CN113416235A - 用于纯化分离病毒类抗原的液相色谱法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型复合型层析介质，其具有独特的核壳结构，专为生物大分子的分离纯化而设计。其以高聚物微球为基质，粒径均一，粒径大小可以调节并精确控制，具有良好的物理化学稳定性。其表面经特殊处理，具有更好的亲水性，最大程度地避免了与生物类样品的非特异性吸附。并通过专有的表面修饰专利技术，通过精确控制两步关键的化学反应来建立壳层、核层的表面化学。两层的表面化学官能团可以选择和官能团密度可以调节、精确控制，并确保了壳层、核层的官能团的高密度和均一性，壳层、核层的厚度可以调节且均一性良好。该核壳结构复合模式层析介质可广泛适用于蛋白、抗体、病毒、病毒载体、疫苗、DNA、RNA、质粒等生物大分子的分离和纯化。

Description

用于纯化分离病毒类抗原的液相色谱法

技术领域

本发明涉及复合模式层析介质液相色谱纯化分离应用领域。具体而言，本专利涉及一种化学合成的多孔亲水高分子微球，其具有独特的壳核结构，以及其在病毒、病毒载体、病毒样颗粒纯化分离的液相色谱应用。

背景技术

液相色谱(Liquid Chromatography，LC)是从混合物中分离物质的重要工具。作为现代液相色谱的关键组成部分，液相色谱层析介质，多为固体多孔载体，可分为两大类：无机液相色谱层析介质(二氧化硅和相关无机氧化物)和有机液相色谱层析介质。而有机液相色谱层析介质可以进一步分为天然聚合物，如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖及其衍生物，以及合成聚合物。

液相色谱在化学、生物化学、制药等前沿科学领域发挥着越来越重要的作用，越来越受到学术界和工业界的关注。一般来说，液相色谱在所有的制药过程中，包括发现、开发、制造过程和质量控制，都涉及并发挥着非常重要的作用。例如，它被广泛用于鉴定和分析样品中是否存在化学物质或微量元素，制备大量极纯材料，分离手性化合物，检测混合物和未知化合物的纯度，以及大规模分离和纯化药物。

生物制品(biologics)作为新的重要治疗剂出现，涵盖了广泛的产品，如各种重组治疗蛋白、疫苗、血液和血液成分、过敏原、细胞、基因治疗和组织。生物制品通常由糖类、蛋白质，核酸或它们的复杂组合组成，其来源可以是天然的，如从人类、动物或微生物中分离出来，或通过生物技术方法和其他尖端技术生产制备。它们通常处于生物医学研究的最前沿，可用于治疗各种其他方法难以治疗的严重疾病。

然而，由于生物药物的物理化学特性的异质性和其分离复杂性，因此其在生物药物的发现、开发和制造中存在许多挑战和未解决的问题。例如，1)它们的分子量(MW)、电荷和过渡期后修饰不同，因此先进的液相色谱表征和快速质量控制(QC)分析技术必不可少。2)可能与产品有关或与工艺有关的杂质，必须被去除和表征，因此生物医药的制备通常需要多个大规模和高纯度的纯化过程。3)由于其稳定性差和浓度低，必须优化下游纯化工艺，其目的是提高生产效率，降低生物制品的药物成本。例如，减少或简化LC工艺步骤、提高纯化速度、减少缓冲液的消耗和废物产生，都可以帮助提高生物医药的生产效率和降低其生产成本。

众所周知，生物制品的分离纯化主要依靠色谱技术。上述这些未满足且具有挑战性的需求为新液相色谱层析介质的开发提供了机会。随着研发和商业化管线中治疗性生物制品的数量不断增加，其结构的复杂性也在增加，对分析和分离的要求也相应增加。

虽然新液相色谱层析介质不时出现，但它们总体上跟不上生物制药行业的高要求，原因有以下几点：1)生物制药行业需要液相色谱平台产品，在下游纯化工艺(DSP)方面能够为新的生物制品提供系统化和平台化的解决方案，而不是为每个新的生物制品进行新的、通常是漫长的工艺开发。2)在生物药物的不同商业化阶段，所选择的液相色谱层析介质缺乏可扩展性。从分析表征到生产，从小规模到大规模生产，这都是有问题的，而许多液相色谱介质在商业上只提供一定范围的微球大小和孔径大小，而且树脂化学的选择也很有限。即使最初的分析结果或小规模纯化结果很好，也不能保证商业化的液相色谱层析介质可以用于全面生产。3)缺乏通用的树脂化学或分离模式来满足个别的分离和纯化的挑战。工业界不仅需要一些具有常规性能的液相色谱层析介质以保持其低成本，而且还需要定制的液相色谱层析介质(或可以易于定制的液相色谱层析介质)以提高制造效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种合成的、多孔结构的、核壳结构的亲水高分子聚合物在纯化分离病毒、病毒载体、病毒样颗粒的液相色谱法中的应用。

本发明的第一方面，提供了一种用于纯化分离病毒类抗原的液相色谱法，所述方法包括如下步骤：

1)提供一层析介质、待分离病毒类抗原、第一缓冲液、第二缓冲液、在线清洗(CIP)溶液；

所述层析介质为合成的亲水高分子聚合物，且具有多孔结构，并且具有2-5层结构；

2)以所述层析介质填装液相色谱设备的色谱柱，得到用于所述方法的液相色谱柱；

3)以所述第一缓冲液冲洗所述液相色谱柱；

4)将所述待分离病毒类抗原在步骤3)所得液相色谱柱上进行上样；

5)以所述第二缓冲液冲洗步骤4)所得液相色谱柱，收集分离产物，得到经分离的病毒类抗原；

6)以所述CIP溶液冲洗步骤5)所得液相色谱柱，收集分离产物，除去所述待分离病毒类抗原中的工艺相关杂质。

在另一优选例中，用于所述合成的亲水高分子聚合物的可聚合单体选自下组：(甲基)丙烯酸类单体、苯乙烯类单体、乙烯基类单体、或其组合。

在另一优选例中，所述多孔结构用于尺寸排阻分离；且

所述层析介质的至少一个内层和至少一个外层具有不同类型的结合功能基团，或者所述层析介质的至少一个内层和至少一个外层具有相同类型的、不同结合密度的结合功能基团，以使得所述层析介质的至少一个内层和至少一个外层具有不同的层析性能。

在另一优选例中，所述结合功能基团选自下组：亲水性基团、疏水性基团、离子基团、亲和性基团、混合模式功能基团。

在另一优选例中，所述亲水性基团选自下组：羟基、或通过2-羟基乙硫醇、3-硫烷基丙烷-1,2-二醇、葡聚糖、任何直链或支链多官能环氧化物进行化学改性而转化的基团。

在另一优选例中，所述疏水性基团选自下组：直链或支链C1-C18烷基、低聚(环氧乙烷)、苯基、苄基及其衍生物；优选地，所述疏水性基团通过氧原子(O)、氮原子(N)、硫原子(S)、醚、酯或酰胺基团与所述层结构连接。

