CN111683976B - 具有阴离子交换-疏水混合模式配体的色谱树脂 - Google Patents

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Abstract

提供了具有混合模式配体的色谱树脂以及使用该树脂的方法。

Description

具有阴离子交换-疏水混合模式配体的色谱树脂
背景技术
从来源液体(主要是哺乳动物的体液或细胞培养物)中提取免疫球蛋白对于获得充分浓缩或纯化形式的免疫球蛋白是很有价值的，一般用于诊断和治疗用途以及实验室研究。类似地，从生物样品纯化其他类型的蛋白质和其他分子可以是很有价值的。
发明内容
提供了色谱树脂，所述色谱树脂包含连接至阴离子交换-疏水混合模式配体的色谱基质。在一些实施方式中，色谱树脂具有下式：
色谱基质-(X1)-L-Ar-(X2)-Y
或其互变异构体或阴离子盐，
其中：
X1是间隔基；
X2是C1至C5烷基、C3或C5环烷基、或不存在；
L是NR8、O、或S，其中，R8是氢、或C1至C6烷基；
Ar是6元至10元的单环或双环，并且是任选地被至多4个C1至C3未取代烷基或C3至C6支链烷基取代的芳基；并且
Y选自下组：
Figure GDA0003762926070000011
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢或C1至C6烷基；
如果Y是
Figure GDA0003762926070000021
则R2任选地连接至R3以形成4元至7元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至7元杂环；
如果Y是
Figure GDA0003762926070000022
则R1任选地连接至R2以形成4元至7元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至7元杂环；并且
如果Y是
Figure GDA0003762926070000023
则R5任选地连接至R6以形成4元至7元杂环或者R6任选地连接至R7以形成4元至7元杂环。
在色谱树脂的一些实施方式中：
X1是间隔基；
X2是C1-C3烷基或不存在；
L是NR8、O、或S，其中，R8是氢、或C1至C3烷基；
Ar是任选地被至多四个C1至C3未取代烷基取代的苯基或萘基；
Y选自下组：
Figure GDA0003762926070000024
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢或C1至C4烷基；
如果Y是
Figure GDA0003762926070000025
则R2任选地连接至R3以形成4元至6元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至6元杂环；
如果Y是
Figure GDA0003762926070000031
则R1任选地连接至R2以形成4元至6元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至6元杂环；并且
如果Y是
Figure GDA0003762926070000032
则R5任选地连接至R6以形成4元至6元杂环或者R6任选地连接至R7以形成4元至6元杂环。
发明详述
提供了一种连接的色谱树脂，其允许从样品有效纯化目标生物分子。值得注意的是，这些示例说明了连接的色谱树脂可用于从样品的抗体聚集体中分离单体抗体。
定义
除非另有说明，否则如本申请(包括说明书和权利要求)所用的以下术语具有下文所给出的含义。除非上下文另外明确说明，否则本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物。标准化学术语的定义可以在参考著作中找到，所述参考著作包括Carey和Sundberg(2007)“高级有机化学第五版”(Advanced OrganicChemistry 5th Ed.)的卷A和B，纽约斯普林格科学商业媒体有限责任公司(SpringerScience+Business Media LLC,New York)。除非另有说明，本发明的实施将采用合成有机化学、质谱、色谱的制备和分析方法、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。
“抗体”是指免疫球蛋白、其复合物(例如，融合)或片段形式。该术语包括但不限于：源自人或其它哺乳动物细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类的多克隆或单克隆抗体，包括天然形式或遗传修饰形式，如人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移接和体外生成的抗体。“抗体”还包括复合物形式，其包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白。“抗体”包括抗体片段，如无论保留抗原结合功能与否的Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc。
如本文所用，术语“烷基”指具有1至10个碳原子的直链或支链的饱和脂族基团。例如，C1-C6烷基包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、和/或己基。烷基可包括任意数量的碳，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6。烷基基团通常是一价的，但可以是二价的，例如当烷基基团将两个化学基团连接到一起时。
如本文所用，术语“环烷基”指具有指定数量碳原子的单环烷基。单环包括：例如，环丙基、环丁基和环戊基。
如本文所用，术语“芳基”指单环或稠合二环芳族环组成物。例如，芳基可以是苯基、萘基、或吡啶基。芳基基团可以任选地被一个、两个、三个或四个未被取代的烷基基团取代。
如本文中所用，术语“杂环”是指包含一至三个杂原子作为环成员的环组成物。示例包括但不限于：环胺，例如，氮杂环丁基(azetidino)、吡咯烷基(pyrrolidino)、哌啶基(piperidino)、吡唑烷基(pyrazolidino)和咪唑啉基(imidazolidino)。杂环可以任选地被一个、两个、三个或四个未被取代的烷基基团取代。
