CS259875B2 - Phase carrier for distributing chromatography and method of its production - Google Patents

Phase carrier for distributing chromatography and method of its production Download PDF

Info

Publication number
CS259875B2
CS259875B2 CS851471A CS147185A CS259875B2 CS 259875 B2 CS259875 B2 CS 259875B2 CS 851471 A CS851471 A CS 851471A CS 147185 A CS147185 A CS 147185A CS 259875 B2 CS259875 B2 CS 259875B2
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
phase
carrier
dextran
cross
chromatography
Prior art date
Application number
CS851471A
Other languages
English (en)
Other versions
CS147185A2 (en
Inventor
Werner Muller
Heinz L Sanger
Original Assignee
Merck Patent Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent Gmbh filed Critical Merck Patent Gmbh
Publication of CS147185A2 publication Critical patent/CS147185A2/cs
Publication of CS259875B2 publication Critical patent/CS259875B2/cs

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/327—Polymers obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/30—Partition chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28004—Sorbent size or size distribution, e.g. particle size
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/321—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
    • B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
    • B01J20/3219—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond involving a particular spacer or linking group, e.g. for attaching an active group
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3278—Polymers being grafted on the carrier
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/328—Polymers on the carrier being further modified
    • B01J20/3282—Crosslinked polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3287—Layers in the form of a liquid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3289—Coatings involving more than one layer of same or different nature
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/58—Use in a single column
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/803—Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding

Description

Vynález se týká nosiče fází pro rozdělovači chromatografii makromolekul ve dvoufázovém vodném systému polyethylenglykoldextran a způsobu jeho výroby.
Je známo, že biologické makromolekuly, subcelulární jednotky, bakterie a eukaryotické buňky lze oddělovat protiproudovým dělením ve vodném systému polyethylenglykol-dextran (P. A. Albertson „Partition of Cell Particles and Macromolecules“, 1971, druhé vydání, Almquist a Wiksell, Stockholm). Způsoby tohoto protiproudového dělení jsou ale nyní mimořádně nákladné jak aparaturně, tak i časově, zejména když při malých rozdělovačích koeficientech je zapotřebí velkého množství stupňů protiproudového dělení к tomu, aby se dosáhlo požadovaného rozdělení. Byly proto již prováděny pokusy nahradit tento proces protiproudového dělení způsobem rozdělovači chromatografie, protože takto je možné podstatně jednodušeji dosáhnout množství dělicích stupňů. Tyto pokusy však zatím ztroskotávaly, protože nebyly vhodné nosiče pro stacionární fázi.
Zatím mohly být chromatograficky děleny jenom dvouretězcové nukleové kyseliny ve vodném systému polyethylenglykol-dextran za použití celulózy jako nosiče pro dextranem bohatou stacionární fázi (W. Muller, H. J. Schuetz, C. Guerrier-Takada, P. E. Cole a R. Potts, Nucleic Acids Research, vol. 7, č. 8, 1979, 2 483 až 2 499, a W. Milller a G. Kůtemeier, Eur. J. Biochem. 128, 1982, 231 až 238). Při těchto výzkumech chromatografie kapalina/kapalina fragmentů DNK byla použita pro dextranem bohatou fázi vodného systému polyethylenglykol-dextran řada materiálů, z nichž se ukázala vhodnou zejména celulóza, protože vykazuje postačující afinitu pro fázi bohatou dextranem, V důsledku svých vyhraněných adsorpčních vlastností jsou tyto nosiče fází pro bílkovinné součásti buněk nepoužitelné; rovněž u ribonukleových kyselin jsou adsorpcí podmíněné rušivé vlivy již zřetelné. Kationtové nebo aniontové gely na bázi polysacharidů vážou dextranem bohatou fázi sice podobně dobře jako celulóza, lze jich však použít jenom pro isokratické dělicí procesy, protože fáze je odpuzována, jakmile se mění elektrický potenciál v průběhu gradientově eluce různými solemi v mobilní, polyethylenem bohaté fázi.
Mezi neutrální gely, které by přicházely v úvahu jako potenciální nosiče fází pro takovou rozdělovači chromatografii, patří porézní směsné polymery na vinylové bázi (fraktogely), jakož i polyakrylamidové gely (biogely). Prvé z nich vážou pro obecné použití příliš malé množství fází dextranu, zatímco v druhém případě vázaná fáze je stěží dostupná makromolekulám. Toto je zřetelně zdůrazněno i ve výše uvedené literatuře Eur. J. Biochem. 128 (1982), str. 233. Tato nepřístupnost vázané fáze platí i pro kombinační gely polyakrylamid-agaróza.
Úkol tohoto vynálezu spočívá tudíž ve vytvoření nosiče fází pro rozdělovači chromatografii makromolekul, který umožňuje jednoduchým způsobem vynikající dělení, lze ho snadno vyrábět, je vhodný pro dělení jak nízkomolekulárních, tak vysokomolekulárních kyselin ribonukleových i pro subcelulární jednotky a celé buňky, což je důležité zejména při studiu virů a viroidů.
Nyní se ukázalo, že úkol lze řešit pomocí nosiče fází, který se skládá z částic základního nosiče, jejichž povrch je převrstven pevně přilnavým materiálem s afinitou pro jednu z fází fázového systému pro rozdělovači chromatografii.
Předmětem vynálezu je tudíž nosič fází pro rozdělovači chromatografii makromolekul, vyznačující se tím, že sestává ze základního nosiče o velikosti částic v rozmezí 7 až 2 000 μΐη, který má na svém povrchu hydroxylové skupiny a je potažen polymerovou vrstvou, vázanou chemickou vazbou, s afinitou pro jednu z fází fázového systému pro rozdělovači chromatografii.
U makromolekul se jedná zejména o jednořetězcové nukleové kyseliny a zvláště bílkoviny, jakož i subcelulární jednotky a celé buňky.
