CN109647361A - 一种复合型聚合物层析介质的制备方法 - Google Patents

一种复合型聚合物层析介质的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种复合型聚合物层析介质的制备方法，首先将核壳型聚合物微球加入到带有大量电荷的水溶性多胺的去离子水中，搅拌均匀，并保持一定温度和转速进行反应；再选取高分子量中性高分子化合物与聚合物微球在一定温度和转速下进行反应，将其偶联至所述聚合物微球的壳层表面，制备得到表面中性、内部为离子交换基团的复合型聚合物层析介质。该方法制备过程简单、操作步骤少、安全环保，表面能够截留的蛋白粒径范围为20‑400nm，所制备的层析介质可以广泛适用于大部分病毒的中度和精细纯化。

Description

一种复合型聚合物层析介质的制备方法
技术领域
本发明涉及聚合物层析填料技术领域，尤其涉及一种复合型聚合物层析介质的制备方法。
背景技术
复合型层析介质是一类具有双重或多重功能性的纯化填料，可以同时应用多个分离机理来达到更加高效的纯化结果，广泛应用于疫苗研制中的病毒纯化、色谱分离、生物医药等领域。
该类型的层析介质通常是通过偶联具有不同性质的配基来达到亲水或疏水作用或者是通过偶联带有不同电荷的配基来吸附带相反电荷的物质，再通过改变缓冲液pH来使配基和分离物带有正负不同的电荷，当配基与分离物具有相同电荷时形成静电排斥从而达到洗脱与分离等效果。但由于需要具备多种功能，需要偶联带有不同配基的物质或者一种物质上具有不同性质的配基，这使得基质表面需要提供足够多的结合位点，同时配基之间也会产生位阻效应导致不同配基之间的比例无法控制，配基的密度也不是很高；另外在分离不同蛋白时还需要重新选择合适的配基进行偶联，增加了多次制备的成本，应用范围也有局限性。因此针对复合型层析介质亟需开发一种适用范围广、制备方法简单、分离效果好的介质。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合型聚合物层析介质的制备方法，该方法制备过程简单、操作步骤少、安全环保，表面能够截留的蛋白粒径范围为20-400nm，所制备的层析介质可以广泛适用于大部分病毒的中度和精细纯化。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种复合型聚合物层析介质的制备方法，所述方法包括：
步骤1、首先将核壳型聚合物微球加入到带有大量电荷的水溶性多胺的去离子水中，搅拌均匀，并保持一定温度和转速进行反应；
步骤2、再选取高分子量中性高分子化合物与所述步骤1反应后的聚合物微球在一定温度和转速下进行反应，将其偶联至所述聚合物微球的壳层表面，制备得到表面中性、内部为离子交换基团的复合型聚合物层析介质。
在步骤1中，所选用的水溶性多胺包括四乙烯五胺、聚乙烯亚胺或乙二胺。
在步骤1中，所选用水溶性多胺的用量为聚合物微球质量的0.5-10倍。
在步骤1中，反应的温度范围为30-60℃，转速为80-140r/min，反应时间为12-36h。
在步骤2中，所选取的高分子量中性高分子化合物包括醛基化葡聚糖、醛基化聚乙烯醇、醛基化琼脂糖、醛基化纤维素中的一种或多种。
在步骤2中，所选取的高分子量中性高分子化合物的平均分子量范围为1000000-10000000。
在步骤2中，所选取的高分子量中性高分子化合物的质量用量为聚合物微球质量的0.1-5倍。
在步骤2中，进行反应的温度范围为5-25℃，转速为80-140r/min，反应时间为24-48h。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，上述方法制备过程简单、操作步骤少、安全环保，表面能够截留的蛋白粒径范围为20-400nm，所制备的层析介质可以广泛适用于大部分病毒的中度和精细纯化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1为本发明实施例提供的复合型聚合物层析介质的制备方法流程示意图；
图2为本发明所举实施例1中选取小粒径的牛血清蛋白(BSA)测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图；
