CN1939585A - 不对称多孔吸附珠粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及适合于分离应用的不对称色谱介质，特别是作为填充床、流化床或磁化床的色谱介质。在某些实施方案中，所述不对称介质包括具有至少两个截然不同的受控制的孔径分布、优选为珠粒的不对称颗粒。优选地，一个截然不同的孔径分布在所述颗粒的内部区域，另一个在外部区域或所述颗粒上的涂层中。这些截然不同的孔径分布可以由均匀的或可选独特的官能团或官能团混合物改性。通过提供优选为珠粒形式的截然不同的内部区域，及优选为珠粒上涂层形式的截然不同的外部区域，本发明可以控制不对称多孔粒子内的孔径分布。

Description

不对称多孔吸附珠粒
技术领域
本发明涉及适合于色谱应用的不对称多孔珠粒。
背景技术
诸如蛋白质、多肽和生物分子片段的生物分子已经成为制药和诊断应用的重要试剂。目前，生物分子的纯化经常涉及包括色谱处理的多个步骤。用于生物分子分离的多孔色谱介质的合成和使用有完善的文献记录。所述色谱步骤经常通过使用珠粒填充床来进行，产品和杂质得以与原料流分离。这些珠粒通常为含有官能或用官能改性的基体(如多醣、合成聚合物或材料、陶瓷、玻璃或上述材料的复合物)，官能通过化学或物理方法与生物分子相互作用；它提供结合或相互作用的“驱动力”。该复杂组合的相互作用导致介质在要求的分离中的表现。介质影响生物分子间特定分离的能力经常被称作“介质的选择性”。通常这些基体表现出可使所关心的生物分子进入粒子内部容积的孔隙。所述内部的孔隙率在粒子内是均匀的。
色谱分离典型地在填充有微粒型珠粒形式的分离基体的柱子内进行。介质粒子的大小支配分离动力学，但较小的粒子会产生高的反压。为了能够分离大分子，所述粒子应具有大的孔隙，但大的孔隙降低所述粒子的机械稳定性，尤其是对于诸如琼脂糖的多糖而言。多糖是具有优势的，因为通常它们与蛋白的结合力低，易于官能化，并且能够形成多孔结构。传统上，多糖珠粒由一种多糖与在整个珠粒内具有均匀的或“对称的”多孔结构制得。这些“对称”珠粒的实例包括Cellufine(纤维素)、Sepharose(琼脂糖)和Sephadex(葡聚糖)。所述对称的珠粒在珠粒的整个内部结构内与分子结合。内部结构内的化学环境(孔径大小、疏水性、配体类型和配体密度)基本上是均匀的。因此所述珠粒的整个结合环境的性质是均匀的。在这些体系中，分离的驱动力来自被吸附生物分子间结合强度的差异。典型地当使用对称树脂时，通过控制缓冲条件优化结合强度是实现所要求分离的唯一驱动力。此外，多糖材料内在是可压缩的，并经常要求进行化学改性如通过交联来减少其可压缩性。
对称树脂的另一特性是介质的机械强度，机械强度是由材料、孔隙结构和化学改性等所造成的。典型地对于多糖而言，介质孔径越小，则由于较高的固体材料浓度(孔隙率更低)而使其机械强度越高。然而，孔径越小，较大物种(如IgG)进入吸附剂的传质就越容易受阻。因此，对称介质的设计经常涉及粒子刚性和生物分子传质的优化/妥协。事实上，由于对称珠粒的渗透率是所述粒子的尺寸及粒径分布所造成的，所以该优化问题更加复杂。随着粒子尺寸变小，粒子的外表面积增大，因此传质也增加。在洗提期间，较小的粒子可使离开介质的扩散时间更短，因此产生更集中和窄的洗脱峰。然而，传质的该改进是以渗透率为代价的，这就限制了柱的大小和介质的物料通过量。
在许多生物分子的分离中，考虑的物种(目标分子)是原料中浓度最高的物种。换言之，杂质只占要分离的全部混合物中的很小比例。对于对称的色谱介质，分离经常受目标分子与一些杂质结合的影响，然后通过应用洗提条件来区分所述物种，以分离杂质。如果两个物种与介质的结合强度十分相似，那么即使蛋白质的大小不同，分离也十分困难。在某些情况下，分离的困难状态是由有限数量的影响纯化的驱动力因素所造成的。最终结果是，由于分离不完全，纯化蛋白的收率低，或者还必须需要另一个色谱步骤使用具有不同分离驱动力的不同介质来进一步纯化目标分子。这样的方法费时、低效且昂贵。