U nosiče fází podle vynálezu jsou částice základního nosiče převrstveny pevně přilnavým materiálem s afinitou к jedné z fází, jmenovitě к dextranové fázi dvoufázového systému polyethylenglykol-dextran, což má za následek, že u těchto kombinačních částic se dextranová fáze nucené váže na povrchu, a tak se sátvá dostupnou i pro extrémně velké molekuly až celé buňky. Na druhé straně zajišťují částice základního nosiče potřebnou mechanickou stabilitu nosiče fází.
Podle výhodného provedení vynálezu sestávají částice základního nosiče z anorganického anebo organického materiálu, například z oxidu hlinitého, křemičitanu, křemeliny, silikagelu, celulózy, derivátů celulózy, zesítěného dextranu, zesítěné agarózy nebo z polymeru nebo kopolymeru na bázi kyseliny akrylové, akrylamidu, esterů kyseliny akrylové, kyseliny methakrylové, methakrylamidu, esterů kyseliny methakrylové, a/nebo vinylových sloučenin nebo směsí těchto monomerů. Obzvláště výhodné je, jestliže částice základního nosiče sestávají z některého z těchto popsaných materiálů v hydroxylované formě, protože takto je bez dalšího možné spojit povrchovou vrstvu pevně s částicemi základního nosiče, jmenovitě dosáhnout chemické vazby mezi materiálem povrchové vrstvy a materiálem částic základního nosiče.
Obzvláště výhodné je používat částic základního nosiče ze silikagelu substituovaného diolem, hydrofilizovaného polymethakrylátu, křemičitanu se škrobovitou vrstvou, nebo porézního polymeru na bázi vinylu.
Obzvláště výhodně mají částice základní ho nosiče u nosiče fází podle vynálezu průměrné velikosti částic 7 až 100 a zejména 10 až 50 μΐη.
Podle další výhodné formy provedení podle vynálezu jsou částice základního nosiče převrstveny polymerním materiálem, který je se zvláštní výhodou vázán chemicky na materiál částic základního nosiče. Přitom se ukázalo jako -obzvláště výhodné převrstvit částice základního nosiče syntetickým polymerem nebo kopolymerem, který se vytváří naroubováním monomerních složek na částice základního n-osiče. К tomuto účelu se pro požadovaný dělicí efekt ukázal být nejvhodnější naroubovaný polyakrylamid a obzvláště lineární nebo slabě zesítěný polyakrylamid.
Dalším předmětem vynálezu je způsob výroby tohoto nosiče fází, který se vyznačuje tím, že se к základnímu nosiči o velikosti částic v rozmezí 7 až 2 000 ^m majícímu na povrchu hydroxylové skupiny ve vodné suspenzi přidá polymerovatelný monomer a potom se provede roubovaná polymerace.
Podle jednoho z výhodných provedení vynálezu se suspendují částice základního nosiče z hydroxylovaného materiálu výše uvedeného druhu v roztoku obsahujícího případně monomery, načež se provádí v průběhu redoxpolymerace za vyloučení kyslíku naroubování polymerního materiálu. Při tomto provedení lze s výhodou použít jako polymeračního katalyzátoru iontů čtyřmocného ceru, protože tento materiál vyvolává tvorbu volných radikálů ovlivňujících příznivě polymeraci výlučně na povrchu částic základního nosiče, takže polymerace probíhá ve f-ormě roubované polymerace. Pokud se týká podrobností tohoto o sobě známého způsobu, lze odkázat na práci autorů G. Mino a S. Kaizerman, Journal of Polymer Science, sv. XXXI, č. 122 (1958), str. 242 až 243.
Při tomto způsobu provedení se používá akrylamidu, výhodného к vytváření polyakrylamidové povrchové vrstvy, ve formě vodného roztoku.
Ukázalo se, že při výše diskutované redoxpolymeraci. v přítomnosti iontů čtyřmocného ceru poskytuje roubovaná polymerace akrylamidu během 30 až 240 minut dostatečně hustou polyakrylamidovou vrstvu na částicích základního nosiče, která postačuje pro tvorbu dostačujícího množství dextranové fáze pro rozdělovači chromatografií ve vodném systému polyethylenglykol-dextran.
Následující nosiče byly s úspěchem opatřeny polyakrylamidovou vrstvou:
„SuperoseÍR)“: Zesítěná agaróza, velikost částic 25 až 40 gm, ,,Lichrosorb(R): — Diol: diolsubstituovaný silikagel, velikost částic 10 μπι, „Separon Herna 1000(R)“: hydrofilizovaný polymethakrylát, velikost 16 až 21 μπι, ,,TSK-SIL 3000(R,u: křemičitanové nosiče se škrobovitou vrstvou, velikost částic 16 až 21 μπι, „TSK-HW-40(S)(R), -55(S)-65(S) a -75(SJ“: porézní směsné polymery na vinylové bázi, lm Aq OH/g, na trhu dostupné jako „Fractogely“, velikost částic 25 až 40 ^m.
Ukázalo se, že nosiče fází podle vynálezu jsou vhodné к dělení nízkomolekulárních a vysokomolekulárních ribonukleových kyselin, kyselin nukleových s dvojitým řetězcem, subcelulárních jednotek a celých buněk, takže jich lze použít к izolaci viroidních RNK z rostlinných surových extraktů a ke chromatografickému dělení subcelulárních jednotek a celých buněk, mimo jiné i к lékařskodiagnostickým účelům.
Výše definovaného nosiče fází lze použít pro oddělování (pomocí rozdělovači chromatograf ie) makromolekul, biopolymerů, subcelárních jednotek i celých buněk ve vodných dvoufázových i vícefázových systémech na bázi polymerů, které jsou popsány například u P. A. Albertsona („Patrition of Cell Particles and Macromolecules“, druhé vydání; Almquist a Wiksell, Stockholm, str. 18 až 30), zejména ve dvoufázovém vodném polyethylenglyk-ol-dextran.
Následující příklady slouží к dalšímu osvětlení vynálezu.
Příklad 1
Znázorňuje výrobu nosiče fází podle vynálezu.
Do trojhrdlé baňky opatřené plynovou zaváděcí trubicí, kapací nálevkou a připojením na vakuum, se vnáší roztok 50 g akrylamidu v 500 ml destilované vody a v tomto roztoku se suspenduje 20 g částic základního nosiče z diolem substituovaného silikagelu (Lichrosorb(R) o velikosti části 10 ^m v tomto roztoku. Potom se promývá po dobu 5 minut předčištěným dusíkem, evakuuje se a baňka se znovu naplní dusíkem. Tato opatření zahrnující evakuaci a plnění dusíkem se opakují dvakrát, načež se přidá za míchání 15 ml 0,2 M roztoku dusičnanu ceričitoamonného v 1N kyselině dusičné za míchání. Za mírného míchání se zavádí suspenzí dusík po dobu 60 minut, přičemž intenzity žlutého zbarvení iontů čtyřmocného ceru zřetelně ubývá. Potom se к suspenzi za příštupu vzduchu přidá 20 g částic základního nosiče a po promíchání se provede tlaková filtrace přes filtr modrá páska (Schleicher a Schtill č. 5 893). Po promytí se 400 ml destilované vody se promývá asi se 400 ml 0,2 N roztoku octanu sodného v kakodylátovém pufru [10 mM kakodylátu sodného na 1 mM kyseliny ethylendiaminotetraoctové, hodnota pH = 6).
Stejným způsobem se převrstvují částice základního nosiče z výše specifikovaných materiálů polyakrylamidovou vrstvou, přičemž není nezbytné provádět výše uvedené ředění nosiče, převrstveného polyakrylamidem, materiálem nepře vrstveným. V případě částic základního nosiče z Lichrosorbu(R) je toto ředění potřebné, aby se převrstvený materiál učinil filtrovatelným a tím se usnadnilo převrstvení dextranovou fází.
Příklad 2
К ozřejmění dělicích vlastností nosiče fází podle vynálezu byly provedeny srovnávací pokusy, při kterých byly vzájemně srovnány nosiče fází podle vynálezu s těmi nosiči, které sestávají jenom z částic základního nosiče odpovídajícího nosiče fází podle vynálezu.
Nejprve byly nosiče fází převrstveny následujícím způsobem dextranovou fází systému polyethylenglykol-dextran.
Promytý materiál byl propláchnut na tlakovém filtru při teplotě 37 cC 2,5 objemy dextranové fáze systému polyethylenglykol-dextran (připravené rozpuštěním 66,3 g dextranu T 500 a 5,4 g polyethylenglykolu 8000 v 428,3 ml 0,2 m roztoku octanu sodného v kakodylátovém pufru připraveném podle příkladu 1), načež byl přebytek fáze vymyt horní fází, bohatou na polyethylenglykol, téhož systému (připravenou rozpuštěním 3 g dextranu T 500, 71,7 g polyethylenglykolu 8000 v 925,3 ml 0,2 M octanu sodného v kakodylátovém pufru). Po suspendování materiálu ve 3 objemech horní fáze byl takto získaný nosič fází naplaven do vhodné chromatografické trubice opatřené termostatickým vyhřívacím pláštěm, udržujícím teplotu na 37°%.
