JPS61501310A - 高分子の分配クロマトグラフイ−用相支持体、それらの製造方法およびそれらの用途 - Google Patents
高分子の分配クロマトグラフイ−用相支持体、それらの製造方法およびそれらの用途Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
高分子の分配クロマトグラフィー月相支持体、それらの製造方法およびそれらの
用途本発明は、特に水性ポリエチレングリコール/デキストラン2相系((おけ
る、高分子の分配クロマトグラフィー月相支持体、それらの製造方法およびそれ
らの用途に関する。
生物学的高分子、細胞レベル以下の構成巣位、細菌および真核細胞全水性?リエ
チレングリコール/7′キストラン系での向流分配により分離することができる
ことは知られている( P、 X、 Alberston (ビー・オー・アル
ペルストン) ”’ Partition of Ce1l Particle
s and Macromolecules(パーティンヨ、ン・オプ・セル・
パーティクルズ・アンド・マクロモレキュールズ)”(1971年) 第2版、
Almquist (アルムキスト)およびWiksell (ヴイクセル)、
ストックホルム〕。しかしながらこれらの向流分配段階装置的に極めて複雑であ
り、また特:τ、分配係数が小さい場合であって目的とする分離?達成するのに
多数の向流分配段階を必要とするときは、時間がかかる。それ故に、この向流分
配性全分配クロマトグラフィー法で置き換えようとする試みが既になされている
。何故ならこのようにすれば多数の分離段階全相当1度に一段と容易に達成する
ことが可能だからである。しかしながらこれらの試みは、静止相に適した支持体
が無いためにこれまで失敗している。
従来は、デキストランが豊富な静止相用支持体としてセルロースを用いた水性、
j? IJエチレングリコール/デキストラン系で2本鎖核酸をクロマトグラフ
ィーにより分離できるにすぎなかつfc (W、 Miller (グプリュー
・ミニーシー)、H,J 、 5chuetz(エイチ・・ゾx−−シzンツ)
、C、Guerrier −Takada (シー・グエリアー高田)、P、E
、Co1e(ピー・イー・コール)お工びR,Potts (アール・ポソツ)
、 Nucleic Ac1ds Re5earch (ヌクレイツク・アン
ズ・リサーチ)、第7巻、第8号(1979年)、第2485〜およびG、Kf
itemeier (ノー・′#コーチマイエル)、Eur 。
J、Biochem、 (5−0−ヒフ 7− )ヤ−fk ・オf □ ハ(
オケミストリー)第128巻(1982年)、第231〜258頁〕。DNA断
片の液/iクロマトグラフィーのこれら研究において、その水性ポリエチレング
リコール/デキストラン系のデキストランが豊富な相に用いられる支持体材料に
は多くの材料があるが、そのうち特にセルロースシエデキストランが豊富な相に
対し十分な親和性を示すことから適切であることが判っている。しかしながら、
これらの相支持体:′f、タンパク成分およびタンパク含有細抱構底底分にはこ
れら成分の著しい吸着特性のえめに使用することができない。吸着によって生じ
る問題の結果はリダ該酸の場合にも生じる。多糖5に基づく陽イオン性ま几は陰
イオン性ゲル(エセルロースト同様にデキストランが豊富な相全結合するがそれ
らは、インクラチック(1socratic )な分離方法に使用できるにすぎ
ない。
何故ならば、その相(ヱポリエチンンが豊富な移動相中の各埋置による濃度勾配
溶出の過程で相電位が変化するや否や排斥されるからである。
この型の分配クロマトグラフィーのための潜在的相支持体として用いるのに適当
と思われる中性ゲルの中にはビニール化合物に基づく多孔質共重合体〔グルムシ
ュタソト市のメルク社製フラクトゲルズ(Fractogels ) )および
ポリアクリルアミドゲル(Biorad社製パイオゲルズ(Biogels )
)がある。前者は一般的に用いられるデキストラン相の量全結合するのが少な
すぎ、一方後者の場合には結合相が高分子にほとんど接することができない。
この事情は前記引用文献(Eur 、 J 、 Bio、chem、第128巻
(1982年) 、第26己頁〕においても明確に強調されている。この結合相
の近接不能はポリアクリルアミド/アガロース組合せゲル〔例えばIDF (ア
イ・ディー・エフ)g AcA−Ultrogels (−1−イ・X7−−
エイーウル) Oゲルス)〕にもあてはまる。
従って本発明の目的(工、高分子の分配クロマトグラフィーiC>いて普遍的な
利用分野全盲し、そして優れた分離全容易に可能にし、製造しやすく、ま之細胞
レベル以下の構成単位3よび全細胞に対するのと同様、低分子および高分子のリ
セ該酵の分離:て適している(そしてこのこと11特にウィルス研究2:びウィ
