JPS60501209A - 生物学的活性物質の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的活性物質の精製方法 本発明は、少なくとも２つの非混和性水性相よりなるシステムを使用して生物学 的活性物質を精製する方法に係る。

例えばペプチド、タンパク質およびその他の生体分子のような生物学的活性物質 が溶液中に含まれている場合、その中から各成分を単離する方法と手段が必要で あるが、その結果種々の異なった生体分子系のための多大な数の分前方法が開発 されてきた。大量の分離については、カラムを使用した多くの技術が現在広く使 用されている。これ等の方法においては、溶液をゲル床に流し、分子の大きさに よって流出溶液中に含まれる各成分が異なった遅延を見せるものくゲル濾過〉、 電向により各成分がゲル中の基に結合されるもの（イオン交換り【コマ！〜グラ フィー）、生物学的特異親和性にＪ、り各成分がゲル中に固定されたりカントに 結合されるものくアフィニティークロマ１〜グラフイー）がある。これ等の方法 ではカラム中を通さなｔプればならない溶液が比較的多いと分離に長時間を要し 、その１全ての成分を可溶性状態にしなければならないために実用上の範囲が限 られている。固体が存在するとそれによってゲル床が非常に閉塞してしまいやす くなるのである。それゆえ、生物学的液体試料中にそのような非溶解物質が存在 すると濾過及び／又は遠心分離といった余分な予備的分離段階が必要である。

異なった極性を持つ少なくとも２つの液相を含むシステムを使用する、大量の精 製に関して有利な可能性を持った方法が見出された。この場合、異なった成分が それらの相の中でそれらの間に特有の各々異なった分布パターンを示すものと考 えられる。生物学的物質はその活性を失なわないために通常マイルドな条件を必 要とするという事実から見て、まず最初にそれ等の相として使用できるのは水成 相であり、時としてマイルドな有機溶媒との組み合せである。

この型の分離システムは以下のものの水成溶液を含み得る。

（１）少なくとも２つのポリマー （２）少なくとも１つのポリマーと少なくとも１つの塩（３）少なくとも１つの ポリマーと少なくとも１つの有機溶媒（１）の組合せに従う少なくとも２つの水 成ポリマーを含むシステムは例えばアルバートソン（八１ｂｅｒｔｓｓｏｎ、　 Ｐ、　Ａ、　）によって「細胞粒子と巨人分子の分離Ｊ　（［Ｐａｒｔｉｔｉｏ ｎ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ａｎｄ　Ｈａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌ ｅｓｌ　Ａｌｌ１ｌＱＵｉＳｔ　＆　Ｗｉｋｓｅｌｌ、　５ｔＯＣｋｈＯ１ｌ’ ｌ及びＪｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　 １９７１）において述べられており、水に加えられるこのシステムに包含され得 る水溶性のポリマーの組合せの例は以下のようなものである。ポリエチレングリ コール／デキストラン、ポリプロピレングリコール／デキストラン、ポリエチレ ングリコール／ポリビニルアル］−ル、ポリエチレングリコール／′フィ］ル（ Ｆｉｃｏｌｌ、登録商標、シコクロースとエビクロロヒドリンのコポリマー、Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｕｐｐｓａｌｅ、Ｓｗｅｄ ｅｎ）、ポリビニルアルコール／デキストラン、メチルセルロース／デキストラ ン、ポリプロピレングリコール／ポリビニルピロリドン、荷電ポリエチレングリ コール／デキストラン、ポリプロピレングリコール／メトキシポリエチレングリ コール、ポリプロピレングリコール／ポリビニルアルコール、ポリプロピレング リコール／ヒドロキシプロピルデキストラン、ポリ］−ヂレノグリ］−ル／ポリ ビニルビ［］リドン、ポリエチレングリコール／スターチ、及びポリビニルアル コール／メチルセルロースである。これ等のポリマー或いはその他のポリマーも 含めた他の組合せが文献により公知である。

前記の組合せの中で、デキストランをより極性の強い相として含む２相システム が最も広く研究されている。しがしデキストランが比較的高価であることが大量 の精製に対するこの方法の使用を制限する要因となっている。

（２）の組合せによる少なくとも１つのポリマーと少なくとも１つの塩の水性溶 液を含むシステムにおいては、ポリマーは上記に挙げたものの中から選択し得、 塩は例えばリン酸カリウム及び硫酸マグネシウムといったリン酸塩或いは硫酸塩 のような水溶性の有機或い無機塩でよい。この場合より極性の強い相は塩溶液で あり、低価格で調製することができるので、この方法は経済的に優れ人聞の精製 への使用に適している。

