酸盐 6.7 0 99.1 49
14.24 75 柠檬酸盐 5.3 0 99 49
14.9 53 磷酸盐 6 0 98.9 49
14.5 102 磷酸盐 6 0 98.9 47.9
14.9 87 磷酸盐 6 0 99.2 47.5
14.5 69 磷酸盐 6.7 0 99 46.6
4-ABA* 74 柠檬酸盐 5.3 0 99.1 45
14.20 60 磷酸盐 7.4 0 98.8 44.9
14.2 70 磷酸盐 6 0 98.9 43.7
14.4 64 磷酸盐 6.7 117 98.9 43.3
4-ABA* 35 柠檬酸盐 5.3 0 98.7 41.9
14.24 98 柠檬酸盐 4.6 0 98.8 37
14.6 99 磷酸盐 6 0 98.9 36.8
14.6 63 磷酸盐 6 0 99 33.3
14.11 51 磷酸盐 6 0 98.8 32.1
14.7 82 磷酸盐 6 0 99.3 25.5
14.2 85 柠檬酸盐 5.3 0 99 16.6
14.11 70 磷酸盐 6 0 98.9 14.9
*4-ABA是4-氨基苄基胺
表1:所有原型的收率和纯度的柱预测
相比之下，在相同基础基质上通过烯丙基化的基质的溴化与100 µmol/ml N-苄基-N-甲基乙醇胺偶合的原型在无盐加入的87 g/l，pH 6.0的上样情况下，产生99.1%的纯度和64%的收率。N-苄基-N-甲基乙醇胺配位体具有1.73的lgP值和7.93的pKa。来自此实验的层析图展示于图6中。
柱实验：在预测中满足以可接受的收率获得少于1%聚集体(约99%单体纯度)的目的的原型被选定在小TricornTM柱中运行。相应地，选定满足预设条件的6种不同的原型介质。与依据美国专利7,867,784的教导制备的参考原型相比，四种最佳实施原型的结构和它们的性质展示于表2中。
表2：与Capto Adhere相比，四种最佳原型和它们的性质
将6种原型介质填充入柱并且试验按来自PreDictorTM板实验的最佳实验条件来实施，所述条件产生期望的收率和纯度(表3)。在柱试验期间作出的一个重要的观察是蛋白质在低于6的pH的25 mM柠檬酸盐中趋于沉淀，并由此选择在50 mM磷酸盐中的次佳条件用于柱试验。
表3：选定的原型的柱结果。
所有原型的停留时间是5分钟。有希望的原型之一的柱试验的色谱曲线展示于图4中。
SEC分析结果：对于来自三个级分(起始样品、流通物和剥离物)的层析峰，原型之一的SEC分析结果展示于图5中。
来自PreDictor TM板实验的HCP结果：针对所有原型在通过更低Qm/Qa值给定的条件下确定在板实验之后流通物中的HCP含量。四种原型表现了在HCP上相当大的减少(<400 ppm)，尽管在板中进行了大的上样量(大约170 mg/ml)。从表4看来，显然，低盐浓度对于HCP除去具有相当大的作用。这很可能归因于在与配位体结合方面氯化钠离子与HCP竞争的事实。有趣的是，在HCP减少方面实施良好的四种原型中的两种在聚集体除去方面也是良好的。
原型 缓冲液 pH NaCl浓度(mM) HCP含量ppm (750)
14.8 25 mM柠檬酸盐 4.6 0 325.6
14.10 25 mM柠檬酸盐 4.6 0 350.2
14.16 25 mM柠檬酸盐 5.3 117 390
14.19 25 mM柠檬酸盐 4.6 0 362.3
14.19 25 mM柠檬酸盐 5.3 0 354.4
表4：来自PreDictorTM板实验的4种不同原型的HCP含量
如可以从表5中看到的，HCP结果在与起始样品中存在的HCP高含量相比表现出HCP含量的相当大的减少。由于在柠檬酸盐缓冲液中的蛋白沉淀的影响，将用于柱实验的缓冲液交换成50 mM磷酸盐，并因此这些结果不能直接与来自PreDictorTM板实验的HCP结果作比较。一个从该数据观察到的普遍趋势是，除第一种原型(14.8)之外，在低盐浓度下有更优的HCP除去，所述第一种原型(14.8)具有与其它原型相比稍微更高的NaCl浓度。第一种原型(14.8)的性质对于在低盐浓度下进一步研究给出了足够的凭据。
表5：来自柱实验的5种原型的HCP含量。起始样品含有881 ppm。
使用运用96孔PreDictorTM板的容量的高通量过程开发(HTPD)研究三十三种不同类型的多元配位体。此研究的产生高纯度和收率的两种最优原型是14.8和14.3，结构如表1和2中所展示。
总体而言，如从Log P值中观察到的在疏水性方面的达到一定程度的增加导致在高收率下更优的聚集体的除去。柱实验的HCP的减少是显著的，因为对于最优实施原型，它从881 ppm的初始HCP含量减少至24 ppm，这是HCP含量几乎减少到40分之一。这些结果是显著的，即使板实验和柱实验之间的结果是不可比较，因为由于蛋白沉淀的影响而更换了缓冲液。
本书面说明书将实施例用于公开包括最佳模式的本发明，并也用于允许本领域中技术人员实施本发明，包括制作和使用任何装置或系统和实施任何结合的方法。本发明的可专利范围通过权利要求限定，并可包括本领域技术人员想到的其它实例。如果它们具有与所述权利要求的字面语言没有区别的结构要素，或如果这些其它实例包括与所述权利要求的字面语言没有实质性区别的等效结构要素，则预期它们在所述权利要求的范围内。

