JPH0252669A - β↓２−ミクログロブリンの体外循環治療用及着材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液、血漿、血清、腹水、膨水等の体液中よ
り疾患に関連した悪性物質を選択的に吸着、除去する体
液浄化用吸着材に関する。

さらに詳しくは、腎不全患者や悪性腫瘍患者の体液中に
増加し、手根骨症候群、アミロイド−シス、弾発指・肩
・膝関節症、皮膚掻痒症、骨障害等の原因となるβ２−
ミクログロブリンの吸着材に関する。

（従来の技術） 腎不全患者に血液透析が施行され、約１０年の年月が経
過し、手根骨症候群等の異常が顕在化してきた。近年、
この原因物質が透析では比較的除去し難いβ２−ミクロ
グロブリンであり、その体内蓄積により各種の症状が発
現することが明らかになった。

従来、このような中分子量物質の除去の目的で、血液濾
過、透析濾過が用いられているが、除去率が低く、有効
に除去すると大量の補液を必要とする問題点を有した。

また、除去率を上げるためには膜のボアーを大きくすれ
ばよいが、ボアーが少し大きくなると、有用タンパクで
あるアルブミンの漏失が生じ、ボアーサイズの制御では
中分子量物質の有効な選択的除去をなし得ないのが現状
である。一方、最近、β２−ミクログロブリンの吸着材
が特開昭６２−２０４７６１号、特開昭６２−２４００
６８号、特開昭６２−２６１３６７号各公報に報告され
ている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の目的は、上記の如き治療用高分子膜技術に基づ
く問題点に鑑み、−船釣に普及可能であり、中分子量物
質、特にβ８−ミクログロブリンを高い効率で選択的に
吸着し、非特異的吸着、特にアルブミンの吸着が少なく
、さらに、補液を必要とせず、安全性があり、滅菌操作
も簡単に行うことができ、全血、あるいは血漿等の体液
浄化あるいは再生用に適した吸着材を提供しようとする
ものである。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記目的に沿って鋭意研−究した結果、
特定のゼラチンを表面に存する水不溶性担体が、β２−
ミクログロブリンを選択的に、しかも、驚くほど高い効
率で吸着することを見出した。

これについてさらに詳しく検討したところ、ゼラチンの
分子量と等電点との関係が一定の条件を満たす場合に限
り、β２−ミクログロブリンを選択的に、しかも、高い
効率で吸着することがわかり、本発明を完成するに至っ
た。

すなわち、本発明は、水不溶性担体の表面に、分子量が
１０００以上であって、かつ、等電点が６．５以上であ
るゼラチンを有することを特徴とする体液浄化用β２−
ミクログロブリンの吸着材である。

本発明の体液浄化用β２−ミクログロブリンの吸着材は
、前記で述べた特定のゼラチンを表面に有する吸着材で
あり、下記の例に限定されるものではない゛が、より具
体的に言うと、前記で述べた特定のゼラチン（これらを
リガンドと言う）が何らかの方法（例えば、エボクロル
ヒドリン法、ハロゲン化シアン法）で水不溶性担体の表
面に固定されているものが好ましい。さらには、固定さ
れているリガンドが水不溶性担体の表面を平面的に覆っ
ているのではなく、長く伸びている形態がより好ましい
。その理由としては、β２−ミクログロブリンと接触で
きる本発明の吸着材の表面積が大きくなることが考えら
れ、そのことにより、本発明の吸着材が、より効率的に
β２−ミクログロブリンを吸着できるようになることが
挙げられる。

本発明でいうβ２−ミクログロブリンとは、通常、臨床
検査において酵素免疫法等で測定されるβ２−ミクログ
ロブリンであるが、より詳しくは以下の物性値を有する
。

沈降定数　　　１．６３ 部分比容積　　０．７２〜０．７３　１１ｄ！／ｇ分子
量　　　　１１０００〜１２０００窒素含量　　　１６
〜１７　　％ 本発明の対象とするβ２−ミクログロブリンには、β□
−ミクログロブリンそのもの、および他のタンパクとの
複合体を含み、β８−ミクログロブリンのアミノ酸配列
の一部変異したものも含むものである。