在另一优选例中，所述离子基团选自下组的阳离子基团：伯胺、仲胺、叔胺、或其组合。

在另一优选例中，所述伯胺为直链或支链C1-C18烷基胺；更优选地，伯胺选自下组：乙胺、丁胺、己胺、辛胺、或其组合。

在另一优选例中，所述仲胺选自下组：二甲胺、二乙胺、或其组合。

在另一优选例中，所述叔胺选自下组：三甲胺、N，N-二甲基丁胺、或其组合。

在另一优选例中，所述离子基团选自下组的阴离子基团：磺酸根基团、磷酸根基团、羧酸根基团及其含有相关基团的衍生物。

在另一优选例中，所述亲和性基团选自下组：蛋白A、蛋白L、蛋白G、3-氨基苯基硼酸、正义/反义寡核苷酸、亚氨基二乙酸(IDA)、三(羧甲基)乙二胺(TED)、次氮基三乙酸(NTA)和其他金属螯合配体。

在另一优选例中，所述混合模式功能基团为含有至少一个直链C2-C10烷基、N,N-二甲基丁胺、N-苄基-N-甲基乙醇胺、N,N-二甲基苄胺和2-苯甲酰氨基-4-巯基丁酸的仲胺和叔胺。

在另一优选例中，所述层析介质具有核壳结构。

在另一优选例中，所述层析介质具有选自下组的一个或多个特征：

1)所述层析介质的比孔容为0.05mL/g-3.0mL/g；

2)所述层析介质的比表面积为40m²/g-1200m²/g；

3)所述层析介质的孔径为

4)所述层析介质的体积平均粒径为1μm-1000μm；

5)所述层析介质的粒径分布(D₉₀/D₁₀)为1.0-2.2。

在另一优选例中，所述层析介质的壳层厚度占所述层析介质等效半径的0.5％-30％。

在另一优选例中，所述层析介质的壳层厚度为0.5μm-10μm；

在另一优选例中，当核层的官能团与壳层的官能团相同时，核层的官能团密度为D1，壳层的官能团密度为D2，层析介质具有以下特征之一：

1)D1/D2大于1.05，优选1.1，更优选1.5，最优选2.0；

2)D2/D1大于1.05，优选1.1，更优选1.5，最优选2.0。

在另一优选例中，所述层析介质为球形或类球形。

在另一优选例中，所述液相色谱柱具有选自下组的一个或多个特征：

1)所述液相色谱柱的核层离子交换当量为100-500μmol/mL层析介质；

2)所述液相色谱柱的线性流速为10cm/h-1000cm/h；

3)所述液相色谱柱的操作压力为≤100bar。

在另一优选例中，所述液相色谱柱的核层离子交换当量为100-300μmol/mL层析介质。

在另一优选例中，所述液相色谱柱的线性流速为20cm/h-900cm/h、50cm/h-800cm/h、100cm/h-700cm/h或150cm/h-500cm/h。

在另一优选例中，所述液相色谱柱的操作压力为≤50bar、≤10bar、≤5bar或≤3bar。

在另一优选例中，所述待分离病毒类抗原选自下组：病毒、病毒载体、疫苗、病毒样颗粒、或其组合。

在另一优选例中，所述待分离病毒类抗原至少包含如下两种物质：

1)分离样品中分子量较大的物质，所述分子量较大的物质的分子量为M1；和

2)分离样品中分子量较小的物质，所述分子量较小的物质的分子量为M2；

M1/M2≥2。

在另一优选例中，所述分子量较大的物质为目标分离产物。

在另一优选例中，所述分子量较小的物质为工艺相关杂质。

在另一优选例中，M1/M2≥5，或者M1/M2≥10。

在另一优选例中，所述经分离的病毒类抗原的粒径选自下组：14-750nm、16-300nm、18-200nm、20-120nm。

在另一优选例中，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液相同或不同，独立地选自下组：Tris缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、NaCl盐溶液、或其组合。

在另一优选例中，所述CIP溶液没有特别限制，如NaOH的水溶液、NaOH的乙醇/水混合溶液、NaOH的异丙醇/水混合溶液，优选NaOH的水溶液。

在另一优选例中，步骤4)中，所述待分离病毒类抗原的上样量为1-2个柱体积。

在另一优选例中，步骤5)中，所述冲洗的流速为10cm/h-1000cm/h。

在另一优选例中，步骤5)中，所述冲洗的流速为20cm/h-900cm/h、50cm/h-800cm/h、100cm/h-700cm/h、或150cm/h-500cm/h。。

在另一优选例中，步骤5)中，所述冲洗的操作压力为≤10bar。

在另一优选例中，步骤5)中，所述冲洗的操作压力为≤5bar或≤3bar。

在另一优选例中，所述液相色谱法中，所述待分离病毒类抗原的回收率≥75％，或者≥80％，或者≥85％，或者≥90％，或者≥95％。

在另一优选例中，所述液相色谱法中，所述经分离的病毒类抗原的纯度≥80％，或者≥85％，或者≥90％，或者≥95％。

本发明的第二方面，提供了一种层析介质的用途，用于纯化分离病毒类抗原的液相色谱法；

所述层析介质为合成的亲水高分子聚合物，且具有多孔结构，并且具有多层结构。

在另一优选例中，所述层析介质为合成的亲水高分子聚合物，且具有多孔结构，并且具有核-壳两层结构；

所述层析介质核层孔表面上有胺基，壳层孔表面上有亲水官能团。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式，或者现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方法或现有技术描述中所需要使用的附图简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1.本发明中用到的层析介质结构示意图：核壳结构的多孔合成高分子层析介质；其中，X和Y可以是阳离子交换、阴离子交换、亲水、疏水、亲和或混合模式功能基团，并且X和Y可以是不同的功能基团或者为相同功能基团但具有不同密度。

图2.Monomix Core 60(即本发明层析介质的代表)的扫描电子显微镜(SEM)图,微球体积平均粒径为59.1μm。

图3.Capto^TM Core 700(来自GE)的扫描电子显微镜(SEM)图,微球体积平均粒径为88.3μm。

图4.核壳多层结构的直观显示：经荧光染料染色的Monomix Core 60的共聚焦激光扫描显微镜分析。图4A为EDANS荧光染料染色，图4B为刚果红荧光染料染色。

图5.本发明层析介质和Capto^TM Core 700的离子交换当量以及NaNO₂保留时间对比分析。

图6.层析介质Monomix Core 60的分离应用：直径为80-90nm的病毒样颗粒(VLP)粗品的液相分离纯化图谱。

图7.层析介质Monomix Core 60的分离应用：直径约为80nm，等电点<7噬菌体病毒粗品的液相分离纯化图谱。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，通过采用本发明所述特定的合成的、多孔结构的、核壳结构的亲水高分子聚合物作为层析介质，可实现高结合载量、高柱层离子交换当量和高线性流速的纯化分离病毒、病毒载体、病毒样颗粒的纯化分离效果。在此基础上，发明人完成了本发明。