前ン（３）の組合せにあるように１つの相を有機液体にすることもできる。これ は分離システムの中にある生体分子に逆に影響を与えないものの中から選ばなけ ればならない。これ等の液体の例としてはアルコール類で、例えばプロピルアル コール、グリセロール、ブタノキシエタノールのようなものである。

前記（１）および（２）の組合せによる２つの水成相を含む２相システムを適用 した分離方法を以下に記述するが、上記に関らずシステム中には２つ以、トの相 あるいは非水酸相も存在し得る。この方法においては片方（通常はより極性の強 い方）が分離すべき成分を含む混合物を含んだ２つの相を接触をさせて行う。こ の混合物中の異なる生体分子は元の相からもう一方の相に向って異なった移動傾 向を示し、その結果混合物の成分が相分離する。この分離を最適なものにするた めには、１種またはそれ以上の単離目的成分がどちらか１つの相に存在し、残り の成分の大部分がもう一方の相に存在づるようにしなければならない。しかしな がら、この方法が最初に述べたこの形で使用できるような最適な分布比率に遭遇 するのは極く希・なことである。かなり良好な分布比率およびそれに伴う良好な 収量と純度は、目的成分に対して親和性を持った可溶性リガンドを含むシステム によって得られる。この場合、成分の１つの相内での濃縮の能率性を決定する要 因は相システム中でのりガント＝−成分複合体の分布特性である。例えばフラナ ガン他（Ｆｌａｎａｇａｎ、Ｓｅｔ　ａｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　 ２５０（４１（１９７５）、１４８４−９及び２５１（３）（１９７６）、　８ ５８−８６５）にょリゾキス［・ラン／ポリ■ブーレノグリニｌ−ル２相システ ムにおいて、存在する１つのポリマーに共有結合した可溶性リガンドを含んだも のを使用して得られる右利な結果が示されている。またミューラ−（Ｈｉｉｌｌ ｅｒ）他は米国特許４、２０７．２００号において、ポリエチレングリコールと デキストランの２相システムでポリエチレングリコールにより誘導化され核酸に 対して親和性を持った可溶性リガンドを使用した核酸の分離を示している。この 文献に示されるタイプの可溶性りカントの使用において残存する欠点は、リガン ド−成分複合体の１つの相への高率分布が困難であることが潜在することにある 。

それｔよりガントが実際に好適な分布特性を保有している場合でもそって・ある ３、特に大ぎな生体分子からの分布により、リガン１ニー成分複合体の分イ■パ ターンがリガンドそのものよりも良好でなくなるのである。その上、結合された りガントがら後で目的成分を中離ηるという余分な分離段階が必要である。

ぞこで本願出願人は本願発明に従い、使用覆るリガンドが不活性の粒子であっ一 部それが粕￥ｌへさ成分に対して親和性を持ち、前記粒子が１つの相に多量に分 子１ｊされるような十分に高い相に対づる分布係数を持っているならば、２相シ ステムを使用しに精製方法に残存覆る前記のＪ、うな問題を効率的に取り除くこ とがでさることを発見した。粒子は不活性であり、それは粒子−１の特異的な基 とそれに対して親和性を持った物質との間の結合以外には粒子システム内の成分 とどのようにも反応しないということである。ここで使用している「多聞の分布 」という用品は、粒子の総量のごく一部が粒子の大部分が示す分布挙動に従わな いこと及び例えばガラス表面に付着づるような可能性は含んでいない。上相に分 布した粒子は、−１分に高い密度を保有しているならばこの相の下側の面に沈積 する。