本発明で規定する分子量は、水不溶性担体の表面にある
ゼラチンを特定するものであり、光散乱の原理（例えば
、新実験化学講座１９．高分子化学ＩＴ、Ｐ５１４〜５
１８９日本化学会編、丸善株式会社発行、昭和５３年９
月２０日発行）により測定された重量平均分子量である
。本発明の分子量は１０００以上であり、分子量が１０
００より小さいと、水不溶性単体の表面にあるゼラチン
の分子の長さが短くなってしまい、充分な量のβ２−ミ
クログロブリンを吸着できなくなってしまう。効率よく
充分な量のβ２−ミクログロブリンを吸着するためには
、ゼラチンの分子量は１０００以上であることが必要で
ある。

本発明でいう等電点とは、水不溶性担体の表面にあるゼ
ラチンを特定するものであり、等電点電気泳動の原理〔
例えば、生化学実験講座１．タンパク質の化学１．Ｐ３
０５〜Ｐ３１２．日本生化学編、東京化学同人発行（１
９７７年３月３０日発行）〕により測定されたものをい
う。本発明の等電点は、６゜５以上であることが必要で
ある。等電点が６．５より小さいと、ゼラチンとβ２−
ミクログロブリンとの相互作用が弱（なり、ゼラチンを
表面に有する吸着材のβ２−ミクログロブリンの吸暑能
力が低くなる。

これらのことは、ゼラチンが血液、体液等の中。

外電解質液中で正電荷をより強く帯びること、すなわち
、ゼラチンが陰イオン性基（カルボキシル基などのよう
に、血液、体液等の中性電解質液中で負電荷を示すイオ
ン性基をいう）に比べ、陽イオン性基（１級、２級、３
級、４級アミン基などのように、血液、体液等の中性電
解質液中で正電荷を示すイオン性基をいう）をより多く
有することにより、β２−ミクログロブリンとゼラチン
とのイオン的相互作用がより強くなり、そのためゼラチ
ンを表面に有する吸着材のβ２−ミクログロブリンの吸
着能力が高くなり、また、アルブミン等目的物質以外の
物質に対する吸着選択性が向上すると考えられる。

ここで、分子量と等電点の範囲は、分子量が１０００以
上であって、かつ、等電点が６．５以上であるが、より
好ましくは、分子量が１０，０００から３００゜０００
であって、かつ、等電点が７．０から１１．０の範囲で
ある。さらに好ましくは、分子量が３０，０００から２
００，０００であって、かつ、等電点が８．０−１０．
０の範囲である。

本発明において、ゼラチンとは、前記で示した分子量が
１０００以上であって、かつ、前記で示した等電点が６
．５以上であるゼラチンのすべてをいう。本発明のゼラ
チンを例示すると、人、牛、豚等種々の動物の皮膚、骨
、股、血管、基底膜、胎盤、筋肉、軟骨等を、酵素、酸
、アルカリ等で処理して得られた各タイプのコラーゲン
〔例えば、（コラーゲン代謝と疾患、ＰＩＩＯ〜Ｐ１３
３．水弁　裕。

藤本大三部編、講談社、　１９８２年４月１日発行）（
コラーゲン、　Ｐ１９６〜２０６．野田春彦、水弁　裕
。

藤本大三部編、南江堂、昭和５３年５月１０日発行）に
述べられたものを言い、コラーゲン分子末端のテロペプ
チドを切断したアテロコラーゲンも含む〕を酸性下また
はアルカリ性下で熱処理したもの、さらには、熱処理し
たものをメタノール、エタノール、イソプロピルアルコ
ール等の有機アルコール化合物で処理し、ゼラチンを構
成するアスパラギン酸、グルタミン酸のカルボキシル基
をエステル化したもの、また、熱処理したものを、イソ
シアナート等により再重合したものを挙げることができ
る。これらの中では、酸性下で処理して得たコラーゲン
を酸性下で熱処理したものが特に好ましい結果を与える
。

本発明において、水不溶性担体としては、前記で示した
分子量が１０００以上であって、かつ、前記で示した等
電点が６．５以上であるゼラチンを固定できれば、セル
ロース系、ビニルポリマー系、ポリアクリルアミド系、
ポリヒドロキシエチルメチルアクリレート系、ガラス系
、シリカ系等の有機系高分子化合物または無機系化合物
すべてを使用できるが、β２−ミクログロブリンをより
高い効率で選択的に吸着し、かつ、血小板等の血液細胞
の共存する全血液で使用する場合には、上記水不溶性担
体が、接触角が少なくとも２０度以上である水不溶性材
料と血液適合性重合体との少なくとも二層構造であるこ
とが好ましい。