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明涉及一种化学合成的多孔亲水高分子微球，其具有独特的壳核结构，其可有效地应用于病毒、病毒载体、病毒样颗粒的纯化分离。

本发明所展示的复合型层析介质，为化学合成的多孔亲水高分子微球，其具有独特的壳核结构，如图1，该微球具备比较窄的粒径分布以及理想的孔隙结构等特性。该层析介质作为理想的纯化平台工具，可以系统地解决众多分析级或者工业级的分离挑战，同时也为以下分离难题提供新的解决方案，例如：打破了产能扩大限制、核层和壳层多种化学修饰的选择打破了层析介质分离模式扩展的限制、极大地提高了纯化分离产率和效率等。本发明所述具有核壳结构的复合层析介质，同时兼备尺寸排阻分离效应以及离子交换、疏水层析等层析效应，其可以达到其他层析介质所不能达到的效果，完成其不能完成的分离任务。

本发明所述层析介质具备特有的核壳多层结构；

所述核壳多层结构，其可为2、3或者4层结构；

优先地，该核壳多层结构为2层结构，其最内层为液相层析介质的核层，最外层为液相层析介质的壳层，如图1；

本发明所述层析介质，其位于核层或者壳层的官能团，可以根据需要选择任何基团，该被选基团可以使介质或者介质的核或者壳具备以下分离效应，例如：尺寸排阻、强阳离子交换、弱阳离子交换、强阴离子交换、弱阴离子交换、疏水层析、亲和层析以及混合模式层析等。

所述基团可以是相对应的以下功能基团，例如：亲水基团，疏水基团，带电或者可电离基团，亲和基团，混合模式基团，以及其相应组合。

本发明所用于在病毒、病毒载体、病毒样颗粒分离的核壳双层析介质，其壳层为亲水结构，其核层带有混合模式层析基团，兼备了尺寸排阻和混合模式层析机理，在分离过程中，大尺寸分离物(如大尺寸蛋白、病毒、大尺寸DNA等)可以直接穿流柱体，然后被收集；而小尺寸分离物将会流穿孔隙，被核层内功能基团吸附，然后再被洗脱并收集。

本发明所述复合层析介质具有以下一个或者多个特性：

1)在一些实施方案中，介质的孔体积可以控制在0.05mL/g到3.0mL/g这个范围内，优选于0.2mL/g到2.5mL/g，更优选于0.4mL/g到2.0mL/g；

2)在一些实施方案中，介质的孔表面积可以控制在40m²/g到1200m²/g这个范围内，优选于60m²/g到1000m²/g，更优选于80m²/g到800m²/g；

3)在一些实施方案中，介质的孔径可以控制在

到

这个范围内，优选于

到

更优选于

到

4)在一些实施方案中，介质的体积平均粒径可以控制在1μm到1000μm这个范围内，优选于1μm到500μm，更优选于2μm到200μm；

5)在一些实施方案中，介质的粒径分布(D₉₀/D₁₀)可以控制在1.0到2.2这个范围内，优选于1.0到1.5，更优选于1.0到1.2，最优选于1.0到1.05；

6)在一些实施方案中，介质的核的功能基团密度可以控制在0.5mmol/g到6.0mmol/g，优选于0.7mmol/g到5.5mmol/g，更优选于0.9mmol/g到5.2mmol/g。

本发明所述层析介质，其壳的厚度可以根据具体要求进行调控，其壳厚度对壳与核厚度总和的占比率可以控制在0.5％-30％，优选于1.0％-20％，更优选于2.0％-15％，最优选于3.0％-10％。

在一些实施方案中，壳的厚度可以控制在0.5μm到10μm之间,优选于1-8μm,更优选于1.5-6μm。

在另一优选实施例中，当核层的官能团与壳层的官能团相同时，核层的官能团密度为D1，壳层的官能团密度为D2，层析介质具有以下特征之一：

1)D1/D2大于1.05，优选1.1，更优选1.5，最优选2.0；

2)D2/D1大于1.05，优选1.1，更优选1.5，最优选2.0。

本发明所述复合模式层析介质Monomix Core 60，经过荧光染料染色处理，然后通过共聚焦激光扫描显微镜分析，可以直观显示其核壳双层结构，如图4。

基质支持物可以根据应用从一系列选项中选择合适的形状，形式，材料和变型。该基质支持物表面可以是基本平坦的或平面的。也可以是圆形等形状。该基质支持物表面的形状包括但不限于孔，凹陷，柱，脊，通道，膜或类似形状。基质支持物优选表面基本平坦的颗粒物，整体的圆柱体或者原片。颗粒物的形状优选为球形或者基本球形。

本发明所述层析介质，可以根据分离或者提纯需要，加工成多种多样的液相色谱柱或者其他相关器件。特别地，所述色谱柱或者器件可以使分析柱、保护柱、制备柱、半制备柱、高效液相柱、固相萃取柱、超高效液相色谱柱、快速蛋白液相色谱柱、手性柱、分离柱、重力层析空柱、毛细管柱、离心柱、一次性柱、整体柱、萃取柱等。所述层析分离装置种类较多，包括但不限于以下种类：SPE固相萃取柱，带分离膜的离心管，磁珠，分离膜(membranes)，快速检测生物芯片(bio-chips)，试剂盒，纤维束柱，整体柱及常规分析级或制备级层析色谱柱。

层析分离装置优选为柱状，并由多个必要组成要素组成：层析介质材料，层析介质的粒径和孔径，柱子的基质材料，柱子的尺寸，装柱子方法。

本发明所述任何柱体，其内直径可以根据需要控制在0.1毫米到2米之间，柱体长度可以控制在1毫米到2米之间。根据分离需要，所述色谱柱材料可以为不锈钢、玻璃、硼化玻璃、塑料、SPE管以及其他高分子材料，如高密度聚乙烯等。不同材质的柱管耐压性能不同，在色谱柱填装时注意控制压力不能超过层析介质的最高耐压，同时不超过柱管材质的最大耐压。

使用本发明层析介质填装成的色谱柱可以有多种物理形式，由不同的色谱柱必要组成要素组合构成。

装柱子方法：恒流/变流/恒压/多级调压力/DAC。

根据介质粒径、孔径等性能及色谱柱规格选择不同的装柱方法。

粒径小于15μm层析介质多用恒流、恒压方法装柱；粒径大于15μm层析介质根据柱床及层析介质耐压性能选择恒流或变流方法装柱。

匀浆液：水，盐水，含有机相的水或缓冲盐等，20-80％(v:v)固含量。根据色谱柱规格及层析介质性能选择合适的匀浆流动相及匀浆体积。

在一些实施方式中，所述层析色谱柱可以在pH 1-14的范围内使用，优选2-13，更优选于4-10。

在一些实施方式中，所述层析色谱柱可以在<100bar的压力范围内使用，优选<50bar，更优选于<10bar，更优选于<5bar，最优选于<3bar。

色谱柱子清洗条件：长时间使用色谱柱会吸附一些难以清洗的杂质，这些杂质会影响色谱柱性能，需要定期将这些杂质清洗掉。不同杂质清洗方法不同，一般杂质用0.5MHCl或0.5-1.0M NaOH清洗，强疏水性结合的杂质可用0.1-1％的吐温和Triton X-100或者有机溶剂添加剂清洗。