对于包括膨胀床或流化珠粒色谱的应用，填充的多糖珠粒相当成熟。通常这些材料通过在珠粒形成期间向多糖(典型地为琼脂糖)加入实心的或非多孔的小球而制造。这样，就可以形成包裹在多糖材料内的具有一个或多个非多孔粒子的珠粒。另一种常用的技术是用最终要成为吸收剂材料的涂敷固体粒子。所述固体粒子对珠粒的蛋白容量或分离性能没有作用。通常粒子的作用仅在于改善珠粒的密度，以便所述材料可用于非填充床的应用。在某些情况下，固体粒子提供刚性和/或减少的凝胶体积。
最近，为了避免大分子的结合及同时保持对较小物种的容量，已经开发了带有所谓非吸收性多糖的“盖子”或外层材料来限制进入的多孔结构。这些材料具有非常低的对大分子的容量，因为其内表面积不能同时供两个物种结合。
以前的工作表明可以以不对称的方式用化学改性来改进对称多糖的结构。该技术可以在珠粒内产生变化的化学环境。典型地，所述改性可用于在珠粒外面上提供中性层。这可防止在珠粒外面堵塞，尤其是在脏的原料流如在膨胀床吸收(EBA)中所遇到的。然而，该技术不改变珠粒的孔径，因此在整个珠粒内产生的是对称的孔径。
也开发了改进多孔色谱介质孔径的方法。使用这些技术可以产生双峰分布的孔径尺寸。然而，孔隙结构在整个珠粒内是均匀分布的，因此不能在珠粒内产生化学上独特的区域来调节/改变所观察的选择性。
相应地，需要一种更好的介质设计以改善生物分子的纯化，其中所述分离受多于一种的生物分子特性所驱动。
发明内容
本发明已克服现有技术的问题，并可提供适合分离应用的不对称色谱介质，尤其是作为填充床、流化床或磁化床的色谱介质。在某些实施方案中，不对称色谱介质包括优选为珠粒的不对称粒子，其具有至少两个截然不同的层，通常各层具有截然不同的受控制的孔径分布。优选其中一个截然不同的孔径分布在所述粒子的内部区域中，另一个在外部区域中或粒子的涂层上。可以用均匀的或者可选独特的官能团或官能团的混合物来改良这些截然不同的孔径分布。通过提供优选珠粒形式的截然不同的内部区域及优选珠粒上涂层形式的截然不同的外部区域，本发明使得可以控制不对称多孔粒子的孔径分布。
本发明的不对称珠粒提供了刚性，并且可以控制填充床介质的传质路径。刚性介质可以装填得更高，因此可取得全面更高的柱吸收或交换能力。通过缩短扩散路径，可以以比均质珠粒高得多的效率使用凝胶。在某些操作条件下，带芯核珠粒可以产生更尖的洗脱峰及更少的缓冲液消耗。
本发明的另一方面是具有两个截然不同区域的珠粒，其各自具有一个或多个彼此不同的特征。例如，所述特征可以仅仅是第一和第二区域之间的不同孔径。可选地和/或另外地，其可以是在各个区域中使用的不同的配体类型、配体密度或配体混合物、介质材料和/或琼脂糖百分数(当制备琼脂糖珠粒时)。
本发明带芯核珠粒的另一个应用是用于流化床色谱或磁色谱，其中所述芯核提供要求的密度(用于流化床)或者为磁色谱提供磁特性。
附图说明
图1所示为对称琼脂糖珠粒及不对称琼脂糖珠粒的剖面图；以及
图2所示为根据本发明一个实施方案的不对称珠粒的阵列。
具体实施方式
根据本发明的不对称色谱介质可以实现介质机械性能和选择性能的调节，提供特别适合于生物分子分离的改进的材料。在优选的实施方案中，所述介质包括两个截然不同的、受控制的孔径分布，每个孔径区域都具有独特的化学改进。一个截然不同的孔径分布位于介质的内部区域，另一个位于诸如涂层的外部区域。虽然在两个区域中孔径尺寸可以相同，由此产生局部区域经过不同化学改良的对称色谱介质，但优选两个区域中的孔隙尺寸不同。最优选内部区域的孔隙尺寸小于外部区域的孔隙尺寸。对于孔隙的尺寸没有特别限定；例如，内孔隙尺寸可以小到足以仅能有效吸附小的生物分子(如：小于10KD的分子量)，或者可以大到足以接受大的生物分子。内部和外部的孔隙尺寸可以在一定必要的范围内扩展，以影响改善的色谱分离。