图3为本发明所举实施例1中选取较大粒径的狂犬免疫球蛋白测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图；
图4为本发明所举实施例2中选取小粒径的牛血清蛋白(BSA)测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图；
图5为本发明所举实施例2中选取较大粒径的狂犬免疫球蛋白测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图；
图6为本发明所举实施例3中选取小粒径的牛血清蛋白(BSA)测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图；
图7为本发明所举实施例3中选取较大粒径的狂犬免疫球蛋白测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图；
图8为本发明所举实施例4中选取的小粒径的牛血清蛋白(BSA)测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图；
图9为本发明所举实施例4中选取较大粒径的狂犬免疫球蛋白测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明实施例所述方法适用于核壳结构聚合物微球，在微球内外表面引入离子配基起到离子交换作用，再将壳层表面进行中性化处理达到类似凝胶过滤的作用，即制备出凝胶过滤/离子交换双重功能的复合型层析介质。下面将结合附图对本发明实施例作进一步地详细描述，如图1所示为本发明实施例提供的复合型聚合物层析介质的制备方法流程示意图，所述方法包括：
步骤1、首先将核壳型聚合物微球加入到带有大量电荷的水溶性多胺的去离子水中，搅拌均匀，并保持一定温度和转速进行反应；
在该步骤中，所选用的水溶性多胺包括四乙烯五胺、聚乙烯亚胺或乙二胺等多胺类，凡是能和环氧基反应的水溶性多胺类皆可；且所选用水溶性多胺的用量为聚合物微球质量的0.5-10倍。
上述反应的温度范围为30-60℃，转速为80-140r/min，反应时间为12-36h。
具体实现中，反应完后可以进行抽滤洗涤除去未反应的残留物。
步骤2、再选取高分子量中性高分子化合物与所述步骤1反应后的聚合物微球在一定温度和转速下进行反应，将其偶联至所述聚合物微球的壳层表面，制备得到表面中性、内部为离子交换基团的复合型聚合物层析介质。
在该步骤中，所选取的高分子量中性高分子化合物包括醛基化葡聚糖、醛基化聚乙烯醇、醛基化琼脂糖、醛基化纤维素中的一种或多种；且所选取的高分子量中性高分子化合物的平均分子量范围为1000000-10000000，其质量用量为聚合物微球质量的0.1-5倍。
具体实现中，进行反应的温度范围为5-25℃，转速为80-140r/min，反应时间为24-48h。同时，在反应完后可以进行抽滤洗涤除去未反应的残留物。
下面以具体的实例对本发明的方法及材料作进一步说明：
实施例1、
1)偶联离子配基
称取核壳型聚合物微球(以甲基丙烯酸缩水甘油酯与乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚微球，PGMA-EDMA)和四乙烯五胺，其质量比为2：1，加入到100mL的去离子水中，搅拌至混合均匀，放到摇床上调整温度为30℃、转速为80r/min进行反应，反应时间为12h，反应完成后抽滤洗涤除去未反应的残留物；
2)核壳微球表面中性化
称取醛基化琼脂糖(Mw＝1000000)和步骤1)中所得微球，其质量比为1：10，将二者放入100mL去离子水中，混合均匀放到摇床上调整温度为5℃、转速为80r/min、反应24h，即制成复合型聚合物微球，最后用去离子水和乙醇依次进行抽滤洗涤除去未反应的残留物。
再将所制得的微球在70℃烘箱中干燥后，用扫描电子显微镜观察其粒径大小及孔径结构、液相色谱考察核壳结构以及蛋白载量的性能，通过显微镜观察可知：表面并没有明显的孔道结构，壳层表面孔道稀疏且孔径很小。