在配体的碱性(例如胍、氨基或烷基氨基)基团上形成“阴离子盐”。阴离子盐包括但不限于卤化物、磺酸盐、硫酸盐、羧酸盐、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、和硝酸盐。酸加成盐的示例包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、和硝酸盐。
如本文所用，术语“间隔基”是指具有1至30个选自下组的原子的分子：H、C、N、O和S。间隔基具有中性电荷，并且可以包括环状基团。间隔基将色谱配体连接至色谱。用于将间隔基连接至色谱基质的结合类型包括但不限于：酰胺、胺、醚、酯、氨基甲酸盐/酯、脲、硫醚、硫代氨基甲酸盐/酯、硫代碳酸盐/酯、和硫脲。在一些实施方式中，用于将间隔基连接至色谱基质的结合是胺、醚或酰胺。
“生物样品”是指含有希望纯化的生物来源靶分子(“生物分子”)的任何组合物。在一些实施方式中，待纯化的靶分子是抗体蛋白或非抗体蛋白(例如，激素或酶)。
“结合-洗脱模式(Bind-elute mode)”是指色谱的一种操作方法，其中，建立缓冲条件，以使得在将样品应用于配体时，靶分子以及可任选的不希望的污染物会与配体结合。随后可以通过改变条件使得目标物从载体上洗脱来实现目标物的分提。在一些实施方式中，在目标物洗脱后，污染物仍保持结合。在一些实施方式中，在目标物洗脱之前，污染物会流穿(flow-through)或结合并洗脱。
“流动-通过模式(Flow-through mode)”是指色谱的一种操作方法，其中，建立缓冲条件，以使得待纯化靶分子流动通过包含配体的色谱载体，同时选择性保留至少一些样品污染物，由此实现将其从样品中去除。
色谱配体
在第一实施方式中，色谱树脂具有下式：
色谱基质-(X1)-L-Ar-(X2)-Y
或其互变异构体或阴离子盐，
其中：
X1是间隔基(spacer)；
X2是C1至C5烷基、C3或C5环烷基、或不存在；
L是NR8、O、或S，其中，R8是氢、或C1至C6烷基；
Ar是任选地被至多4个C1至C3未取代烷基或C3至C6支链烷基取代的6元至10元的芳基单环或二环；并且
Y选自下组：
Figure GDA0003762926070000051
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢或C1至C6烷基；
如果Y是
Figure GDA0003762926070000052
则R2任选地连接至R3以形成4元至7元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至7元杂环；
如果Y是
Figure GDA0003762926070000053
则R1任选地连接至R2以形成4元至7元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至7元杂环；并且
如果Y是
Figure GDA0003762926070000061
则R5任选地连接至R6以形成4元至7元杂环或者R6任选地连接至R7以形成4元至7元杂环。
在第一实施方式的第一方面中，X2是C1-C3烷基或不存在。或者，X2是C1-C2烷基或不存在。在另一替代方式中，X2是甲基或不存在。
在第一实施方式的第二方面中，L是NR8或O、或NR8或S。或者，L是NR8，其中，R8是氢、或C1至C3烷基。在另一替代方式中，L是NH。
在第一实施方式的第三方面中，A是被一个或两个C1至C3未取代烷基取代的六元芳基。或者，Ar是任选地被一个或两个C1至C3未取代烷基取代的苯基。或者，Ar是未被取代的苯基。
在第一实施方式的第四方面中，Y是
Figure GDA0003762926070000062
其中，R1-R4各自独立地是H或C1-C4烷基，R2任选地连接至R3以形成4元至7元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至7元杂环。或者，Y是
Figure GDA0003762926070000063
其中，R1-R4皆未形成杂环，并且各自独立地是H或C1-C4烷基；各自独立地是H或C1-C2烷基；或者各自是H。
在第一实施方式的第五方面中，Y是
Figure GDA0003762926070000064
其中，R1-R4各自独立地是H或C1-C4烷基，并且R1任选地连接至R2以形成4元至7元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至7元杂环。或者，Y是
Figure GDA0003762926070000065
其中，R1-R4皆未形成杂环，并且各自独立地是H或C1-C4烷基；各自独立地是H或C1-C2烷基；或者各自是H。
在第一实施方式的第六方面中，Y是
Figure GDA0003762926070000071
其中，R1-R7各自独立地是H或C1-C4烷基，并且R5任选地连接至R6以形成4元至7元杂环或者R6任选地连接至R7以形成4元至7元杂环。或者，Y是
Figure GDA0003762926070000072
其中，R1-R7皆未形成杂环，并且各自独立地是H或C1-C4烷基；各自独立地是H或C1-C2烷基；或者各自是H。
在第一实施方式的第七方面中，X1通过选自如下的结合附着至色谱基质：酰胺、胺、醚、酯、氨基甲酸盐/酯、脲、硫醚、硫代氨基甲酸盐/酯、硫代碳酸盐/酯、和硫脲。或者，所述结合是胺、醚或酰胺。
在第一实施方式的第八方面中，X1选自下组：
–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-、和-CO-NH-C(CH3)2-CO-。X1选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、和-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-。
在第二实施方式中，色谱树脂具有下式：
色谱基质-(X1)-L-Ar-(X2)-Y
或其互变异构体或阴离子盐，
其中：
X1是间隔基；
X2是C1-C3烷基或不存在；
L是NR8、O、或S，其中，R8是氢、或C1至C3烷基；
Ar是任选地被至多四个C1至C3未取代烷基取代的苯基或萘基；并且
Y选自下组：
