JPH01254248A

JPH01254248A - 複合化分離剤及びその製造方法

Info

Publication number: JPH01254248A
Application number: JP63078230A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Kusano; 草野　裕志; Takeshi Ito; 剛伊藤; Takayuki Tashiro; 田代　孝行; Hiroaki Takayanagi; 弘昭高柳; Eiji Miyata; 宮田　栄二
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1988-04-01
Filing date: 1988-04-01
Publication date: 1989-10-11
Anticipated expiration: 2013-06-18
Also published as: JP2767251B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（ａ）発明の目的（産業上の利用分野）本発明は、機械的強度に優れ、カラムに充填したときの
通液性が良好で、蛋白質等の生体高分子物のクロマトグ
ラフィー分離用に適する複合化分離剤及びその製造方法
に関する。

（従来の技術）蛋白質等の生体高分子物の分離、精製用の分離剤として
は、デキストラン、アガロースなどの多糖類が使用され
る。この種の分離剤は、Ｒ水性に富んでいて、特に蛋白
質の非特異的吸着が少ない点で優れており、かつ巨大網
目構造を有していて優れた分離能を有することから、ク
ロマトグラフィー、％にｒル濾過クロマトグラフィー分
離用の分離剤として優れたものである。しかし、これら
の分離剤は、その優れた分離性能を有する反面において
、軟質であるために機械的強度に劣り、カラムに層高を
高く充填して高流速で分離を行なわせる工業的スケール
の分離においては１分離剤が圧密化され、通液できなく
なる欠点があった。

（発明が解決しようとする問題点）本発明は、架橋デキストランや架橋アガロース等からな
る巨大網目構造を有する親水性ポリマー分離剤の有する
優れた分離性能を保有しながら、同分離剤の有する機械
的強度の劣る欠点が改良された複合化分離剤及びその製
造方法を提供しようとするものである。

（ｂ）発明の構成Ｘ問題点を解決するための手段）本発明者らは、前記の問題点を解決するために種々研究
を重ねた結果１機械的強度に劣る巨大網目構造を有する
親水性、３ｅ　ＩＪママ−子状分離剤を。

強度の大きい細孔構造を有する親水性ポリマー粒子中に
包み込んだ構造のものとするととくよって。

その目的を達成できたのである。

すなわち、本発明の複合化分離剤は、水中における膨潤
度が１０〜１００ｘ／／ｉ　−ｄ　ｒ　ｙで巨大網目構
造を有する親水性？リフ−粒子状分離剤を、水中におけ
る膨潤度が２０　！Ｉ＋４／、ｌｉ’−ｄｒｙ以下で架
橋度が４〜５０モルチでかつ細孔構造を有する親水性ポ
リマー粒子中に包み込んでなる分離剤である。

そして、かかる本発明の複合化分離剤は、水中における
膨潤度が１０〜１００ｄ／ｇ　−ｄ　ｒ　ｙで巨大網状
構造を有する親水性／　ＩＪママ−子状分離剤を、水中
における膨潤度が２０　ｍＶ＃−ｄｒｙ以下で架橋度が
４〜５０そルチでかつ細孔構造を有する親水性Ｉサマー
粒子形成用の単量体混合物の多孔化剤を含む造球液滴中
又は架橋前の原料ポリマー溶液の造球液滴中に分散せし
めておき１次いで単量体混合物の重合反応又は原料ポリ
マーの不溶化及び架橋反応を行なわせる方法によって、
容易に製造することができる。

本発明の複合化分離剤における水中における膨潤度が１
０〜１００ｒｄ／ｉ　−ｄ　ｒｙで巨大網目構造を有す
る親水性ポリマー粒子状分離剤（以下において。

これを「巨大網目構造を有する親水性、３９　サマー粒
子状分離剤」ということがある。）は、５〜５００μの
範囲内の粒径のものが望ましく、また本発明における水
中における膨潤度が２０　ｍｌ／ｇ−ｄｒｙ以下で架橋
度が４〜５０モルチでかつ細孔構造を有するは、２０〜
１０００の範囲内の粒径を有し、かつ分離をする蛋白質
や酵素等の生体高分子物が自由に拡散できるための大き
さの細孔、すなわち細孔半径１００Ｘ以上の細孔を有す
るものが望ましい。

一般に、巨大網目構造を有する親水性ポリマー粒子状分
離剤は、粒径が小さいほど分離性能が向上するが、しか
しその粒径は細孔構造を有する親水性／　リマー粒子の
細孔径よりも大である必要がある。

本発明の複合化分離剤は、巨大網目構造を有する親水性
ポリマー粒子状分離剤の含有割合が複合化分離剤全体に
対して容積比で４０〜８０チを占めるのが望ましい。

本発明の複合化分離剤における巨大網目構造を有する親
水性ポリマー粒子状分離剤用の原料ポリマーとしては、
蛋白質や酵素等の生体高分子物に対する非特異吸着の少
ないもの、たとえばデキストラン、アガロース等の多糖
類が好ましい。これらの原料親水性ポリマーは、適当々
溶媒に溶解して造球し、架橋反応させて巨大網目構造を
有する親水性ポリマー粒子状分離剤としたのち１本発明
の複合化分離剤の製造に使用される。

その際に用いる溶媒としては、原料親水性ポリマーを溶
解しうるものであれば、何でも使用できるが、通常、水
が最も一般的に用いられる。原料親水性ポリマーを溶媒
、特に水に２〜５０重量％、好ましくは５〜１５重量％
の濃度に溶解させた溶液に架橋剤を添加したものを有機
溶媒中で分散させて造球してから架橋反応させる。