合适的介质材料包括那些典型用于色谱珠粒的材料，其包括玻璃、天然或合成的聚合物如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、琼脂糖、琼脂糖衍生物、琼脂、藻酸盐、纤维素、纤维素衍生物、葡聚糖、淀粉、角叉菜胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、印度胶、黄蓍胶、刺梧桐树胶、槐豆胶、黄原胶、果胶、粘蛋白、肝硫酯和明胶。尤其优选琼脂糖。珠粒可全部由相同的材料形成，或者可以是两种或多种材料的复合物，优选为多孔材料。例如，所述珠粒可以包括玻璃或合成聚合物的珠粒，或者内部有芯核外部有琼脂糖涂层的珠粒。举例来说，还可以包含填料来控制密度。当琼脂糖为内部和外部区域的介质材料时，可以通过改变琼脂糖浓度来控制孔径分布。例如，较高的琼脂糖浓度会产生较小的孔隙尺寸，因此内部区域可以是15％的琼脂糖，而外涂层可以是6％的琼脂糖。这样的外涂层因此可以吸附大的蛋白如IgG，而内部的芯核层则可有效地(在色谱分离的时间尺度内)排除大的蛋白。
更具体地，本发明粒子的芯核可以由任何可用于色谱法的材料制成。例如，所述芯核可以是交联的琼脂糖珠、塑料、金属、玻璃或陶瓷。当最终珠粒要具有高的刚度时，所述芯核优选选自不会在制造过程中的使用温度下熔化的自支撑材料。合适的材料包括但不限于塑料，如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯和聚丙烯的共混物、多层聚乙烯/聚丙烯珠、丙烯酸树脂、聚砜、聚醚砜、PVDF或PTFE；玻璃，如硼硅酸盐玻璃、耐碱玻璃和受控制的多孔玻璃；金属，如不锈钢、镍、钛、钯及钴，或各种铁、含铁或其它磁性金属的合金和混合物；以及陶瓷，如硅酸盐材料、氧化锆和各种陶瓷混合物。
所述芯核优选基本上为球形的或不规则微粒形式的。其直径依赖于所要求的珠粒的大小，但优选直径为约30微米～约150微米。
如琼脂糖珠粒生产中所常见的，可以使用各种添加剂改善生产或增加珠粒的性能。一类添加剂包括可与溶剂混溶的挥发性有机物。实例有一元醇，如甲醇、乙醇和丙醇。其使用浓度可高至产生略微浑浊的溶液。也可以使用诸如丙酮的可混溶的酮。但必须小心，因为琼脂糖在酮-水混合物中的溶解度要低一些。还可以考虑两种或更多种这类物质的任何混合物。
另一类添加剂包括非挥发性的可混溶有机物。其非限定性实例包括：甘油、乙二醇、甲基戊二醇、二甘醇、丙二醇、三甘醇、乙二醇的甲基、乙基或正丁基醚、乙二醇的二甲基或二乙基醚、乙二醇二甲基醚醋酸酯、乙二醇二乙基醚醋酸酯、二甘醇甲基醚、二甘醇乙基醚、二甘醇正丁基醚、二甘醇二甲基醚、二甘醇二乙基醚、二甘醇二甲基醚醋酸酯、二甘醇二乙基醚醋酸酯、N-甲基吗啉和N-乙基吗啉等。这类物质的实例还有低分子量的聚乙二醇。还可以考虑两种或更多种这类物质的任何混合物。
另一类添加剂包括水溶性聚合物，包括例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇、葡聚糖和水溶性聚酰胺，包括取代的聚酰胺如聚二甲基酰胺。这些聚合物添加剂可以作为与琼脂糖的混合物在最初的溶解步骤中使用，或可以在琼脂糖加入和溶解后再溶解在所述溶液中。必须小心不要加入过量的聚合物，因为可能会产生溶液聚沉。聚合物和琼脂糖的比例可以是约0.1～10。优选的聚合物是聚乙烯醇、葡聚糖和聚酰胺。
若有需要，尤其是包括琼脂糖时，可以使用工业上常用于如多糖珠粒的含多羟基材料交联的任何化学物对介质进行交联，这些化学物的非限定性实例有表氯醇或其它多官能环氧化物、各种溴(bromyl)化学物或其它多官能卤化物；甲醛、戊二醛(gluteraldehyde)及其它多官能醛、二(2-羟乙基)砜、二甲基二氯硅烷、二羟甲基脲、二羟甲基亚乙基脲、二异氰酸酯或多异氰酸酯等。
介质上也可以具有与其连接的包括配体的一个或多个官能，如A蛋白或G蛋白，每一种为天然型或重组衍生型的，以及使它们对腐蚀更稳定的A蛋白或G蛋白的改进型等，各种化学配体如2-氨基苯并咪唑(AMI)、氨甲基苯并咪唑(AMBI)、巯基乙基吡啶(MEP)或巯基苯并咪唑(MBI)，或各种使琼脂糖呈阳离子的、阴离子的、亲的、疏的或带电荷的化学物，如在介质形成技术领域中众所周知的。
液相色谱中所使用的适用于本发明的官能团包括，但不限于：离子交换、生物亲合、疏水基团、可用于共价色谱的基团、亲硫的相互作用基团、螯合物或螯合基团、与目标化合物有所谓π-π相互作用的基团、氢键键合的和亲水的基团等。