Figure GDA0003762926070000081
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢或C1至C4烷基；
如果Y是
Figure GDA0003762926070000082
则R2任选地连接至R3以形成4元至6元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至6元杂环；
如果Y是
Figure GDA0003762926070000083
则R1任选地连接至R2以形成4元至6元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至6元杂环；并且
如果Y是
Figure GDA0003762926070000084
则R5任选地连接至R6以形成4元至6元杂环或者R6任选地连接至R7以形成4元至6元杂环。
在第二实施方式的第一方面中，X2是C1-C2烷基或不存在。在另一替代方式中，X2是甲基或不存在。
在第二实施方式的第二方面中，L是NR8或O、或NR8或S。或者，L是NR8，其中，R8是氢、或C1至C3烷基。在另一替代方式中，L是NH。
在第二实施方式的第三方面中，Ar被一个或两个C1至C3未取代烷基取代。或者，Ar是任选地被一个或两个C1至C3未取代烷基取代的苯基。或者，Ar是未被取代的苯基。
在第二实施方式的第四方面中，Y是
Figure GDA0003762926070000085
其中，R2任选地连接至R3以形成4元至6元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至6元杂环。或者，Y是
Figure GDA0003762926070000091
其中，R1-R4皆未形成杂环，并且各自独立地是H或C1-C2烷基；或者各自是H。
在第二实施方式的第五方面中，Y是
Figure GDA0003762926070000092
其中，R1任选地连接至R2以形成4元至6元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至6元杂环。或者，Y是
Figure GDA0003762926070000093
其中，R1-R4皆未形成杂环，并且各自独立地是H或C1-C2烷基；或者各自是H。
在第二实施方式的第六方面中，Y是
Figure GDA0003762926070000094
其中，R5任选地连接至R6以形成4元至6元杂环或者R6任选地连接至R7以形成4元至6元杂环。或者，Y是
Figure GDA0003762926070000095
其中，R1-R7皆未形成杂环，并且各自独立地是H或C1-C2烷基；或者各自是H。
在第二实施方式的第七方面中，X1通过选自如下的结合附着至色谱基质：酰胺、胺、醚、酯、氨基甲酸盐/酯、脲、硫醚、硫代氨基甲酸盐/酯、硫代碳酸盐/酯、和硫脲。或者，所述结合是胺、醚或酰胺。
在第二实施方式的第八方面中，X1选自下组：
–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-、和-CO-NH-C(CH3)2-CO-。或者，X1选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、和-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-。
在第三实施方式中，色谱树脂具有下式：
色谱基质-(X1)-L-Ar-(X2)-Y
或其互变异构体或阴离子盐，
其中：
X1选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-、和-CO-NH-C(CH3)2-CO-；
X2是–CH2-，或不存在；
L是NR8，其中，R8是氢、或-CH3；
Ar是任选地被一个或两个C1至C2未取代烷基取代的苯基；并且
Y选自下组：
Figure GDA0003762926070000101
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢或C1至C3烷基。
在第三实施方式的第一方面中，L是NH。
在第三实施方式的第二方面中，Ar是未被取代的苯基。
在第三实施方式的第三方面中，Y是
Figure GDA0003762926070000102
其中，R1-R4各自独立地是H或C1-C3烷基；或各自独立地是H或C1-C2烷基；或者各自是H。
在第三实施方式的第四方面中，Y是
Figure GDA0003762926070000111
其中，R1-R4各自独立地是H或C1-C2烷基；或者各自是H。
在第三实施方式的第五方面中，Y是
Figure GDA0003762926070000112
其中，R1-R7各自独立地是H或C1-C2烷基；或者各自是H。
在第三实施方式的第六方面中，X1选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、和-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-。
在第四实施方式中，色谱基质-(X1)-L-Ar-(X2)-Y是表1最后一列中所列的色谱树脂结构之一。
表1
Figure GDA0003762926070000113
Figure GDA0003762926070000121
Figure GDA0003762926070000131
Figure GDA0003762926070000141
Figure GDA0003762926070000151
在一些实施方式中，盐是盐酸盐或硫酸盐。