上記の接触角とは、水中における固体表面上の空気泡の
接触角であり、Ｗ、Ｃ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ、　Ｊ、Ｃｏ
１１ｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ、、　４０．
２１９−２２２　（１９７２）　（ダブル・シー・ハミ
ルトン・ジャーナル・オブ・コロイド・インターフェイ
ス・サイエンス、　４０．２１９−２２２　　（１９７
２））　　、ｒ、ｏ、八ｎｄｒａｄｅ、　　Ｊ、Ｐｏｌ
ｙｍ、Ｓｃｉ、Ｐｏｌｙｍ、Ｓｙｍｐ、、　６６、３１
３−３３６　（１９７９）　（ジエー・デー・アンドレ
ード、ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス・ポリ
マー・シンポジウム、　６６、３１３−３３６　（１９
７９）〕で示された原理および方法にしたがい測定した
接触角を言う。従来よく知られている空気中における固
体表面上の液滴の接触角測定法は、水吸収性材料では、
時間の経過とともに、接触角の値が変化し、材料の物性
値としては採用しにくい。

また、試料は、シートおよびフィルム状成形物を作製し
、接触角の測定温度は２５°Ｃとし、１０回以上測定し
、その平均値を材料の接触角の値とした。

接触角が２０度以上である水不溶性材料としては、前記
で示した方法で測定した接触角が２０度以上であれば、
無機系化合物、有機高分子化合物すべてが含まれるが、
体液浄化材料としての溶出物等の安全性や吸着親和性面
より、有機高分子材料が好ましく用いられる。

有機高分子材料としては、そのβ２−ミクログロブリン
との吸着親和性より接触角が２０度以上が好ましく、さ
らに好ましくは３０度以上、特に好ましくは４０度以上
の材料が用いられる。

好ましい有機高分子材料としては、ポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリテトラフルオロエチレン等のポリオレ
フィン系化合物、ポリスチレン、ポリメタクリレートエ
ステル、ポリアクリレートエステル等のビニル系化合物
の重合体、ナイロン６．６６等のポリアミド系化合物、
ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系化合物
等を例示することができる。この中でメタクリレートエ
ステル、アクリレートエステル、スチレンおよびスチレ
ン誘導体等のホモポリマーあるいはコモノマーや架橋剤
とのコポリマーが好ましく用いられる。特にメチルメタ
アクリレート、あるいはスチレンを主成分とする架橋重
合体粒子が好ましく用いられる。架橋剤としては、公知
のいずれの架橋剤も用いることができるが、例示すると
、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジ（メタ）ア
クリレート、ポリエチレングリュールジ（メタ）アクリ
レート等を挙げることができる。

血液適合性重合体としては、前記で示した分子量が１０
００以上であって、かつ、前記で示した等電点が６．５
以上であるゼラチンを固定できれば、一般に、公知の血
液適合性材料すべてが含まれるが、微粒子の発生の防止
、すなわち、水不溶性材料への被覆のし易さと安全性、
滅菌性より、（メタ）アクリル酸エステル系重合体、ア
クリルアミド系重合体、ポリビニルピロリドン系重合体
、ポリビニルアルコール系重合体、エチレン−ビニルア
ルコール系重合体、エチレン−酢酸ビニル系重合体、硝
酸セルロース、およびゼラチン等を例示することができ
る。

微粒子の発生を防止し、血液適合性を一段と向上させる
目的で、血液適合性重合体として特に含窒素塩基性官能
基を有する重合体が好ましく用いられる。

上記の「含窒素塩基性官能基」とは、酸性水溶液中で窒
素原子上に陽電荷を有し、陽イオンとなりうる官能基で
ある。このような官能基としては、第１級アミノ基、第
２級アミノ基、第３級アミノ基、４級アンモニウム基お
よびピリジル基、イミダゾリニル基等の含窒素芳香環基
等が挙げられる。