色谱柱子保存方法：色谱柱在含20％乙醇水溶液中，室温下保存。层析介质在含20％乙醇水溶液中，2-8℃保存。

所述色谱柱或装置可以与分批层析模式和连续层析模式(如逆流色谱相)结合。所述色谱柱可在连续或非连续(常规)色谱中用作单柱或多柱形式使用。所述柱子可用于分析或工业纯化过程中的流穿模式层析或结合-洗脱模式层析。

所述介质的另一个有利应用是生物分子混合物的分离，该介质的壳层将排阻较大尺寸的细胞、VLP、疫苗、病毒载体或病毒、或脂质体，并防止其与核层孔表面上官能团相互作用，如离子交换、亲和、疏水或混合离子-疏水模式。而较小尺寸的杂质，如DNA、RNA、寡核苷酸、内毒素、其他小蛋白质和肽，与核层孔表面上官能团有吸附作用，之后可用高盐洗脱液或在线清洗(CIP)试剂(如0.5-1.0M NaOH)将其洗脱。

例如，赛分科技公司的Monomix Core 60层析介质产品(货号：290160990，层析介质的性能列在表1中)成功应用于纯化分离病毒、病毒载体和病毒样颗粒(VLP)。在纯化过程中，大尺寸的病毒、病毒载体和病毒样颗粒(VLP)被Monomix Core 60层析介质外壳层排除并作为流穿物收集，而大多数工艺相关杂质则被内核层混合模式基团(胺基)暂时吸收，然后通过CIP步骤从层析介质中去除。该层析介质旨在中度纯化和精细纯化生物大分子制品，一步层析纯化基本上可以替代传统层析工艺中的两步纯化(体积排阻层析和阴离子交换层析)。该层析介质在病毒样颗粒实际纯化应用中，流穿模式下上样量可以至少达到1个柱体积(实施例1)，远远超过常规体积排阻层析介质在吸附-洗脱分离模式下约4％柱体积。该层析介质的粒径和孔径均一可控且可以根据应用需要来调节。壳层和核层两层的表面化学功能基团可以根据需要选择和基团密度可以调节、精确控制，并确保了壳层、核层的官能团的高密度性和均一性，壳层、核层的厚度可以调节且均一性良好。

Monomix Core 60与Capto^TM Core 700两种层析介质产品对比数据如表1所示。Monomix Core 60和Capto^TM Core 700核层功能基团都为胺基，Monomix Core 60基团密度可以控制在分离需求的范围内，并且可根据需要调至远远高于Capto^TM Core 700的基团密度。离子交换当量为100-300μmol/mL，远高于Capto^TM Core 700的40–85μmol/mL。核层胺基基团对NaNO₂保留时间，在PCT/CN2021/097462专利申请中所示，Monomix Core 60可以在1.07-1.67分钟调节，远高于Capto^TM Core 700的0.87分钟(见图5)。此外Monomix Core 60为硬胶亲水性高分子基质微球，最大使用线流速和最大操作压力分别为1000cm/h和10bar，远远高于软胶琼脂糖基质Capto^TM Core 700的500cm/h和5bar。相比于传统的软胶琼脂糖基质，采用硬胶亲水性高分子基质可以提高填料的耐压性能，能够在更快的流速下实现样品纯化(或者可以装更长的柱子，可以批次处理更多的生物样品)，节省宝贵时间，提高生产效率。对于不稳定的生物样品(要求快速分离纯化母液)，在提高生产效率的同时可以提高产品的收率和质量控制。

综上所述新型复合型层析介质及色谱层析柱子作为一个理想的纯化平台工具，可以解决众多分析级或者工业级的分离挑战与难题，例如：减少分离纯化步骤、增加样品上样量、以及满足生物大分子不断增长的分离与检测要求。

本发明公开了一种新型复合型层析介质，其具有独特的核壳结构，专为生物大分子的分离纯化而设计。其以高聚物微球为基质，粒径均一，粒径大小可以调节并精确控制，具有良好的物理化学稳定性。其表面经特殊处理，具有更好的亲水性，最大程度地避免了与生物类样品的非特异性吸附。并通过专有的表面修饰专利技术，通过精确控制两步关键的化学反应来建立壳层、核层的表面化学。两层的表面化学官能团可以选择和官能团密度可以调节、精确控制，并确保了壳层、核层的官能团的高密度和均一性，壳层、核层的厚度可以调节且均一性良好。该核壳结构复合模式层析介质可广泛适用于蛋白、抗体、病毒、病毒载体、疫苗、DNA、RNA、质粒等生物大分子的分离和纯化。

如上所述，为克服所述分离难题，以及满足日益增长的液相分离要求。本发明展示了一种可应用于病毒、病毒载体、病毒样颗粒纯化分离的的新型复合型层析介质，其为化学合成的多孔亲水高分子微球，其具有独特的壳核结构。该层析介质具有较为均一的粒径分布，以及理想的孔隙结构，其同时兼备尺寸排阻分离效应以及离子交换与疏水层析效应，如图1和表1。该层析介质作为一个理想的纯化平台工具，可以解决众多分析级或者工业级的分离挑战与难题，例如：减少分离纯化步骤、增加样品上样量、以及满足生物大分子不断增长的分离与检测要求。

本发明所述层析介质为化学合成、多孔亲水高分子微球层析介质，其具备核壳多层结构，该结构至少包含最内层的核结构，以及核以外的至少一层壳结构。通过特定的化学修饰，该多层结构可带完全不同的功能基团，或者带上相同的功能基团，但各层间有着不同的基团密度，使得该层析介质兼备尺寸排阻分离效应以及离子交换与疏水层析效应。

本发明所述层析介质具备特有的核壳多层结构；

所述核壳多层结构，其可为2、3或者4层结构；

更可取地，该核壳多层结构为2层结构，其最内层为液相层析介质的核，最外层为介质的壳，如图1；

本发明所述层析介质，其位于核或者壳的功能基团，可以根据需要选择任何基团，该被选基团可以使介质或者介质的核或者壳具备以下分离效应，例如：尺寸排阻、强阳离子交换、弱阳离子交换、强阴离子交换、弱阴离子交换、疏水层析、亲和层析以及混合模式层析等。

例如，其中核壳双层结构，其壳为亲水结构，其核带有不同的分离官能团，如混合模式层析基团。本发明所用于病毒分离的核壳双层析介质，兼备了尺寸排阻和混合模式层析机理，在分离过程中，大尺寸的分离物(如大尺寸的蛋白、抗体、病毒、病毒载体、疫苗、DNA、RNA、质粒等生物大分子等)可以直接穿流柱体，然后被收集；而小尺寸分离物将会流穿孔隙，被核层官能团吸附，然后再被洗脱并被收集。