色谱基质是官能化的聚合物，因此可以与间隔基X1形成结合。优选地，聚合物是亲水性聚合物。聚合物不溶于水。合适的聚合物是多羟基聚合物，例如，基于如下的多羟基聚合物：多糖，例如琼脂糖(例如，来自GE医疗保健公司(GE Healthcare)的Sepharose和Superose珠以及来自伯乐公司(Bio-Rad)的Biogel A)、右旋糖酐(例如，GE医疗保健公司的Sephadex)、纤维素、淀粉、支链淀粉，和完全合成的聚合物，例如，聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚羟烷基乙烯基醚、聚羟烷基丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯(例如聚甲基丙烯酸缩水甘油酯)，聚乙烯醇，以及基于苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物，以及其中包括两种或更多种对应于上述聚合物的单体的共聚物。合适的合成聚合物包括但不限于如下物质：来自Toso-Haas公司的Fractogel、来自赛默飞世尔科学公司的POROS介质、来自伯乐公司的Bio-Gel P和Macro Prep、来自TESSEK公司的HEMA和Separon、以及来自波乐公司(Pall)的Hyper D和三丙烯酰基介质(Trisacryl media)。可溶于水的聚合物可衍生为不溶的，例如，通过交联并通过经吸附或共价结合偶联至不溶体。可以通过如下方式将亲水基团引入疏水性聚合物上(例如，单乙烯基和二乙烯基苯的共聚物上)：使呈现出可转化为OH的基团的单体进行聚合，或通过使最终聚合物亲水化，例如，通过合适化合物(例如，亲水性聚合物)的吸附。可以进行聚合以获得可用基质的单体的示例是：乙酸乙烯酯、乙烯基丙胺、丙烯酸、甲基丙烯酸酯、丙烯酸丁酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、乙烯基吡咯烷酮(vinyl pyrrolidone/vinylpyrrolidinone)，在一些情况下具有官能团。交联剂也可用于许多实施方式中，并且在一些实施方式中当存在交联剂时，其可构成相对于总单体约0.1至约0.7的摩尔比。交联剂的示例为：二羟基乙烯双丙烯酰胺、二烯丙基酒石二酰胺、三烯丙基柠檬酸三酰胺、二丙烯酸乙二醇酯(ethylene diacrylate)、双丙烯酰基胱胺、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺和哌嗪二丙烯酰胺。在一些实施方式中，基质是UNOsphereTM载体、由水溶性亲水性单体生产的聚合物(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)。
色谱基质可以是颗粒、碎片、膜或整体件(monolith)的形式，即材料的厚块、单块、或丸粒。优选地，色谱基质是多孔的。当用作基质时，颗粒可以是球形或珠状形式的，并且是表面光滑的或具有粗糙或纹理化表面。在一些情况下，一些孔是延伸穿过颗粒的通孔，以用作足够大的通道，从而允许流体动力学流或快速扩散通过孔。当为球形或珠状形式时，中值粒径为约25微米至约150微米，其中，术语“直径”是指颗粒的最长外部尺寸。示例性基质及其制备方法的公开见述于Hjertén等人的美国专利第5,645,717号、Liao等人的美国专利第5,647,979号、Liao等人的美国专利第5,935,429号、和Liao等人的美国专利第6,423,666。
通过间隔基X1使配体连接至色谱基质。与色谱基质的连接将取决于所使用的色谱基质和将连接至色谱基质的化学基团。与色谱基质的连接将取决于所使用的色谱基质和待连接至色谱基质的化学基团。对于未具有合适官能团的色谱基质，色谱基质可能与合适的活化试剂反应，以产生配体可附着的合适官能团。还原胺化、环氧化物化学反应或氮杂内酯化学反应是分别作用于醛、环氧化物或氮杂内酯官能团的化学反应的实例。例如，用醛或酮基团官能化的色谱基质可用于使色谱基质与配体中的胺基连接。在一些实施方式中，色谱基质包括二醇，其会转化成醛，例如通过用NaIO4进行转化。配体的伯胺可以通过以下方案由还原胺化反应与色谱基质上产生的醛连接。在该方案中，间隔基X是–O-CH2-CH2-。在本公开的该合成方案和其它合成方案中，盒子表示基质，并且分别显示所有偶联化学反应。
Figure GDA0003762926070000161
在一些实施方式中，色谱基质包含环氧化基团，并且配体中的伯胺通过以下方案由环氧化物化学反应连接至环氧化基团。在该方案中，间隔基X是–O-CH2-CH(OH)-CH2-。
Figure GDA0003762926070000171
在一些实施方式中，色谱基质包含吖内酯环，并且配体中的伯胺通过以下方案连接至吖内酯环。在该方案中，间隔基X是-CO-NH-C(CH3)2-CO-。
Figure GDA0003762926070000172
在一些实施方式中，色谱基质包含二醇，并且配体中的伯胺按以下方案，通过用两种活化试剂(烯丙基缩水甘油醚(AGE)和溴)使树脂活化而连接至–OH基团。在该方案中，间隔基X是–O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-。
Figure GDA0003762926070000173
在一些实施方式中，色谱基质包含–OH基团，并且配体中的伯胺按以下方案，通过用表氯醇使树脂活化而连接至–OH基团。在该方案中，间隔基X是–O-CH2-CH(OH)-CH2-。
Figure GDA0003762926070000181
在一些实施方式中，色谱基质包含–OH基团，并且配体中的伯胺按以下方案，通过用1,4-丁二醇二缩水甘油醚使树脂活化而连接至–OH基团。在该方案中，间隔基X是–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-。
Figure GDA0003762926070000182
其他活化试剂包括但不限于：表溴醇，双环氧化物，例如；卤素取代的脂族化合物，例如，二氯丙醇、二乙烯基砜；羰基二咪唑；醛，例如戊二醛；醌；溴化氰；高碘酸盐，如偏高碘酸钠；碳二亚胺；氯三嗪，如氰尿酰氯；磺酰氯，例如，甲苯磺酰氯和三氟代乙烷磺酰氯(tresyl chlorides)；N-羟基琥珀酰亚胺；2-氟-1-甲基吡啶甲苯-4-磺酸酯/盐；噁唑酮；马来酰亚胺；吡啶基二硫化物；和酰肼。
其它间隔基包括但不限于：–O-CH2-,–O-CH2-CH2-CH2-,–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、和–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-。
色谱基质可以以任何常规构造使用，包括填充柱和流化床或膨胀床柱、整体件或多孔膜，并且可以通过任何常规方法使用，包括用于加载、洗涤和洗脱的分批模式，以及连续或流穿模式。在一些实施方式中，柱的直径范围为1cm至约1m，并且高度为1cm至约30cm或更高。