如图2所示为本发明所举实施例1中选取小粒径的牛血清蛋白(BSA)测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图，可以发现BSA大部分进入到孔道里并且洗脱下来，而没有进到孔道里的蛋白是由于BSA中含有杂蛋白且粒径较大被阻挡在孔外直接流穿出来了。
如图3所示为本发明所举实施例1中选取较大粒径的狂犬免疫球蛋白测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图，可以发现狂犬免疫球蛋白大部分被阻挡在孔外直接流穿出来，而只有少部分蛋白进入到孔道里并被洗脱下来，这是由于狂犬疫苗中除了狂犬免疫球蛋白还含有一些小粒径的杂蛋白能够进入到孔道里；通过液相色谱图验证了壳层结构具备截留固定范围分子量的能力，核心结构具备吸附蛋白的能力。
实施例2、
1)偶联离子配基
称取核壳型聚合物微球(PGMA-EDMA)和聚乙烯亚胺，其质量比为1：3，加入到100mL去离子水中，搅拌至混合均匀，放到摇床上调整温度为40℃、转速为100r/min进行反应，反应时间为20h，反应完成后抽滤洗涤除去未反应的残留物；
2)核壳微球表面中性化
称取醛基化葡聚糖(Mw＝4000000)和步骤1)中所得微球，其质量比为2：1，将二者放入100mL去离子水中，混合均匀放到摇床上调整温度为10℃、转速为100r/min、反应30h，即制成复合型聚合物微球，最后用去离子水和乙醇依次进行抽滤洗涤除去未反应的残留物。
再将所制得的微球在70℃烘箱中干燥后，用扫描电子显微镜观察其粒径大小及孔径结构，可以看到表面并没有明显的孔道结构，壳层表面孔道稀疏且孔径很小。
如图4所示为本发明所举实施例2中选取小粒径的牛血清蛋白(BSA)测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图，可以发现BSA几乎全部进入到孔道里并且洗脱下来。
如图5所示为本发明所举实施例2中选取较大粒径的狂犬免疫球蛋白测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图，可以发现狂犬免疫球蛋白大部分被阻挡在孔外直接流穿出来，而只有少部分蛋白进入到孔道里并被洗脱下来，这是由于狂犬疫苗中除了狂犬免疫球蛋白还含有一些小粒径的杂蛋白能够进入到孔道里；通过液相色谱图验证了壳层结构具备截留固定范围分子量的能力，核心结构具备吸附蛋白的能力。
实施例3、
1)偶联离子配基
称取核壳型聚合物微球(PGMA-EDMA)和乙二胺，其质量比为1：6，加入到100mL去离子水中，搅拌至混合均匀，放到摇床上调整温度为50℃、转速为120r/min进行反应，反应时间为30h，反应完成后抽滤洗涤除去未反应的残留物；
2)核壳微球表面中性化
称取醛基化纤维素(M＝6000000)和步骤1)中所得微球，其质量比为3：1，将二者放入100mL去离子水中，混合均匀放到摇床上调整温度为15℃、转速为120r/min、反应40h，即制成复合型聚合物微球，最后用去离子水和乙醇依次进行抽滤洗涤除去未反应的残留物。
再将所制得的微球在70℃烘箱中干燥后，用扫描电子显微镜观察其粒径大小及孔径结构，可以看到表面并没有明显的孔道结构，壳层表面孔道稀疏且孔径很小。
如图6所示为本发明所举实施例3中选取小粒径的牛血清蛋白(BSA)测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图，可以发现BSA大部分进入到孔道里并且洗脱下来，而没有进到孔道里的蛋白是由于BSA中含有杂蛋白且粒径较大被阻挡在孔外直接流穿出来了。
如图7所示为本发明所举实施例3中选取较大粒径的狂犬免疫球蛋白测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图，可以发现狂犬免疫球蛋白大部分被阻挡在孔外直接流穿出来，而只有少部分蛋白进入到孔道里并被洗脱下来，这是由于狂犬疫苗中除了狂犬免疫球蛋白还含有一些小粒径的杂蛋白能够进入到孔道里；通过液相色谱图验证了壳层结构具备截留固定范围分子量的能力，核心结构具备吸附蛋白的能力。
实施例4、
1)偶联离子配基：
称取核壳型聚合物微球(PGMA-EDMA)和聚乙烯亚胺，其质量比为1：10，加入到适量的去离子水中，搅拌至混合均匀，放到摇床上调整温度为60℃、转速为140r/min进行反应，反应时间为36h，反应完成后抽滤洗涤除去未反应的残留物；