通过与核层及壳层的不同作用这款层析介质可用于天然或人工合成的大尺寸生物大分子聚集体，如由真核和无核细胞组成的聚集体，类病毒颗粒，疫苗，病毒载体，病毒，脂质体，纳米脂质体颗粒与小分子及其聚集体的分离。

优选地，这样的真核和无核细胞，类病毒颗粒，疫苗，病毒载体，病毒，脂质体，纳米脂质体颗粒大分子或超大分子聚集体尺寸大于10纳米。这样的病毒可以是有活性的或失活的，包膜的或无包膜的。这样的类病毒颗粒，疫苗，病毒载体，病毒，脂质体，纳米脂质体颗粒与小分子及可以包含遗传物质，如单链脱氧核糖核酸，双链脱氧核糖核酸，单链核糖核酸，双链核糖核酸，这样的脂质体或纳米脂质体颗粒，可以带正电荷，或负电荷，或不带电荷，首选的实体带有正电荷。

优选地，所述小分子或组装体包括但不限于DNA片段、RNA、质粒、HCP、蛋白质片段、壳蛋白、内毒素、去污剂、核酸酶、过量组分(未包封组分)，小于10nm。

本发明描述了一种用于病毒、病毒载体、疫苗纯化分离的液相色谱应用。病毒、病毒载体广泛的基因治疗和疫苗的应用。

病毒的种类包括：双链DNA病毒，单链DNA病毒，双链RNA病毒，正义单链RNA病毒，反义单链RNA病毒，单链RNA反转录病毒，双链DNA反转录病毒。

常用的病毒、病毒载体有腺病毒，腺相关病毒(AAV)，慢病毒，人乳头状瘤病毒(HPV)，疱疹病毒(HSV)，噬菌体病毒及与以上病毒相应的病毒载体。

按照病毒、病毒载体、病毒样颗粒的大小为14nm-750nm，优选16nm-300nm,进一步优选18nm-200nm，更优选20nm-120nm。

疫苗开发一直是人类针对各种疾病的长期努力。预防性疫苗可用于预防或减轻未来感染的影响，而治疗性疫苗可用于对抗已经发生的疾病，例如癌症。随着2020年初Covid-19的爆发，针对Covid-19的疫苗开发成为摆在制药行业和医疗保健研发组织面前的紧迫任务。

疫苗一般可以分为灭活疫苗，减毒活疫苗，复制型病毒载体疫苗，非复制型病毒载体疫苗，病毒样颗粒，蛋白疫苗，DNA疫苗和RNA疫苗。

病毒样颗粒，Virus-like particles(VLP)，为病毒空蛋白外壳，由病毒壳蛋白构成，不含病毒的遗传物质。病毒载体疫苗优选腺病毒载体疫苗。腺病毒载体可以是人源，动物源或者嵌合病毒；包括重组的5型人腺病毒载体(Ad5)，重组的26型黑猩猩腺病毒载体(Ad26)。Covid-19新冠疫苗研发和商业化中使用到灭活疫苗，减毒活疫苗，复制型病毒载体疫苗，非复制型病毒载体疫苗，病毒样颗粒的路线。

病毒的宿主可以是人或者动物(兽，禽)。因此疫苗按受用对象可以分为人用也可以是动物用(兽用，禽用)。基因治疗按受用对象可以分为人用也可以是动物用(兽用，禽用)。

基因治疗开发将新的治疗基因组合到病毒载体中，如腺病毒，腺相关病毒(AAV)，慢病毒等病毒。通过病毒载体有治疗疗效的基因可有效地插入细胞以达到基因改造消除病变基因。在治疗基因组合到病毒载体的过程中，本发明中的新型复合型层析介质可以用来分离游离治疗基因和工艺相关杂质与治疗基因和病毒载体的组合体。治疗基因和病毒载体的组合体因为体积大而被外壳层体积排阻，游离治疗基因和工艺相关杂质可被内核层的胺基官能团结合而达到分离。

基因治疗常用的病毒有腺病毒，腺相关病毒(AAV)，慢病毒及与以上病毒相应的病毒载体。

病毒、病毒载体可以是由鸡蛋表达系统、动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、酵母表达系统、植物表达系统制备。因为表达系统有多种选择，每个表达系统所固有的工艺相关杂质不相同。

本发明所述新开发的层析介质，采用体积排阻分离和多种结合化学分离机理的复合层析模式，成功地应用于病毒、病毒载体、病毒样颗粒的实验室规模的纯化和工业规模纯化的放大。实现了载量大、纯化速度快、下游纯化(DSP)工艺流线化、高通量和低成本的纯化分离。本发明所述新开发的层析介质作为一个理想的纯化平台工具，在病毒、病毒载体、病毒样颗粒领域，可以解决众多分析级或者工业级的挑战与难题。

总的来说，本发明为本专利背景介绍部分中公开的许多液相色谱(LC)挑战提供了平台化的层析介质解决方案：1)微球尺寸、多孔结构和孔壁官能团密度可以预先设计，并且这些特性可以根据应用需要进行调整。2)多样化的层析介质化学。3)可聚合单体容易获得、表征良好且单体的特性可以很好地控制。4)具有确定的孔径大小、微球尺寸和化学性质的层析介质可以在短时间内大量商业化。5)核壳构建方法结合了两种不同的化学成分以达到卓越的性能，这是单一化学成分的树脂混合或使用“隔离化学成分”(“segregatedchemistries”)的方法难以实现的。6)使用相同类型的聚合物树脂可以简化从分析表征到生产，从小规模到工业规模生产的过程转移。7)微球是一个平台，具有多功能性和良好的适应性。具有特殊性能的定制树脂可以在很短的时间内开发出来。8)大量可能的新液相色谱应用。

如上所述，为克服所述分离难题，以及满足日益增长的液相分离要求。本发明展示了一种可应用于病毒疫苗分离的新型层析介质，其为化学合成的高分子带孔微球，其具有独特的壳核结构。该层析介质具有较为均一的粒径分布，以及理想的孔隙结构，其同时兼备尺寸排阻分离效应以及离子交换与疏水层析效应。该层析介质做为理想的平台工具，可以解决众多分析级或者工业级的分离挑战与难题，例如：减少分离纯化步骤、增加样品上样量、以及满足生物大分子不断增长的分离与检测要求。

本发明所述层析介质为化学合成高分子带孔介质，其具备壳核多层结构，该结构至少包含最内层的核结构，以及核以外的至少一层壳结构。通过特定的化学修饰，该多层结构可带完全不同的功能基团，或者带上相同的动能基团，但各层间有着不同的基团密度，使得该层析介质兼备尺寸排阻分离效应以及离子交换与疏水层析效应。

本发明所述层析介质具备特有的核壳多层结构；

所述核壳多层结构，其可为2、3或者4层结构；

更可取地，该核壳多层结构为2层结构，其最内层为液相层析介质的核，最外层为介质的壳；

本发明所述层析介质，其位于核或者壳的功能基团，可以根据需要选择任何基团，该被选基团可以使介质或者介质的核或者壳具备以下分离效应，例如：尺寸排阻、强阳离子交换、弱阳离子交换、强阴离子交换、弱阴离子交换、疏水层析、亲和层析以及混合模式层析等。