取决于色谱流动相缓冲液的pH，配体中的任意氮可以被质子化，并且；因此可以带有正电荷。
方法
还提供了用于纯化目标生物分子的方法。在一个实施方式中，该方法包括：使得含有生物分子的样品与色谱树脂接触，由此分离生物分子与污染物。随后收集所产生的经纯化生物分子。在一些实施方式中，靶生物分子是单体抗体，并且该方法包括从样品的聚集抗体中纯化单体抗体。
色谱树脂可用于使用阴离子交换(即，其中配体带正电)和疏水混合膜是色谱来纯化靶分子。可以对条件进行调整以使得色谱以结合-洗脱模式或流穿模式运行。
可以应用该方法的蛋白质制剂可以包括未纯化或部分纯化的蛋白质，包括但不限于来自天然、合成或重组来源的抗体(例如IgG、IgM)和非抗体蛋白质。例如，未纯化的蛋白质制剂可以来自各种来源，包括但不限于：血浆、血清、腹水、牛奶、植物提取物、细菌溶解产物(bacterial lysates)、酵母裂解物(yeast lysates)或有条件细胞培养基。部分纯化的蛋白质制剂可以来自未纯化制剂，所述未纯化制剂已经通过至少一种色谱法、沉淀法、其他分馏步骤或前述的任意组合进行了处理。在一些实施方式中，一个或多个色谱步骤采用任意方法，所述方法包括但不限于：尺寸排阻色谱、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、蛋白质A亲和色谱、疏水相互作用色谱、固定化金属亲和色谱或羟基磷灰石色谱。一个或多个沉淀步骤可以包括盐或聚乙二醇(PEG)沉淀，或用有机酸、有机碱或其它试剂沉淀。其他分馏步骤可包括但不限于：结晶、液:液分配或膜过滤。
如本领域中将理解的，用于混合模式色谱的加载、洗涤和洗脱条件将取决于所使用的具体色谱法基质/配体。
在一些结合-洗脱模式的实施方式中，在高于7(例如7-8或7-9)的pH下进行加载(即，使抗体或非抗体蛋白与色谱树脂结合)、并任选地进行洗涤。一些示例性结合-洗脱条件为：
结合条件：在适当缓冲液(例如，Tris、Bis-Tris或磷酸盐)中，pH为6.5-8.5，0-1000mM NaCl或100-300mM NaCl；
洗脱条件：使用具有醋酸钠、柠檬酸盐、精氨酸、或甘氨酸的适当缓冲液，pH 3-8.5，1-1000mM NaCl或0-300mM NaCl。
任选地，可以在一定条件下对色谱树脂进行洗涤，以使得样品的一些组分被从色谱树脂去除、但目标生物分子保持固定在树脂上。在一些实施方式中，随后通过降低盐浓度和/或降低与树脂接触的溶液的pH，使目标生物分子洗脱。
或者，样品可以流穿模式施加，其中，样品的某些组分固定在色谱树脂上，但是目标生物分子会流动通过(即，流过)色谱树脂，并被收集。一些示例性流穿条件为：0-150mMNaCl、pH 4.0-8.0；合适的缓冲液可以包括：例如，2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、Bis-Tris、醋酸钠、柠檬酸盐-磷酸盐。
实施例
下列实施例仅作为说明而不是限制进行提供。本领域技术人员将容易识别可以进行改变或修改以产生基本上相同或相似结果的各种非关键参数。
实施例1–制备具有下表2的色谱树脂
表2
Figure GDA0003762926070000201
Figure GDA0003762926070000211
对于表2中的各配体，以球形珠的形式使用
Figure GDA0003762926070000212
二醇(20mL)，用N,N′-亚甲基双丙烯酰胺交联的3-烯丙氧基-1,2-丙二醇和乙烯基吡咯烷酮的共聚物，并且二醇密度为200-300μmol/mL。对于各配体，使珠悬浮在20mL的0.1M醋酸钠或水中。添加高碘酸钠至浓度为50至100mM，并将所得混合物在室温(约70℉(21℃))下孵育3-24小时。反应导致在150-250μmol/mL的范围内二醇基团转化为醛基团。将各所得的醛官能化珠转移到20mL的柱中，该柱中各树脂用100mL的水洗涤。
对于各配体，然后将二十毫升的醛官能化珠悬浮在20ml的含0.6g N-(4-氨基苯基)胍、pH为7.0的0.20M磷酸钠中。在这些混合物在室温下孵育(振荡，200rpm)15分钟后，然后添加200mg NaBH3CN，并使反应继续进行3-20小时。各反应中配体浓度确定在25-200mM的范围内。反应结束时，将各树脂转移至20ml柱中，依次用3CV的水和1-2CV的0.1N HCl洗涤，然后用5CV的水进行洗涤。所有树脂的配体密度在25-100μmol/ml的范围内。
实施例2-使用实施例1的树脂和流穿模式对抗体进行纯化
将表2中所列各树脂(如上所述产生的)填充至7mm(内径)×5.5cm柱中，并用pH为4.5的含有75mM NaCl的20mM醋酸钠进行平衡。将含有15-20％聚集抗体的750μl的2.0mg/ml单克隆IgG抗体溶液以2毫升/分钟的流速施加至柱。抗体流动通过各柱。为了去除与各树脂结合的污染物，将各柱用pH为4.5的20mM醋酸钠以10ml梯度的平衡缓冲液相对于洗脱缓冲液进行洗涤，然后用洗脱缓冲液通过10ml等度洗脱进行洗涤。通过尺寸排阻高效液相色谱法(HPLC-SEC)分析在各柱流穿级分中收集的抗体，以确定聚集抗体的含量。在各柱的抗体流穿级分中均未检测到抗体聚集体。
实施例3-使用实施例1的树脂和结合-洗脱模式(梯度洗脱)对抗体进行纯化
将表2中所列各树脂填充至7mm(内径)×5.5cm柱中，并用pH为8.5的含有300mMNaCl的20mM Tris-HCl缓冲液进行平衡。将含有5-10％聚集抗体的500μl的6.0mg/ml单克隆IgG抗体溶液以2毫升/分钟的流速施加至柱。对于各柱，抗体用pH为4.5的含150mM NaCl的20mM醋酸钠以10ml梯度的平衡缓冲液相对于洗脱缓冲液进行洗脱，然后用洗脱缓冲液通过30ml等度洗脱进行洗脱。通过尺寸排阻高效液相色谱法(HPLC-SEC)分析各柱所收集的抗体洗脱级分，以确定洗脱级分中聚集抗体的含量。在任意柱的抗体洗脱级分中均未检测到抗体聚集体。
实施例4-使用实施例1的树脂和结合-洗脱模式(分步洗脱和梯度洗脱)对抗体进行纯化
表2中的各树脂均以结合洗脱模式测试了从不纯的抗体溶液中去除聚集体的能力和/或纯抗体(即，无聚集体)与树脂结合的能力。对各种抗体进行测试。
材料
1.表2中所列色谱树脂。