Claims (30)

1. 一种分离基质，其包含固定在支持物上的通过式(I)定义的多种分离配位体，
R1 - L1 – N (R3) – L2 –R2　(I)
其中
R1是五元或六元的取代或未取代的环结构或羟乙基或羟丙基基团；
L1是亚甲基基团或共价键；
R2是五元或六元的取代或未取代的环结构；
L2是亚甲基基团或共价键；
R3是甲基基团；
并且其中如果R1是羟乙基基团并且L1是共价键，R2就是取代的芳族环结构或取代或未取代的脂族环结构。
2. 权利要求1的分离基质，其中所述配位体通过胺基团固定。
3. 权利要求1或2的分离基质，其中所述游离形式的配位体具有1.8或更高，例如1.8-5、1.8-4、2-4、1.8-3或2-3的辛醇-水分配系数(lg P)。
4. 任一前述权利要求的分离基质，其中R2是取代或未取代的苯基或环己基环结构。
5. 任一前述权利要求的分离基质，其中R2包括在所述环结构上的一个或多个甲基、甲氧基或三氟碳取代基。
6. 任一前述权利要求的分离基质，其中R2是在对位上包含取代基，例如三氟碳取代基的苯基环。
7. 任一前述权利要求的分离基质，其中R1是羟乙基基团和L1是共价键。
8. 权利要求1-5任一项的分离基质，其中R1是取代或未取代的五元或六元的环结构。
9. 权利要求8的分离基质，其中R1是取代或未取代的苯基或噻吩环。
10. 权利要求8或9的分离基质，其中L1是亚甲基基团。
11. 任一前述权利要求的分离基质，其通过式(II)、(III)、(IV)或(V)定义
　　　(II)
　　　　　(III)
　(IV)
　　　　(V)。
12. 任一前述权利要求的分离基质，其中如在式(VI)中定义，所述固定的分离配位体通过间隔基Sp固定化在支持物Su上
　　　　　　(VI)。
13. 权利要求12的分离基质，其中所述间隔基Sp包含2-8个碳原子的链，其任选被一个或多个醚基团间隔或以一个或多个醚基团结束和任选被一个或多个羟基基团取代。
14. 任一前述权利要求的分离基质，其中所述支持物包括颗粒，例如多孔颗粒。
15. 任一前述权利要求的分离基质，其中所述支持物包含多孔膜。
16. 任一前述权利要求的分离基质在生物分子分离，例如蛋白分离中的用途。
17. 权利要求16的用途，其中所述生物分子是抗体、抗体片段；或包含抗体的融合蛋白。
18. 在液体样品中从一种或多种其它化合物分离一种或多种抗体的方法，其包括以下步骤： a) 提供包含所述抗体和其它化合物的移动相；和b)将所述移动相与权利要求1-15任一项的分离基质接触。
19. 权利要求18的方法，其中所述移动相的电导率是至少10 mS/cm，例如15-30或20-30 mS/cm。
20. 权利要求18或19的方法，其中所述移动相包括来自先前层析步骤的含有抗体的洗脱物，所述层析步骤例如亲和性层析步骤、离子交换步骤、多元层析步骤或疏水性相互作用层析步骤。
21. 权利要求18-20任一项的方法，其中所述分离基质提供于层析柱中，所述移动相通过重力和/或泵送通过所述柱，并且所述抗体被回收在柱的流通物中。
22. 权利要求18-20任一项的方法，其中所述分离基质提供于层析柱中，在步骤b)中，让所述移动相通过重力和/或泵送通过柱并且至少一部分的抗体吸附于柱，和在进一步的步骤c)中，让洗脱缓冲液通过柱并且在通过柱之后抗体被回收到洗脱缓冲液中。
23. 权利要求18-20任一项的方法，其中在步骤b)中让基质颗粒的悬浮液与移动相接触，在进一步的步骤c)中，基质颗粒通过沉降、离心或在磁场的影响下从移动相分离，和在任选进一步的步骤d)中，抗体被回收在分离的移动相中。
24. 合成分离基质的方法，其包括以下步骤：
a) 提供仲胺R5-NH-CH3作为起始化合物，其中R5包括五元或六元的取代或未取代的环结构、羟乙基基团或羟丙基基团；
b) 使起始化合物与亲电试剂R4-X反应，以形成叔胺R5-N(CH3)-R4，其中R4包含五元或六元的取代或未取代的环结构；
c) 任选纯化叔胺；和
d) 通过胺基团将叔胺固定在支持物上以形成分离基质。
25. 权利要求24的方法，其中试剂R4-X是醛R’4-CHO，其中R’4是五元或六元的取代或未取代的环结构，和步骤b)包括将起始化合物与R4-CHO反应以形成席夫碱并将席夫碱还原以形成叔胺R5-N(CH3)-CH2-R’4。
26. 权利要求24或25的方法，其中所述起始化合物是2-(甲氨基)乙醇或N-苄基-甲胺。
27. 权利要求24-26任一项的方法，其中所述分离基质通过权利要求1-15任一项限定。
28. 权利要求24-27任一项的方法，其中步骤d)进一步包括将分离基质与包含抗体和一种或多种其它化合物的移动相接触并测量所述抗体和一种或多种其它化合物与基质的结合程度。
29. 权利要求24-28任一项的方法，其进一步在步骤d)之后包括以下步骤：
e) 用起始化合物和亲电试剂R4-X的新组合重复步骤a)-d)。
30. 权利要求29的方法，其中步骤e)被重复至少五次，例如至少十次。
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