その分散・造球は、原料親水性ポリマーを溶解した溶液
（通常、水溶液）に架橋剤を加えたものを有機溶媒に添
加して、たとえば０〜３０℃の温度で５〜６０分間撹拌
して行なわせる。その際の温度が高すぎると良好な球状
液滴が形成される前に架橋反応が進行するので好ましく
ない。

分散・造球用の有機溶媒としては、通常、トルエン、ベ
ンゼン、クロルベンゼン、ジクロルベンゼン等の芳香族
炭化水素及びそれらのハロダン誘導体；ｎ−へブタン、
ｎ−ヘキサン、流動パラフィン、シクロヘキサン、ジク
ロルメタン、ジクロルエタン等の脂肪族炭化水素、脂環
式炭化水素及びそれらのハロダン誘導体などが用いられ
る。これらの有機溶媒は１通常、単独で用いられるが、
それらを２種以上混合して用いても差支えがなへ有機溶
媒の使用量は、原料親水性−リマー溶液の２容量倍以上
、好ましくは３〜６容量倍である。

有機溶媒中には分散安定剤として、たとえばエチルセル
ロース、セルロースアセテートブチレート。

エチルヒドロキシエチルセルロース等の油溶性セルロー
ス；アラビアゴム、ソルビタンセスキオレエート、ソル
ビタンモノオレエート、ソルビタンモノステアレート等
の油溶性分散安定剤を添加するのが好ましい。その添加
量は有機溶媒に対して。

通常、０．０５〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重
量％である。

架橋剤としては、グルタルアルデヒド、テレフタルアル
デヒド等のジアルデヒド化合物；エピクロルヒドリン、
エビブロモヒドリン等のエピハロヒドリン化合物等の原
料親水性−サマー主鎖間Ｋ。

２個以上の炭素原子を有する架橋部分を形成しうるもの
が好ましい。架橋剤の添加量は、生成分離剤の所望の膨
潤度に応じて変化するが１通常、原料親水性ポリマーの
構成単位１モル当り０．１モル以上である。生成分離剤
の膨潤度は、溶解した原料親水性ポリマー溶液濃度、架
橋剤の添加量を変えることにより、１０〜１００叫／ｊ
ｌ−ｄｒｙ、好ましくは１０〜５０　ｍ４／ｇＩ−ｄｒ
ｙになるように制御する。

架橋反応は１分散・造球後に０〜１００℃、好ましくは
３０〜８０℃の温度で１〜２０時間、好ましくは２〜８
時間反応させて実施する。

架橋反応においては、架橋剤に応じて、触媒として塩酸
や硫酸等の酸、又は水酸化す）　ＩＪウムや水酸化カリ
ウム等のアルカリが使用される。

このようにして得られる架橋反応後の親水性ポリマー粒
子は、濾過して有機溶媒を分離し１次いでアセトンやメ
タノール等の有機溶媒で洗浄したのち、充分に水洗すれ
ば、水中における膨潤度が１０〜１００ＷＬＶＩ！−ｄ
ｒｙで、かつ巨大網目構造を有する分離剤、すなわち本
発明における巨大網目構造を有する親水性ポリマー粒子
状分離剤となる。なお、この種の本発明における巨大網
目構造を有する親水性ポリマー粒子状分離剤は、既に種
々の商品名で市販されているから１本発明の複合化分離
剤は、かかる市販の親水性ポリマー粒子状分離剤を用い
て製造してもよい。

以上詳述した巨大網目構造を有する親水性ポリマー粒子
状分離剤を、細孔構造を有する親水性ポリマー粒子中に
包み込めば１本発明の複合化分離剤となるが、その細孔
構造を有する親水性ポリマー粒子用の親水性ポリマーと
しては、（ｉ）アルキレンジ（メタ）アクリレート及び
／又はグリセリンポリ（メタ）アクリレートからなる架
橋成分単量体と１重合性ビニル基若しくはイソプロペニ
ル基と官能基を有するエステル及び／又はエーテルから
なる主鎖成分単量体との共重合体、（１１）架橋キトサ
ン重合体、及び（ｉｉ）架橋ポリビニルアルコール等の
ような蛋白質や酵素等の生体高分子物の非特異吸着の少
ない親水性ポリマーが用いられる。

なお１本明細書に記載の「（メタ）アクリレート」とは
、アクリレートとメタクリレートとの総称である。

本発明における細孔構造を有する親水性ポリマー粒子は
、水中における膨潤度が１０　ＷＬＶｌｌ−ｄｒｙ以下
で、架橋度が４〜５０モルチで、かつ細孔構造を有する
ものであるが、これは、その膨潤度が１０ｎｌ／１−ｄ
ｒｙを超えると粒子の機械的強度が低下してくるし、そ
の架橋度が５０モルチを超えると親水性−リマーとして
の親水性が失なわれ、蛋白質の非特異的吸着を起こすよ
うになるし、さらにその架橋度が４モルチより小さくな
りても粒子の機械的強度が低下してくる。からである。

また、同ポリマー粒子は、蛋白質や酵素等の生体高分子
物が自由に拡散できる充分な大きさの孔径（孔径半径と
して少なくとも１００Ｘ）の細孔を有する必要がある。

前記（１）の共重合体を用いて本発明の複合化分離剤を
製造する方法について詳述すると、その架橋成分単量体
のアルキレンジ（メタ）アクリレートとしては、炭素数
２〜３のアルキレングリコール又は重合度が４以下程度
のプリアルキレングリコールとアクリル酸若しくはメタ
クリル酸とのエステルが好ましい。その具体例としては
、エチレンクリコールジアクリレート、エチレングリコ
ールジメタクリレート、ｆロピレングリコールジアクリ
レート、プロピレングリコールジメタクリレート、１ｅ
’）エチレングリコールジメタクリレート。