2.含有以下单克隆抗体(mAb)之一的样品。样品中mAb的量以牛IgG为标准物通过Bradford试验来确定。
a.人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体(mAb1)-约15mg mAb1在7mL粗制中国仓鼠卵巢(CHO)细胞收获物中(或约2mg/mL)。粗制CHO细胞收获物含有5-10％的聚集mAb1。
b.抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体(mAb2)-约15mg mAb2在5mL粗制中国仓鼠卵巢(CHO)细胞收获物中(或约3mg/mL)。粗制CHO细胞收获物含有5-10％的聚集mAb2。
c.纯化的mAb3–约15mg在3ml结合缓冲液中(或约5gm/mL)。
d.纯化的mAb4–约15mg在3ml结合缓冲液中(或约5gm/mL)。
3.柱：7mm(内径)×5.5cm。
4.结合/洗涤缓冲液：
a.1X PBS–10mM磷酸盐，137mM氯化钠(NaCl)和2.7mM氯化钾，pH 7.2或7.8。
b.改性1X PBS(更高的NaCl浓度)–10mM磷酸盐，300mM氯化钠(NaCl)和2.7mM氯化钾，pH 7.2。
5.洗脱缓冲液：50mM醋酸钠(NaOAc)，pH 5.0或5.4，或100mM甘氨酸，pH 3。
6.剥离缓冲液：1N氢氧化钠(NaOH)。
方法：对于表2中的各树脂，将树脂填充到柱中，并用表3中列出的结合/洗涤缓冲液进行平衡。将含有mAb的样品(参见表3，施加至各树脂的样品)施加至柱，并用结合/洗涤缓冲液对柱进行洗涤。对于分步洗脱，用10个柱体积(CV)的洗脱缓冲液对单体或纯化的mAb进行洗脱。对于梯度洗脱(即，用mAb1测试的树脂2)，抗体用15CV梯度的结合/洗涤缓冲液相对于洗脱缓冲液进行洗脱，然后用洗脱缓冲液以5CV等度洗脱进行洗脱。所有柱均进行清洁，并且在mAb被洗脱用，用剥离缓冲液进行剥离。
通过尺寸排阻高效液相色谱法(HPLC-SEC)分析各柱所收集的抗体洗脱级分，以确定洗脱级分中抗体的聚集体百分含量。通过从100％减去聚集体百分含量来确定样品中单体百分含量，并列于表3中。
在表3中，“～”表示“约”。
表3
Figure GDA0003762926070000241
结果：表3中的结果表明，通过改变结合和洗脱条件，任何树脂都可用于纯化抗体(即，去除聚集体)。例如，1x PBS(pH 7.2或pH 7.8)使单体mAb1与树脂1、2和11结合，并通过用50mM NaOAc、pH 5.4或pH 5.0进行分步洗脱，洗脱了97％以上的单体mAb1。对于树脂2，梯度洗脱(即，0-100％50mM NaOAc，pH 5.0)也用于纯化mAb1：结果表明，超过97％的单体mAb1被洗脱。此外，对于树脂14和15，用1x PBS、pH 7.2结合缓冲液和50mM NaOAc、pH 5.4洗脱缓冲液来收集流穿液中的单体mAb1。
本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料均通过引用全文纳入本文。
其他公开和可要求的主题
项目1.一种具有下式的色谱树脂：
色谱基质-(X1)-L-Ar-(X2)-Y
或其互变异构体或阴离子盐，
其中：
X1是间隔基；
X2是C1至C5烷基、C3或C5环烷基、或不存在；
L是NR8、O、或S，其中，R8是氢、或C1至C6烷基；
Ar是任选地被至多4个C1至C3未取代烷基或C3至C6支链烷基取代的6元至10元的芳基单环或二环；并且
Y选自下组：
Figure GDA0003762926070000251
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢或C1至C6烷基；
如果Y是
Figure GDA0003762926070000252
则R2任选地连接至R3以形成4元至7元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至7元杂环；
如果Y是
Figure GDA0003762926070000253
则R1任选地连接至R2以形成4元至7元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至7元杂环；并且
如果Y是
Figure GDA0003762926070000261
则R5任选地连接至R6以形成4元至7元杂环或者R6任选地连接至R7以形成4元至7元杂环。
项目2.如项目1所述的色谱树脂，
其中：
X2是C1-C3烷基或不存在；
L是NR8、O、或S，其中，R8是氢、或C1至C3烷基；
Ar是任选地被至多四个C1至C3未取代烷基取代的苯基或萘基；
Y选自下组：
Figure GDA0003762926070000262
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢或C1至C4烷基；
如果Y是
Figure GDA0003762926070000263
则R2任选地连接至R3以形成4元至6元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至6元杂环；
如果Y是
Figure GDA0003762926070000264
则R1任选地连接至R2以形成4元至6元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至6元杂环；并且
如果Y是
Figure GDA0003762926070000265
则R5任选地连接至R6以形成4元至6元杂环或者R6任选地连接至R7以形成4元至6元杂环。
项目3.如项目2所述的色谱树脂，其中：
X1选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-、和-CO-NH-C(CH3)2-CO-；
X2是–CH2-，或不存在；
L是NR8，其中，R8是氢、或-CH3；
Ar是任选地被一个或两个C1至C2未取代烷基取代的苯基；并且
Y选自下组：
Figure GDA0003762926070000271
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢或C1至C3烷基。
项目4.如项目1或2所述的色谱树脂，其中，Y是
