CN113101909A - 一种新型层析介质及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型层析介质及其制备方法，该新型层析介质是一种用于病毒或类病毒颗粒纯化分离的层析介质，具有双层结构，包括具有离子疏水作用双功能配体的内层A和可排阻病毒或类病毒颗类多孔隙结构的外层B组成；该层析介质的制备方法包括以下步骤：利用多孔聚合物微球基质进行烯丙基活化处理；将烯丙基活化基质进行部分溴化处理；将部分溴化的基质进行碱处理；将碱处理的基质进行完全溴化处理；将完全溴化的基质进行具有离子疏水作用双功能配体偶联。有益效果：通过对介质内层结构中核心微球上配基的重新设计，得到一种新型双层结构层析介质，具有离子和疏水作用复合模式，极大的提高了生物大分子的中间纯化和精细纯化效果。

Description

一种新型层析介质及其制备方法

技术领域

本发明涉及层析介质技术领域，具体来说，涉及一种新型层析介质及其制备方法。

背景技术

目前已提出的层析法基于与目标相互作用的不同模式，如离子交换层析以及疏水性相互作用层析。其中，离子交换基于带电靶化合物与带相反电荷的层析基质之间的可逆相互作用。洗脱最常通过增加盐浓度进行，但改变pH同样是可能的。离子交换剂分为阳离子交换剂，其中用带负电荷的层析基质吸附带正电荷的靶化合物；和阴离子交换剂，其中用带正电荷的层析基质吸附带负电荷的靶化合物。用于分离生物分子的离子交换剂在低离子强度下能吸附大多数带电荷的生物分子，但是当离子强度提高至超过度一定水平时，这些介质失去吸附样品分子的能力。

疏水性相互作用层析法通常分为为HIC和RPC两种类型，HIC是指使用非常亲水性的基质的蛋白质的疏水性相互作用层析法，其中疏水性配体与蛋白质的固定化程度非常低，以避免己分离的蛋白质变性。为了吸附待分离的蛋白质，需要在水中使用高浓度的无机盐。RPC是指使用与疏水性非极性分子/配体(通常为包含4-18个碳原子的脂族碳链)官能化程度非常高的基质(通常基于二氧化硅)的层析法。含有18个碳链的RPC介质与蛋白质牢固结合，在结合过程中蛋白质也有不同程度的变性，在洗脱蛋白质过程中，使用的条件较为苛刻，也会使蛋白质发生变性。

因此，期望得到一种层析介质，具有离子和疏水作用复合模式。小于对应分子量的生物分子能够进入微球内部与配基基团结合，大于对应分子量的生物分子会被阻隔在微球外流穿通过层析柱。从而提高大分子和小分子之间的分辨率，使得分离纯化效果大大提高。

发明内容

针对相关技术中的问题，本发明提出一种新型层析介质及其制备方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。

为此，本发明采用的具体技术方案如下：

根据本发明的一个方面，提供了一种新型层析介质，该层析介质是一种用于病毒或类病毒颗粒纯化分离的层析介质，该层析介质具有双层结构，包括具有离子疏水作用双功能配体的内层A和可排阻病毒或类病毒颗粒多孔隙结构的外层B组成；

其中，所述层析介质具有以下通式：

其中，Q是基质；L是连接臂；S是-S-，-O-，-NH-基团；R是C1-C12直链烷基、C4-C8环烷基、不饱和芳香烃基团；n是1-4；X₁、X₂、X₃是相同或者不同C0-C4烷基。

进一步的，所述层析介质的通式为：

进一步的，所述层析介质为内层具有离子疏水作用双功能配体的多孔聚合物微球。

进一步的，所述多孔聚合物微球基质的材料包含但不限于琼脂糖、葡聚糖、纤维素、淀粉、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酰胺、聚羟基烷基乙烯基醚、聚羟基烷基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯等多羟基聚合物微球。

进一步的，所述多孔聚合物微球的活化基团L为烯丙基缩水甘油醚。

进一步的，所述双功能配体具有-R-，-[CH₂]_n-，X₁，X₂，X₃，其中，R是C1-C12直链烷基、C4-C8环烷基、不饱和芳香烃基团，n为1-4，X₁、X₂、X₃是相同或者不同C0-C4烷基。

进一步的，所述多孔隙结构的外层B可排阻病毒或类病毒颗粒，且截留分子量大小为50-1000KDa。

进一步的，所述层析介质微球粒径是50-120μm。

进一步的，所述层析介质中双功能配体的密度为40-120μmol/mL介质。

根据本发明的另一个方面，提供了一种新型层析介质的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

S1、利用所述多孔聚合物微球基质进行烯丙基活化处理；

S2、将所述烯丙基活化基质进行部分溴化处理；

S3、将部分溴化的所述多孔聚合物微球基质进行碱处理；

S4、将碱处理的所述多孔聚合物微球基质进行完全溴化处理；

S5、将完全溴化的基质进行具有离子疏水作用双功能配体偶联。

本发明的有益效果为：通过对介质内层结构中核心微球上配基的重新设计，得到一种新型双层结构层析介质，具有离子和疏水作用复合模式，极大的提高了生物大分子的中间纯化和精细纯化效果。此外，在纯化过程中，不仅生物大分子不能通过外壳进入微球内部，因此直接流穿，而且大部分杂质可以进入微球内部通过离子和疏水作用结合在介质上，从而有效地提高了大分子和小分子之间的分辨率，使得分离纯化效果极大的提高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是根据本发明实施例的一种新型层析介质的结构示意图；

