CN117753482A - 一种阴离子交换层析介质及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阴离子交换层析介质及其制备方法和应用,通过将季铵化阳离子聚乙烯醇通过间隔臂试剂偶联到亲水性的基础介质上,得到一种阴离子交换层析介质,其结构式为SP‑R‑Quaternary ammonium cationic polyvinyl alcohol,其中,SP为基础介质,Quaternary ammonium cationic polyvinyl alcohol为季铵化阳离子聚乙烯醇,R为基础介质偶联季铵化阳离子聚乙烯醇的间隔臂。阳离子型聚乙烯醇含有大量的正电荷,可以与类脂A结合,而季铵化引入了带有正电荷的季铵盐基团,使得聚乙烯醇在水相中表现出更强的阴离子交换性能,同时提高了聚乙烯醇在水相中的稳定性,本发明的阴离子交换层析介质在内毒素去除测试中,有着大于98.1%的去除率。
Description
技术领域
本发明涉及层析介质领域,具体涉及一种阴离子交换层析介质及其制备方法和应用。
背景技术
内毒素也称为脂多糖,是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分,位于细胞壁最外层,覆盖在细胞壁的黏肽上,内毒素一般是细菌死亡溶解或人工破坏细菌细胞之后才能释放出来,其化学成分有磷脂多糖-蛋白质复合物,其中毒性成份主要为类脂A。内毒素对人体有危害,可以引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。
传统的内毒素去除方法包括热处理、酸碱处理和吸附剂法等,然而,这些方法存在选择性差、样品回收率低的缺点。例如,热处理可能对蛋白质等生物分子造成不可逆的损伤,而酸碱处理可能导致环境恶化,影响工艺的可持续性。因此,寻找一种高效、选择性强、可控的内毒素去除方法成为当今研究的焦点。
阴离子交换层析介质作为一种具有高度选择性的分离纯化技术,在生物制品制备中展现出广阔的应用前景。聚阳离子可以与内毒素中具有疏水性和电负性的类脂A相结合,因此可以用来去除内毒素。然而,当前市场上存在的阴离子交换介质在去除内毒素方面仍然存在一些问题,如吸附容量不足、稳定性差、工艺复杂等。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种基于季铵化阳离子聚乙烯醇的阴离子交换层析介质及其制备方法。
技术方案:一种阴离子交换层析介质,结构式如下:
SP-R-Quaternary ammonium cationic polyvinyl alcohol,
其中,SP为基础介质,Quaternary ammonium cationic polyvinyl alcohol为季铵化阳离子聚乙烯醇,R为基础介质偶联季铵化阳离子聚乙烯醇的间隔臂。
具体的,所述基础介质为表面含有多羟基的化合物,选自琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、明胶、聚甲基丙烯酸酯微球、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯-二乙烯基苯微球中的一种或几种。
优选的,所述基础介质为琼脂糖,进一步优选为Agarosix 65,Agarosix 65是由苏州赛分科技股份有限公司自行生产的琼脂糖微球,具有高交联度,有一定的机械性能,可用于工业层析纯化,其表面未经任何修饰且具有大量天然的羟基,亲水性极佳,对杂质的非特异性结合可忽略不计。本发明的琼脂糖基质粒径优选为50-65μm,孔径优选为200nm。
具体的,所述间隔臂为环氧化合物,选自环氧氯丙烷、乙二醇二缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,2-环己二醇二缩水甘油醚、二(2-环氧丙基)醚、二丙二醇二缩水甘油醚中的一种或几种。
优选的,所述间隔臂为环氧氯丙烷。
本发明还提供一种阴离子交换层析介质的制备方法,包括以下步骤:
S1.将聚乙烯醇溶液和环氧基季铵盐在碱性条件下反应,得到季铵化阳离子聚乙烯醇;
S2.将季铵化阳离子聚乙烯醇通过间隔臂偶联至基础介质上,得到阴离子交换层析介质。
具体的,所述步骤S1中,可在季铵化阳离子聚乙烯醇的每个单体的羟基上接枝若干个环氧基季铵盐,多次接枝的季铵盐既可以选择同一种,也可以选择不同的季铵盐。