这些基团可以在琼脂糖珠粒形成和交联后加入，也可以加入到初始溶液中，初始溶液的组成作相应的改变，如减小或增大pH值，这样可在交联反应的同时发生反应，使官能团结合到琼脂糖上。
这些官能通常以两种方式加以应用。第一种是可以在加入具有所要求官能团或其前体的含亲电体分子时应用这些官能。典型地，用氢氧化钠活化含羟基的基体，这可使基体与以上提及的亲电体发生有效反应。非限定性的实例包括：溴丙烷磺酸、丙磺酸内酯、烯丙基缩水甘油醚、烯丙基溴、缩水甘油基三甲基氯化铵、丁二醇二缩水甘油醚、氯醋酸钠。或者，可以选择以所述领域中的已知方法向基体中加入亲核基团，如胺或硫醇，然后使用上述亲电试剂改良基体。其次，这些官能在使用时用亲电子基团活化基体，亲电基团包括以下非限定性实例：溴化氰、活化的羧酸、醛、酯、如丁二醇二缩水甘油醚的环氧化物、表氯醇、烯丙基溴和烯丙基缩水甘油醚，然后含所选官能的合适的亲核分子与活化基体进行反应。这些亲核体可以是如氨基丙烷磺酸的小分子，或可以是如聚乙烯亚胺或蛋白及肽的大的实体。此外，所有上述化学物可以在如葡聚糖的亲水隔臂或“触角”附着到基体上之后加入珠粒中。这可以为结合提供更多的表面积，并且可进一步在珠粒的不对称结构内改变孔径和化学环境。
与对称珠粒相比，本发明的不对称色谱介质可提供改善的机械性能。许多形成于多糖的常用色谱介质是可压缩的。该可压缩性最初是由材料的孔隙率决定的。例如，商用琼脂糖珠粒典型地是4～6％的琼脂糖，这意谓粒子有96～94％是多孔的。若不进行化学改性，这些材料的色谱应用将十分有限。尽管通过广泛的交联，这些材料可以有足够的刚性用于许多应用，但是初始的琼脂糖珠粒越是多孔，其机械性能越是受到限制。对于本发明的不对称介质，如果珠粒内部比外部多孔结构的孔隙少得多，则内部区域的机械强度比外部区域的要高得多。在机械应力下，外部区域会十分类似于其对应的对称珠粒发生压缩。然而，在最初的压缩之后，邻近珠粒的内部区域会开始相互接触，如图2中所图示。内部区域的该“点接触”带来具有内部珠粒结构机械可压缩性的填充床。因为该内部结构可以孔隙较少、刚性较高，其实际效果是具有刚性高得多的材料的机械可压缩性的更多孔或更敞开的外部结构。如果用不可压缩材料作为内部多孔结构，那么得到的色谱床在内部结构产生“点接触”后将会不可压缩。
色谱介质对于给定生物分子或其混合物的选择性是由多因素的复杂组合所决定的，这些因素包括配体类型、配体密度、介质孔径和介质的疏水性等。对称珠粒的选择性可以看作是“一维的”，因为珠粒中的结合环境是均匀的。因此，驱动介质选择性的是由每个单独的生物分子在相同结合环境中相互作用的能力所驱动的。换言之，是“分子的比相互作用”(物种的净电荷、疏水性、氢结合等)，而不是分子的大小驱动了不同生物分子的分离。不对称色谱珠粒的优点是材料含有至少两种截然不同的化学/结合环境，物种可在此环境中可以进行结合。该结构可以通过以下步骤产生：改变1)内部和外部孔隙结构间的孔隙尺寸，2)配体类型、配体密度和/或配体混合物，3)介质材料(如：外部的更亲/内部的更疏)，以及1)、2)和3)的组合。这些材料提供“两维的”选择性，因为分离不仅由分子的比相互作用所驱动，也由介质内的至少两种截然不同的区域所驱动。例如，结合较弱的物种易于在结合较强的环境中集中，或较大的物种可以被排除在内部孔隙结构之外。
本发明新型介质应用的一个具体实例是Mab与宿主细胞蛋白(HCP)的分离。Mab是分子量较高的蛋白(160kD)，不易在15％的琼脂糖凝胶中扩散。相应地，含有15％琼脂糖的内部珠粒的6％的琼脂糖珠粒提供了杂质“槽(sink)”，其中HCP可以被吸附在一个区域(具有可能唯一的化学改性)中，而Mab被吸收在6％的结构中。这可以提供增强的对普通HCP杂质的去除。为了使所要求蛋白(Mab)的结合容量最大化，孔径较小的区域(槽区)可以最小化至总体积的20％，琼脂糖珠粒孔隙比较敞开的区域可以用如葡聚糖的亲水配体载体的“触角”来改良。这可以使用于Mab的琼脂糖珠粒的容量翻倍。