ロイド研究に極めて重要でちる)相支持体を提供することにある。
今般、これらの目的は、表面が、分配クロマトグラフィーのための相系における
相のうちの一つに親和性を有し堅固な付着性?有する材料で被覆された基本支持
体粒子よりなる相支持体により達成できることを見出した。
すなわち1本発明は、主要な請求の範囲に特定された相支持体に関する。従属の
請求の範囲は本発明のこの主題の特に好ましい態様2−びこれらの相支持体の製
造方法およびそれらの使用に関する。
従って本発明は、高分子、特に単鎖核酸および特にタン・!りならびに細胞レベ
ル以下の構成単位および全細胞の分配クロマトグラフィーのための相支持体であ
って、この相支持体が相系に不溶性であって7〜2000μ口の範しそして分配
クロマトグラフィーのための相系の相のうちの一つに親和性全盲する材料で被覆
されている非吸着性基本支持体粒子よりなる分配クロマトグラフィーのための相
支持体に関する。
本発明O相叉持体の場合には、基本支持体粒子は、複数の相のうちの一つ、特に
ポリエチレングリコール/デキストラン2相系のデキストラン相に親和性を有し
堅固に付着する材料で被覆されるが、その結果、デキストラン相はこれら組合せ
粒子の表面に必然的に結合され、その念めに全細胞の寸法にいたるまでの極めて
大きな分子に対してさえも接触できる。他方において、基本支持体粒子は相支持
体の所要の機械的安定性を確保する。
本発明の好ましい態様によれば、基本支持体粒子は、無磯質および(または)有
機質の材料、例えば酸化アルミニウム、けい酸塩、けい藻土、シリカゲル、セル
ロース、セルロース誘導体、架橋デキストラン、架橋アがロース、またはアクリ
ル酸、アクリルアミド、アクリル酸エステル、アクリロニトリル、メタクリル酸
、メタクリルアミド、メタクリル酸エステル、メタクリレートリルおよび(また
は)ビニール化合物などの単量体またはこれら単量体の混合物に基づく重合体ま
たは共重合体などよりなる。基本支持体粒子がヒドロキシル化された形のこれら
前掲の材料よりなるのが特に好ましい。何故ならば、このようにすれば、表面層
全基本支持体粒子に困難全件うことなく堅固に付着させ、特に表面層の材料と基
本支持体粒子の材料との間に化学的結合?達成することができる。
ジオール−置換されたシリカゲル、親水性化されたポリメタクリレート、デンプ
ン様被覆で有するシリケートまたはビニール化合物に基づく多孔質重合体から構
成された基本支持体粒子を用いるのが特に有利である。
本発明の相支持体の基本支持体粒子は7〜100μm、特に10〜50μmの平
均粒度金有しているのが特に有利である。
本発明の更なる好ましい態様によれば、基本支持体粒子は、特に有利にはその基
本支持体粒子の材料に化学的に連結される重合体材料で被覆される。この点に関
し、基本支持体粒子全単量体成分をこの基本支持体粒子上にグラフトすることに
より形成される合成重合体または共重合体で被覆するのが特に有利であることが
判明した。
この目的には、グラフト化されたポリアクリルアミドおよび特に線状のまたはわ
ずかに架橋されたポリアクリルアミドが所望の分離効果に極めて適していること
が判明した。
本発明はまた、前述の型の基本支持体粒子全表f層の形で適用される重合体材料
に化学的に結合することよりなる、この相支持体の製造方法にも関する。これは
、好ましくは、グラフト重合により基本支持体粒子に重合体材料の表面層音節す
ことにより行うのが好ましい。
この方法の好ましい態様によれば、前掲の型のヒドロキシル化された材料から構
成された基本支持体粒子全単量体(一種または複数種)を含む溶液に懸濁し、そ
の後、酸素を排除してのレドックス重合の過穆で重合体材料のグラフト全行う。
この方法ではセリウム(Mイオン全重合触媒として有利に用いることができる。
何故ならば、この物Xは基本支持体粒子の表!のみでの重合?促進するフリーラ
ジカル全形成し、それ故に重合がグラフト重合の形で起きるからである。この自
体知られた方法の詳細Icツいては、G、Mino (ノー・ミノ)およびS、
Kaizerman(ニス・カイセルマ:y ) 、the Journal
of Polymer 5c1ence(デ・ツヤ−ナル・オプ・Iリマー・
サイエンス)、第XXXI巻、第12号(’1958年)、第242〜243頁
全参照するとよい。
前記方法のこの実施方式において、表面層として好ましいポリアクリルアミドの
形成に用いられるアクリルアミドは水溶液の形で用いるのが好ましい。
前述のセリウム(財)イオンの存在下にレドックス重合を行う際に、注意深く酸
素を排除しながらアクリルアミPのグラフト重合を行えば基本支持体粒子上に3
0〜240分のうちに、水性ポリエチレングリコール/7′キストラ −ン系で
の分配クロマトグラフィーにとって十分な蚤のデキストラン相を結合するのに十
分な、十分濃密なポリアクリルアミド層が生成されることを見出した。