具体的,所述步骤S2中,先将基础介质与间隔臂混合偶联,再加入季铵化阳离子聚乙烯醇偶联在间隔臂上。
所述环氧基季铵盐结构式为:
式中:R1为C1-C5直链烷基或支链烷基,R2、R3、R4为C1-C3烷基,M﹣为氯、溴离子。
优选的,所述环氧基季铵盐为2,3-环氧丙基三甲基氯化铵、3,4-环氧丁基三乙基溴化铵、4,5-环氧戊基三丙基氯化铵、3,4-环氧丁基三甲基氯化铵中的一种或多种。
具体的,本发明对聚乙烯醇的聚合度不做特别限定,聚合度可以为500-3500。
具体的,本发明对聚乙烯醇的醇解度不做特别限定,优选为87.0~89.0%。
上述阴离子交换层析介质可应用于绝大部分阴离子交换层析介质的应用领域,例如脂质、蛋白、抗体、质粒、RNA、DNA、VLP、抗原、疫苗、病毒载体、病毒、细菌的分离纯化,特别适用于去除生物制品中的内毒素。
有益效果:与现有技术相比,本发明的显著效果是:阳离子型聚乙烯醇含有大量的正电荷,可以与类脂A结合,而季铵化引入了带有正电荷的季铵盐基团,使得聚乙烯醇在水相中表现出更强的阴离子交换性能,提高了聚乙烯醇在水相中的性能稳定性,同时影响了聚乙烯醇的水溶性,有助于调控阴离子交换介质的使用条件,使其在特定pH范围内表现出最佳的去除内毒素性能。本发明的阴离子交换层析介质在内毒素去除测试中,有着大于98.1%的去除率。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法;下述实施例中所用的试剂、材料等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下面结合具体实施方式,进一步阐明本发明。
实施例1
本实施例中采用的基础介质为Agarosix 65,是由苏州赛分科技股份有限公司生产的琼脂糖微球,具有高交联度,其表面未经任何修饰且具有大量天然的羟基,亲水性极佳,对杂质的非特异性结合可忽略不计,粒径范围为50-65μm,孔径为200nm。
1、季铵化阳离子聚乙烯醇配基制备
在2L的四口烧瓶中加入1L去离子水,边搅拌边加入100g聚乙烯醇1788型(上海麦克林生化科技有限公司,醇解度:87.0~89.0%),将温度升高至80℃左右,使聚乙烯醇完全溶解,随后降至室温。而后在室温条件下,向四口烧瓶中缓慢加入400g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵,滴加0.5mol/L氢氧化钠水溶液,将pH调至10,再逐渐升温至60℃,在50rpm转速下搅拌4h,待反应结束后,使用0.1mol/L稀盐酸水溶液将pH调至中性,得到季铵化阳离子聚乙烯醇配基。
2、阴离子交换层析介质合成
在2L的四口烧瓶中加入100g Agarosix 65、175g环氧氯丙烷、200g NaBH4和400mL1mol/L NaOH,然后升温至40℃,50rpm转速下搅拌4h,用5L纯水洗至中性,然后加入100mL步骤1配制好的季铵化阳离子聚乙烯醇配基,再加入50mL的甲苯,升温至60℃,以50rpm转速下搅拌1h后冷却至室温,得到阴离子交换层析介质。
合成步骤如下式所示:
(1)季铵化阳离子聚乙烯醇配基制备
(2)偶联间隔臂
(3)偶联季铵化阳离子聚乙烯醇配基
式中,为基础介质Agarosix 65。
实施例2
本实施例中采用的基础介质为市售的聚甲基丙烯酸酯微球,在使用前需进行亲水改性。
1、聚甲基丙烯酸酯微球亲水改性
在1L的四口烧瓶中加入100g聚甲基丙烯酸酯微球(由苏州赛分科技股份有限公司提供,粒径为60-80μm,孔径为100-200nm)和200mL 1mol/L NaOH溶液,以100rpm的转速搅拌1h,然后加入100g乙二醇二缩水甘油醚和100g葡聚糖,升温至60℃,50rpm转速下搅拌24h,使用5L纯水清洗后过滤,得到表面具有大量-OH的聚甲基丙烯酸酯基球。
2、环氧活化
向1L的四口烧瓶中加入100g表面带有大量-OH的聚甲基丙烯酸酯基球和200mL1mol/L NaOH溶液,以100rpm的转速搅拌1h,然后加入100g乙二醇二缩水甘油醚,升温至60℃,50rpm转速下搅拌4h,使用5L纯水清洗后过滤,得到中间体。
3、层析介质合成
在1L的四口烧瓶中加入100g步骤2中的中间体和50mL的甲苯,升温至60℃,50rpm转速下搅拌2h后加入100mL实施例1步骤1中所述方法配制好的季铵化阳离子聚乙烯醇配基,以50rpm转速下搅拌1h后冷却至室温,得到阴离子交换层析介质。