生物学的活性物質は結合によって、１つの相中への分イＩＪ特性淵度に従う粒子 に拘束される。次にイの相を他の相から分離し粒子を濾別し洗浄する。その後物 質は適当４ｆ環境の士で粒子から分離される。本発明に依れば分離工程遂行に際 して粒子サイズは問題ではない。粒子サイズの」ニ限は粒子の重早、拡散距園の 長さ、付随的に吸着時間によって決まる。小さい粒子の場合、迅速な物質の吸着 とより人込な総表面面積が得られるが、公知のＩＪ法ではそれに続くカラム中で の溶出工程にａ３いて、粒子り一イズが小さくなればなる程流れに対する抵抗が 人さくなる。粒子の直径は好ましくは１〜１１０００Ｉ１である。［１的物質が 粒子に結合している場合は、生体分子のりイズに比較した粒子のサイズのために 粒子の分布特性が有意に変化Ｊるということはない。これは粒子が成分を結合す る部位をいくつが持っている場合でもそうである。本発明に依る精製■稈への使 用に適した粒子としては、例えばカラムクロマトグラフィーにより知られるマト リックス、すなわちゲルでありそれ等は例えば架橋デキストラン、アガロース、 架橋アガロース、セルロース、架橋セルロースおよび架橋スターチ等によるビー ズである。架橋化は７１〜リツクスの堅固性を増加するために行なわれる。その 他の例としてはポリアクリルアミド、ポリメタクリレート及び親水化したポリス チレンのビーズがある。しかしこれ等の粒子およびその代替物は公知であり、当 業者にとっては自明のことである。もし粒子がそれ自体で所望相に対する十分高 い分布係数を持たない場合は、所望な様にその極性を変化させるような基を粒子 に備えさせる必要がある。づなわちその極性を粒子がその中に向うような相と同 様のものにしなＩプればならない。粒子の親水＋１を増加させることは、例えば 水酸基、カルボキシル基、アミノ基あるいはスルホン酸基で粒子を誘導化覆るこ とによって可能である。もし粒子の親水性が増加ηることが必要であれば、誘導 化を例えばポリ■ブレングリー１−ルａ−３よびポリプロピレングリコールタイ プのポリマーを使用して行なえばよい。もちろんその他の置換基、例えばハイド ロオキシプロピル基のＪ、うな任意に置換された炭化水素残基も使用でき、その 構造の親水性、疎水性の基礎的知識により適当な特有の選択をすることができる 。

所望の極性をもたらづ基および後における目的物質の結合をもたらす特異的な基 による粒子の誘導化のためには、種々のクロマトグラフィー技術に関連して公知 のどのような結合方法も使用できる。そのような結合方法の中でも特に、ＣＮＢ ｒ結合、エポキシ結合及びトリアジン結合が挙げられる。種々のアフィニティー クロマトグラフィーの関連で例えば生体分子およびポリマーを不活性マトリック スに共有結合覆るのにこの方法が長年使用されて来た。多くの粒子の態様とこの 技術の使用が署されており、この技術に基いて前記粒子にある特定の成分に対す る生物学的親和性を与えるための物質（基）を粒子上に固定し得ることは自明で ある。これ等の物質（基）の例は抗体、抗原、酵素、酵素基質、レクチンあるい はその他の親和性リガンドである。粒子の１物学的活性物質に対づる親和性は静 電型の親和性であってもよく、この場合粒子はその表面に荷電Ｌ！を具備υる。

例えば第４級あるいは第３級アミノ基のようなアニオン交換基、および例えばカ ルボキシル基およびスルホン酸！：果のＪ、うなカチオン交換基がイオン交換ク ロマミルグラフィーの技術から良く知られている。

もちろん７１〜リツクス物質及びそれに加えて所望の親水性及び疎水性、さらに は特異的な結合基を粒子上にもたらり一成分を含む混合物の中で、本発明による 精製工程に適した粒子を合成することもできる。そのようにすると粒子はまさに 当初からすでに所望の性質を具備していることになり、余分な誘導化工程は必要 なくなる。

本方法を微生物、例えばバクテリア細胞によって生成された物質の精製に適用す ると、その利点がよく示される。物質は細胞中で自然に生成されたものでもよい し、例えばＤＮＡ組換え技術により特異的なりＮＡ配列を挿入した後に生成する ものでもよい。細胞が物質を分泌しない場合は、物質を１１るために細胞壁を破 壊しなければならない。これは物質を固体細胞組織片と非常に多聞の溶解生体分 子から分離しなければならないということである。この細胞懸濁液に例えばポリ エチレングリコールを誘導化し前記物質に対して親和性を持った粒子を加える。

前記の（２）の場合、この後例えばリン酸カリウムのような塩を加える。その後 この細胞懸濁液を水成ポリ］−ヂレノグリコール溶液に接触させると２相システ ムが形成され、ポリエチレングリコール相である上相中ヘポリエチレングリコー ル誘導化粒子が移動する。他の成分の大部分はより極性の強い塩相である下相に 残る。良好な分布条件に依ると上相はごく小容量となるが、これを下相から分離 しポリエチレングリコールの水成溶液を濾過する。その後、上相に移動している 余分な成分を除去するために粒子を洗浄する。目的物質を粒子から遊離するため に、物質粒子間の結合を弱めるように環境条件を変化させる。