ポリプロピレングリコールジメタクリレートなどがあげ
られる。特に好ましいものはエチレングリコールジ（メ
タ）アクリレートである。

また、その架橋成分単量体のグリセリン２す（メタ）ア
クリレートとしては、グリセリントリアクリレート、グ
リセリンジメタアクリレートなどがあげられる。

また、その主鎖成分単量体としての重合性のビニル基又
はイソプロペニル基を有し、かつ官能基を有するエステ
ル又はエーテルとしては、たとえば重合性のビニル基又
はイソプロイニル基を１個有するカルゲン酸（好ましく
は炭素数が３〜１２のもの）のグリシジルエステル、同
カルゲン酸のヒドロキシアルキルエステル、及び重合性
のビニル基又はイソプロ（ニル基を１個有するアルケニ
ル（好ましくは炭素数３〜１２のもの）グリシジルエー
テルから選ばれる化合物があげられる。それらの化合物
の具体例としては、グリシゾル（メタ）アクリレート、
アリルグリシジルエーテル。

２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、／リエチ
レングリコールモノ（メタ）アクリレートなどがあげら
れる。

かかる架橋成分単量体と主鎖成分単量体とを用いて本発
明の複合化分離剤を製造する代表的な方法は、その架橋
成分単量体の主鎖成分単量体との適当な割合の混合物中
に、前記のようにして製造された巨大網目構造を有する
親水性、３ｅ　１７マ一粒子状分離剤を分散させ、その
分散物の多孔質化剤としての有機希釈剤を加えたものを
、水性媒体中に分散させて造球してから、同水性媒体中
でその造球液滴粒子を懸濁重合させる方法である。すな
わち、前述の架橋成分単量体と主鎖成分単量体との混合
物（同混合物中の架橋成分単量体の含有割合は４〜５０
モルチとする。）に、前述のようにして製造された。或
いは市販の巨大網目構造を有する親水性ポリマー粒子状
分離剤を加え、さらに多孔質化剤として有機希釈剤を適
量加えた混合物を。

適当な乳化剤及び重合開始剤を添加した水性媒体中に加
えて撹拌し、水中油滴型の分散液にして造球させてから
、所望の温度に加熱してその造球液滴粒子を懸濁重合さ
せると、多孔構造を有する親水性／　ＩＪママ−子中に
、巨大網目構造を有する親水性Ｉサマー粒子状分離剤が
複数個包み込まれた構造の本発明の複合化分離剤が形成
される。

その場合に用いる多孔質化剤の有機希釈剤としては、グ
リシジル基やヒドロキシル基等の前述の官能基に対して
不活性のものであれば、何でも使用できる。その具体例
としては、たとえばベンゼン、トルエン、エチルベンゼ
ン、クロルベンゼン、ｎ−オクタン、ジクロルエタン、
シクロヘキサノール、ｎ−オクチルアルコール、ｎ−）
’ｒシルアルコール、ジブチルエーテル、シアミルエー
テル、酢酸グロビル、酢酸ブチル、シクロヘキサノン、
メチルインブチルケトン等があげられ、これらは単独で
又は２種以上の混合物として用いられる。

その使用量は１通常、全単量体量に対してＯ，ＯＳ〜３
重量倍量でおる。

また１重合開始剤としては、たとえば過酸化ベンゾイル
、過酸化ジラウロイル、アゾビスイソブチロニトリル等
があげられ、その使用量は１通常。

全単量体に対して０．０１〜１０重量％濃度範囲から選
ばれる。

懸濁重合反応の終了後、生成分離剤を濾過分離し１次い
でアセトンやメタノール等の有機溶媒で洗浄してから、
さらに充分に水洗すれば１本発明の複合化分離剤が得ら
れる。

また９本発明の複合化分離剤は、細孔構造を有する親水
性ポリマー粒子用の原料ポリｉ−としてキトサンポリマ
ーを用いても製造することができる。

すなわち、前述のようＫして製造された。或いは市販の
巨大網目構造を有する親水性ポリマー粒子状分離剤の水
で膨潤させたものをキトサン酸性水溶液中に分散させた
ものを、有機溶媒からなる分散浴中で撹拌して分散、造
球させたのち１次いでその分散浴中に塩基性物質を加え
て中和してキトサンを不溶化し、さらに架橋剤を添加し
て架橋反応させれば、巨大網目構造を有する親水性、ｆ
ｆ　ＩＪママ−子状分離剤の複数個が、細孔構造を有す
る架橋キトサン重合体粒子中に包み込まれた構造の本発
明の複合化分離剤が得らる。

この場合の不溶化させたキトサンポリマー粒子が何故に
細孔構造を有するものとなるかの詳細な理由は明らかで
ないが、推測によれば、キトサンが中和されて不溶化物
が析出し、相分離を起して不均一構造のものとなって、
細孔が形成される。

と考えられる。

その際に用いる分散浴用の有機溶媒としては、７ｈ、！
：、ｔばトルエン、ベンゼン、クロルベンゼン、ジクロ
ルベンゼン等の芳香族炭化水素及びそのハロゲン誘導体
：ｎ−へブタン、ｎ−ヘキサン、流動／４ラフイン、シ
クロヘキサン、ジクロルメタン、ジクロルメタン等の脂
肪族炭化水素、脂環式炭化水素及びそれらのハロゲン誘
導体などがあげられる。これらの有機溶媒は１通常、１
ｆｌｉ類を単独使用されるが、２種以上を適宜に混合し
て用いても差支えがない、有機溶媒の使用量は、キトサ
ン水溶液の２容量倍以上、好ましくは２〜６容量倍であ
る。