したがって、本発明で用いられる含窒素塩基性官能基を
有する重合体としては、例えば、ビニルアミン；２−ビ
ニルピリジン、４−ビニルピリジン、２−メチル−５−
ビニルピリジン、４−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニル
−２−エチルイミダゾール、Ｎ−ビニル−２−メチルイ
ミタソール等の含窒素芳香族化合物のビニル誘導体；ジ
メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルア
ミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノプロ
ピル（メタ）アクリレート、３−ジメチルアミノ−２−
ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート等のアクリル
酸およびメタアクリル酸誘導体；Ｎ−ジメチルアミノエ
チル（メタ）アクリル酸アミド、Ｎ−ジエチルアミノエ
チル（メタ）アクリル酸アミド等のアクリル酸アミドお
よびメタアクリル酸アミド誘導体；ｐ−ジメチルアミノ
メチルスチレン、ｐ−ジエチルアミノエチルスチレン等
のスチレン誘導体；および上記ビニル化合物をハロゲン
化アルキル等によって４級アンモニウム塩とした誘導体
等を含有する重合体が挙げられる。

この中で特に好ましいのは、ジエチルアミノエチル（メ
タ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アク
リレート、ｐ−ジメチルアミノメチルスチレン、ｐ−ジ
エチルアミノエチルスチレン等を含有する重合体が挙げ
られる。

さらに、本発明で用いられる含窒素塩基性官能基を有す
る重合体は、ビニル化合物と含窒素塩基性官能基を有す
る単量体との共重合体が好ましく、その窒素含量は０．
０５〜３．５重量％であることが好ましい、さらに、窒
素含量が０．１〜２．５重量％であると、より好ましい
結果を与える。ここで言う窒素含量とは、上記官能基中
の窒素原子の前重合体中における重量％である。

上記のビニル化合物としては、２−ヒドロキシエチルメ
タアクリレート、メチル（メタ）アクリレート、エチル
（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレー
ト等のアルキル（メタ）アクリレート類、（メタ）アク
リルアミド、Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド等のア
ミド類、Ｎ−ビニルピロリドン、酢酸ビニル、スチレン
等が挙げられる。

さらに、ビニル化合物と含窒素塩基性官能基を有する単
量体との共重合体としては、ブロック共重合体、グラフ
ト共重合体、ランダム共重合体等があるが、グラフト共
重合体、ブロック共重合体は、１００人〜１００μ平均
長のミクロドメイン構造を有するものが、その血液適合
性より好ましい。

以下、本発明の吸着材を製造する方法について、ゼラチ
ンを水不溶性担体に固定する方法を例示するが、本発明
は、この例示に限定されるものでないことはもちろんで
ある。

水不溶性担体の形状は、粒子状、繊維状、中空糸状、膜
状等いずれの公知の形状も用いることができるが、本発
明のゼラチンの保持量、吸着材としての取扱性よりみて
、粒子状、繊維状のものが好ましい。

球状または粒子状担体の平均粒径は２５〜２５００μｍ
のものを利用できるが、その比表面積（吸着材としての
吸着能力）と体液の流通面より、５０〜１５００μｍの
ものが特に好ましい。

担体の比表面積は５　ｒｒｒ　／　ｇ以上が好ましく、
５５ｒｄ／ｇ以上が望ましい。

粒子状担体としては、多孔性粒子が好ましい。

本発明で用いられる多孔性粒子は、その表面に本発明の
ゼラチンを固定化できるものであり、さらには、β２−
ミクログロブリンの吸着効率を上げるには、多孔性粒子
の細孔内部までβ２−ミクログロブリンが入れることが
好ましいので、多孔性粒子の細孔の平均孔径としては、
２０人〜５０００人の範囲にあることが好ましい。

繊維状担体を用いる場合には、その繊維径が０゜０２デ
ニールないし１０デニール、より好ましくは０．　１デ
ニールないし５デニールの範囲にあるものがよい。繊維
径が大きすぎる場合には、β２一ミクログロプリン系化
合物の吸着量および吸着速度が低下するし、小さすぎる
場合には、凝固系の活性化、血球粘着、目づまりをおこ
しやすい。