Potom byly zkoumány dělicí vlastnosti nepřevrstvených částic základního nosiče dextranové fáze na jedné straně, případně nosiče fází podle vynálezu na druhé straně, a to za použití zkušebního materiálu na podkladě směsi přenosových RNK (tRNK) a 5sRNK. Oba komponenty RNK náležejí к rozpustným ribonukleovým kyselinám a mají následující vlastnosti:
t ribonukleová kyselina:
Molekulární hmotnost 30 000, sestává ze 40 až 60 stejně velkých druhů, které se liší aminokyselinovou akcepturovou aktivitou.
5s ribonukleová kyselina:
Molekulární hmotnost 43 000, u většiny organismů jednotná RNK, která má úlohu při přenášení sekvencí báze RNK do aminokyselinových sekvencí.
Dělení se provádí v systému polyethylenglykol-dextran D z 6,2 % hmot, dextranu, 4,40 % hmot, polyethylenglykolu a 89,4 % hmot, vody, který ve spodní fázi sestává ze 13,25 % hmot, dextranu, 1,07 % hmot, polyethylenglykolu a 85,68 % hmot, vody, a v horní fázi z 0,30 % hmot, dextranu, 7,17 procenta hmot, polyethylenglykolu a 92,53 procenta hmot, vody (tento a podobné polyethylenglykol-dextranové systémy jsou známy z výše uvedené literární citace P. A. Albertsona; viz zejména fázový diagram na straně 264). U tohoto dvoufázového systému polyethylenglykoldextran lze ovlivňovat rozdělovači koeficient zejména skladbou iontů, tj. přidáním různých solí, přičemž ionty lithia rozdělovači koeficient К stupňují, zatímco ostatní alkalické kationty mají opačný účinek.
Při dělení prováděném zde ve fázové dvojici se tudíž používá následujících elektrolytů:
mM pufr s kakodylátem sodným o hodnotě pH 6,0, mM azid sodný, mM sodná sůl kyseliny ethylendiaminotetraoctové,
0,2 M octan sodný.
Dělení se provádí při teplotě 37 °C na chromatografickém sloupci s termostatem.
Množství vzorků jsou udána v jednotkách OH254, tj. jako optická hustota při vlnové délce 254 nM, přičemž 25 OH254 odpovídá 1 mg RNK.
Výsledky dosažené při těchto děleních jsou uvedeny na připojených výkresech, jejichž obr. znázorňují v jednotlivostech následující údaje:
Obr. 1
Srovnávací pokus: Chromatografie vzorku 10 OH254 na sloupci, který je plněn částicemi základního nosiče z „LichrOsorb(R)“-diolu, nepřevrstveného polyakrylamidem. Objem sloupce: 55 ml.
Průtok: 18 ml/hod.
Obr. 2
Pokus podle vynálezu: Dělení vzorku 50 OH254, obsahujícího barviva, na sloupci naplněném částicemi z „Lichrosorb(R)“-diolu převrstvenými polyakrylamidem.
Objem sloupce: 8,4 ml.
Průtok: 15 ml/hod.
Obr. 3
Srovnávací pokus: Chromatografie vzorku 19 OH254 na sloupci naplněném částicemi základního nosiče ze „Superose(R)“.
Objem sloupce: 10 ml, průtok 9 ml/hod.
Z 9 3 7 5
Obr. 4
Pokus podle vynálezu: Dělení vzorku 50 OH.254 na sloupci naplněném částicemi ze „Superose ÍR)“ převrstvenými polyakrylamidem.
Objem sloupce: 60 ml, průtok 20 ml/hod.
Obr. 5
Srovnávací pokus: Chromatografie vzorku 35 011:54 na sloupci naplněném částicemi základního nosiče z „TSK-HW-40(Sf‘.
Objem sloupce 65 ml, průtok: 15 ml/hod.
Obr. 6
Pokus podle vynálezu: Dělení vzorku 50 OH254 na sloupci naplněném polyakrylamidem převrstvenými částicemi základního nosiče z ,,TSK-HW-40(S]“.
Objem sloupce: 65 ml, průtok: 15 ml/hod.
Na obrázcích 1 až 6 je na -ose у uvedeno množství vzorku v jednotce OH254 a na ose x objem vzorku v ml.
Z výše uvedených obrázků je zřejmé, že s pomocí nosičů fází podle vynálezu ve srovnání se sloupci, které obsahují nepřevrstvené částice základního nosiče, je možné dosahovat překvapivě čistého oddělení složek zpracovávané rozdělované směsi. Z toho je ovšem zřejmé, že nosiče fází podle vynálezu jsou neočekávaně vhodné к dělení biologických makromolekul, což nemohlo být nikterak předvídáno, a lze jich používat s velkou výhodou к dělení а к lékařskodiagnostickým postupům.