また１分散浴用の有機溶媒中には９分散安定剤、！−し
て、　た、！：、ｔばエチルセルロース、セルロースア
セテートブチレート、エチルヒドロキシエチルセルロー
ス等の油溶性セルロース；アラビアゴム、ソルビタンセ
スキオレエート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタ
ンモノステアレート等の油溶性分散安定剤を添加するの
が好ましい。その添加量は、有機溶媒に対して１通常、
０．０５〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％で
ある。

キトサンの不溶化は１分散・造球後に、塩基性物質を添
加してキトサン酸性水溶液を中和することにより行なわ
せるが、その塩基性物質としては。

水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、
アンモニア、エチレンシアミン等が用いられる。

キトサンの不溶化後に架橋剤を添加して架橋反応させる
が、その架橋剤としては、グリオキゾール、ダルタルア
ルデヒド、テレフタルアルデヒド等のジアルデヒド化合
物：　１．２，３．４−ジェＩキシブタン等のジェポキ
シ化合物；エチレングリコールジグリシジルエーテル、
１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル等のグリ
シジルエーテル化合物；エピクロル辷ドリン、エビブロ
モヒドリン等のエビハロヒドリン化合物；ヘキサメチレ
ンジイソシアネート、１，４−シクロヘキサンジイソシ
アネート等のジインシアネート化合物等のキトサン、主
鎖間に２個以上の炭素原子を有する架橋部分を形成せし
めうるものが用いられる。架橋剤の使用量は、キトサン
のグリコサミンに対して、通常。

４モルチ以上である。

架橋反応は、不溶化後の懸濁液に架橋剤を添加して０〜
１００℃、好ましくは３０〜８０’Ｃで１〜２０時間、
好ましくは２〜８時間処理することにより行なわせるが
、その架橋反応系に必要に応じて、触媒として塩酸や硫
酸等の酸、又は水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等の
アルカリ土類金属ることかできる。

以上のようにして得られた架橋反応後の分離剤をヂ過分
離し、アセトンやメタノール等の有機溶媒で洗浄したの
ち、充分に水洗をすれば本発明の複合化分離剤が得られ
る。

さらに本発明の複合化分離剤は、細孔構造を有する親水
性Ｉリマー粒子用の原料ポリマーとして。

ポリビニルアルコールを用いても製造することができる
。

すなわち、塩類を含有せしめたポリビニルアルコール水
溶液中に、前述のようにして製造された、或いは市販の
巨大網目状構造を有する親水性ポリマー粒子状分離剤の
水で膨潤させたものを分散させた分散液を、有機溶媒か
らなる分散浴中に分散させて造球したのち、ポリビニル
アルコール水溶液の自然グル化現象を利用してその造球
液滴を不溶化させ、さらに架橋剤を用いて架橋反応させ
ることによっても１本発明の複合化分離剤は容易に製造
することができる。

この方法で製造された複合化分離剤は、蛋白質や酵素等
の生体高分子物が自由に拡散できる孔径の細孔を有する
必要があるが、ポリビニルアルコール水溶液の自然グル
化によってかかる細孔が容易に形成され為。

すなわち、ポリビニルアルコール水溶液の自然グル化現
象とは、ポリビニルアルコール水溶液が第三成分として
の架橋剤等を用いなくして不溶化する現象である。ポリ
ビニルアルコール水溶ｉｔ−放置すると、経時的に粘度
上昇を起して、つぃにグル化することは古くから知られ
てい念ことである。この現象は、Ｉリビニルアルコール
分子間の水素統合によ）生起すると考えられておシ、ポ
リビニルアルコール水溶病濃度が高いほど、また放置温
度が低いほど早くグル化する。自然グル化現象を利用し
てグル化させたグル化物が細孔構造を有するものとなる
原因は明らかでないが、推測によれば自然グル化に伴な
ってグル化したポリビニルアルコールが媒体中に析出し
、相分離を起して不均一構造のものとなシ、細孔が形成
される、と考えられる。

この方法においては、巨大網目構造を有する親水性ポリ
マー粒子状分離剤を水で膨潤させてから塩類を含む４リ
ビニルアルコール水溶液中に添加して分散させてもよ騒
し、塩類を含むポリビニルアルコール水溶液中に巨大網
目構造を有する親水性ポリマー粒子状分離剤を添加して
、同水溶液中で同分離剤を膨潤させてもよい。次いで、
同分離剤を分散して含有するポリビニルアルコール水溶
液を、適当な有機溶媒からなる分散浴中に加えて撹拌分
散させて、造球し、次いでその造球した液滴をポリビニ
ルアルコール水溶液の自然グル化現象を利用してグル化
させるとともに、そのグル化物に細孔構造を形成させる
。

その分散中造球において用いる有機溶媒としては、キト
サンを用いて本発明の複合化分離剤を製造する場合に用
いた分散浴用の有機溶媒と同じものが使用される。

ポリビニルアルコールとしては１重合度が数十〜数千の
もの、好ましくは２００〜２００ｏのもので。

ケン化度が９０モル％以上、好ましくは９５モルシ以上
のものが用いられる。ポリビニルアルコール水溶液は、
濃度２〜３０重量％、好ましくは５〜１５重量％におい
て自然グル化するが、そのままでは自然グル化に長時間
を要するから、自然グル化を促進させるために＃１類を
添加する。その塩類としては塩化ナトリウムや硫酸ナト
リウムなどのポリビニルアルコールを沈澱・凝縮させる
作用のあるものが適する。