特定例で挙げれば、次の支持体に首尾よくポリアクリルアミP層金施すことがで
きた。
Paarmacia (ファルマシア)社製架橋アガロース、粒度25〜40μ
m
r Lichrosorb (リ クロソルブ)(商標名)」−ジオール:Me
rck (メルク)社製ジオール置換シリカゲル、粒度10 μm
r 5eparon Hema (セパロン・ヘマ)1000(商原名)」ニブ
ラバ市のLaboratory 工nstruments Works (ラボ
ラトリ−・インスソルメンツーウオークス)製の親水性化されたポリメタクリレ
ート、粒度16〜21μmrTSK−8IL (ティーエスケー・ノル)300
0 C商標名)」:東洋曹i裂デングン様被覆を持つシリケート支持体、粒度1
0μID(特にLKB (エル・ケー・ビー)製「ブルー・カラム」に含まれる
)
rTSK(テイーエスケー)−3(エッチ・ダブりニー) −40(S)(商標
名)−55(Si、−65(S)および−75(SIJ:ビニール化合物、こ基
づく多孔質共重合体、1ミリ当ユOH/?、東洋曹達社製、Merck (メル
ク)社よりr FractOgels (フラストゲルズ)」として入手可能、
粒度25〜40μ口
本発明による相支持体)ま低分子および高分子のIJ d核酸、二本鎖該酸、細
胞レベル以下の構成単位および全細胞の分離に適し、したがってそれらは粗製植
物抽出液からのウィロイド−FL1=lAの単離および細胞レベル以下の得双呈
位お:び全細胞のクロマトグラフィーによる分離、特に治療−診断目的に使用で
きることを見出した。
従って、本発明1工また、例えばP、又−Albartson (ビー・オー・
アルベルトソン)のr Partition of Ce1l Particl
esapd Macrosolecules (/′P−ティジョン・オプ・セ
ル・パーティクルズ・アンド・マクロモレキュルズ)j (1971年)、第2
版、Almquist (アルムキスト)およびWikS6111 (ダイク1
ル)、ストックホルム市、第18〜30頁)に記載されているような、重合体に
基づく水性の2相系および多相系、特、C水性ポリエチレングリコール/デキス
トラン2相系での高分子、生物系高分子、細胞レベル以下の構成単位および全線
、胞の分配クロマトグラフィーへの前記定義に係る相支持体の使用にも関する。
次の実施例は本発明を更に説明する念めのものでちる。
実施例 1
この実施例は本発明の相支持体の裂造例である。
ガス導入管、瀾下漏斗および真空接続具全備えt三頌フラスコに507のアクリ
ルアミFの蒸留水50ロゴ中の溶’t’5. を入れ、そして10μmv粒度?
有するノオール置換され之シリカゲル(Merck (メルク)社製の12 ”
3名Lichrosarb−Dior (リ り ロソルプーノオール)〕から
講成される2070基本支持体粒子をこの溶液に、懸濁する。そのフラスコを次
に5分間再n W窒素でフラッシュしそして排気し、そして再び2累で満たす。
これら排気および窒素充満の措置全2回繰返しt後、1N硝酸中の硝酸てリウム
(MアンモニウムのCL2M溶Vt攪拌しながら添加する。その3濁液I′c6
0分間窒素?徳やかに攪拌しながら通じると、その間にセリウム(Mイオンの黄
色強度が著しく低下する。次に更ンζ207の基本支持体粒子上空気?入れた状
態でその懸濁筬に添加し、そして混合後、懸濁ty、f Blauband (
プラオパント)フィルタ(5chleicher &Schα11(シュラ・イ
ヘル・ラント・ジュール) 社Ji 589’ )全通して加圧濾過する。40
0.屁の蒸留水で洗浄後、残留物全カコノル醪塩援5徹(カコノル酸ナトリウム
10mM /エチレンノアミン四酢酸1mM、pH=6)中の酢酸ナトリウム0
.2 M溶液約400m1で洗浄する。
前記に2いて特記され念材料から構成される基本支持体粒子には同様−てしてポ
リアクリルアミド層が施されるが、ポリアクリルアミド・被覆支持体の未被覆材
料による前述の希釈全行うことが必要である。「リクロンルブ(商標名)」から
構成される基本支持体粒子の場合には、この希釈は、被覆材料t濾過可能にし、
従ってデキストラン相による被覆全促進させるために必要である。
実施例 2
本発明の相支持体の分離特性全示すために、比較試験全行い本発明の相支持体金
、本発明の適宜の相支持体の基本支持体粒子だけからなる相支持体と対比し友。
それら相支持体をまず次のようにしてポリエチレングリコール/デキストラン系
のデキストラン相で被覆した。
前記洗浄済みの材料全圧力フィルタ中、37℃でポリエチレングリコール/デキ
ストラン系C66−39のデキストランT500および5.42のポリエチレン
グリコール800C1実施例1に記載のカコノル竣塩僚衝液中のQ、2M酢酸ナ
トリウム42a3mJK溶解することにより調製される)のデキストラン相2.