另一个优点是，对外部区域的厚度可以进行限制(1～15微米)，以使洗脱期间的扩散路径更短。这可以提供更窄的洗脱峰以及可能更佳的分辨率。
制造本发明介质的合适方法涉及在合适的液体中溶解/熔化介质材料如琼脂糖，加入优选珠粒形式的芯核，由此使所述芯核可以由琼脂糖涂敷，将涂敷的芯核与疏水液体混合形成乳液，并将该乳液保持在等于或高于琼脂糖熔点的温度，使其通过静态混合器产生琼脂糖小滴，在疏水液的第二浴器中固化所述琼脂糖小滴。然后可以如本领域所已知的洗涤珠粒、使用珠粒或进一步处理以交联琼脂糖，和/或将各种官能加到琼脂糖上。
实施例
实施例1A具有独特化学环境和均匀孔径的不对称琼脂糖珠粒
根据以下方法，用10～15微米的6％琼脂糖层涂敷SP-SepharoseFast Flow(6％的交联琼脂糖)：将50ml珠粒混入到300ml 6％的琼脂糖溶液(来自Hispanagar的D-5琼脂糖)中，得到浆液。将琼脂糖-珠粒混合物加入90℃下的1000ml的矿物油中，在不断搅拌下得到其中油相为连续的乳液。然后以3L/min的流速泵送乳液通过直径0.5英寸(12.7mm)、长度6英寸(152.4mm)的Kenics静态混合器(KMR-SAN-12)，进入5℃的矿物油中。得到的琼脂糖珠粒具有预计10微米的外涂层厚度，珠粒的种群大多数为单芯核的(＞50％)。使珠粒沉积，用水、乙醇洗涤，然后再用水洗涤。根据Porath，Jerher和Janson，Jan-Christer和Lass，Torgny，Journal of Chromatography，60(1971)167-177页公开的方法对珠粒进行交联，此公开内容通过引用结合在此。然后用溴丙烷(bromoporane)磺酸(BPSA)对珠粒进行改性。向罐中加入10g珠粒、30ml 5M NaOH和7.2g BPSA，在50℃下搅拌一夜。用500ml Milli-Q品质的水洗涤珠粒，第二次重复BPSA方法。用500ml的Milli-Q水洗涤珠粒，然后将其保存在20％的乙醇中。
实施例1B
如用实施例1A所讨论的，用10～15微米的6％琼脂糖层涂敷SP-Sepharose Fast Flow(6％的交联琼脂糖)。根据Porath，Jerher和Janson，Jan-Christer和Lass，Torgny，Journal of Chromatography，60(1971)167-177页公开的方法对珠粒进行交联。然后用溴丙烷磺酸(BPSA)对珠粒进行改性。向罐中加入10g珠粒、30ml 5M的NaOH和7.2g BPSA，在50℃下搅拌一夜。用500ml Milli-Q品质的水洗涤珠粒，并且另外重复BPSA方法三次。用500ml的Milli-Q水洗涤珠粒，然后将其保存在20％的乙醇中。
实施例1C
如用实施例1A所讨论的，用10～15微米的6％琼脂糖层涂敷SP-Sepharose Fast Flow(6％的交联琼脂糖)。根据Porath，Jerher和Janson，Jan-Christer和Lass，Torgny，Journal of Chromatography，60(1971)167-177页公开的方法对珠粒进行交联。然后用烯丙基缩水甘油醚(AGE)对珠粒进行改性。向罐中加入10g珠粒、10ml 8M的NaOH、2g AGE和2g Na2SO4，在25℃下搅拌一夜。用500ml Milli-Q品质的水洗涤珠粒，然后将其保存在20％的乙醇中。
选择性的测试
使用具有不同净电荷和分子量的两种蛋白，在典型的阳离子交换(CEX)条件下则是选择性或分离因子。将含有0.5mg/ml多克隆IgG(Sigma)和0.5mg/ml溶菌酶(Sigma)的蛋白混合物在pH 4.5下得到10mS的电导率的含NaCl的50mM醋酸盐缓冲液中，以脉冲输送方式以200cm/hr(7cm的床高，0.66cm直径)施加到每个样品柱。然后用20CV的NaCl梯度从10mS开始至80mS结束，以200cm/hr洗脱脉冲。每种蛋白的峰从洗脱梯度变化曲线的起点开始(对死体积进行修正)，以柱体积(CV)的方式记录。峰分离的数据如表1所示：