これは例えばｐＨの変化によって行なう。

便宜上、粒子を含んだ液相をグリッド底を備えた空のカラムに直接流し込み、保 持された粒子を含むカラムをクロマトグラフィー装置として適当な溶液で洗浄し 溶出する。この場合アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換ゾロマ トグラフィー技術の文献において成分の溶出法として述べられている技術を直接 適用することによって行い冑る。

本方法を活性化粒子の調製、その粒子へのりガントの結合および２相システムの 分離の非限定的な実施例により下記に示覆。

１６５Ｉのポリエチレングリコール４０００　（Ｈｅｒｃｋ）を４０℃で５０１ １１１！の蒸溜水に溶解した。その後Ｎａ叶でｌ）Ｈを約１２．５に調整し、そ こへ２０ｇの洗浄エポキシ活性化セファロース６［３（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、登 録商標、ＰｈａｒＩＩｌａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｗｅｄｅ ｎ）を加えた。１８時間、４０℃で振盪した後、１５ｍのエチレングリコールを 加え、さらに粒子を蒸溜水とｐＩ−１７の０．０５Ｍリン酸バッファーにより４ 時間洗浄した。

１２ｇのメトキシポリエチレングリコール３０００　（Ｈｏｅｃｈｓｔ）を実施 例１（ａ）に記述の方法でエポキシ活性化セファロース６Ｂに結合した。

１、ｏｏｇのＣＮＢｒを３０ｍ＋！の蒸溜水中に溶解し、反応容器を水浴中に置 いた。次に冷却した蒸溜水で洗浄した１５ｍのゲルを加え、Ｎ　ａ　ＯＨでｐ　 Ｈを１１．３に調整した後、活性化を６分間行った。生成物をその後、蒸溜水、 ｏ　ｆ−１３の０．２５Ｍクエン酸、ｐＨ３の０．００５Ｍクエン酸及び蒸溜水 で順次洗浄メトキシポリエチレングリコール−セファロース６Ｂを実施例１（Ｃ ）と同様の方法で活性化した。

実施例１（ａ）に記述したものと同様の方法で、ポリエチレングリコール２００ ００　（Ｈｅｒｃｋ）をエポキシ活性化セファロース６Ｂに結合した。３０−の ゲルを蒸溜水で洗浄し、その後アセトンへ移した。６０−のアセトンと２．４ｄ のピリジンの混合物中で１．２ｍｍｏｌの２．２．２−１−リフルオロ■タンス ルホン酸塩化物で１２分間活性化を行なった。生成物をグラスフィルター上で冷 却アセ１〜ン及び１　ｍ　Ｍ　ｌ−ｌ　Ｃｆ２で順次洗浄１した。

実施例１（ａ）に依るゲルの２７−を蒸溜水で洗浄した。この洗浄段階の後、７ ０ｍｙのＮａＢＨ４を含有する３５ｄの０．４５１ｙｌ　ＮａＯＨを加え、その 後１５．６ｄの１，４−ビス（エポキシプロポキシ）ブタンを加えた。反応は２ ４℃で３時間行ない、その後生成物を蒸溜水で洗浄した。

生物学的活性物質に対して親和性を持ったリガンドの活性生粉実施例１（Ｃ）に よるｌ〜レジル活性化ポリ］−ヂレノグリ］−ルーセフフッロース６［３の１０ ．９ｍを１８０１１１ｆｆのガンマグロブリン（Ｓｉｇｍａ）ど１）Ｈ８，７の バッファ’　（０、１Ｍ　Ｎａ１ｌＣ０３゜０　、５　ＭＮａｃｌり　ｔ１１′ Ｃ：／１時間撹拌しながら反応させた。その後混合物（合ｉｔ　２０　ｍ！！　 ）を４℃で−・晩そのまま放間した１、その後１：）Ｈ／１．Ｏの０．１Ｍ酢酸 バッファー　（０，５ＭＮａｃｉり及びｐｌ−１８，３の０．２Ｍ炭酸バッノノ □−（０，５ＭＮａｃｆ）により交りに洗浄Ｊる。１）Ｈ７，２の０．０２５Ｍ リン酸バツノアーに貯蔵りる、１ 実施例１（Ｃ〉による１〜レジル話ｆＩ化ポリＪヂレングリ］−ルーセファ［］ −ス６Ｂの１９．１ｍｆ！を３２０ｍｇの生血清アルフミン（Ｓｉｇｍａ）と実 施例２（ａ）と同じ条ｆ［で反応させた。（合ｔ１容量５９．９ｍ）。