用いる繊維状担体としては、再生セルロース系繊維、ナ
イロン、アクリル、ポリエステル等公知の繊維を一般に
用いることができる。

本発明において、ゼラチンを水不溶性担体に固定する方
法は、共有結合、イオン結合、物理吸着、包埋あるいは
水不溶性担体表面への沈澱不溶化などあらゆる公知の方
法を用いることができるが、結合物の溶出性よりみて、
共有結合により固定、不溶化して用いることが好ましい
。そのため、通常、固定化酵素、アフィニティークロマ
トグラフィで用いられる公知の担体の活性化方法および
リガンドの結合方法を用いることができる。

活性化方法を例示すると、ハロゲン化シアン法、エピク
ロルヒドリン法、ビスエポキシド法、ハロゲン化トリア
ジン法、ブロモアセチルプロミド法、エチルクロロホル
マート法、１．１’−カルボニルジイミダゾール法等を
挙げることができる。本発明の活性化方法は、リガンド
のアミノ基、水酸基、カルボキシル基、チオール基等の
活性水素を有する求核反応基と置換および／または付加
反応できればよく、上記の例示に限定されるものではな
いが、化学的安定性、熱的安定性等を考慮すると、エポ
キシドを用いる方法が好ましく、特にエピクロルヒドリ
ン法が推奨できる。

担体に本発明で用いられるゼラチンを２種類以上結合し
てもさしつかえない。

以上、本発明において、ゼラチンを水不溶性担体に固定
する方法として、水不溶性担体を活性化した後に、ゼラ
チンを結合する方法について詳細に説明したが、本発明
は、これに限定されるものではない。例えば、不溶性物
質にゼラチンを結合可能な重合体に被覆した後、ゼラチ
ンを結合する方法や、ゼラチンを有する重合体を不溶性
物質に被覆する方法も用いることができる。その際、必
要に応じて被覆に使用する重合体を後架橋することもで
きる。また、ゼラチンを活性化した後に担体と結合する
方法も採用することができる。

また、必要に応じて水不溶性担体とゼラチンの間に任意
の長さの分子（スペーサー）、例えば、アミノエチル基
、アミノペンチル基、アミノオクチル基、アミノドデシ
ル基等を導入することもできる。すなわち、本発明は、
ゼラチンが吸着材表面にあることにより、その効果を発
揮するものであり、製造方法に左右されるものではない
。

以下に本発明のβ２−ミクログロブリンの吸着材の使用
方法について例示するが、本発明は、この例示に限定さ
れるものでないことはもちろんである。

本発明の吸着材は単独で使用してもよく、また、他の体
液浄化材と混合もしくは積槽して使用してもよい。他の
体液浄化材としては、吸着型人工腎臓に用いられる活性
炭、透析型人工腎臓、濾過型人工腎臓に用いられる中空
糸膜、平膜を例示することができる。本発明の吸着材の
相乗効果によるより広範な臨床効果が期待できる。吸着
材容積は、体外循環に用いる場合、５０〜６００ｄｌ程
度が適当である。

一本発明の吸着材を体外循環で用いる場合には、大路次
の三通りの方法がある。一つには、体内から取り出した
血液を直接核装置に通過させ、浄化する方法であり、二
つには、体内から取り出した血液を遠心分離器もしくは
膜型血漿分離器を使用して、血漿成分と血球成分とに分
離した後、血漿成分を該装置に通過させ、浄化した後、
血球成分と合わせて体内にもどす方法であり、三つには
、体内から取り出した血液を吸着型人工腎臓、透析型人
工腎臓、濾過型人工腎臓等の体液浄化器に通過させた後
に、該装置に通過させ、浄化する方法である。逆に血液
を該装置に通過させた後に、体液浄化器に通過させても
よい。

また、血液もしくは血漿の通過速度については、該吸着
材の吸着能率が非常に高いため、吸着材の粒度を粗くす
ることができ、また、充填度を低くできるので、吸着材
層の形状の如何にかかわりなく、高い通過速度を与える
ことができる。そのため多量の体液処理をすることがで
きる。

血液および血漿等の体液の通液方法としては、臨床上の
必要に応じ、あるいは設備の装置状況に応じて、連続的
に通液してもよいし、また断続的に通液使用してもよい
。

（発明の効果） 本発明の吸着材は、以上述べてきたように、体液中のβ
２−ミクログロブリンを高い効率かつ特異的に吸着除去
し、簡便かつ安全である。

本発明は、自己血液、血漿等の体液を浄化、再生する一
般的な用法に使用可能であり、腎不全患者や悪性腫瘍患
者の体液中に増加し、手根骨症候群、アミロイド−シス
、弾発指・肩・膝関節症、皮膚掻痒症、骨障害等の原因
となる中分子量物質、アミロイドプロティン、特にβオ
ーミクログロブリンの吸着、除去に有効かつ安全に使用
できるものである。