                        表1
  样品  IgG峰(CV)   溶菌酶峰(CV)   峰值分离(CV)
  实施例1A  9.36   13.46   4.1
  实施例1B  9.63   14.03   4.4
  实施例1C  9.95   13.65   3.7
  SP-Sepharose Fast Flow  9.95   13.85   3.9
该表报告了IgG和溶菌酶两者在洗脱梯度变化曲线中的峰位置。洗脱中延迟越长(CV越大)，物种与介质的结合越牢固。介质被设计成具有不同的化学环境，主要是磺丙基配体的密度。配体密度在外部琼脂糖区域和内部区域之间的差异按照以下顺序增加：实施例1C＜实施例1B＜实施例1A。实施例1C中内部配体密度和外部配体密度间差异极小，每个基本上具有相同的化学配置。IgG峰位置符合该一般趋势。IgG峰洗脱首先发生在外层中具有最低配体密度的珠粒，而对于实施例1C，洗脱只单独相同地在内部珠粒结构上(SP-Sepharose控制)发生。令人感兴趣的是，溶菌酶和峰分离没有表现出相同的简单趋势。然而，很清楚珠粒内部结构带有独特化学区域的不对称珠粒的峰分离更大。
实施例2
根据以上Porath等对含有10％琼脂糖的琼脂糖珠粒(ABTTechnologies)进行交联。然后用溴丙烷磺酸(BPSA)对珠粒进行改性。向罐中加入100g珠粒、300ml 5M NaOH和72g BPSA，在50℃下搅拌一夜。用1500ml Milli-Q品质的水洗涤珠粒，另外再重复BPSA方法两次。用1500ml Milli-Q水洗涤珠粒，然后将其保存在20％的乙醇中。根据以下方法将珠粒涂敷上6％的琼脂糖层，形成不对称琼脂糖珠粒：将100ml的珠粒混入到600ml的6％琼脂糖溶液(来自Hispanagar的D-5琼脂糖)中，得到浆液。将琼脂糖-珠粒混合物加入90℃下的2000ml矿物油中，在不断搅拌下得到其中油相为连续的乳液。然后以3L/min的流速泵送乳液通过直径0.5英寸(12.7mm)、长度6英寸(152.4mm)的Kenics静态混合器(KMR-SAN-12)，进入5℃的矿物油中。得到的琼脂糖珠粒具有预计10微米的外涂层厚度，珠粒的种群大多数为单芯核的(＞50％)。使珠粒沉积，用水、乙醇洗涤，然后再用水洗涤。根据以上Porath等的方法交联珠粒。然后用缩水甘油基三甲基氯化铵(GTMAC)处理珠粒。在罐中将100ml珠粒加入100ml 75％的GTMAC中。经混合后，加入3.3ml 50％的NaOH，在25℃下摇动反应一夜。用1500ml Milli-Q水洗涤珠粒。然后将珠粒再次涂敷上另一层6％的琼脂糖。此时珠粒在Milli-Q水中显示为两种染料的混合物：亚甲蓝(1mg/ml)和丽春红S(1mg.ml)。将仅显示出亚甲蓝的珠粒样品作为对比。用Milli-Q水洗涤珠粒三次(100ml)。用装在显微镜头上的数码相机记录染料的位置。
BPSA(负电荷)中心10％的琼脂糖区域结合有亚甲蓝染料。第二区域带有正电荷(含GTMAC)，没有结合亚甲蓝。然而，当暴露珠粒于亚甲蓝和带负电荷的丽春红S染料的混合物时，蓝色中心区域观察到在GTMAC区域的位置上有强烈的红色色带。中性的最外层区域含有一些不完全洗涤后残留的红色染料，但红色不如预期的强烈。
实施例3
实施例3A有独特化学环境和两个截然不同的孔径区域的不对称琼
脂糖珠粒：内部结构的制备
使用以下方法制造15％琼脂糖的珠粒：将1000ml 15％的琼脂糖溶液(来自Hispanagar的D-5琼脂糖)加入含有120ml Span 80乳化剂、第一油浴中的80℃的2000ml矿物油中，在不断搅拌下得到其中油相为连续的乳液。然后以3L/min的流速泵送乳液通过直径0.5英寸(12.7mm)、长度6英寸(152.4mm)的Kenics静态混合器(KMR-SAN-12)，进入5℃的第二矿物油浴中。得到的是最大的粒径为200微米的球形的均质琼脂糖珠粒。使珠粒沉积，用水、乙醇洗涤，然后再用水洗涤，筛分得到粒径75～125微米的珠粒。然后根据Porath，Jerher和Janson，Jan-Christer和Lass，Torgny，Journal ofChromatography，60(1971)167-177页公开的方法对珠粒进行交联，其公开内容通过引用结合在此。然后用烯丙基缩水甘油醚(AGE)对珠粒进行改性。向罐中加入120g珠粒、150ml 8M NaOH、30g硫酸钠和100g AGE，在45℃下搅拌一夜。用3×500ml Milli-Q品质的水洗涤珠粒。