２（Ｃ）ガンマグロブリンのメトキシｉｇ　ｊＪ　Ｉヂレ＞　’ｊ　ｌ）、、− エユ西１２ｙのＣＮＢｒ活性化メトキシポリエチレングリコール−セファロース ６Ｂを２００■のガンマグロブリン（Ｓｉｇｍａ）とｐＨ８，３の０．１Ｍ炭酸 バッファー　（０，５ＭＮａｃ１り　１０ｍｌ。

中において撹拌下で３時間反応させた。さらに２日間４℃で放置した後、ｐｔ− １４，０の０．１Ｍ昨耐酸バッファーびｐｉ−１８，３の０．１Ｍ炭酸バッファ ー（共に０　、５　ＭＮａｃｉ：　）　−ｃ交互に洗浄する。生成物はｐＩ−１ ７，０の２０ｍＭリン酸バッファー中に貯蔵ηる。

実施例１（ａ）で（を成した定着ポリ−１ヂレングリニ１−ルーレフｊ・［］− ス６Ｂの２５　ｍＱを０．０！ｌ？のＫ　ＯＬｌを含有マノる２！う威の蒸溜水 に溶解した１！？のシバクロン（Ｃｉｂａｃｒｏｎ、　Ｑ録商標）ブルー「３Ｇ −△と８０℃で１００分間反応させた。生成物を蒸溜水、ｐＨ７，４の０．０２ ５Ｍリン酸バッフＩ−１蒸溜水、エタノール、蒸溜水、及びリン酸バッファーで 順次洗浄した。

生物学的活性物質の粒子への結合、２相システムでの精製実施例２（ａ）で得た ガンマグロブリン−ポリエチレングリコール−セファロース６Ｂの１．５ｄをｐ Ｈ７，１のリン酸バッファー中の２．５■のタンパク△（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　 Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ。

Ｓｗｅｄｅｎ）に加え、そのｖＡ１時間反応容器を回転させた。ポリエチレング リコール／Ｉ　０００と、ＫＨＯＰ４及びＫ１１２ＰＯ４のＤ　Ｉ−１７の水成 溶液を加えた後、沢含物を撹拌した。この処理の後リン酸　１１％（Ｗ／Ｗ）　 、ポリ−［ヂレノグリコール１９．５％及び蒸溜水６９．５％の組成を持つ２相 システムが生成した。

ゲル粒子を含む上相をグリッド底を具備した空のカラムに移し、次にゲル粒子を ｐｌ−１７，２のリン酸バッファーで洗浄した。

ｐｌ−１３のＯ，１Ｍグリシンの溶出にＪ：す０．８ｍｇのタンパク質Δがゲル 粒子から遊離した。ポリアクリルアミドゲル［〕ΔΔ４／　３０　（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｓｗｅｄｅｎ）中の電気泳動ニヨ り純度をチェックした。

キシポリエチレングリコール−セファロース６Ｂ（ＩＩ）への結実施例２（Ｃ） （あるいは゛類似の方法）に依り得られた定着ゲルを約０．６ｄ含有する１ｄの ゲル懸濁液を２つの並行実験のｐｌ−１７，１の０．１Ｍリン酸バッファー中の １．９４■のタンパク質Δ溶液に加えた。反応容器を２時間回転させ、その後ポ リエチレングリコール４０００．ポリエヂレノグリ：」−ル１５４０及びＫｌｌ 　ＰＯどに２ＨＯＰ　４のｐｔ−１７の水成溶液を加えた。

４ リン酸９．４％、ポリエチレングリコール４０００１３．１％、ポリエチレング リコール１５４０　４．９％、蒸溜水７２．６％の組成を持つ２相システムが形 成された。

ゲル粒子を含むボリエヂレノグリ」−十相を、グリッド底を具備した空のカラム に移し、ゲル粒子を濾別しリン酸バツノア−で洗ｒｐシた。ｐ　Ｈ３の０．１Ｍ グリシンによる溶出により（丁）は１．　２４ｍ！ｊ、（ＴＩ＞４ま１．４０Ｒ ９のタンパク質△かそれぞれ得られた。ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動に Ｊ、り純度をチェックした。その後ポリエチレングリコールーセノ？ロース６Ｂ 粒子及びメトキシポリエチレングリ］−ルーセフノ・ロース６Ｂ粒子、すなわら 生物学的特異親和性リガンドを持たない粒子について実験を繰り返した。これ等 の場合、グリシンによる溶出においてタンパク質Ａは検出されなかった。