5容ですすいだ後、相過剰分?同じ系(′52のデキストラT500,71.7
9のポリエチレングリコール800111前記カコノル酸塩緩衝液中の0.2M
酢酸ナトリウム925.3 、qlに溶解することにより調装される)の4リエ
チレングリコールに冨む上相で洗浄することにより抽出した。材料全3容の上相
に忍濁後、このようにして得られた相支持体士37℃に恒温&l制御された加熱
ノヤケソト全備えた適当なりロマトグラフィー管に注ぎ込んだ。
次に、一方ではこのようにしてデキストラ/相?備えた未被覆の基本支持体粒子
、他方では本発明の相支持体の分離特性を、転移−RNA(tRNA)および5
sRNAの混合物に基づく試料を用いて検討した。これら2つのRNA成分は可
溶性り〆核酸のカテゴリーに属しま几次の特性を有する。
tRNA :分子全室30,000、アミノ酸アクセプタ活性の異なる等サイズ
の40〜60種よりなる。
5sRNA:分子1言43,000、RIJA塩基配列のアミノ酸配列への合成
に役割全盲する、大抵の生物における一元性RNA 。
分離)工、6.20重量%のデキストラン、4.40重量%のポリエチレングリ
コールおよび8940重量%の水から構成されるビリ、エチレングリコール/デ
キストラン系「D」で行うが、その下相は13.25重量%のデキストラン、1
.07重量%のポリエチレングリコールおよび85.68ii量チの水よりなり
、そして上相はa30重量%のデキストラン、117重量%のポリエチレングリ
コールおヨヒ92.53重量−の水よりなる〔この、および同様のポリエチレン
グリコール/デキストラン系は前掲p、L Albertson(ビー・オー・
アルベルトソン)の引用文献(特に第264頁の相ダイアグラム参照)から知ら
れる〕。このポリエチレングリコール/デキストラン2相系では、分配係数は特
にイオン組成′に、よりすなわち様々な塩の添加により影響?受けることがあり
、リチウムイオンは分配係数に全高める一方他のアルカリ金属陽イオンは反対の
効果?及ぼす。
従ってここで行う分離においては、次の電解質金相の対に用いる。
105Mカコノル戯ナトリウム緩衝液(pH+工6.0)3コMアノ化ナトリウ
ム
1 mMエチレンノアミン四酢酸ナトリウム、お工びcL2M酢酸ナトリウム
分離は37℃で恒温制御されたクロマトグラフィー・カラムで行う。
試料の量は、0D254単位、すなわち254 nmの波長での光学密度として
示され、250D254単位は1119のRNA疋相当する。
これらの分離で得られた結果を第1〜6図に示すが、これらの図はそれぞれ次の
もの全表わす。
第1図 比較試験:10個の0D254試料について、ポリアクリルアミドで被
覆されていない「リクロソルプーノオール」の基本支持体粒子全充填したカラム
で行ったクロマトグラフィー。カラム容量:55m;流速:18rfLl/時;
第2図 不発明による試験二色素を含有する50個の0D254試料金「リクロ
ンルプーノオール」から構成されたポリアクリルアミドで被覆された基本支持体
粒子を充填したカラムで分離。カラム容量:a4d:流速:15rnt/時;
第5図 比較試験:19個0OD254試料について、「スにローゼ」から構成
された基本支持体な子で被覆された(?)カラムで行ったクロマトグラフィー。
カラム容量:iQm/;流速:9ゴ/時;
第4図 3発明による試験:50個の0D254試料について、ポリアクリルア
ミドで被覆された「スペロース」粒子全元項したカラムで分離。カラム容量:6
0m1:流速:20プ/時;
第5図 比較試験:35個の0D254試料について、rTsK−Hw−40(
S) Jから構成される基本支持体粒子を充填したカラムで行ったクロマトグラ
フィー。カラム容量:65プ;流速:15m//時;
第6図 本発明による試験:35個の○D254試料について、Iリア、クリル
アミドで被覆されたr TSK−Hw−40(SIJ基本支持体粒子全充填した
カラムで分離。カラム容量:ssy;流速:15m11時。
前記の図より、被覆されていない基本支持体粒子を含むカラムに比較して、本発
明の相支持体により、使用した分離混合物の成分を驚く程きれいに分離できるこ
とがわかる。いずれにせよ、本発明の相支持体は生物学的高分子の分離に意外な
程に有”利な安定性を有しくこのことを工全く予期できなかったことである)、
また分離法および治療−診断法に極めて有利に使用できることは、このように明
らかである。
ANNEX To 1:dX DJTERIJATXONAr、5EARC:!
