JP2000262895A - 免疫吸着剤マトリックスの製法および免疫吸着剤カラム - Google Patents

免疫吸着剤マトリックスの製法および免疫吸着剤カラム

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JP2000262895A JP11071982A JP7198299A JP2000262895A JP 2000262895 A JP2000262895 A JP 2000262895A JP 11071982 A JP11071982 A JP 11071982A JP 7198299 A JP7198299 A JP 7198299A JP 2000262895 A JP2000262895 A JP 2000262895A
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P Sharuma Chandora
ピー.シャルマ チャンドラ
R Hari P
ピー.アール.ハリ
Paul Willey
パウル ウイリイ
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 直接血液灌流に使用するための免疫吸着剤マ
トリックスを製造する方法を提供すること。 【解決手段】 ポリビニルアルコールを架橋剤で部分的
に架橋することによってポリビニルアルコールビーズを
得る; このビーズの上にフェニルアラニンを結合させて
フェニルアラニンポリビニルアルコールビーズのCOO
H官能基を得る;そして前記ビーズの上にヘパリンを固
定化するためにCOOH官能基を活性化する; 諸工程を
含む、免疫吸着剤マトリックスの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、修飾されたポリビ
ニルアルコール微小球 (modified polyvinyl alcohol m
icrospheres)を基材とした免疫吸着剤マトリックス (im
munoadsorbent matrix) を製造する方法と、この免疫吸
着剤マトリックスを直接血液灌流 (directhaemo-perfus
ion) 用のカラムの中で使用することに関する。
【0002】
【従来の技術】血漿交換(plasma exchange) は様々な手
に負えない障害や神経疾患の治療における最も普遍的か
つ有効な療法になってきている。血漿製品(plasma prod
ucts)の入手困難性と高価格及び感染の危険性は血漿療
法機器の開発に導く。選択吸着血漿療法(selective ads
orption plasma treatment) は今や、重症筋無力症、ギ
ラン−バレ症候群(GBS)、全身性ループスエリテマ
トーデス(SLE)等、の治療のために十分に確立され
た臨床的慣行であるが、血漿交換法よりもかろうじて安
価であるに過ぎず、そしてカラムは血漿灌流のためだけ
にある。しかしながら、これは血漿浄化法(plasmaphere
sis)に対する血漿製品の依存性を解消することができ、
従って、感染の危険性を回避できる。血漿灌流のためだ
けの様々な免疫吸着カラムが入手可能であるが、直接血
液灌流用のカラムを有することは未だ知られていない。
また、血漿分離と血漿治療を単一装置又は直接血液灌流
で達成することによって更に簡便にし治療コストを軽減
することができる機器を有することは知られていない。
【0003】この分野では、血液を血液ポンプ及びカラ
ムを通して引き出しそして血漿分離器として機能して血
球を血漿から分離させる装置及び方法が知られている。
血漿は次いで免疫吸着剤カラムを通過するとIgGタン
パク質が吸着剤に吸着され、そしてこの処理済み血漿は
次いで、先に除去した血球と混合され、そして患者に戻
される。かかる方法及び装置の欠点はかなりコストがか
かることである。更には、かかる方法は一度、二度と繰
り返されなければならず、そしてその都度、カラム及び
血漿分離器が交換されなければならない。
【0004】この分野で知られている更に別の方法及び
装置は患者の血液を抜き取るものであり、血液は次いで
遠心分離されて血漿を除去され、それは次いでドナーか
らの新鮮血液の血漿によって置き換えられる。かかる方
法及び装置の欠点はドナーの新鮮血液における感染であ
る。また、遠心分離で溶血が起こることがある。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
【発明の目的】本発明の目的は、直接血液灌流用にポリ
ビニルアルコール微小球を基材とした免疫吸着剤マトリ
ックスを製造する方法を提供することである。
【0006】本発明の別の目的は、血液からIgGタン
パク質を特異的に除去することができ且つ高度に血液適
合性である、ポリビニルアルコールを基材とした免疫吸
着剤マトリックスを製造する方法を提供することであ
る。
【0007】本発明の更に別の目的は、クラスGの免疫
グロブリンに属する又はそれからなる抗体及び循環性免
疫複合体を特異的に除去するための、ポリビニルコール
を基材とした免疫吸着剤マトリックスを製造する方法を
提供することである。
【0008】本発明の更に別の目的は、IgG媒介障害
を治療するためにヒト患者血液の直接灌流を行うために
使用することができる免疫吸着剤カラムを提供すること
である。
【0009】本発明の更に別の目的は、血漿療法機器に