实施例3
将实施例1中的聚乙烯醇1788型替换为聚乙烯醇2488型(上海麦克林生化科技有限公司,醇解度:87.0~89.0%),将2,3-环氧丙基三甲基氯化铵替换为4,5-环氧戊基三丙基氯化铵,将环氧氯丙烷替换为1,4-丁二醇二缩水甘油醚,在其余条件与实施例1完全相同的情况下制备阴离子交换层析介质。
实施例4
1、季铵化阳离子聚乙烯醇配基制备
在2L的四口烧瓶中加入1L去离子水,边搅拌边加入100g聚乙烯醇1788型(上海麦克林生化科技有限公司,醇解度:87.0~89.0%),将温度升高至80℃,使聚乙烯醇完全溶解,随后降至室温。在室温条件下,向四口烧瓶中缓慢加入400g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵,滴加0.5mol/L氢氧化钠水溶液将pH调至10,逐渐升温至60℃,50rpm转速下搅拌4h,反应结束后,使用0.1mol/L稀盐酸水溶液将pH调至中性,然后加入200mL 1mol/L盐酸水溶液和200g 4,5-环氧戊基三丙基氯化铵,缓慢升温至70℃,在100rpm转速下搅拌2h,待反应结束后,使用0.5mol/L NaOH将水溶液pH调至中性,得到季铵化阳离子聚乙烯醇配基。
该步骤在初步合成聚乙烯醇的季铵盐上再接枝一个季铵盐,双季铵盐基团可以增强离子交换作用,两次接枝的季铵盐既可以选择同一种,也可以选择不同的季铵盐。接枝季铵盐既可以在碱性条件下,也可以在酸性条件下,若有需要可以在反应留下的羟基上继续接枝季铵盐。
2、层析介质合成
在2L的四口烧瓶中加入100g Agarosix 65、200g 1,2-环己二醇二缩水甘油醚、200g NaBH4和400mL 1mol/L NaOH,然后升温至40℃,50rpm转速下搅拌4h,用5L纯水洗至中性,然后加入50mL的甲苯,升温至60℃,50rpm转速下搅拌2h后加入100mL步骤1制备好的季铵化阳离子聚乙烯醇配基,以50rpm转速下搅拌1h后冷却至室温,得到一种阴离子交换层析介质。
实施例5
内毒素去除试验:
1、探究内毒素去除率的影响因素:
(1)NaCl浓度对于去除内毒素的影响
准确称取实施例1制备的20mg层析介质,加入1mL的20Eu/mL的内毒素标准品(由康朗生物提供,货号KL-140405-10)和不同浓度的NaCl溶液放入振荡器中,NaCl浓度为0mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、3mol/L、5mol/L,转速为200r/min振荡2h,实验温度为25℃,离心取上清液测定内毒素含量,内毒素检测方法为使用北京索莱宝科技有限公司提供的动态显色法鲎试剂盒进行检测(货号:T7570)。
检测完毕后分别用2mol/L NaOH溶液、0.5mol/L NaCl溶液和无热原水淋洗层析介质,充分解离层析介质上的内毒素,清洗层析介质。
内毒素去除率结果如下表1所示:
表1 NaCl浓度对于去除内毒素影响
从表1中结果可以看出,随着NaCl浓度升高,内毒素去除率有先增大后减小的趋势,当氯化钠浓度为0.1mol/L时,去除率达到最高,为96.15%。
(2)pH对于去除内毒素的影响
准确称取实施例1制备的20mg层析介质,加入1mL 20Eu/mL的内毒素标准品(由康朗生物提供,货号KL-140405-10)和不同pH的溶液放入振荡器中,溶液包括50mM HAC-NaAC(pH5.0),20mM磷酸钠缓冲溶液(pH6.0),20mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.0),20mM Tris-HCl(pH8.0),20mM Tris-HCl(pH9.0),以上五种缓冲液中均加入0.1mol/L NaCl溶液,转速为200r/min振荡2h,实验温度为25℃,离心取上清测定内毒素含量,内毒素检测方法为使用北京索莱宝科技有限公司提供的动态显色法鲎试剂盒进行检测(货号:T7570)。
表2 pH对于去除内毒素影响
由上表结果可知,pH在6.0-8.0之间内毒素去除率大于95%,因此可以选用pH6.0-8.0为上样条件。
2、高通量法筛选去除内毒素最佳实验条件