Figure GDA0003762926070000272
并且，R2连接至R3以形成4元或5元杂环。
项目5.如项目1或2所述的色谱树脂，其中，Y是
Figure GDA0003762926070000273
并且，R3连接至R4以形成4元至6元杂环
项目6.如项目1或2所述的色谱树脂，其中，Y是
Figure GDA0003762926070000274
并且R5连接至R6以形成4元或5元杂环，或者R6连接至R7以形成4元或5元杂环。
项目7.如项目1至6中任一项所述的色谱树脂，其中，R1-R7各自独立地是氢、C1或C2烷基。
项目8.如项目7所述的色谱树脂，其中，R1-R7各自独立地是氢或–CH3。
项目9.如前述项目中任一项所述的色谱树脂，其中，X1选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、和-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-。
项目10.如前述项目中任一项所述的色谱树脂，其中，Ar是未取代的。
项目11.如项目1至10中任一项所述的色谱树脂，其中，如果Ar是苯基，则色谱基质-(X1)-L-在相对于(X2)-Y的对位或间位。
项目12.如项目1至11中任一项所述的色谱树脂，其中，色谱基质-(X1)-L-Ar-(X2)-Y是表1最右侧列中的任一结构。
项目13.如项目1至12中任一项所述的色谱树脂，其中，阴离子盐是盐酸盐或硫酸盐。
项目14.一种色谱树脂，其通过使表1的任一配体以还原胺化、环氧化物化学反应或氮杂内酯化学反应中的任一与色谱基质反应来制备。
项目15.如项目14所述的色谱树脂，其中，色谱基质包含醛基团，并且表1中任一配体通过还原胺化与色谱基质反应。
项目16.如项目14所述的色谱树脂，其中，色谱基质包含醛基团，并且表1中任一配体通过环氧化物化学反应与色谱基质反应。
项目17.如项目14至16中任一项所述的色谱树脂，其中，在色谱基质与配体反应之前，色谱基质与烯丙基缩水甘油醚和溴；1,4-丁二醇二缩水甘油基、或表氯醇反应。
项目18.如项目17所述的色谱树脂，其中，色谱基质含有-OH基团，并且与烯丙基缩水甘油醚和溴反应。
项目19.一种对生物分子进行纯化的方法，所述方法包括：
使得含有生物分子的样品与如项目1至18中任一项所述的色谱树脂接触，由此分离生物分子与污染物；以及
收集纯化的生物分子。
项目20.如项目19所述的方法，其中，纯化的生物分子是蛋白质。
项目21.如项目20所述的方法，其中，蛋白质是抗体。
项目22.如项目19-21中任一项所述的方法，其中，样品包含单体抗体和抗体聚集体，所述方法包括：分离单体抗体与抗体聚集体，并且，纯化的生物分子包含单体抗体。
项目23.如项目22所述的方法，其中，接触步骤包括：使单体抗体固定至色谱基质，并且收集步骤包括：从色谱基质洗脱单体抗体。
项目24.如项目23所述的方法，其中，单体抗体用约7–9至约3–6的pH梯度的缓冲液进行洗脱，所述缓冲液与配体接触。
项目25.如项目22所述的方法，其中，接触步骤包括：使单体抗体流动通过色谱基质，并且收集步骤包括：收集流穿液中的单体抗体。

Claims (25)

1.一种具有下式的色谱树脂：
色谱基质-X1-L-Ar-X2-Y
或上式的互变异构体或阴离子盐，
其中：
X1是间隔基；
X2是C1至C5烷基、C3或C5环烷基、或不存在；
L是NR8、O、或S，其中，R8是氢、或C1至C6烷基；
Ar是任选地被至多4个C1至C3未取代烷基或C3至C6支链烷基取代的6元至10元的芳基单环或二环；并且
Y选自下组：
Figure FDA0003803869050000011
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢或C1至C6烷基；
如果Y是
Figure FDA0003803869050000012
则R2任选地连接至R3以形成4元至7元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至7元杂环；
如果Y是
Figure FDA0003803869050000013
则R1任选地连接至R2以形成4元至7元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至7元杂环；并且
如果Y是
Figure FDA0003803869050000014
则R5任选地连接至R6以形成4元至7元杂环或者R6任选地连接至R7以形成4元至7元杂环。
2.如权利要求1所述的色谱树脂，
其中：
X2是C1-C3烷基或不存在；
L是NR8、O、或S，其中，R8是氢、或C1至C3烷基；
Ar是任选地被至多四个C1至C3未取代烷基取代的苯基或萘基；
Y选自下组：
Figure FDA0003803869050000021
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢或C1至C4烷基；
如果Y是
Figure FDA0003803869050000022
则R2任选地连接至R3以形成4元至6元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至6元杂环；
如果Y是
Figure FDA0003803869050000023
则R1任选地连接至R2以形成4元至6元杂环或者R3任选地连接至R4以形成4元至6元杂环；并且
如果Y是
Figure FDA0003803869050000024
则R5任选地连接至R6以形成4元至6元杂环或者R6任选地连接至R7以形成4元至6元杂环。
3.如权利要求2所述的色谱树脂，其中
X1选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-、和-CO-NH-C(CH3)2-CO-；
X2是–CH2-，或不存在；
L是NR8，其中，R8是氢、或-CH3；
Ar是任选地被一个或两个C1至C2未取代烷基取代的苯基；并且
Y选自下组：
Figure FDA0003803869050000031
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢或C1至C3烷基。
4.如权利要求1或2所述的色谱树脂，其中，Y是