代わるもっと複雑でなく且つ経費のかからない代替機器
として臨床的に応用されてもよい血液灌流用免疫吸着剤
カラムを提供することである。
【0010】本発明の更に別の目的及び利点は以下の記
載から明らかになるであろう。
【0011】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、 a)ポリビニルアルコールを架橋剤で部分的に架橋する
ことによってポリビニルアルコールビーズを製造する; b)このポリビニルアルコールビーズの上にフェニルア
ラニンを結合させてフェニルアラニンポリビニルアルコ
ールビーズのCOOH官能基を得る; c)前記フェニルアラニン結合ビーズの上にヘパリンを
固定化するために前記COOH官能基を活性化する;諸
工程を含む、免疫吸着剤マトリックスの製造方法が提供
される。
【0012】本発明によれば、この免疫吸着剤ビーズの
製法は部分的に架橋されたポリビニルアルコール(PV
A)ビーズを製造することを含み、それには、まず、P
VAの水溶液をグルタルアルデヒドと混合し、そしてこ
の混合物を油媒体の中に攪拌によって分散させる。この
分散されたPVA溶液に塩化ベンゾイルをゆっくり滴下
で添加する。反応が完了したら、こうして形成されたビ
ーズに濾過、洗浄、乾燥及び篩い分けの工程を受けさせ
て、架橋PVAビーズを得る。この乾燥架橋ビーズはア
ルカリ性媒体の中で膨潤させられ、次いで濾過され、そ
して次いでこの膨潤ビーズにエピクロロヒドリンと1,
4−ジオキサンの混合物を添加し、そして加熱によって
反応を行う。この反応混合物を冷却し、次いで洗浄し、
そしてこの洗浄されたビーズに穏やかな攪拌を伴うアミ
ノ酸溶液による処理を受けさせ、そしてこのビーズを洗
浄して、アミノ酸結合PVAビーズを得る。このアミノ
酸結合ビーズはPBSの中の1−エチル−3−(3−ジ
メチルアミノプロピル)カルボジイミドに曝すことによ
って活性化され、その後に、この活性化されたビーズを
ヘパリン溶液に曝し、洗浄して未結合ヘパリンを除去し
て、免疫吸着剤ビーズ、Hep−ph−PVA、を得る
工程を受けさせられる。
【0013】
【発明の実施の態様】この製法の第一工程はポリビニル
アルコール(PVA)ビーズの製造にある。このために
は、部分的に架橋されたPVAビーズが酸触媒反応によ
って製造されるが、それには、まず、分子量1,00,
000〜1,50,000のPVAの水溶液を3〜6m
Lのグルタルアルデヒドの中に混合し、そして油媒体の
中に分散させ、そして攪拌の工程を受けさせる。PVA
溶液が完全に分散されたら、触媒を滴下で添加する。触
媒は例えば塩化ベンゾイルである。約30分間の反応が
完了した後に、このビーズを濾過し、洗浄し、乾燥し、
そして分級する。
【0014】PVAビーズの架橋において使用される油
媒体は重い液体パラフィン油と軽い液体パラフィン油の
例えば2:1の割合であり、それにソルビタンモノオレ
エートが添加されている。好ましくは、約500mLの
油溶液は約355mLの重い油と165mLの軽い油
を、0.4mLのソルビタンモノオレエートと共に含有
している。
【0015】ビーズの洗浄は、有機溶剤、好ましくは、
エーテルとその後のアセトン、そして次いで蒸留水を使
用して行われる。
【0016】この製法におけるその次の工程は、このP
VA微小球の上にフェニルアラミンを結合させることで
あり、それは図1に示された反応スキーム(スキーム
I)に従って遂行される。
【0017】安定なアミノ酸リガンドはビーズの上に膨
潤によって結合される。既知量の乾燥ビーズをアルカリ
性媒体の中で膨潤させ、そして濾過した。この膨潤され
たビーズに、エピクロロヒドリンと有機溶剤たとえば
1,4−ジオキサンとの混合物を添加し、そして反応を
100〜120℃で1時間行った。この混合物を室温に
冷却し、その後でアセトン及び蒸留水によって洗浄して
過剰の反応混合物を除去しそして最終的に中性にする。
フェニルアラニンは、この活性化されたビーズを250
mg%以上のアミノ酸溶液で40〜60℃で穏やかな攪
拌を伴って処理することによって、ビーズ上に結合され
る。ビーズは未結合アミノ酸を含有しないように洗浄さ
れた。可能な反応が図1に示されている。
【0018】ビーズはアセトン及び蒸留水によって洗浄
されて未結合アミノ酸を除去されそして最終的に中性に
される。
【0019】フェニルアラニン結合ビーズの上にヘパリ
ンを固定化することは、図2に示されている反応スキー
ム(スキームII)に従って遂行される。
【0020】アミノ酸結合PVAビーズ(湿潤)をPB
Sの中の1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピ
ル)カルボジイミドに曝す。この活性化されたビーズを
蒸留水で洗浄し、その後で、PBS中の4〜25mg%
ヘパリン溶液に曝して様々な量のヘパリンが結合してい
る吸着剤を得る。次いで、このHep−ph−PVAビ
ーズを蒸留水で洗浄して未結合ヘパリンを除去する。
【0021】これら2つの反応は室温で、それぞれ約
8.5及び5.5のpHで、穏やかな攪拌を伴って行わ
れる。
【0022】本発明のもう一つによれば、このHep−
ph−PVAビーズをカラムに充填し、そして、Gの免
疫グロブリンに属する又はそれからなる抗体、即ち、ア
ンチDNA、AChRab、アンチGBMのような抗
体、及び循環性免疫複合体を特異的に除去するための血
液灌流に使用する。
【0023】