2)核壳微球表面中性化
称取醛基化聚乙烯醇(Mw＝10000000)和步骤1)中所得微球，其质量比为5：1，将二者放入100mL去离子水中，混合均匀放到摇床上调整温度为25℃、转速为140r/min、反应48h，即制成复合型聚合物微球，最后用去离子水和乙醇依次进行抽滤洗涤除去未反应的残留物。
然后将所制得的微球在70℃烘箱中干燥后，用扫描电子显微镜观察其粒径大小及孔径结构，可以看到表面并没有明显的孔道结构，壳层表面孔道稀疏且孔径很小。
如图8所示为本发明所举实施例4中选取的小粒径的牛血清蛋白(BSA)测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图，可以发现BSA几乎全部进入到孔道里并且洗脱下来。
如图9所示为本发明所举实施例4中选取较大粒径的狂犬免疫球蛋白测试复合型核壳微球的截留效果以及吸附载量的色谱评价示意图，可以发现狂犬免疫球蛋白大部分被阻挡在孔外直接流穿出来，而只有少部分蛋白进入到孔道里并被洗脱下来，这是由于狂犬疫苗中除了狂犬免疫球蛋白还含有一些小粒径的杂蛋白能够进入到孔道里；通过液相色谱图验证了壳层结构具备截留固定范围分子量的能力，核心结构具备吸附蛋白的能力。
值得注意的是，本发明实施例中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
综上所述，本发明实施例所述方法首先通过向核壳型聚合物微球上偶联带正电荷阳离子配基，通过选取不同分子量的高分子聚合物和调控反应时间来控制偶联配基密度，从而使微球内外表面具备了离子交换功能；接着通过表面偶联高分子量水溶性高分子，从而微球表面中性，形成惰性的壳层，与凝胶过滤功能相似具备了只截留特定分子量物质的功能。上述方法操作步骤简单、反应容易控制、设计思路巧妙，所用试剂成本低、绿色环保，同时该微球所制成的层析介质适用范围广，分离纯化效率高，表面还有未结合的位点可以继续修饰其他配基来拓展其他功能。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种复合型聚合物层析介质的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1、首先将核壳型聚合物微球加入到带有大量电荷的水溶性多胺的去离子水中，搅拌均匀，并保持一定温度和转速进行反应；
步骤2、再选取高分子量中性高分子化合物与所述步骤1反应后的聚合物微球在一定温度和转速下进行反应，将其偶联至所述聚合物微球的壳层表面，制备得到表面中性、内部为离子交换基团的复合型聚合物层析介质。
2.根据权利要求1所述的复合型聚合物层析介质的制备方法，其特征在于，在步骤1中，所选用的水溶性多胺包括四乙烯五胺、聚乙烯亚胺或乙二胺。
3.根据权利要求1所述的复合型聚合物层析介质的制备方法，其特征在于，在步骤1中，所选用水溶性多胺的用量为聚合物微球质量的0.5-10倍。
4.根据权利要求1所述的复合型聚合物层析介质的制备方法，其特征在于，在步骤1中，反应的温度范围为30-60℃，转速为80-140r/min，反应时间为12-36h。
5.根据权利要求1所述的复合型聚合物层析介质的制备方法，其特征在于，在步骤2中，所选取的高分子量中性高分子化合物包括醛基化葡聚糖、醛基化聚乙烯醇、醛基化琼脂糖、醛基化纤维素中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的复合型聚合物层析介质的制备方法，其特征在于，在步骤2中，所选取的高分子量中性高分子化合物的平均分子量范围为1000000-10000000。
7.根据权利要求1所述的复合型聚合物层析介质的制备方法，其特征在于，在步骤2中，所选取的高分子量中性高分子化合物的质量用量为聚合物微球质量的0.1-5倍。
8.根据权利要求1所述的复合型聚合物层析介质的制备方法，其特征在于，在步骤2中，进行反应的温度范围为5-25℃，转速为80-140r/min，反应时间为24-48h。
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