その塩類の添加量は、塩類の種類等によっても異なるが
、通常、ポリビニルアルコール水溶液中の濃度で３重量
％以上で、ポリビニルアルコールを析出させない範囲内
の濃度で用いられる。塩化ナトリウムの場合についてい
えば、ポリビニルアルコールの重合度、ケン化度及び水
溶液濃度にょシ異なるが、念とえば重合度５００．ケン
化度９８モル％以上のポリビニルアルコールの１０ｉｉ
量５水溶液であれば、ｄｅ　ｌＪビニルアルコール水溶
液中のＮａＣＬ濃度で１〜１２重量％（好ましくは３〜
１０重量％）になる割合で、また５重量％水溶液であれ
ば、同じく１〜１５重量％（好ましくは５〜１３重量％
）になる割合で、それぞれ添加する。

塩類を添加したポリビニルアルコール水溶液には、自然
グル化をさらに促進させるために、水酸化ナトリウム等
の塩基性物質を添加することができる。

自然グル化は、前述のように、水膨潤させた巨大網目構
造を有する親水性、３２１Ｊマ一粒子状分離剤及び塩類
等を添加したポリビニルアルコール水溶液を、有機溶媒
からなる分散浴中で分散・造球させた後に行なわせるが
、その自然グル化は０〜５０℃、好ましくは３〜３０℃
で、２〜２００時間、好ましくは５〜１００時間かけて
行なわせる。１かかる自然グル化によって、巨大網目構
造を有する親水性、ｊ？　ＩＪママ−子状分離剤が複数
個包み込まれ、かつ細孔構造を有するＩリビニルアルコ
ール粒状グル化物が得られる。

次いで、その粒状グル化物を架橋反応させるが、その架
橋剤としては、たとえばグリオキザール、グルタルアル
デヒド、テレフタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物
：　１，２，３．４−ジェポキシブタン等のジェポキシ
化合物；エチレングリコールゾグリシジルエーテル、１
．４−ｆタンジオールジグリシジルエーテル等のグリシ
ジルエーテル化合物；エピクロルヒドリン、エビブロモ
ヒドリン等のエビハロヒドリン化合物；ヘキサメチレン
ジイソシアネート、１．４−シクロヘキサンジイソシア
ネート等のジイソシアネート化合物等の？リピニルアル
コール主鎖間に２個以上の炭素原子を有する架橋部分を
形成しうるものが用いられる。架橋剤の使用割合は、ポ
リビニルアルコールの全水酸基に対して、通常、４モル
％以上である。

架橋反応は、自然グル化後の有機溶媒浴中に架橋剤を添
加して行なわせてもよいし、自然グル化後の球状粒子を
一旦濾過して有機溶媒と分離し、アセトンやメタノール
等の有機溶媒で洗浄したのち、同球状粒子を水中に加え
てから同水中に架橋剤を添加して行なわせてもよい、架
橋反応は、温度０〜１００℃、好ましくは３０〜８０℃
で、１〜２０時間、好ましくは２〜８時間の条件で行な
わせる。その架橋反応系には架橋剤の種類に応じて、触
媒として塩酸や硫酸等の酸、又は水酸化ナトリウムや水
酸化カリウム等のアルカリを添加する。すなわち、架橋
剤としてジアルデヒド化合物を用いる場合には、触媒と
して水層中の酸濃度が０、ＩＮ以下になる割合で酸を添
加するしくなお、その酸濃度が０．ＩＮを超えると、デ
キストラン系分離剤のデキストランのグリコシド結合が
切れて、グルが分解する。）、エビハロヒドリン化合物
を用いる場合には、水層中のアルカリ濃度が２Ｎ以上に
なる割合でアルカリを添加する（なお、そのアルカリ濃
度が２Ｎ未満になると、エピクロルヒドリンの反応性が
悪くなる。）。

架橋反応は、水中で架橋反応させる場合も含めて、硫酸
ナトリウムや塩化ナトリウム等の塩類又は塩類水溶液を
添加して行なわせるのが好ましい。

その塩類の添加量は、塩類の種類によっても異なるが、
通常、水層中の濃度として６重量％以上で、／　リピニ
ルアルコール水溶液が沈澱凝析を起こす濃度以上の割合
で添加させる。たとえば、塩化ナトリウムの場合には２
０重量シ以上、硫酸ナトリウムの場合には６重量％以上
添加される。

架橋反応後の粒子をヂ過分離し、次いでアセトンやメタ
ノールなどの有機溶媒で洗浄したのち充分に水洗すれば
、本発明の複合化分離剤が得られる。

生成複合分離剤の有機溶媒を完全に除去するには、濾過
分離した分離剤を水中で加熱して共沸によシ有機溶媒を
留去させるようにする。

以上の各種の方法で製造される本発明の複合化分離剤は
、全体の粒径が２０〜１０００μで、粒径５〜５００μ
の巨大網目構造を有し水中における膨潤度１０〜１００
ψＪＦ−ｄｒｙの親水性ポリマー粒子状分離剤が、水中
における膨潤度が２０吟、９−ｄｒｙ以下で架橋度が４
〜５０モル％で細孔構造を有する親水性ポリマー粒子中
に包み込まれた構造を有するものであり、その複合化分
離剤全体に対して巨大網目構造を有する親水性ポリマー
粒子状分離剤が４０〜８０容量５を占めるものである。