例如，其中核壳双层结构，其壳为亲水结构，其核带有不同的分离功能基团，如混合模式层析基团。本发明所用于病毒分离的核壳双层析介质，兼备了尺寸排阻和混合模式层析机理，在分离过程中，较大尺寸分离物(如大尺寸蛋白、病毒、大尺寸DNA等)可以直接穿流柱体，然后被收集；而较小尺寸分离物将会流穿孔隙，被核内功能基团吸附，然后再被洗过并收集。

与现有技术相比，本发明具有以下主要优点：

(1)相比GE的使用琼脂糖作为介质基体材质的Capto^TM Core 700，本发明所述层析介质以合成的、硬胶高分子材料作为介质基体材质，使得以所述层析介质制备的色谱柱具有显著提高的离子交换当量、保留时间、线性流速和操作压力；

(2)以本发明所述层析介质制备的色谱柱具有高的原料液量结合载量；

(3)本发明所述液相色谱法具有以下优点：分离纯化效率高、工艺简化、高速、高通量、低成本；

(4)本发明所述层析介质可以定制、优化。其粒径大小，粒径分布，孔隙结构，以及壳层、核层功能基团的种类的选择以及相应官能团密度均可以根据终端客户分离纯化的需求而定制。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

通用测试方法

离子交换当量

离子交换当量通过对氨基滴定测得，其测试方法如下：1)干燥一定量的待测层析介质；2)加入稀盐酸溶液(1M),溶液室温摇晃过夜；3)过滤溶液，用去离子水充分冲洗介质直至pH7，以除去多余盐酸；4)向介质中加入0.5MNaOH溶液，充分反应，并过滤，且冲洗；5)用稀硝酸溶液中和滤液(pH 7)；6)用硝酸银(AgNO₃)滴定上述溶液，并计算使用的硝酸银的量，其为该层析介质的离子交换当量。

对比层析介质：来自GE Healthcare的Capto^TM Core 700样品。

微球粒径的表征与评估方法：微球体积平均粒径(D₅₀)以及粒径分布(D₉₀/D₁₀)通过贝克曼库尔特粒度分析仪(Beckman)或者光散射粒度分布分析仪(Better,Bettersize2600E)测得。在一些特定情况下，光学显微镜,扫描电子显微镜(SEM)和荧光共焦显微镜(CLSM,LSM 880)也应用于微球粒径与粒径分布研究。

微球孔隙结构的表征与评估方法：微球孔隙结构经由扫描电子显微镜，荧光共焦显微镜，比表面积与孔隙度分析仪(Micromeritics TriStar II Plus)，以及压汞法压汞仪(Micromeritics MicroActive AutoPore)等多种方法组合测得。

如图3，Capto^TM Core 700为多分散多孔琼脂糖微球(约85μm)，其具有核壳结构，其具有一个亲水的外壳以及一个正辛烷修饰的内核。该微球粒径为多分散，其D₅₀为88.3μm，粒径分布(D₉₀/D₁₀)为2.22。

核壳结构的表征与评估方法：

为直观显示核壳多层结构，可以通过荧光染料选择性的修饰壳层或者核层。如图4A所示，Monomix Core 60层析介质中核层被5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸荧光染料(EDANS)选择性染色而壳层未染色。其核壳多层结构的直观显示由共聚焦激光扫描显微镜分析获得，可以清楚的看到带有染料标记的核层以及未染色的亲水壳层。

类似地，采用刚果红染色的结果见图4B。

制备实施例

以下实施例1-3中，其微球可采用本领域常规方法合成,该微球主成分为PMMA且微球内部和外部均含有高官能团密度的环氧乙烷和乙烯基团，并且该微球具有多孔结构，其可用于后续核壳结构的化学修饰，该微球为亲水高分子聚合物，其平均粒径为60μm且粒径单分散分布，其孔径约为

实施例1，树脂28的制备

树脂28的制备步骤如下，1)环氧基水解反应:通过稀硫酸(2％wt)处理，水解微球中的环氧基团，本步反应使微球更具亲水性；2)微球的乙烯基含量的测定:通过硝酸银(AgNO₃)滴定法，精确测定微球中的乙烯基含量；3)局部溴化微球的乙烯基:本步反应为树脂28合成的关键步，该反应根据微球中乙烯基的含量，使用0.3个当量的溴素，配制的溴素溶液滴加到微球的含醋酸钠的水溶液中，使得微球外层的乙烯基被溴化,使其具有初步的核壳结构；4)微球亲水壳层的制备：在浓氢氧化钠(NaOH)的水溶液中加热处理局部溴化的微球，使得微球壳层的溴代基团水解成为羟基(-OH)，使微球的壳层具有很好的亲水性，在分离过程中不会粘黏被分离样品；5)充分溴化微球核内的乙烯基团：把过量的溴素，加入到含有醋酸钠的微球水溶液中，得到充分溴化的微球中间体；4)微球核结构的氨基化：将上述微球中间体以及过量的烷基氨(约10个当量)加入到混合溶液中(水/DMF为2/1，体积比)，充分搅拌，加热过夜，使核内溴基团完全被烷基氨取代，制备具有核壳结构的树脂28。通过后续的清洗步骤，该微球便可以用于不同生物样品的分离提纯。

高分子聚合物多孔微球，树脂28，具有以下特性：1)具有独特的核壳结构；2)平均粒径大小为60微米；3)粒径分布D₉₀/D₁₀<1.5；4)平均孔径约为

蛋白排阻分子量约为700KD；5)核层离子交换当量为229μmol/mL层析介质；6)壳的厚度平均约为3.4μm。

实施例2，树脂31的制备

树脂31的制备步骤与树脂28类似，如上述实施例1中，微球经过以下几步处理：1)环氧基水解反应；2)微球的乙烯基含量的测定；3)微球乙烯基的局部溴化反应；4)微球亲水壳层的制备反应；以及5)微球核内乙烯基团的充分溴化反应，制得初步具有核壳结构的微球中间体，根据需要，微球核内的烷基氨的官能团密度可以通过化学方法调控，树脂31便是根据需要，将微球的核层离子交换当量调至132μmol/mL层析介质。制备树脂31的最后一步反应为微球核结构的氨基化：将上述微球中间体以及烷基氨(约5个当量)加入到含氢氧化钠的混合溶液中(水/DMF为2/1，体积比)，充分搅拌，加热过夜，使得核内溴基团部分被烷基氨取代，而另一部分被氢氧化钠水解。