图2是根据本发明实施例的一种新型层析介质的制备方法的流程图。

具体实施方式

为进一步说明各实施例，本发明提供有附图，这些附图为本发明揭露内容的一部分，其主要用以说明实施例，并可配合说明书的相关描述来解释实施例的运作原理，配合参考这些内容，本领域普通技术人员应能理解其他可能的实施方式以及本发明的优点，图中的组件并未按比例绘制，而类似的组件符号通常用来表示类似的组件。

根据本发明的实施例，提供了一种新型层析介质及其制备方法。

现结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明，根据本发明的一个方面，如图1所示，提供了一种新型层析介质，是一种用于病毒或类病毒颗粒纯化分离的层析介质，该层析介质具有双层结构，包括具有离子疏水作用双功能配体的内层A和可排阻病毒或类病毒颗粒多孔隙结构的外层B组成；

其中，所述层析介质具有以下通式：

其中，Q是基质；L是连接臂；S是-S-，-O-，-NH-基团；R是C1-C12直链烷基、C4-C8环烷基、不饱和芳香烃基团；n是1-4；X₁、X₂、X₃是相同或者不同C0-C4烷基。

具体的，所述层析介质的通式为：

其中，所述层析介质为内层具有离子疏水作用双功能配体的多孔聚合物微球；所述多孔聚合物微球基质的材料包含但不限于琼脂糖、葡聚糖、纤维素、淀粉、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酰胺、聚羟基烷基乙烯基醚、聚羟基烷基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯等多羟基聚合物微球；所述多孔聚合物微球的活化基团L为烯丙基缩水甘油醚；所述双功能配体具有-R-，-[CH₂]_n-，X₁，X₂，X₃，其中，R是C1-C12直链烷基、C4-C8环烷基、不饱和芳香烃基团，n为1-4，X₁、X₂、X₃是相同或者不同C0-C4烷基；所述多孔隙结构的外层B可排阻病毒或类病毒颗粒，且截留分子量大小为50-1000KDa；所述层析介质微球粒径是50-120μm；所述层析介质中双功能配体的密度为40-120μmol/mL介质。

为了更好地理解本发明的上述技术方案，以下就本发明的实验部分及具体实施例进行详细说明。

实验部分

一种新型层析介质的一般制备方法，如图2所示，该制备方法包括以下步骤：

S1、利用所述多孔聚合物微球基质进行烯丙基活化处理；

取1.0L基质与0.24L水混合，再往上述悬浮液中加入360g氢氧化钠(50％溶液)。搅拌均匀后，加入160g固体氢氧化钠，升温至50℃搅拌1小时，得到溶液A。再加一定量的烯丙基缩水甘油基醚(AGE)，50℃剧烈搅拌18小时。用60％乙酸调节pH为5.7，最后依次用纯化水、乙醇、纯化水洗涤胶。

S2、将所述烯丙基活化基质进行部分溴化处理；

取1L烯丙基活化的胶，加入1L纯化水，搅拌均匀后，加入10g乙酸钠，充分搅拌20分钟。混合均匀后，加入15g溴并且搅拌15分钟。随后加入3g甲酸钠，并搅拌15分钟。然后用纯化水彻底洗涤。

S3、将部分溴化的所述多孔聚合物微球基质进行碱处理；

取1L部分溴化的胶与700mL 2M NaOH混合均匀，在50℃下搅拌18小时，随后用纯化水洗涤干净。

S4、将碱处理的所述多孔聚合物微球基质进行完全溴化处理；

取1L经NaOH处理后的胶，加入1L纯化水，搅拌均匀后，加入10g乙酸钠，充分搅拌20分钟。混合均匀后，加入15g溴并且搅拌15分钟。随后加入3g甲酸钠，并搅拌15分钟。然后用纯化水彻底洗涤。

S5、将完全溴化的基质进行具有离子疏水作用双功能配体偶联。

取1L溴化好的胶加入瓶中，在瓶中加入600mL纯化水，再加7g氯化钠。经充分搅拌溶解后，得到溶液B。在上述溶液中加入一定量具有离子疏水双功能的配体，搅拌3分钟后，加入3g固体氢氧化钠，在30℃下反应13小时。用纯化水、乙醇、纯化水依次洗涤，最后将胶储存在20％乙醇中。