そして、この複合化分離剤は、蛋白質等の生体高分子物
の非特異的吸着の少ない巨大網目構造を有する親水性？
リブ−粒子状分離剤が、機械的強度に優れた細孔構造を
有する親水性ポリマー粒子中に包み込まれ九構造を有す
るものであるから、機械的強度が犬でカラムに層高く充
填しても圧密化されにくくて通液性に優れている。しか
もその蛋白質等の生体高分子物が自由に拡散できる細孔
を有する多孔構造の親水性ポリマー粒子内に撓み込まれ
た巨大網目構造を有する親水性／　ＩＪママ−子状分離
剤は、蛋白質等の生体高分子物の非特異的吸着の少ない
ものであるので、たとえばγ−グロブリン、アルブミン
、ジオグロビン等の各種の蛋白質をはじめとする生体高
分子物のクロマトグラフィー、特に水系ｒルパーミエイ
シランクロマトグラフィー分離において優れ要分離性能
を発揮できる。

（実施例等）以下に、実施例及び実験例をあげて詳述するが、本発明
はこれらの例によって限定されるものではない。

実施例１撹拌機及び還流冷却管を取付けた０、５１の三つロフラ
スコに、ジクロルエタン２５０ｄを入れ、セルロースア
セテートブチレート（イーストマンコダック社商品名Ｃ
ＡＢ　３８１−２０　）　０．５．９を溶解して分散浴
を作った。

別に、撹拌機及び還流冷却管を取付けた２００ｄの三つ
ロフラスコに、塩化ナトリウム５ｇ、水５０ｍ／を入れ
、撹拌して溶解させたのち、粉末状のポリビニルアルコ
ール（日本合成化学工業株式会社商品名デーセノールＮ
Ｌ−０５）　２．５　＃を加えて分散させ、９８℃で１
時間加熱して溶解させ、さらに５Ｎ水酸化ナトリウム水
溶液６ｍｌを加えて、室温まで冷却した。

別に、市販の巨大網目状構造を有する架橋デキストラン
系分離剤〔ファルマシア株式会社商品名セファデックス
Ｇ　５０　（Ｍｅｄｌｕｍ）　、水中における膨潤度１
０１ｌＬ４／ｇ−ｄｒｙ　）　５０１を、撹拌機及び還
流冷却管を取付けた２００−の三つロフラスコ中の塩化
ナトリウム水溶液（塩化ナトリウム５ｇを水５０−に溶
解したもの）中に加えて分散させ、９８℃で１時間加熱
膨潤させたのち、室温まで冷却した上記のポリビニルア
ルコール溶液中に加えて撹拌し、分散させた。

次いで、この分散液を上記のジクロルエタン分散浴中に
加えて分散させ、造球し、室温で１９時間撹拌しながら
放置して、その造球液滴を自然ｒル化させた。

その自然ｒル化後、さらに２５重量％食塩水１００−を
加え、５時間撹拌しながら放置したのち濾過し、アセト
ン及びメタノールで順次に洗浄してから水洗した。得ら
れた球状ｒル化物を再び撹拌機付きの５００−三つロフ
ラスコに移し、塩化ナトリウム４０Ｉｉ、水２００１１
Ｌｌを加えて撹拌しながら、２５重量５グルタルアルデ
ヒド水溶液１．４−を加え九のち、５Ｎ塩酸４ｒＲ１を
加え、撹拌しながら６５℃で２時間加熱して架橋反応さ
せた。

次いで室温まで冷却後、濾過し、充分に水洗し九ところ
、平均粒径２２０μの架橋デキストジン系分離剤を約１
６個包み込んで含有する平均粒径が７００μの乳白潤色
をした球状架橋、ｊ（’　リビニルアルコールの粒子状
複合化分離剤が得られ念。

この分離剤における架橋ポリビニルアルコール部分は、
水中における膨潤度が１２　ｒｎｌ／１−ｄｒｙで、架
橋度が２５モル％のものでありた。

なお、この実施例１において用いた市販の架橋デキスト
ラン系分離剤の種類と添加量、使用したポリビニルアル
コールの種類と添加量、及び水酸化ナトリウムの添加量
は第１表にまとめて示すとおシである。

実施例２実施例１において用いた市販の架橋デキストラン系分離
剤の代シに、第１表に示すように他の市販の架橋デキス
トラン系分離剤〔ファルマシア株式会社商品名セファデ
ックスＧ１００（Ｍ＠ｄｉｕｍ）、水中における膨潤度
１８　ＷＬＶｌｌ−ｄｒｙ　：］　３１を使用し、その
ほかは実施例１に記載の方法を用いて、平均粒径２１０
μの架橋デキストラン系粒子状分離剤約１８個を包み込
んで含有する平均粒径が７００μの乳白潤色をｐ＋球状
架橋ポリビニルアルコール粒子状複合化分離剤を得た。

この分離剤における架橋ポリビニルアルコール部分は、
水中における′膨潤度が１２ψ、９−ｄｒｙで、架橋度
が２５モルシであり之。

なお、この実施例２における使用各成分の種類及び添加
量は第１表に示すとおりでありた。

実施例３撹拌機及び還流冷却管を取付け＆２００ｍの三つロフラ
スコに、塩化ナトリウムＩＯＮ、水１００−を入れ、撹
拌して溶解させたのち、粉末ポリビニルアルコール（日
本合成化学工業株式会社商品名ゴーセノールＮＨ−１８
）　３．５１！、市販の架橋デキストラン系分離剤〔フ
ァルマシア株式会社商品名セファデックスＧ１５０（Ｓ
Ｆ）　、水中における膨潤度２０　ｊＩ４／ｌ／−ｄｒ
ｙ　）　２．５．９を加えて分散させ、９８℃で３時間
加熱してポリビニルアルコールを溶解させ、かつ架橋デ
キストラン系分離剤を膨潤させ次のち、５Ｎ水酸化ナト
リウム水溶液４ｄを加えて撹拌した。