（実施例） 次に実施例により本発明をさらに詳細に述べる。

実施例１ 本発明のβ２−ミクログロブリンの吸着材表面にあるゼ
ラチンとβ２−ミクログロブリンとの結合能力をみるた
め、通常臨床検査に用いられる酵素免疫測定法を利用し
、プラスチックのプレート（エライザ・プレート）表面
に固定されたβ２−ミクログロプリンとゼラチンとの結
合能力を評価した。以下１、評価の方法、条件を述べる
。

（１）エライザ・プレート表面へのβ２−ミクログロブ
リンの固定 人の尿中より精製して得られたβ２−ミクログロブリン
（アメリカ、シグマ社製）をＰＢＳ　（リン酸緩衝生理
食塩水）に溶解し、１０μｇβ２−ミクログロブリン／
ｒｄＰＢｓ溶液を作成した。この溶液１００μｌを酵素
免疫測定用として用いられているエライザ・プレート（
商品名イミュロン。

６００、西独、グライナー社製）に添加し、４°Ｃ，２
４時間放置した。

（２）βニーミクログロブリンが固定されていないフリ
ーなエライザ・プレート表面への牛血清アルブミンの固
定（ブロッキング掻作） フリーなエライザ・プレート表面とゼラチンとの結合を
抑制するため、次の操作をする。

添加した１０μｇβ２−ミクログロブリン溶液１００μ
ｌを吸引除去した後、０．５％牛血清アルブミンＰＢＳ
溶液２００μ２をエライザ・プレートに添加し、２５°
Ｃ，２時間放置する。

（３）エライザ・プレートの固定されていないフリーな
牛血清アルブミンの除去 上記のエライザ・プレートの牛血清アルブミン溶液を吸
引除去した後、ＰＢＳを１００μｌ添加する。その後、
ＰＢＳを吸引除去し、再度ＰＢＳを１００μｌ添加する
。ＰＢＳを添加し、吸引除去する操作を洗浄操作と言う
が、ここでは、洗浄操作を３回（り返し、エライザ・プ
レートに固定されていない牛血清アルブミンを除去する
。

（４）ゼラチンとエライザ・プレート表面に固定された
β２−ミクログロブリンとの結合 ゼラチンをＰＢＳに溶解し、０．１■／　ｍ１ＰＢＳ溶
液をそれぞれ作製する。（３）の操作後に、エライザ・
プレートに残っているＰＢＳを吸引除去し、ゼラチンの
０．１■／ｄＰＢｓ溶液１００μ２を、それぞれエライ
ザ・プレートに添加し、３７°Ｃ１２時間放置する。

（５）エライザ・プレート表面に固定されたβ２ミクロ
グロブリンと結合していないフリーなゼラチンの除去 ゼラチンのＰβＳ溶液を吸引除去した後、（３）に示し
たＰＢＳによる洗浄操作を３回行い、β２ミクログロブ
リンと結合していないフリーなゼラチンを除去する。

（６）エライザ・プレート表面に固定され、かつ、ゼラ
チンと結合されなかったβ２−ミクログロブリンの測定 この操作は、通常の酵素免疫測定法と同様な操作を行う
。

（ａ）　　（５）の操作後に、抗人β２−ミクログロブ
リンウサギ抗体１００μ２をエライザ・プレートに添加
し、３７°Ｃ１１時間放置後、（３）と同様なＰＢＳ洗
浄を行う。この操作により、ポリアミノ酸、多糖、合成
高分子と結合されなかったエライザ・プレート表面のβ
２−ミクログロブリンと抗人β２−ミクログロブリンと
の抗原抗体反応が行われる。

（ｂ）　　次に、酵素標識（ペルオキシダーゼ標識）さ
れた抗ウサギＩｇＧ　（ベクタスティンＡＢＣキット）
を１００μ！添加し、抗人β２−ミクログロブリンウサ
ギ抗体と抗ウサギＩｇＧとの抗原抗体を行う。