Claims (9)

  1. PŘEDMĚT VYNALEZU
    1. Nosič fází pro rozdělovači chromatografii makromolekul, vyznačující se tím, že sestává ze základního nosiče o velikosti částic v rozmezí 7 až 2 000 gni, který má 11a svém povrchu hydroxylové skupiny a je potažen polymerovou vrstvou vázanou chemickou vazbou s afinitou pro jednu z fází fázového systému pro rozdělovači chromatografii.
  2. 2. Nosič fází podle bodu 1, vyznačující se tím, že základní nosič sestává z oxidu hlinitého, křemičitanu, křemeliny, silikagelu, celulózy, derivátu celulózy, zesítěného dextranu, zesítěné agarózy nebo z polymeru nebo kopolymeru na bázi kyseliny akrylové, akrylamidu, esterů kyseliny akrylové, kyseliny methakrylové, methakrylamidu, esterů kyseliny methakrylové a/nebo vinylových sloučenin nebo ze směsí těchto monomerů.
  3. 3. Nosič fází podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se tím, že základní nosič sestává ze silikagelu substituovaného diolem, hydrofilizovaného polymethakrylátu, křemičitanu se škrobovitou vrstvou nebo porézního polymeru na bázi vinylu.
    i
  4. 4. Nosič fází podle bodů 1 -až 3, vyznačující se tím. že částice základního nosiče mají velikost 7 až 100 μτη.
  5. 5. Nosič fází podle bodů 1 až 4, vyznaču jící se tím, že základní nosič je potažen vrstvou naroubovaného lineárního nebo zesítěného polyakrylamidu.
  6. 6. Způsob výroby nosiče fází podle bodu 1, vyznačující se tím, že se к základnímu nosiči o velikosti částic v rozmezí 7 až 2 000 μπι majícímu na povrchu hydroxylové skupiny ve vodné suspenzi přidá polymerovatelný monomer a potom se provede roubovaná polymerace.
  7. 7. Způsob podle bodu 6, vyznačující se tím, že se roubovaná polymerace provádí jako redox-polymerace indukovaná čtyřmocným cerem za nepřístupu vzduchu.
  8. 8. Způsob podle bodu 6, vyznačující se tím, že se jako monomer použije akrylamid ve vodném roztoku.
  9. 9. Způsob podle bodu 6, vyznačující se tím, že se použije základní nosič sestávající z oxidu hlinitého, křemičitanu, křemeliny, silikagelu, celulózy, celulózového derivátu, zesítěného dextranu, zesítěné agarózy nebo polymeru nebo kopolymeru na bázi kyseliny akrylové, akrylamidu, esterů kyseliny akrylové, kyseliny methakrylové, methakrylamidu, esterů kyseliny methakrylové a/nebo vinylových sloučenin nebo ze směsí těchto monomerů.
CS851471A 1984-03-02 1985-03-01 Phase carrier for distributing chromatography and method of its production CS259875B2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19843407814 DE3407814A1 (de) 1984-03-02 1984-03-02 Phasentraeger fuer die verteilungschromatographie von makromolekuelen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS147185A2 CS147185A2 (en) 1988-04-15
CS259875B2 true CS259875B2 (en) 1988-11-15