次いで、室温まで冷却してから、セルロースアセテート
ブチレートの添加量を１．２４Ｍ’に変えたほかは実施
例１と同様にして有機溶媒中に分散・造球させ、室温で
１９時間撹拌しながら放置して、ポリビニルアルコール
の自然ゲル化現象を利用してその造球液滴をダル化した
。

その自然ｒ層化後、さらに２０重量５塩化ナトリウム水
溶液１００ｒＩＬｌ加え、５時間撹拌しながら放置して
から一過し、アセトン及びメタノールで順次に洗浄し、
さらに水洗した。

得られた球状グル化物を撹拌機付きの３００１ｎｌの三
つロフラスコに移し、水８０．ｄを入れて撹拌しながら
冷却下で粒状の水酸化ナトリウム７２１！を加えて溶解
させたのち、エピクロルヒドリン３８ｄを加え、撹拌し
ながら６０℃で６時間加熱して架橋反応させ九。室温ま
で冷却後に濾過し、充分に水洗してから、もう−度前記
と同一の条件で架橋反応させたのち、室温まで冷却し、
濾過し、充分に水洗して複合化分離剤を得た。

この複合化分離剤は、平均粒径６８μの架橋デキストラ
ン系分離剤約７０個が包み込まれて含有する平均粒径が
３５０μの薄い黄色をした球状架橋ポリビニルアルコー
ル粒子状分離剤であった。

この複合化分離剤における架橋ポリビニルアルコール部
分は、水中における膨潤度が８　ｍｌ／ｇ−ｔｌｒｙ、
架橋度が約１５モル秀で６−）た。

なお、この実施例３における使用成分の種類及び添加量
は第１表に示すとおりである。

実施例４使用ポリビニルアルコールの種類及び使用量を第１表に
示すように変更し、そのほかは実施例３と同様の方法で
複合化分離剤を製造した。

得られた分離剤は、平均粒径６８μの架橋デキストラン
系分離剤約７０個が包み込まれて含有する平均粒径が３
５０μの薄い黄色をした球状架橋ポリビニルアルコール
粒子状の複合化分離剤であっ之。

この複合化分離剤における架橋承りビニルアルコール部
分は、水中における膨潤度が１０１ＬＶ１０１ＬＶで、
架橋度が約２０モル％でらりた。

なお、実施例４における使用各成分の種類及び添加量は
第１表に示すとおシである。

以下余白実験例１内径８．２鱈φのガラスカラム（シャケ、ト付）に粒径
１４９〜２９７μに整粒した実施例４で得られた複合化
分離剤を充填した。分離剤の層高は５゜αでありた。カ
ラムを循環水で２５℃に保ち、カラム上部から蒸留水を
一定流速で流した。充填層が安定し、カラムの上部に取
付けた圧力計の指針が一定になりたところで圧力計の目
盛を読みとり、その値から分離剤を充填していない、い
わゆる空力ラムの状態で前述の操作と全く同様の操作を
した場合の圧力計の読みとυ値を差し引いて、圧力損失
（ΔＰ、単位−ら２／　５０ｃｒｎ−ｂ・ｄ）を求めた
。

流速（ＬＶ：線流速、単位ｍ／ｈｒ）を程々に変えて圧
力損失（ΔＰ）を測定したところ、第１図に示す結果が
得られた。測定をした流速の範囲内（Ｌｖとして３Ｖｈ
ｒ以下）では、実施例４で得られた複合化分離剤を用い
た場合のΔＰとＬＶとの間には直線的関係が成立し、Ｌ
Ｖ＝３ｍ／ｈｒという高流速で通液しても、分離剤粒子
の変形、破砕が全く認められなかりた。

なお比較のために、実施例４で得られた複合化分離剤の
代シに、実施例４で原料として用いた架橋デキストラン
系分離剤のセファデックスＧｌ　５０（Ｍ）（７アルマ
シア社商品名）を用い、そのほかは上記の同様の実験を
し、ΔＰとＬＭの関係を求めたところ、第１図、に示す
結果が得られた。この場合には、流速（ＬＭ　）が０．
３ｍ／ｈｒを越えるあたシから、ΔＰが急激に立ち上シ
はしめ、ＬＶｏ、６以上では通液が困難になった。

実験例２実施例１及び２で得られた各複合化分離剤をそれぞれ１
０■φ×５００■Ｈのガラスカラムに充填し、充分に水
洗したのち、較正曲線を作成するために以下の操作を行
ない、グル濾過クロマトグラフィー用担体としての性能
評価をした。

すなわち、分子量既知のデキストラン水溶液（濃度５　
Ｗ／Ｖ％）を１００μｌ、ポリエチレングリコール水溶
液（濃度２Ｗ／Ｖ％）を３００μノ、上記のカラムにチ
ャージし、次いで流速９．４１＋１７／ｗｉｎで蒸留水
を流し、デキストラン、ポリエチレングリコールをそれ
ぞれ溶出させた。

流出液中のテキストラン、ポリエチレングリコールを示
差屈折計を用いてそれぞれ検出し、その溶出位置（ピー
クのドッグ位置）を求めた。その結果は第２図に示すと
おシでＴｏシ、実施例１及び２で得られた各複合化分離
剤の較正曲線は、包み込まれた架橋デキストラン系分離
剤のダルシ過性能を示している。また、その各複合化分
離剤の較正曲線は、良好な直線性を示し、グル濾過クロ
マトグラフィー用担体として好適ものであることがわか
る。