（Ｃ）　　次に、２，２′−アジノービス（３−エチル
ベンチアゾリン）−６−スルホン酸（分子量５１４．和
光純薬製）と過酸化水素水を添加し、ペルオキシダーゼ
反応により発色させる。発色後、４０５ｎｍの波長によ
り吸光度を測定する。

この吸光度の値は、β２−ミクログロブリンと結合する
抗人β２−ミクログロブリン抗体の量と相関する。また
、ゼラチンそのもののこの評価系への影響を考慮し、エ
ライザ・プレートにβ２ミクログロブリンを添加しない
で、（２）から（６）の操作を別途行った。

また、ゼラチンをエライザ・プレートに添加しない、す
なわち、（１）、　（２）、　（３）、　（６）の操作
のみを別途行った。

以上の操作を行うことにより、エライザ・プレート表面
に固定され、かつ、ゼラチンと結合されなかったβ２−
ミクログロブリンの割合（Ｙ）は、（Ｃ）；（１）から
（５）の操作すべてを行った時の抗人β２−ミクログロ
ブリン抗体結合量 ＣＤ）；（１）の操作でβ２−ミクログロブリンをエラ
イザ・プレートに添加せず、（２）から（５）の操作す
べてを行った時の抗人β２−ミクログロブリン抗体結合
量 〔Ｅ〕　；ゼラチンを添加しない、すなわち、（４）。

（５）の操作を行わないで、（１）、　（２）、　（３
）、　（６）の操作を行なった時の抗人β２−ミクログ
ロブリン抗体結合量 とすると、 で表すことができる。

すなわち、このＹが小さいほど、エライザ・プレートの
表面に固定されたβ２−ミクログロブリンとゼラチンと
の結合能力が高いことになる。

以下に、１この評価方法を用いて得た結果を表１に示す
。

表１ 本実験に使用した酸処理法ゼラチン〔ニッピゼラチン工
業（株）製および宮城化学工業（株）製〕とは、豚皮を
酸で処理して得られたコラーゲンを、さらに、酸性下で
熱処理したものであり、酵素処理法ゼラチンとは、牛の
真皮コラーゲをペプシンで処理し精製したアテロコラー
ゲンＴｙｐｅ　−■〔高研（株）製〕を、旭化成（株）
で熱処理したものである。

比較例１ 実施例１と同じ評価方法を用いて、以下の試料を評価し
た。結果を表２に示す。

表２ 実施例２ 実施例１と同じ評価方法を用いて、以下の試料を評価し
た。結果を表３に示す。

表３ 本実験に使用したアルカリ処理法ゼラチン〔ニッピゼラ
チン工業（株）製〕とは、牛骨をアルカリで処理して得
られたコラーゲンを、さらに、アルカリ性下で熱処理し
たものであり、酵素処理法ゼラチン（旭化成（株）試作
〕とは、牛の真皮コラーゲンをペプシンで処理し精製し
たアテロコラーゲンＴｙｐｅ　−１Ｃ高研（株）製〕を
、旭化成（株）で熱処理したものである。

実施例１および比較例１の結果より、等電点が６．５以
上を示すゼラチンが、β２−ミクログロブリンと強い結
合能力を示すことがわかる。

本実験に使用した酸処理法ゼラチンとは、実施例１に用
いた酸処理法ゼラチン〔ニッピゼラチン工業（株）製；
分子量１２５，０００．等電点８．８　、　Ｙ１９゜５
〕を旭化成（株）で熱処理して得られたものである。

比較例２ 実施例１と同じ評価方法を用いて、以下の試料を評価し
た。結果を表４に示す。

表４ 本実験に使用した酸処理法ゼラチンとは、実施例２と同
様に、実施例１に用いたニッピゼラチン工業（株）製の
酸処理法ゼラチンを、旭化成（株）で熱処理して得られ
たものである。