Family

ID=6229473

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS851471A CS259875B2 (en) 1984-03-02 1985-03-01 Phase carrier for distributing chromatography and method of its production

Country Status (9)

Country Link
US (1) US4756834A (cs)
EP (1) EP0154246B1 (cs)
JP (1) JPS61501310A (cs)
AU (1) AU569147B2 (cs)
CA (1) CA1238626A (cs)
CS (1) CS259875B2 (cs)
DE (2) DE3407814A1 (cs)
IL (1) IL74470A (cs)
WO (1) WO1985003885A1 (cs)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2767251B2 (ja) * 1988-04-01 1998-06-18 三菱化学株式会社 複合化分離剤及びその製造方法
DE3811042A1 (de) * 1988-03-31 1989-10-19 Merck Patent Gmbh Ionenaustauscher
IE911670A1 (en) * 1990-05-17 1991-11-20 Adeza Biomedical Corp Highly reflective biogratings and method
SE9101149D0 (sv) 1991-04-17 1991-04-17 Pharmacia Lkb Biotech Beads for down stream processing
AU681590B2 (en) * 1992-06-19 1997-09-04 Pall Corporation Passivated and stabilized porous supports and methods for the preparation and use of same
US6706188B2 (en) 1993-05-03 2004-03-16 Amersham Biociences Ab Process and means for down stream processing
WO1995002820A1 (de) * 1993-07-16 1995-01-26 Merck Patent Gmbh Trennmaterialien für die hydrophobe chromatographie
DE4333674A1 (de) * 1993-10-02 1995-04-06 Merck Patent Gmbh Nukleotidhaltiges Sorbens für die Affinitätschromatographie
DE4333821A1 (de) * 1993-10-04 1995-04-06 Merck Patent Gmbh Ionenaustauscher
DE4334353A1 (de) * 1993-10-08 1995-04-13 Merck Patent Gmbh Verfahren und Träger für die Gelpermeationschromatographie
JPH09503698A (ja) * 1993-10-08 1997-04-15 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング ポリアクリルアミドのエポキシ誘導体
US6994791B2 (en) * 2002-06-27 2006-02-07 Akzo Nobel N.V. Adsorbent material and method of preparing an adsorbent material
GB0316742D0 (en) * 2003-07-17 2003-08-20 Fermentas Uab Electrophoretic gels and their manufacture
EP2152405B2 (de) * 2007-05-25 2017-04-05 Merck Patent GmbH Mischpfropfpolymere für die kationenaustauschchromatographie
JP2010530462A (ja) * 2007-06-19 2010-09-09 ジーイー・ヘルスケア・バイオ−サイエンシズ・アーベー ポリマー２相システムおよびその使用
JP5631869B2 (ja) * 2008-05-30 2014-11-26 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ 水酸基を含まないポリマー上におけるＣｅ（ＩＶ）で開始されるグラフト重合
DE102011001743A1 (de) * 2011-04-01 2012-10-04 Technische Universität Dortmund Verfahren zur Trennung/Reinigung von Biomolekühlen
MY195756A (en) 2012-09-17 2023-02-09 Grace W R & Co Functionalized Particulate Support Material and Methods of Making and Using the Same
CA2885263C (en) 2012-09-17 2021-11-16 W. R. Grace & Co.-Conn. Chromatography media and devices
JP6853670B2 (ja) 2014-01-16 2021-04-07 ダブリュー・アール・グレース・アンド・カンパニー−コーンＷ Ｒ Ｇｒａｃｅ ＆ Ｃｏ−Ｃｏｎｎ 親和性クロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーデバイス
CN103798227B (zh) * 2014-02-11 2016-03-16 中国农业科学院烟草研究所 一种锦紫苏类病毒离体常温保存方法
WO2015168383A1 (en) 2014-05-02 2015-11-05 W. R. Grace & Co.-Conn. Functionalized support material and methods of making and using functionalized support material
SG10201911134QA (en) 2015-06-05 2020-01-30 Grace W R & Co Adsorbent bioprocessing clarification agents and methods of making and using the same

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3478886A (en) * 1967-03-31 1969-11-18 Atomic Energy Commission Graft-copolymer column support material for liquid-liquid partition chromatography
GB1310872A (en) * 1969-01-13 1973-03-21 Simpson C F Liquid partition chromatography
GB1478971A (en) * 1973-07-05 1977-07-06 Univ Strathclyde Solute-adsorptive material
CA1060728A (en) * 1973-07-26 1979-08-21 Jack Fennimore Treatment of particulate carbon with biocompatible polymer
US3983299A (en) * 1974-03-04 1976-09-28 Purdue Research Foundation Bonded carbohydrate stationary phases for chromatography
US3954678A (en) * 1974-07-11 1976-05-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Semipermeable microcapsules containing a silica gel
JPS5247355B2 (cs) * 1974-10-15 1977-12-01
JPS5211184A (en) * 1975-07-17 1977-01-27 Yoshiaki Motozato Two-layer spherical gel particles for molecular sieve
US4140653A (en) * 1975-09-30 1979-02-20 Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. Solid support for liquid chromatography
JPS5247358A (en) * 1975-10-14 1977-04-15 Nec Home Electronics Ltd Phase lock loop circuit
US4076619A (en) * 1975-10-30 1978-02-28 Polymetrics International Inc. Hydrophilic acrylic polymers as marine filters, algae growth catalysts, and breeding stimulus for fish and invertebrates
US4171283A (en) * 1976-08-04 1979-10-16 Kuraray Co., Ltd. Hemoperfusion adsorbents
US4330440A (en) * 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
DE2709094C2 (de) * 1977-03-02 1984-11-22 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Adsorbens für die affinitätsspezifische Trennung von Nukleinsäuren, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
DE2712344C2 (de) * 1977-03-21 1982-09-23 Hans Dr. 4803 Steinhagen Bünemann Löslicher Komplexbildner für die affinitätsspezifische Trennung von Nukleinsäuren
US4111838A (en) * 1977-09-09 1978-09-05 Eastman Kodak Company Composition for chromatography
US4159966A (en) * 1977-12-27 1979-07-03 The Dow Chemical Company Chromatographic column packing
US4245005A (en) * 1979-02-28 1981-01-13 Purdue Research Foundation Pellicular coated support and method
DE3174809D1 (en) * 1980-09-11 1986-07-17 Atomic Energy Authority Uk Selective retention with composite materials
JPS57150433A (en) * 1981-03-12 1982-09-17 Kuraray Co Ltd Carrier for immobilizing physiologically active material and selective adsorbent, selective electrode and analytical column using said carrier
JPS57171257A (en) * 1981-04-14 1982-10-21 Mitsubishi Gas Chem Co Inc Packing for liquid chromatography
CA1204720A (en) * 1982-09-30 1986-05-20 Hajimu Kitahara Packing materials for chromatographic use and a method for analysis of an enantiomer mixture using the same
CS248505B1 (en) * 1983-06-23 1987-02-12 Marie Tlustakova Method of biocompatible layer production on surface of porous synthetic sorbents' particles