実験例３実施例３及び４で得られた各複合化分離剤を内径８．２
−φ×５００■Ｈのガラスカラムにそれぞれ充填し、１
５０ｍＭのＮａＣｔを含有する５０ｍＭのリン酸バッフ
ァー（ＰＨ７，４０）で充分に平衡化したのち、蛋白質
の較正曲線を作成するために、以下の操作を行ない、）
ｒ”Ａ／ｆｌ過クロマりグラフィー用担体としを０．１
％の濃度になるように、１５０ｍＭのＮａＣ１を含有す
る５　０　ｍＭのリン酸バッファー（ｐｉ−１７，４０
）ＩＣ溶解させ、その１５０μノを上記のカラムにチャ
ージした。チャージ後、流速０．２　ｍ／ｍ監ｎで１５
０　ｍＭのＮａＣ１を含有する５０ｍＭのリン酸バッフ
ァーを流し、蛋白質を溶出した。蛋白質の検出は、ＵＶ
計を用いて行表りた（２８０ｍｍ）。

なお、比較のために、実施例３及び４で得られた複合化
分離剤の代）に、それらの各実施例でぶ料として用いた
架橋デキストラン系分離剤のセファデックスＧ１５０（
Ｍ）（７アルマシア社商品名）を用い、全く同様の操作
を行なりて蛋白質の較正曲線を求めた。

その較正曲線は、蛋白質の溶出位置から下記式によ〕保
持容量ＫａＶ値を求め、その値を分子量に対してプロッ
トして求めた。その結果は第３図に示すとおシであった
。

Ｖｊ　−Ｖ。

式中のｖｔ：分離剤全体積（ｗＬｔ） ■、：溶出体積ＣＴＬＩ’）ｖｏ：排除体積（′１１１）なお、ｖｏは分子量約２００万のブルーデキスト２ンを
用いて求めた値である。

使用した蛋白質第３図より明らかなように、実施例３及び４の複合化分
離剤は較正曲線が良好な直線性を示し、ｒル濾過りロマ
トグラフィー用担体（分離剤）として好適なものである
。

（Ｑ発明の効果本発明の複合化分離剤は、巨大網目構造を有す性ポリマ
ー粒子中に包み込んだ構造を有しているために、機械的
強度が大でカラムに充填したときの圧密化が少なく、通
液性に優れておシ、かつその巨大網目構造を有する親水
性／＋７マ一粒子状分離剤にもとづき蛋白質等の生体高
分子物のクロマトグラフィー分離用の担体（分離剤）と
して優れたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例４で得られた複合化分離剤及
び比較のための架橋デキストラン系分離剤について、カ
ラムに充填したときの圧力損失ΔＰと流速ＬＶとの関係
を試験した結果を示す図面である。第２図は、本発明の実施例１及び２で得られた複合化分
離剤についてのデキストランとポリエチレングリコール
の較正曲線、第３図は、実施例３及び４で得られた複合
化分離剤と、比較のための架橋デキストラン系分離剤の
蛋白質の較正曲線である。第３図における各符号はそれ
ぞれ下記のものを示す。１−・・テログロブリン、２・・・フェリチン、３・・
・牛血清γ−クロプリン、４・・・牛血清アルブミン、
５・・・卵白アルブミン、６・・・ジオグロビン。特許出願人　三菱化成工業株式会社第１図遣浅遺速り、Ｖ　（ｍ／ｈと）イ呆　持　８１ｋａＶ

Claims

【特許請求の範囲】１）水中における膨潤度が１０〜１００ｍｌ／ｇ−ｄｒ
ｙで巨大網目構造を有する親水性ポリマー粒子状分離剤
を、水中における膨潤度が２０ｍｌ／ｇ−ｄｒｙ以下で
架橋度が４〜５０モル％でかつ細孔構造を有する親水性
ポリマー粒子中に包み込んでなる複合化分離剤。２）水中における膨潤度が１０ｍｌ／ｇ−ｄｒｙ以下で
架橋度が４〜５０モル％でかつ細孔構造を有する親水性
ポリマー粒子用の親水性ポリマーが、アルキレンジ（メ
タ）アクリレート及び／又はグリセリンポリ（メタ）ア
クリレートからなる架橋成分単量体と、重合性のビニル
基若しくはイソプロペニル基と官能基を有するエステル
及び／又はエーテルからなる主鎖成分単量体との共重合
体、架橋ポリビニルアルコール、又は架橋キトサンポリ
マーである第１請求項記載の複合化分離剤。３）水中における膨潤度が１０〜１００ｍｌ／ｇ−ｄｒ
ｙで巨大網目構造を有する親水性ポリマー粒子状分離剤
が、架橋デキストラン又は架橋アガロースである第１請
求項、又は第２請求項記載の複合化分離剤。４）水中における膨潤度が１０〜１００ｍｌ／ｇ−ｄｒ
ｙで巨大網目構造を有する親水性ポリマー粒子状分離剤
を、水中における膨潤度が２０ｍｌ／ｇ−ｄｒｙ以下で
架橋度が４〜５０モル％でかつ細孔構造を有する親水性
ポリマー粒子形成用の単量体混合物の多孔化剤を含む造
球液滴中又は架橋前の原料ポリマー溶液の造球液滴中に
分散せしめておき、次いで単量体混合物の重合反応又は
原料ポリマーの不溶化及び架橋反応を行なわせる第１請
求項、第２請求項、又は第３請求項記載の複合化分離剤
の製造方法。