实施例3B具有独特化学环境和两个截然不同的孔径区域的不对称
琼脂糖珠粒：内部结构的制备
改进实施例3A所制得的部分珠粒生成阳离子交换材料。用焦亚硫酸纳对珠粒进行改性。向罐中加入60g珠粒、47ml Milli-Q水、7.9g 50重量％的NaOH和23.4g焦亚硫酸纳，在室温下搅拌一夜。用3×500ml Milli-Q品质的水洗涤珠粒。
实施例3C具有独特化学环境和两个截然不同的孔径区域的不对称
琼脂糖珠粒：外部结构的制备
根据以下方法将实施例3B的珠粒涂敷上6％的琼脂糖：将50ml的珠粒混入300ml的6％琼脂糖溶液(来自Hispanagar的D-5琼脂糖)中，得到浆液。将琼脂糖-珠粒混合物加入90℃的1000ml矿物油中，在不断搅拌下得到其中油相为连续的乳液。然后以3L/min的流速泵送乳液通过直径0.5英寸(12.7mm)、长度6英寸(152.4mm)的Kenics静态混合器(KMR-SAN-12)，进入5℃的矿物油中。得到的琼脂糖珠粒具有预计10微米的外层厚度，珠粒种群大多数为单芯核的(＞50％)。使珠粒沉积，用水、乙醇洗涤，然后再用水洗涤，筛分得到粒径为75～125微米的珠粒。根据Porath、Jerher和Janson、Jan-Christer和Lass、Torgny，Journal of Chromatography，60(1971)167-177页公开的方法对珠粒进行交联，其公开内容通过引用结合在此。用3×500ml Milli-Q品质的水洗涤珠粒。
实施例3D有独特化学环境和两个截然不同的孔径区域的不对称琼
脂糖珠粒：向外部结构加入阳离子交换配体
其后用溴丙烷磺酸(BPSA)改性实施例3C的部分珠粒。向罐中加入10g珠粒、30ml 5M NaOH和7.2g BPSA，并且在50℃下搅拌一夜。用500ml Milli-Q品质的水洗涤珠粒，然后将其保存在20％的乙醇中。
实施例3E有独特化学环境和两个截然不同的孔径区域的不对称琼
脂糖珠粒：向外部结构加入阳离子交换配体
其后，用溴丙烷磺酸(BPSA)改性实施例3C的部分珠粒。向罐中加入10g珠粒、30ml 5M NaOH和7.2g BPSA，并且在50℃下搅拌一夜。用500ml Milli-Q品质的水洗涤珠粒，另外重复BPSA方法一次。用500ml的Milli-Q水洗涤珠粒，然后将其保存在20％的乙醇中。
实施例3F有独特化学环境和两个截然不同的孔径区域的不对称琼
脂糖珠粒：向外部结构加入阳离子交换配体
其后，用溴丙烷磺酸(BPSA)改性实施例3C的部分珠粒。向罐中加入10g珠粒、30ml 5M NaOH和7.2g BPSA，并且在50℃下搅拌一夜。用500ml Milli-Q品质的水洗涤珠粒，另外重复BPSA方法两次。用500ml的Milli-Q水洗涤珠粒，然后将其保存在20％的乙醇中。
选择性的测试
使用具有不同净电荷和分子量的两种蛋白，在典型的阳离子交换(CEX)条件下测试选择性或分离因子。将含有0.5mg/ml多克隆IgG(Sigma)和0.5mg/ml溶菌酶(Sigma)的蛋白混合物在pH 4.5下得到10mS电导率的含NaCl的50mM醋酸盐缓冲液中，以脉冲输送方式以200cm/hr(床高7cm，直径0.66cm)施加到每个样品柱，以使负载在介质上的净蛋白为10mg/mL。然后用30CV的NaCl梯度从10mS开始至80mS结束以200cm/hr洗脱蛋白混合物。每种蛋白的峰从洗脱梯度变化曲线的起点开始(对死体积进行修正)，以柱体积(CV)的方式记录。峰分离的数据如表2所示：
                               表2