REPORT 0NrNTERNAT工0NAL MPLrCATrON N
o、 PCT/EF 8500054 (SA 13926)
Claims (17)
- 1.高分子の分配クロマトグラフイー用の相支持体であつて、相系に不溶性であ つて7〜2000μmの範囲に平均粒度を有し、表面が、相系に不溶性であり堅 固に付着しそして分配クロマトグラフイーのための相系の相のうちの一つに親和 性を有する材料で被覆されている非吸着性基本支持体粒子を含むことを特徴とす る、相支持体。
- 2.基本支持体粒子が無機質および(または)有機質材料よりなる、請求の範囲 第1項記載の相支持体。
- 3.基本支持体粒子が酸化アルミニウム、シリケート、けい藻土、シリカゲル、 セルロース、セルロース誘導体、架橋デキストラン、架橋アガロース、あるいは またアクリル酸、アクリルアミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸、メタク リルアミド、メタクリル酸エステルおよび(または)ビニール化合物またはこれ ら単量体の混合物の重合体または共重合体よりなる、請求の範囲第2項記載の相 支持体。
- 4.基本支持体粒子がヒドロキシル化された形の前記の材料よりなる、請求の範 囲第3項記載の相支持体。
- 5.基本支持体粒子がジオール置換されたシリカゲル、親水性化されたポリメタ クリレート、デンプン様被覆を有するシリケートまたはビニール化合物に基づく 多孔質重合体から構成される、請求の範囲第4項記載の相支持体。
- 6.基本支持体粒子が7〜100μm、好ましくは10〜50μmの平均粒度を 有する、請求の範囲第1〜5項のいずれかに記載の相支持体。
- 7.基本支持体粒子が重合体材料で被覆されている、請求の範囲第1〜6項のい ずれかに記載の相支持体。
- 8.重合体材料が基本支持体粒子の材料に化学的に連結されている、請求の範囲 第1〜7項のいずれかに記載の相支持体。
- 9.基本支持体粒子が単量体成分を前記基本支持体粒子上にグラフトすることに より形成される合成重合体または共重合体で被覆される、請求の範囲第8項記載 の相支持体。
- 10.基本支持体粒子がグラフトされたポリアクリルアミドで被覆される、請求 の範囲第9項記載の相支持体。
- 11.基本支持体粒子がグラフトされた線状のまたはわずかに架橋されたポリア クリルアミドで被覆される、請求の範囲第10項記載の相支持体。
- 12.基本支持体粒子を表面層の形で適用される重合体材料に化学的に連結する ことよりなる請求の範囲第1〜11項のいずれかに記載の相支持体の製造方法。
- 13.基本支持体粒子に、グラフト重合により、重合体材料よりなる表面層を施 すことよりなる、請求の範囲第12項記載の方法。
- 14.ヒドロキシル化された材料から構成される基本支持体粒子を単量体(一種 または複数種)を含む溶液に懸濁し、そして重合体材料のグラフトを酸素を排除 したレドックス重合の過程で行う、請求の範囲第13項記載の方法。
- 15.セリウム(IV)イオンを重合触媒として用いる、請求の範囲第14項記 載の方法。
- 16.水性溶液としてのアクリルアミドを単量体として用いる、請求の範囲第1 3〜15項のいずれかに記載の方法。
- 17.請求の範囲第1〜11項記載の相支持体の、特に水性ポリエチレングリコ ール/デキストラン2相系における、高分子、生物的重合体、細胞レベル以下の 構成単位および全細胞の分配クロマトグラフィーによる分離への使用。
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