Figure FDA0003803869050000032
并且，R2连接至R3以形成4元或5元杂环。
5.如权利要求1或2所述的色谱树脂，其中，Y是
Figure FDA0003803869050000033
并且，R3连接至R4以形成4元至6元杂环。
6.如权利要求1或2所述的色谱树脂，其中，Y是
Figure FDA0003803869050000034
并且R5连接至R6以形成4元或5元杂环，或者R6连接至R7以形成4元或5元杂环。
7.如权利要求1或2所述的色谱树脂，其中，R1-R7各自独立地是氢、C1或C2烷基。
8.如权利要求7所述的色谱树脂，其中，R1-R7各自独立地是氢或–CH3。
9.如权利要求3所述的色谱树脂，其中，X1选自下组：
–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、和-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-。
10.如权利要求1或2或3所述的色谱树脂，其中，Ar是未取代的。
11.如权利要求1或2或3所述的色谱树脂，其中，如果Ar是苯基，则色谱基质-X1-L-在相对于X2-Y的对位或间位。
12.如权利要求1所述的色谱树脂，其中，色谱基质-X1-L-Ar-X2-Y是以下结构中的任一结构，其中，球表示基质和间隔基X1：
Figure FDA0003803869050000041
Figure FDA0003803869050000051
13.如权利要求1所述的色谱树脂，其中，阴离子盐是盐酸盐或硫酸盐。
14.如权利要求1所述的色谱树脂，其中，色谱树脂通过使选自如下的任一配体以还原胺化、环氧化物化学反应或氮杂内酯化学反应中的任一与色谱基质反应来制备：1-(4-氨基苯基)胍、1-(4-氨基苄基)胍、1-(4-氨基苯基丙基)胍、1-(4-氨基苯基丁基)胍、1-(4-氨基苯基戊基)胍、1-(4-氨基苯基环丙基)胍、1-(4-氨基苯基环丁基)胍、1-(4-氨基苯基环戊基)胍、3-(4-氨基苯基)-1,1-二甲基胍、3-(4-氨基苄基)-1,1-二甲基胍、1-(4-氨基苯基乙基)胍、1-(氨基(4-氨基苄基)氨基)甲基胍、4-(((1,3-二甲基咪唑啉-2-亚基)氨基)甲基)苯胺、2-(4-氨基苄基)-1,1,3,3,3-四甲基胍、2-(4-氨基苯基)-1,1,3,3-四甲基胍、1-((6-氨基萘-2-基)甲基)胍、N-(4-氨基苄基)氮杂环丁烷-1-甲脒、4-(((二(吡咯烷-1-基)甲基)氨基)甲基)苯胺、1-(4-氨基苄基)3-(咪唑啉-2-亚基)胍、N-(N-(4-氨基苄基)脒基)氮杂环丁烷-1-甲脒、1-(2-氨基苄基)胍或1-(3-氨基苄基)胍。
15.如权利要求14所述的色谱树脂，其中，色谱基质包含醛基团，并且选自如下的任一配体通过还原胺化与色谱基质反应：1-(4-氨基苯基)胍、1-(4-氨基苄基)胍、1-(4-氨基苯基丙基)胍、1-(4-氨基苯基丁基)胍、1-(4-氨基苯基戊基)胍、1-(4-氨基苯基环丙基)胍、1-(4-氨基苯基环丁基)胍、1-(4-氨基苯基环戊基)胍、3-(4-氨基苯基)-1,1-二甲基胍、3-(4-氨基苄基)-1,1-二甲基胍、1-(4-氨基苯基乙基)胍、1-(氨基(4-氨基苄基)氨基)甲基胍、4-(((1,3-二甲基咪唑啉-2-亚基)氨基)甲基)苯胺、2-(4-氨基苄基)-1,1,3,3,3-四甲基胍、2-(4-氨基苯基)-1,1,3,3-四甲基胍、1-((6-氨基萘-2-基)甲基)胍、N-(4-氨基苄基)氮杂环丁烷-1-甲脒、4-(((二(吡咯烷-1-基)甲基)氨基)甲基)苯胺、1-(4-氨基苄基)3-(咪唑啉-2-亚基)胍、N-(N-(4-氨基苄基)脒基)氮杂环丁烷-1-甲脒、1-(2-氨基苄基)胍或1-(3-氨基苄基)胍。
16.如权利要求14所述的色谱树脂，其中，色谱基质包含环氧化基团，并且选自如下的任一配体通过环氧化物化学反应与色谱基质反应：1-(4-氨基苯基)胍、1-(4-氨基苄基)胍、1-(4-氨基苯基丙基)胍、1-(4-氨基苯基丁基)胍、1-(4-氨基苯基戊基)胍、1-(4-氨基苯基环丙基)胍、1-(4-氨基苯基环丁基)胍、1-(4-氨基苯基环戊基)胍、3-(4-氨基苯基)-1,1-二甲基胍、3-(4-氨基苄基)-1,1-二甲基胍、1-(4-氨基苯基乙基)胍、1-(氨基(4-氨基苄基)氨基)甲基胍、4-(((1,3-二甲基咪唑啉-2-亚基)氨基)甲基)苯胺、2-(4-氨基苄基)-1,1,3,3,3-四甲基胍、2-(4-氨基苯基)-1,1,3,3-四甲基胍、1-((6-氨基萘-2-基)甲基)胍、N-(4-氨基苄基)氮杂环丁烷-1-甲脒、4-(((二(吡咯烷-1-基)甲基)氨基)甲基)苯胺、1-(4-氨基苄基)3-(咪唑啉-2-亚基)胍、N-(N-(4-氨基苄基)脒基)氮杂环丁烷-1-甲脒、1-(2-氨基苄基)胍或1-(3-氨基苄基)胍。
17.如权利要求14至16中任一项所述的色谱树脂，其中，在色谱基质与配体反应之前，色谱基质与以下物质反应：烯丙基缩水甘油醚和溴；1,4-丁二醇二缩水甘油基、或表氯醇。
18.如权利要求17所述的色谱树脂，其中，色谱基质含有-OH基团，并且与烯丙基缩水甘油醚和溴反应。
19.一种对生物分子进行纯化的方法，所述方法包括：
使得含有生物分子的样品与如权利要求1至18中任一项所述的色谱树脂接触，由此分离生物分子与污染物；以及
收集纯化的生物分子。
20.如权利要求19所述的方法，其中，纯化的生物分子是蛋白质。
21.如权利要求20所述的方法，其中，蛋白质是抗体。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中，样品包含单体抗体和抗体聚集体，所述方法包括：分离单体抗体与抗体聚集体，并且，纯化的生物分子包含单体抗体。
23.如权利要求22所述的方法，其中，接触步骤包括：使单体抗体固定至色谱基质，并且收集步骤包括：从色谱基质洗脱单体抗体。
24.如权利要求23所述的方法，其中，单体抗体用7–9至3–6的pH梯度的缓冲液进行洗脱，所述缓冲液与配体接触。
25.如权利要求22所述的方法，其中，接触步骤包括：使单体抗体流动通过色谱基质，并且收集步骤包括：收集流穿液中的单体抗体。
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