２相分離工程に使用したゲル粒子からガンマグロブリンが遊離されないかどうか のテストを行った。この目的のために粒子をｐ）−１３の０．１Ｍグリシンで１ ６時間インキュベートした。

ガンマグロブリンの漏出は全く検出されなかった（２８０ｎｍにお（プる吸光度 はなかった）。

３（Ｃ）アルブミンのシバクロンブルーーポリエヂレノグ■］−ルーセファロー ス６Ｂ（Ｉ）及びシバクロンブルー−メトキシポリエチレングリコール−セファ ロース６Ｂ（ｎ）への結合実施例２（ｄ）（あるいは類似の方法）により生成さ れた定着ゲル２１１１１７を含有する４−のゲルＩＩＪ濁液を、２つの並行実験 のｐｉ−１７，２の０．０２５Ｍリン酸バッファー中に２８．２ｍのアルブミン を溶解した溶液に加えた。反応容器を４５分間回転させ、その後ゲル粒子を安定 させた。上清液中のアルブミンの濃度を測定し、その濃度に基づいて計算したゲ ル粒子に結合したアルブミンの量は、（Ｉ＞が７．０１１！？及び（ＩＩ＞が９ ．８５■であった。ポリエチレングリコール４０００．デキストランＴ５００及 び蒸溜水を加え、ポリエチレングリコール４０００６．０％、デキストランＴ５ ００　７．２％、蒸溜水８６．８％の組成を持った２相システムを形成した。ゲ ル粒子を含むポリエチレングリコール相をグリッド底のカラムに移し、ｐＨ７゜ ２の０．０２５Ｍリン酸バッファーで洗浄した後、（Ｉ）では７．２４Ｒｇ、（ Ｉ［）では９．２６■のアルブミンがそれぞれカラムから溶出された。この検出 量は前述の粒子に結合したアルブミン量の計算値とよく一致する。

２ｇのプロジオンレッドｌ−Ｉ　Ｅ　２　Ｂ　（ＩＣＩ、Ｅｎｇｌａｎｄ）及（ １３ｇ（Ｄ炭酸ニブトリウムを１００＃Ｉｉ！の蒸溜水に溶解した。その後２０ ９のスターチど−ズ（ポテトフラワー、　ｌｌｏｔａｔｉｓｍＪＯｌ、　ｅｘｔ ｒａｐｒｉｍａ”、　Ｓｖｅｒｉｇｅｓ　ｓｔ：１ｒｋｅ＋５ｅｐｒｏｄｕｃｅ ｎｔｅｒｓ　ｆ６ｒｅｎｉｎｇ、　にａｒｌｓｈａＩｌｌｌ、　３ｗｅｄｅｎ） を撹拌下に加えた。温度を５０℃に上昇さｔ！１６時間反応させた。生成物を溶 液の色がなくなるまで蒸溜水で洗浄し、その後ｐＨ６，４の１０ｍＭリン酸ナト リウムバッファーで３回洗浄した。

１５μｐの誘導化スターチビーズを５０μｕの酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）へキソキナーゼ（シグマ及び自家試料をそれぞれ使 用）及び？／Ｌ／トランＭ　−１００（Ｇｒａｉｎ　ＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＣｏ ｒｐ、　Ｈｕｓｃａｔｉｎｅ、　Ｉｏｗａ、　ｕｓ）１５　、Ｑ％、ＰＥＧ−８ ０００５％の組成を持った相システムの９００μρ及びｐＨ６，４の１０ｍＭリ ン酸ナトリウムと混合した。相システムを完全に混合し、その後１時間分離させ た。ビーズはＰＥＧ相中に存在し、その相を取り出してカラムに移した。ＤＨ８ ，５で溶出して酵素をビーズから遊離させた。収量は３２％であった。

マイクロクリスタリンセルロース（Ｈｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ　ｃｅｌｌ ｕｌ。

ｓｅ、　Ｈｅｒｃｋ）をリアクティブプル＝ＩＩ　（Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｂｌｕ ｅｌＩ　、　Ｓｉｇｍａ）と実施例３（ｄ）に記述したものと同様の方法で反応 させた。

５０μｐのアルブミン（Ｓｉｇｍａ）及び５０μｐの誘導化セルロースビーズを 、マルトリンＭ−１００１５，０％及びＰＥＧ−８０００５％を含有する相シス テムと混合した。混合後１時間分離させビーズを含む上相をカラムに移した。０ ．４ＭＫＳＣＮの溶出によりアルブミンをビーズから遊離した。収量は８５％で あった。