実施例２および比較例２の結果より、分子量が１０００
以上で良好なβ２−ミクログロブリン結合能力を示すこ
とがわかる。

実施例３ 水不溶性材料としてメチルメタアクリレ−トルジビニル
ベンゼン共重合体（８０：２０重景％）のシートおよび
４２０〜８００μの粒子を作製し、水中における空気泡
の接触角を測定した。次に２−ヒドロキシエチルメタア
クリレ−トルジエチルアミノエチルメタアクリレート共
重合体の２％ｗｔ／ジメタツール溶液を作製し、この溶
液１００−に対し、上述の粒子３０ｄを５分浸漬した後
（時々攪拌する）、グラスフィルター上で過剰の溶液を
吸引除去してから、送入窒素ガス量と吸引窒素ガス量の
バランスをとりながら、２０分間グラスフィルター上で
窒素乾燥する。次いで、真空乾燥機の中で、室温、７５
５　ｍ８ｇ以上の条件で２４時間乾燥した。この操作に
より、メチルメタアクリレ−トルジビニルベンゼン共重
合体と２−ヒドルキシエチルメタアクリレ−トルジエチ
ルアミノエチルメタアクリレートからなる二層構造の水
不溶性担体が得られる。

この水不溶性担体を１２５°Ｃ１４５分熱処理してエタ
ノールに懸濁した後、水洗する。次いで、脱水し、ジメ
チルスルホキシド中に懸濁する。次に、ジメチルスルホ
キシドを除去し、再度ジメチルスルホキシド中に水不溶
性担体を懸濁する操作をくり返す。この操作後に得られ
た水不溶性担体３０−を、ジメチルスルホキシド３６−
に懸濁し、これに、エピクロルヒドリン２４ｄ、５０％
水酸化ナトリウム３．０ｍｌを加え、３０°Ｃで５時間
攪拌しながら活性化反応を行った。反応後、メタノール
で洗浄し、水洗し、吸引脱水した。

得られた活性化水不溶性担体３０成を酸処理法ゼラチン
にッピゼラチン工業（株）製；分子量７５．０００．等
電点８．０．Ｙ２２．４および旭化成（株）試作；分子
量７，０００　、等電点７．Ｏ，Ｙ３８．５〕溶液（２
０，０■／　！１１１、ｐＨ３，５）１５０Ｉｄに懸濁
し、３０°Ｃ１４日時間振盪しながら、酸処理法ゼラチ
ンの固定化反応を行った。

次いで、０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー〇、ＩＭク
エン酸ナトリウムバッファーで交互に洗浄した後、ＰＢ
Ｓ、生理食塩水で十分洗浄し、吸着材を得た。

酸処理法ゼラチンの保持量は、たんばく質のビウレット
反応を利用したＭｉｃｒｏｂｉｕｒｅｔ法〔生化学分析
法、由岐英剛編、（株）南江堂、　１９８４年９月２５
日発行、　Ｐ１２３〜Ｐ　１２５　）により測定し、算
出した。

吸着実験は、腎不全患者血漿と水不溶性担体および吸着
材を２４：１の容積比で混合後、３７°Ｃで１時間振盪
し、前後の血漿中のβ２−ミクログロブリンとアルブミ
ンを定量した。β２−ミクログロブリンはＲＩＡ法、ア
ルブミンはＢＣＧ法を用いたい結果を表５に示す。

比較例３ 実施例３と同様な水不溶性担体と活性化方法を用い、ア
ルカリ処理法ゼラチン〔ニッピゼラチン工業（株）製；
分子量７５，０００．等電点５．１．　Ｙ２Ｏ，２）お
よび酸処理法ゼラチン〔旭化成（株）試作；分子量８０
０２等電点６，９．Ｙ７２）溶液（２０，ＯｇＩｇ／ｌ
ｌ１１、ｐＨ３，５）で同様に固定化反応を行い、吸着
実験も実施例３と同様に行った。結果を表６に示す。

実施例３および比較例３の結果より、分子量が１０００
以上であって、等電点が６．５以上であるゼラチンを表
面に有する吸着材が、β２−ミクログロブリンに対する
吸着能力が高く、かつ、アルブミンに対して吸着選択性
があることがわかる。

以上の結果より、水不溶性担体の表面に、分子量が１０
００以上であって、かつ、等電点が６゜５以上であるゼ
ラチンを表面に有する吸着材が、β２−ミクログロブリ
ンに対する吸着能力が高（、かつ、アルブミンに対して
吸着選択性があることがわかる。

ほか１名

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 水不溶性担体の表面に、分子量が１０００以上であって
   、かつ、等電点が６．５以上であるゼラチンを有するこ
   とを特徴とする体液浄化用β＿２−ミクログロブリンの
   吸着材。