高分子聚合物多孔微球，树脂31，具有以下特性：1)具有独特的核壳结构；2)平均粒径大小为60微米；3)粒径分布D₉₀/D₁₀<1.5；4)平均孔径约为

蛋白排阻分子量约为700KD，并且可根据需求调节定制；5)核层离子交换当量为132μmol/mL层析介质；6)壳的厚度平均约为3.4μm。树脂31数据详见表1。

实施例3，树脂29的制备

树脂29的制备步骤与树脂28类似，如上述实施例1中，微球经过以下几步处理：1)环氧基水解反应；2)微球的乙烯基含量的测定；3)微球乙烯基的局部溴化反应；4)微球亲水壳层的制备反应；以及5)微球核内乙烯基团的充分溴化反应，制得初步具有核壳结构的微球中间体，根据需要，微球核内的烷基氨的官能团密度可以通过化学方法调控，树脂29便是根据需要，将微球的核层离子交换当量调至109μmol/mL层析介质。制备树脂29的最后一步反应为微球核结构的氨基化：将上述微球中间体以及烷基氨(约1个当量)加入到含氢氧化钠的混合溶液中(水/DMF为2/1，体积比)，充分搅拌，加热过夜，使得核内溴基团部分被烷基氨取代，而另一部分被氢氧化钠水解。

高分子聚合物多孔微球，树脂29，具有以下特性：1)具有独特的核壳结构；2)平均粒径大小为60微米；3)粒径分布D₉₀/D₁₀<1.5；4)平均孔径约为

蛋白排阻分子量约为700KD；5)核层离子交换当量为109μmol/mL层析介质；6)壳的厚度平均约为3.4μm。

表1 Capto^TM Core 700和Monomix Core 60层析介质技术参数对比。

上述实施例1-3中，树脂28，31，29均来自相同的微球，其均具有独特的核壳结构，以及相同的壳层厚度，并且其具有相同的粒径、粒径分布、孔隙结构、机械性能、以及物理化学稳定性等。不同点在于，在一些特定的病毒样品分离过程中，树脂31具有更加适当的烷基氨基官能团密度，其在病毒样品分离以及后续介质清洗过程中，具有更加方便的纯化条件，获得的提纯样品具有更好的收率以及纯度。而树脂28的核内具有更高的官能团密度，层析介质的清洗(CIP)条件更加苛刻，可能会影响了介质的使用寿命，而树脂29的核内具有较低的氨基密度，影响了分离效果，如病毒样品的纯度降低，病毒粗品的上样量较低。针对树脂28，31，29的结果分析，只代表了一些特定病毒样品的分离表现，并不能代表树脂28，31，29在其他分离应用中的表现，其可能在一些特殊要求的生物大分子的分离中会有更加好的应用表现。

文献中和填料厂商资料中报道Capto^TM Core 700推荐使用CIP清洗条件为：1MNaOH in 30％异丙醇的水溶液，并且每次纯化后都需要做CIP清洁。这种CIP工艺使用不方便，影响生产效率；纯化中使用易燃易爆的有机溶剂，有安全隐患。本发明专利中使用经过优化的树脂Monomix Core 60(即树脂31)，CIP条件可以不使用有机溶剂(例如乙醇和异丙醇)，并且没有必要每次上样纯化后都做CIP清洗。

测试实施例

实施例4，NaNO₂保留时间对比实验

Monomix Core 60(即树脂31)和Capto^TM Core 700层析介质分别填装在2.1x50mm的不锈钢色谱柱，对比两种层析介质的NaNO₂保留时间。上样样品为2μL NaNO₂(3.5mg/mL)；缓冲液为A：20mM TRIS,pH 7，B：A+0.5M NaCl；流速为0.30mL/min；Gradient：在10min内0-10％B。

分离过程：以缓冲液A冲洗平衡层析色谱柱；2μL NaNO₂(3.5mg/mL)上样；以表中Gradient(在10min内0-10％B)冲柱子；在214nm紫外光下，检测并记录NaNO₂保留时间；先以缓冲液B，然后缓冲液A冲洗平衡层析色谱柱。使用完色谱柱，将其保存在20％乙醇水溶液中，室温条件保存。

实验结果显示，如图5，Monomix core 60层析柱的NaNO₂保留时间为1.47分钟，Capto^TM Core 700层析柱的NaNO₂保留时间为0.87分钟，该结果表明，相比较Capto^TM Core700介质而言，Monomix core 60介质具有更高的官能团密度。

表2 NaNO₂保留时间测试方法

纯化测试实施例(5-10)

实施例5，病毒样颗粒(VLP)的纯化分离应用例

Monomix Core 60层析介质填装在7.3×100mm的不锈钢色谱柱。上样样品为1个柱体积的病毒样颗粒(VLP)；缓冲液为50mM Tris+0.5M NaCl,pH 7.5；流速为83cm/h；CIP：1.0M NaOH的水溶液。纯化过程如图6所示。

纯化过程：以缓冲液冲洗平衡层析色谱柱；1个柱体积的病毒样颗粒(VLP)上样；以表中缓冲液为50mM Tris+0.5M NaCl,pH 7.5冲柱子，流速为83cm/h；在280nm紫外光下，收集在保留时间30分钟时洗脱的样品，并记录其峰面积；然后以CIP缓冲液(1.0M NaOH的水溶液)冲洗柱子，如图6。使用完色谱柱后，将其保存在20％乙醇水溶液中，室温条件保存。

实验结果表明，以Monomix Core 60层析介质填装的层析柱具有以下特点：

1)可以在流穿模式下收集所需的病毒样颗粒(VLP)，而较小的分子(如DNA和内毒素)则通过弱阴离子交换功能基团(胺基)在核层孔表面上结合，然后在CIP条件下洗脱，达到了分离纯化病毒样颗粒(VLP)的效果。

2)使用该层析介质，其病毒样颗粒(VLP)的回收率>95％,其纯度>93％。

3)以1.0M NaOH的水溶液进行CIP，可对色谱柱进行消毒并再生色谱柱，以进行下一轮纯化。

表3病毒样颗粒(VLP)纯化分离操作条件

设备	Generik FPLC 30
		柱子	Monomix Core 60(7.3×100mm)
流动相	50mM Tris+0.5M NaCl,pH 7.5
		流速	83cm/h
CIP	1.0M NaOH的水溶液
		操作温度	室温
检测	280nm紫外光
		样品	病毒样颗粒(VLP)，80-90nm
注射量	1个柱体积

实施例6，腺病毒的纯化分离应用例

本实施例中使用到实施例2中的Monomix Core 60不锈钢色谱柱，以及相应纯化分离操作条件。上样样品为1个柱体积的腺病毒粗品(5.0×10^11VP/mL，70-80nm)，在流穿模式下收集纯化过的样品。

实验结果表明，以Monomix Core 60层析介质填装的层析柱具有如下特点：

1)可以在流穿模式下收集所需的腺病毒，而较小的分子(如蛋白质、DNA和内毒素)则通过弱阴离子交换功能基团(胺基)在核层孔表面上结合，然后在CIP条件下洗脱，达到了分离纯化腺病毒的效果。

2)使用该层析介质，其腺病毒的回收率>81％,其纯度>85％。

3)以1.0M NaOH水溶液作为CIP的溶液，可对色谱柱进行消毒并再生色谱柱，以进行下一轮纯化。

实施例7，灭活病毒的纯化分离应用例

本实施例中使用到实施例2中的Monomix Core 60不锈钢色谱柱，以及相应的纯化分离操作条件。上样样品为1个柱体积的灭活病毒粗品(约80nm)，在流穿模式下收集纯化过的样品。