３（ｆ）ＤＮＡのアクリジンイエロー−ポリアクリルアミドビーズへの結合 アクリジンイエローを結合したポリアクリルアミドビーズ（ＤＮＡ親和性ゲル、 Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｈａｎｎｈｅｉｍ）５０　ｕ　Ａ及び５０μρの子牛胸 腺の直鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｓｉｏｍａ）及びＥ、ｃｏ＋ｒのプラスミドＤ　Ｎ　Ａ 　（Ｓｉ（１ｍａ）を、デキストランＴ−７０１０％、ＰＥＧ−８０００７，０ ％を含有する相システムの９００μρと混合した。相を混合した後３０分間分離 させ、その後ビーズを含んだＰＥＧ相をカラムに移した。直鎖ＤＮＡは０．２Ｍ Ｎａｃｃで、プラスミドＤＮＡ１．ｌＬｏ、４Ｍ　ＮａＣ，Ｑｏ　４で溶出した 。ｌ）　Ｎ　Ａ　（７）タイプ及び純度は電気泳動くエチディウムー臭素）によ り確認した。

３　（ｑ）ＡＴＰのＰＥＧ−ＤＥΔＦセファセルへの結合ＤＥＡＥセファ４２ル （Ｄ［ＡＥ　５ｅｐｈａｃｃｌ　、登録商標、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を、実施例１〈ｆ）に記述したものと類似の方法で■ボキ シ活性化し、その後Ｐ　Ｅ　Ｇ　−４０００をゲルに結合した。１．６ｍの定着 ゲル懸濁液と、１２．９■のＡＴＰ及びｐＨ７，１の２５ｍＭリン酸カリウムバ ッフ戸−６００μρを含有するＡＴＰ溶液（アデノシン５リン酸、シグマＡ〜２ ３８３）の１００μｐを、ＰＥＧ−４０００７，３％、デキス１〜ランＴ５００ ７．３％を含有しｐＨ７，１の２５ｒＩＦＭリン酸カリウムバッファーに溶解し た相システムと混合した。総量は１２ｇであった。相が分離した後、ゲル粒子を 含む上相をカラムに移した。その後結合△ＴＰを、ｐＨ７，１の２５ｍＭリン酸 カリウムバッファー中の１１ｙｌＮａｃｌで溶出した。

Ａ丁１つの収量は７２，２％（９，３■）であっＩこ。

３（Ｆｌ）アルブミンのＰＥＧ−ＤＦΔＦセファレルへの結合ゲルは実施例３（ ｑ）と同様の方法で調製した。１２ｙの定着ゲル懸濁液を１８７（７）バラ）７ 　（０，ＩＭｌ＝’ＪスｌＩｃ９．。

５　ｍＭＨ（ＩＣｊ！２．　ｂ　ｍＭ　Ｅ　Ｉ）　ｌΔ、ｐｌ−１８，２）及び ５４　Ｑ　ｍ３の生血清アルゾミン（［３Ｓ△、　Ｓｉｇｍａへ−７０３０）と ３０分間ｉｆ〜合しＩこ。ＰＥＧ−’１０００及びデキス１〜ラン工５００を加 え、総量１８０７の相システム（ＰＥＧ６％及びｉゞキス１〜ランフ、２％〉を 生成した。相は１０分以内に分離した１、ゲルを含／ｖだ上相をカラムに移し、 その中で５０　ＴＴＴ　Ｍ　ｌ＝リスを含むｐＨ７，５の溶液で洗かした。ｐｔ −１７，５のトリスバッファー中に溶解したＩ　Ｍ　Ｎａｃ１！ｒ結合ＢＳ△を 溶出した。、　Ｂ　Ｓ　Ａの収量は３３８ｒｎ９（６２，６％）であり、これは グル１ｄ当りＢＳＡ実施例４ 酵母からのアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａ　Ｄ　Ｈ）及びへｙツキナーゼの精 製 水冷容器に入れた４０７！のｐＨ６，’ｌのバッファー（０，０２０ＭＴｒｉｓ ／ｌｌ＋Ｊ、５ｍＭＨ（ＩＣ９２，０，／ＩｍＭＥＤ−１−△）中で１００！？ のパンｇＥＪをガラスピーズと共に８分間激しく撹拌して分解した。その後２０ ．ｏｙのシバクロンブルー−メ１〜キシポリエチレングリ］−ルーセファロース ６Ｂ及び３０ｒｎｆ！のバッファーをさらに加え、総容量を１５０ｍｅとした。