  样品   IgG峰(CV)   溶菌酶峰(CV)   峰值分离(CV)
  实施例3D   19.7   25.7   6.6
  实施例3E   18.6   26.7   8.1
  实施例3F   18.7   26.8   8.1
  SP-Sepharose Fast Flow   20.3   26.3   6
该表报告了IgG和溶菌酶两者在洗脱梯度变化曲线中的峰位置。洗脱中延迟越长(CV越大)，物种与介质的结合越牢固。所述介质被设计成具有不同的化学和物理环境，主要是磺丙基配体的密度和内部结构的孔径。对于实施例3D而言，选择性类似于标准商业树脂的(SP-Sepharose Fast Flow)选择性。然而，实施例3E和3F表现出两种蛋白峰分离的增加，这是具有独特化学和孔径区域的不对称珠粒结构所产生的结果。
实施例5-琼脂糖芯核的珠粒
将75ml平均直径100微米的15％的交联琼脂糖珠粒(使用同一天申请的方法专利制造)与100ml 4％的琼脂糖溶液(Hispanagar的D5)混合，得到浆液。将琼脂糖-珠粒混合物加入80℃的2000ml矿物油中，在不断搅拌下得到其中油相为连续的乳液。然后以3L/min的流速泵送乳液通过直径0.5英寸(12.7mm)、长度6英寸(152.4mm)的Ross ISG静态混合器，进入5℃的矿物油中。得到的不对称珠粒具有预计10微米的外部区域厚度，珠粒种群大多数为单芯核的(＞60％体积)。

Claims (20)

1、一种不对称色谱粒子，其包括具有第一孔径分布的第一区域和具有不同于所述第一孔径分布的第二孔径分布的第二区域。
2、权利要求1的不对称色谱粒子，其中所述第一区域为所述粒子的内部区域，其中所述第二区域为所述粒子的外部区域。
3、权利要求1的不对称色谱粒子，其中所述粒子为珠粒。
4、权利要求3的不对称色谱粒子，其中所述第一区域为所述珠粒的芯核。
5、权利要求1的不对称色谱粒子，其中所述粒子包括琼脂糖。
6、权利要求5的不对称色谱粒子，其中所述第一区域中的琼脂糖浓度不同于所述第二区域中的琼脂糖浓度。
7、权利要求5的不对称色谱粒子，其中所述第一孔径分布小于所述第二孔径分布。
8、一种珠粒种群，其中所述珠粒包括具有第一孔径分布的第一区域和具有不同于所述第一孔径分布的第二孔径分布的第二区域。
9、一种色谱粒子，其包括具有一个或多个第一特征的第一区域和具有一个或多个第二特征的第二区域，所述第一特征选自以下组中：孔径分布、配体密度、配体类型、配体混合物、介质材料和琼脂糖百分数，所述第二特征选自以下组中：孔径分布、配体密度、配体类型、配体混合物、介质材料和琼脂糖百分数，其中第一区域的第一特征与第二区域的第二特征不同。
10、权利要求9的粒子，其中所述第一和第二特征为孔径分布。
11、权利要求9的粒子，其中所述第一和第二特征为配体密度。
12、权利要求9的粒子，其中所述第一和第二特征为配体类型。
13、权利要求9的粒子，其中所述第一和第二特征为配体混合物。
14、权利要求9的粒子，其中所述第一和第二特征为介质材料。
15、权利要求9的粒子，其中所述第一和第二区域由琼脂糖形成，并且所述第一和第二特征为琼脂糖百分数。
16、权利要求9的粒子，其中所述第一区域由15％的琼脂糖形成，第二区域由6％的琼脂糖形成。
17、权利要求9的粒子，其中所述第一区域由15％的琼脂糖形成，第二区域由6％的琼脂糖形成，其中所述第一区域是最里面的区域，第二区域是外面的区域。
18、权利要求9的粒子，其中所述第一区域由15％的琼脂糖形成，第二区域由6％的琼脂糖形成，其中所述第一区域是最外面的区域，第二区域是里面的区域。
19、权利要求9的粒子，其中所述第一和第二特征为孔径分布，以及选自以下组中的附加特征：配体密度、配体类型、配体混合物及琼脂糖百分数。
20、权利要求9的粒子，其中所述第一和第二特征为孔径分布，以及选自以下组中的附加特征：配体密度、配体类型、配体混合物及介质材料。
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