实施例

一种新型层析介质，是一种用于病毒或类病毒颗粒纯化分离的层析介质，该层析介质具有双层结构，包括具有离子疏水作用双功能配体的内层A和可排阻病毒或类病毒颗类多孔隙结构的外层B组成。制备过程中使用不同的AGE和双功能配体用量，并且使用不同的双功能配体产生本发明的新型层析介质，这些层析介质及其配体密度表示在下表1中。

实施例一：AGE用量为70g，双功能配基用量40g

根据步骤S1，将70g AGE加入到溶液A中。在步骤S1，S2，S3后，根据步骤S4，将40g双功能配基1-双功能配基15分别加入到溶液B中，制备得到相应配基密度的层析介质。

实施例二：AGE用量为120g，双功能配基用量100g

根据步骤S1，将120g AGE加入到溶液A中。在步骤S1，S2，S3后，根据步骤S4，将100g双功能配基1-双功能配基15分别加入到溶液B中，制备得到相应配基密度的层析介质。

实施例三：AGE用量为170g，双功能配基用量145g

根据步骤S1，将170g AGE加入到溶液A中。在步骤S1，S2，S3后，根据步骤S4，将145g双功能配基1-双功能配基15分别加入到溶液B中，制备得到相应配基密度的层析介质。

实施例四：AGE用量为205g，双功能配基用量170g

根据步骤S1，将205g AGE加入到溶液A中。在步骤S1，S2，S3后，根据步骤S4，将170g双功能配基1-双功能配基15分别加入到溶液B中，制备得到相应配基密度的层析介质。

表1

(S＝-S-，-O-，-NH-；R＝C1-C12直链烷基、C4-C8环烷基、不饱和芳香烃基团；n＝1-4；X1、X2、X3＝相同或不同C0-C4烷基)；

其中，a:实验过程中，AGE用量为70g，双功能配基用量40g；b:实验过程中，AGE用量为120g，双功能配基用量100g；c:实验过程中，AGE用量为170g，双功能配基用量145g；d:实验过程中，AGE用量为205g，双功能配基用量120g。

综上所述，借助于本发明的上述技术方案，通过对介质上层结构中核心微球上配基的重新设计，得到一种新型双层结构层析介质，具有离子和疏水作用复合模式，极大的提高了生物大分子的中间纯化和精细纯化效果。此外，在纯化过程中，不仅生物大分子不能通过外壳进入微球内部，因此直接流穿，而且大部分杂质可以进入微球内部通过离子和疏水作用结合在介质上，从而有效地提高了大分子和小分子之间的分辨率，使得分离纯化效果极大的提高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种新型层析介质，是一种用于病毒或类病毒颗粒纯化分离的层析介质，其特征在于，该层析介质具有双层结构，包括具有离子疏水作用双功能配体的内层A和可排阻病毒或类病毒颗粒多孔隙结构的外层B组成；

其中，所述层析介质具有以下通式：

其中，Q是基质；L是连接臂；S是-S-，-O-，-NH-基团；R是C1-C12直链烷基、C4-C8环烷基、不饱和芳香烃基团；n是1-4；X₁、X₂、X₃是相同或者不同C0-C4烷基。

2.根据权利要求1所述的一种新型层析介质，其特征在于，所述层析介质的通式为：

3.根据权利要求1所述的一种新型层析介质，其特征在于，所述层析介质为内层具有离子疏水作用双功能配体的多孔聚合物微球。

4.根据权利要求3所述的一种新型层析介质，其特征在于，所述多孔聚合物微球基质的材料包含但不限于琼脂糖、葡聚糖、纤维素、淀粉、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酰胺、聚羟基烷基乙烯基醚、聚羟基烷基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯多羟基聚合物微球。

5.根据权利要求4所述的一种新型层析介质，其特征在于，所述多孔聚合物微球的活化基团L为烯丙基缩水甘油醚。

6.根据权利要求2所述的一种新型层析介质，其特征在于，所述双功能配体具有-R-，-[CH₂]_n-，X₁，X₂，X₃，其中，R是C1-C12直链烷基、C4-C8环烷基、不饱和芳香烃基团，n为1-4，X₁、X₂、X₃是相同或者不同C0-C4烷基。

7.根据权利要求1所述的一种新型层析介质，其特征在于，所述多孔隙结构的外层B可排阻病毒或类病毒颗粒，且截留分子量大小为50-1000KDa。

8.根据权利要求7所述的一种新型层析介质，其特征在于，所述层析介质微球粒径是50-120μm。

9.根据权利要求8所述的一种新型层析介质，其特征在于，所述层析介质中双功能配体的密度为40-120μmol/mL介质。

10.一种新型层析介质的制备方法，用于实现权利要求1-9中任一所述新型层析介质的制备，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

S1、利用所述多孔聚合物微球基质进行烯丙基活化处理；

S2、将所述烯丙基活化基质进行部分溴化处理；

S3、将部分溴化的所述多孔聚合物微球基质进行碱处理；

S4、将碱处理的所述多孔聚合物微球基质进行完全溴化处理；

S5、将完全溴化的基质进行具有离子疏水作用双功能配体偶联。

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