容器を２時間振盪した。その後ポリ丁ヂレノグリニ１−ル４０００　（Ｈｃｒｃ ｋ）及びＫ１１２ＰＯ４とに２１１ＰＯ４のｐＨ７の水成溶液を加えｉＪ、その 結果、２相システム〈リン酸１２％、ポリ丁ヂレノグリｙ−＋−ル１０．０％、 蒸溜水７８％、総量　９００　ｍ！！　）が生成した。

ゲル粒子を含んだ上相を空のグリフ１〜底カラム（内径１．６ｃｍ　）に移し、 ｐＨ６，／ｌのバッファーでゲル粒子を洗浄しＡ：　、。

そしてカラムをクロマトグラノイーシステムとして、ｐＨ６，４（上記と同じ） の１へりスバッノアー中の５ｍＭ二二ｌヂンアミドアデニンジヌクレオヂド（Ｎ ＡＤ、Ｓｉすｍａ）で溶出した。流速は１４．５ｄ／時間であった。Ａ　Ｄ　Ｈ 活性は総Ｅｌ＜　９　ｍｃの分画において検出された。

ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＡ４／３０プレート、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉ ｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｓｗｅｄｅｎ）中の電気泳動で純度をヂエツクし た。同じバッファーにおいてＤＨを８．６まで上昇させると、ヘキソキナーゼが ゲル粒子から溶出された。この酵素は総量９ｉの分画において、存在が見出され 、上記と同様の電気泳動により純度をヂエックした。

このように上記実施例は酵母細胞から容易に調製できる２つの酵素の精製も包含 している。本発明の実際の適用に使用する粒子はただ１つの生物学的活性成分に 対して特異的な親和性を持−）でいてもよいし、また該成分の１つのグループに り・］シて親和ｆ１を持っていてもＪ、い。後者の場合、前述した実施例のよう に、１回に１つの成分を溶出づるための適当な溶出方法を使用づることがｉｉＪ 能である。この１ノ払は、例えばＤＮＡ組換技術によ−）で誘起されたような通 常は存在しないｌ）Ｎ△配列を持った細胞あるいは生物内で形成された物質の精 製にｂ　Ｉｉ’ｉｌ様に適用できる。

実施例５ 血漿１〜ランスフエリンの精製 ＰＥＧ−４０００のセファロースへの結合及びＣＮＢｒ活性化は前記したように 行なった。

１８０ηのアンデートランスフｌリン（Ｂｉｏｃｃｌｌ、１ｌｐｐｓａｌａ。

Ｓｗｅｄｅｎ）を１５９の活性化ゲルに、２．５時間回転振廂し−・晩４℃で撹 拌なしに放置して反応させ結合し７．＝。１４０■の抗体が結合した。

５ｑのゲルを１００ｄのヒト血漿と混合し１．５時間放置した。その後ＰＥＧ− ／Ｉ　０００の最終潤度１０％、リン酸力ｌ）　＋ンムの最終′Ｉａ反１２％と なるようにそれぞれを加え１．：。総Φかは２９５ｇであった。

相が分離した後、ゲルを含／υだ上相をカラムに移し、グルをｐｌ−１７，０の Ｏ，ＩＭリン酸カリウノｘ−’Ｃ洗浄した。収７ｔは５）。

１２■であった。免疫拡Ｖｌｉ、法及び電気泳動により１−ランスへｆリンが免 疫学上粘性を持ち♂１浄なものＣあることが示された。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　少なくとも２つの非混和性水性相よりなるシステムを使用して生物学的 活性物質を精製する方法において、前記物質をその物質に対して親和性を有づる 粒子に結合し、大部分の量を前記相の１つに分布させ、粒子含有相を他の一種以 −にの相から分離した後前記物質が前記粒子から分離することを特徴とする前記 方法。 （２）　生物学的活ｔ！［物質がその物質に対して生物学的特異親和性を右づる 粒子に結合されることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 〈３）　生物学的活性物質がアーＡンあるいはカブオン交換基を含有Ｊる粒子に 結合されることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 （４）　粒子含有相をグリッド底を具備ηるカラムに投入して、粒子が保持され た該カラムをり］］ントグラフイーシステムとし、洗浄及び該物質を粒子からＭ ｍさせる溶液で溶出づることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項のいずれ かに記載の方法。