Also Published As

Publication number Publication date
AU569147B2 (en) 1988-01-21
CS147185A2 (en) 1988-04-15
DE3563693D1 (en) 1988-08-18
WO1985003885A1 (en) 1985-09-12
DE3407814A1 (de) 1985-09-12
AU3995385A (en) 1985-09-24
EP0154246B1 (de) 1988-07-13
IL74470A (en) 1988-11-30
JPS61501310A (ja) 1986-07-03
IL74470A0 (en) 1985-05-31
US4756834A (en) 1988-07-12
CA1238626A (en) 1988-06-28
EP0154246A1 (de) 1985-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS259875B2 (en) Phase carrier for distributing chromatography and method of its production
EP2598223B1 (en) Chromatography media and method
JP2564335B2 (ja) 生体試料から核酸を単離し精製する方法
EP0320023B1 (en) Macroporous polymeric membranes, their preparation and their use for polymer separation
EP1729867B1 (en) A method for chromatographic purification
JP6043062B2 (ja) イオン交換クロマトグラフィー用グラフトコポリマー
EP2653218A1 (en) Temperature-responsive adsorbent having strong cation exchange group, and method for producing same
JPH04505968A (ja) クロマトグラフィー用被覆媒体
JP2001506364A (ja) プレフォームドポリマーのコーティング方法及び製品
EP3114455B1 (en) Robust antibody purification
EP3512866B1 (en) The use of a polymeric mesh for the purification of macromolecules
JP5234727B2 (ja) 温度応答性クロマトグラフィー担体製造方法、それより得られるクロマトグラフィー担体及びその利用方法
JP2022515769A (ja) 大孔径アガロース
US20120232255A1 (en) Pretreatment cartridge for separating substance and method of pretreatment using the same
US20170067861A1 (en) Temperature-responsive monolithic porous body, method for producing same, and temperature-responsive chromatography method using same
JPS60501209A (ja) 生物学的活性物質の精製方法
Müller et al. Size fractionation of DNA fragments ranging from 20 to 30000 base pairs by liquid/liquid chromatography
JP2003514655A (ja) 核酸構造を有する化合物を含むサンプル由来の物質の選択的除去方法
JP5631869B2 (ja) 水酸基を含まないポリマー上におけるＣｅ（ＩＶ）で開始されるグラフト重合
US6723539B1 (en) Absorbent medium containing particles of chopped cellulose or agarose sponge material having functional groups
US7772152B2 (en) Composite polymer-coated sorbent with a bidisperse pore size distribution for the simultaneous separation and desalting of biopolymers
JP3970339B2 (ja) 細胞分離用材料
JPH03108661A (ja) 核酸関連物質の分離方法
EP2315839A1 (en) Simple load and elute process for purification of genomic dna
JP4422541B2 (ja) 温度応答性液体クロマトグラフィー担体及びそれを用いた液体クロマトグラフィー法