本实施例中使用Freedom EVO 200全自动化液体处理工作站,采用流穿模式,使用实施例1制备的阴离子交换层析介质进行测试,层析步骤为先用0.1mol/L NaOH溶液再生5个柱体积,接着使用纯水冲洗10个柱体积,然后使用平衡液平衡10个柱体积,平衡液为1%脱氧胆酸钠+50mM磷酸盐(pH 6.0-8.0),然后上样利妥昔单抗,该样品浓度为5.30g/L,PI为8.9,分子量为150kDa,内毒素含量为500Eu/mg,上样流速为0.2mL/min,上样5个柱体积,将流穿液收集起来,循环上样5次后,使用内毒素试剂盒(北京索莱宝,货号:T7570)检测流穿液中内毒素含量,实验温度为32℃。为找出最佳上样条件,将样品调成3种不同pH和3种不同电导率,具体实验数据见下表3-4:
表3测试条件
表4高通量法筛选去除内毒素最佳实验条件实验结果
上述实验结果表明,使用实施例1所制备的阴离子交换层析介质去除内毒素时,可以使单抗中的内毒素含量从500Eu/mg将至10Eu/mg以下,去除率大于98.1%,具有良好的去除内毒素的效果。
利用同样的测试条件,对实施例2-4所制备的阴离子交换层析介质进行测试,各实施例最优测试结果如下表5。
表5各实施例制备的层析介质去除内毒素的效果
从上表数据可以看出,实施例1-4所制备的阴离子交换层析介质在最佳的测试条件下均取得了大于99.9%的内毒素去除率。
Claims (10)
1.一种阴离子交换层析介质,其特征在于,结构式如下:
SP-R-Quaternary ammonium cationic polyvinyl alcohol,
其中,SP为基础介质,Quaternary ammonium cationic polyvinyl alcohol为季铵化阳离子聚乙烯醇,R为基础介质偶联季铵化阳离子聚乙烯醇的间隔臂。
2.根据权利要求1所述的阴离子交换层析介质,其特征在于:所述基础介质为表面含有多羟基的化合物,选自琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、明胶、聚甲基丙烯酸酯微球、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯-二乙烯基苯微球中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的阴离子交换层析介质,其特征在于:所述间隔臂为环氧化合物,选自环氧氯丙烷、乙二醇二缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,2-环己二醇二缩水甘油醚、二(2-环氧丙基)醚、二丙二醇二缩水甘油醚中的一种或几种。
4.一种如权利要求1-3任一项所述阴离子交换层析介质的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.将聚乙烯醇溶液和环氧基季铵盐在碱性条件下反应,得到季铵化阳离子聚乙烯醇;
S2.将季铵化阳离子聚乙烯醇通过间隔臂偶联至基础介质上,得到阴离子交换层析介质。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:所述步骤S1中,季铵化阳离子聚乙烯醇的每个单体的羟基上接枝若干个环氧基季铵盐。
6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:所述步骤S2中,先将基础介质与间隔臂混合偶联,再加入季铵化阳离子聚乙烯醇偶联在间隔臂上。
7.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:所述环氧基季铵盐结构式为:
式中:R1为C1-C5直链烷基或支链烷基,R2、R3、R4为C1-C3烷基,M﹣为氯、溴离子。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于:所述环氧基季铵盐为2,3-环氧丙基三甲基氯化铵、3,4-环氧丁基三乙基溴化铵、4,5-环氧戊基三丙基氯化铵、3,4-环氧丁基三甲基氯化铵中的一种或多种。
9.权利要求1-3任一项所述的阴离子交换层析介质,或权利要求4-8任一项所述制备方法制备的阴离子交换层析介质在脂质、蛋白、抗体、质粒、RNA、DNA、VLP、抗原、疫苗、病毒载体、病毒、细菌的分离纯化上的应用。
10.权利要求1-3任一项所述的阴离子交换层析介质,或权利要求4-8任一项所述制备方法制备的阴离子交换层析介质在去除生物制品中内毒素的应用。
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