实验结果表明，以Monomix Core 60层析介质填装的层析柱具有如下特点：

1)可以在流穿模式下收集所需的灭活病毒，而较小的分子(如蛋白质、DNA和内毒素)则通过弱阴离子交换功能基团(胺基)在核层孔表面上结合，然后在CIP条件下洗脱，达到了分离纯化灭活病毒的效果。

2)使用该层析介质，其灭活病毒的回收率>75％,其纯度>92％。

3)以1.0M NaOH水溶液作为CIP的溶液，可对色谱柱进行消毒并再生色谱柱，以进行下一轮纯化。

实施例8，慢病毒的纯化分离应用例

本实施例中使用到实施例2中的Monomix Core 60不锈钢色谱柱，以及相应的纯化分离操作条件。上样样品为1个柱体积的慢病毒粗品(5.0×10^10VP/mL，约100nm)，在流穿模式下收集纯化过的样品。

实验结果表明，以Monomix Core 60层析介质填装的层析柱具有如下特点：

1)可以在流穿模式下收集所需的慢病毒，而较小的分子(如蛋白质、DNA和内毒素)则通过弱阴离子交换官能团(胺基)在核层孔表面上结合，然后在CIP条件下洗脱，达到了分离纯化慢病毒的效果。

2)使用该层析介质，其慢病毒的回收率>80％,其纯度>89％。

3)以1.0M NaOH水溶液作为CIP的溶液，可对色谱柱进行消毒并再生色谱柱，以进行下一轮纯化。

实施例9，腺相关病毒(AAV)的纯化分离应用例

本实施例中使用到实施例2中的Monomix Core 60不锈钢色谱柱，以及相应的纯化分离操作条件。上样样品为1个柱体积的腺相关病毒(AAV)粗品(约1.0mg/mL，20-25nm)，在流穿模式下收集纯化过的样品。

实验结果表明，以Monomix Core 60层析介质填装的层析柱具有如下特点：

1)可以在流穿模式下收集所需的腺相关病毒，而较小的分子(如蛋白质、DNA和内毒素)则通过弱阴离子交换功能基团(胺基)在核层孔表面上结合，然后在CIP条件下洗脱，达到了分离纯化腺相关病毒的效果。

2)使用该层析介质，其腺相关病毒的回收率>82％,其纯度>86％。

3)以1.0M NaOH水溶液作为CIP的溶液，可对色谱柱进行消毒并再生色谱柱，以进行下一轮纯化。

实施例10，噬菌体病毒(约80nm，等电点<7)的纯化分离应用例

本实施例中使用到实施例2中的Monomix Core 60不锈钢色谱柱。

纯化过程如图7所示：

平衡：以缓冲液(20mM磷酸缓冲盐溶液,pH 6.0)冲洗平衡层析色谱柱,流速为83cm/h；

上样：1个柱体积的噬菌体病毒上样流速为83cm/h；

后平衡：以缓冲液(20mM磷酸缓冲盐溶液,pH 6.0)冲柱子，在280nm紫外光下，收集流穿样品；CIP：3CV 1.0M NaOH的水溶液冲洗柱子。

保存：纯化水冲洗3CV，20％乙醇水溶液冲洗3CV，20％乙醇室温保存。

实验结果表明，以Monomix Core 60层析介质填装的层析柱具有如下特点：

1)可以在流穿模式下收集所需的噬菌体病毒，而较小的杂质分子则通过弱阴离子交换功能基团(胺基)在核层孔表面上结合，然后在CIP条件下洗脱，达到了分离纯化噬菌体病毒的效果。

2)使用该层析介质，其噬菌体病毒的回收率>90％,其纯度>84％。

3)以1.0M NaOH的水溶液作为CIP的溶液，可对色谱柱进行消毒并再生色谱柱，以进行下一轮纯化。该CIP清洗条件未使用异丙醇等有机溶剂，方便客户使用，优于文献报道中Capto^TM Core 700用到的1.0M NaOH 30％异丙醇的水溶液作CIP清洗条件。

表4噬菌体病毒纯化分离操作条件

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种用于纯化分离病毒类抗原的液相色谱法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)提供一层析介质、待分离病毒类抗原、第一缓冲液、第二缓冲液、在线清洗(CIP)溶液；

所述层析介质为合成的亲水高分子聚合物，且具有多孔结构，并且具有2-5层结构；

2)以所述层析介质填装液相色谱设备的色谱柱，得到用于所述方法的液相色谱柱；

3)以所述第一缓冲液冲洗所述液相色谱柱；

4)将所述待分离病毒类抗原在步骤3)所得液相色谱柱上进行上样；

5)以所述第二缓冲液冲洗步骤4)所得液相色谱柱，收集分离产物，得到经分离的病毒类抗原；

6)以所述CIP溶液冲洗步骤5)所得液相色谱柱，收集分离产物，除去所述待分离病毒类抗原中的工艺相关杂质。

2.如权利要求1所述液相色谱法，其特征在于，所述多孔结构用于尺寸排阻分离；且

所述层析介质的至少一个内层和至少一个外层具有不同类型的结合功能基团，或者所述层析介质的至少一个内层和至少一个外层具有相同类型的、不同结合密度的结合功能基团，以使得所述层析介质的至少一个内层和至少一个外层具有不同的层析性能。

3.如权利要求1所述液相色谱法，其特征在于，所述层析介质具有核壳结构。

4.如权利要求1所述的液相色谱法，其特征在于，所述层析介质具有选自下组的一个或多个特征：

1)所述层析介质的比孔容为0.05mL/g-3.0mL/g；

2)所述层析介质的比表面积为40m²/g-1200m²/g；

3)所述层析介质的孔径为

4)所述层析介质的体积平均粒径为1μm-1000μm；

5)所述层析介质的粒径分布(D₉₀/D₁₀)为1.0-2.2。

5.如权利要求1所述的液相色谱法，其特征在于，所述液相色谱柱具有选自下组的一个或多个特征：

1)所述液相色谱柱的核层离子交换当量为100-500μmol/mL层析介质；

2)所述液相色谱柱的线性流速为10cm/h-1000cm/h；

3)所述液相色谱柱的操作压力为≤100bar。

6.如权利要求1所述的液相色谱法，其特征在于，所述待分离病毒类抗原选自下组：病毒、病毒载体、疫苗、病毒样颗粒、或其组合。

7.如权利要求1所述的液相色谱法，其特征在于，步骤4)中，所述待分离病毒类抗原的上样量为1-2个柱体积。

8.如权利要求1所述的液相色谱法，其特征在于，步骤5)中，所述冲洗的流速为10cm/h-1000cm/h。

9.如权利要求1所述的液相色谱法，其特征在于，步骤5)中，所述冲洗的操作压力为≤10bar。

10.一种层析介质的用途，其特征在于，用于纯化分离病毒类抗原的液相色谱法；

所述层析介质为合成的亲水高分子聚合物，且具有多孔结构，并且具有多层结构。

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