【実施例】本発明のその他の対象及び利点は下記の表に
示した実施例及び比較検討から明らかであろう。
【0024】
【表1】表I: 各種吸着剤を充填したカラムを通しての
灌流の前と後のコウシ血液の血小板、赤血球(RBC)
及び白血球(WBC)の数(×1000/cmm)
【0025】
【表2】表II: カラムを通して1時間灌流後の患者血液
の免疫タンパク質及びC3の減少率(RR%)
【0026】
【表3】表III: 灌流(1時間)の前と後の全タンパク
質及び生化学パラメーターのレベル
【0027】
【表4】表IV: ヘパリン固定化マトリックス24g(湿
潤)を充填したカラムを通してのヒト血液60mLの流
速12mL/分での生体外血液灌流の後の免疫タンパク
質及びC3の減少率(%)
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、PVA微小球の上にフェニルアラミン
を結合させるための反応経路を示す。
【図2】図2は、フェニルアラニン結合ビーズの上にヘ
パリンを固定化するために反応経路を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 599036945 ウイリイ パウル インド国オラー ピー.オー. トリチヤ ー,プラシイウシヤ (72)発明者 チャンドラ ピー.シャルマ インド国695 018 トリバンドラム,パパ ナムコード,シー.ジー.エス.ナガル, 38 (72)発明者 ピー.アール.ハリ インド国695 006 トリバンドラム,ピ ー.オー.シルマラ,バリヤビラ,ミスリ ナガル シー − 23(1),ティ,シ ー,8/1142(5) (72)発明者 ウイリイ パウル インド国オラー ピー.オー. トリチャ ー,プラシイウシヤ Fターム(参考) 4C077 AA12 AA30 BB03 KK13 MM05 NN05 PP09 PP30 4D017 AA11 BA03 CA13 CA14 CB01 DA03 EA01 4G066 AB05D AB21D AB27A AC12B AC35B AD15B BA09 CA20 CA54 DA12 EA01 FA34 FA37

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 a)ポリビニルアルコールを架橋剤で部
    分的に架橋することによってポリビニルアルコールビー
    ズを製造する; b)このポリビニルアルコールビーズの上にフェニルア
    ラニンを結合させてフェニルアラニンポリビニルアルコ
    ールビーズのCOOH官能基を得る; c)前記フェニルアラニン結合ビーズの上にヘパリンを
    固定化するために前記COOH官能基を活性化する;諸
    工程を含む、免疫吸着剤マトリックスの製造方法。
  2. 【請求項2】 ポリビニルアルコール(PVA)の水溶
    液をグルタルアルデヒドと混合しそしてこの混合物を油
    媒体の中に攪拌によって分散させ、この分散PVA溶液
    に塩化ベンゾイルをゆっくり滴加し、反応が完了したら
    こうして形成されたビーズに濾過、洗浄、乾燥及び篩い
    分けの工程を受けさせて架橋PVAビーズを得ることに
    よる、部分的に架橋されたポリビニルアルコール(PV
    A)ビーズを製造する工程を含む、請求項1の方法。
  3. 【請求項3】 乾燥架橋ビーズをアルカリ性媒体の中で
    膨潤させ、次いで濾過し、この膨潤ビーズにエピクロロ
    ヒドリンと1,4−ジオキサンの混合物を添加し、加熱
    して反応させ、この反応混合物を冷却した後に洗浄しそ
    してこの洗浄されたビーズにアミノ酸溶液による処理を
    穏やかな攪拌を伴って受けさせ、そしてこのビーズを洗
    浄してアミノ酸結合PVAビーズを得る、工程を含む、
    請求項1の方法。
  4. 【請求項4】 アミノ酸結合ビーズをPBSの中の1−
    エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジ
    イミドに曝すことによって活性化させる工程の後に、こ
    の活性化されたビーズをヘパリン溶液に曝し、洗浄して
    未結合ヘパリンを除去して、免疫吸着剤ビーズ、Hep
    −ph−PVA、を得る工程を含む、請求項1の方法。
  5. 【請求項5】 前記油媒体が、重い液体パラフィン油と
    軽い液体パラフィン油をソルビタンモノオレエートと共
    に含む、請求項2の方法。
  6. 【請求項6】 エピクロロヒドリンと1,4−ジオキサ
    ンが1:1の割合で存在する、請求項2の方法。
  7. 【請求項7】 膨潤ビーズが、エピクロロヒドリンと
    1,4−ジオキサンによって、100〜120℃の範囲
    の温度で、処理される、請求項2の方法。
  8. 【請求項8】 アミノ酸溶液による処理の工程が40〜
    60℃の範囲の温度で約4時間行われる、請求項2の方
    法。
  9. 【請求項9】 ヘパリンに曝す工程のためには、PBS
    中の4〜25mg%ペパリン溶液が使用される、請求項
    3の方法。
  10. 【請求項10】 免疫吸着剤ビーズ、Hep−ph−P
    VA、で充填されたカラムからなる、免疫吸着剤カラ
    ム。
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