JP6702587B2 - 生物粒子の精製用分離マトリックス - Google Patents

Description

本発明は生物粒子の精製用分離マトリックスに関し、特にワクチン抗原（例えばウイルス粒子）の精製用分離マトリックスに関する。本発明はまた、生物粒子の精製における分離マトリックスの用途、生物粒子の精製方法、及び分離マトリックスの製造方法にも関する。

多くのワクチンでは、抗原を構成する粒子の大きさはタンパク質分子よりかなり大きい。これに該当するものとして、例えば、ウイルス、ウイルス様粒子、細菌、及びプラスミドの抗原が挙げられる。これらの抗原の製造工程において、抗原は抗原よりかなり小さいタンパク質や他の夾雑種を含んだ状態で製造される。そうした種の例として、例えば、卵由来抗原のための卵タンパク質、宿主細胞タンパク質、並びに細胞培養物中で製造される抗原のための培地成分が挙げられる。そのようなタンパク質は含有量が多く、しかもアレルギー反応を引き起こす等の恐れがあるため、抗原の処理プロセスにおいて取り除くことが必要である。

大きさに基づいて抗原と夾雑タンパク質とを分離する処理には従来からサイズ排除クロマトグラフィーが用いられてきた。しかし、処理能力や処理コストに対する要求の高まりにより、代替方法が研究されている。近年、あるタイプのクロマトグラフィー媒体が利用可能となっている。その媒体では、正電荷と親水性部分をともに有するリガンドによってクロマトグラフィービーズの内側のコアが機能化される一方、外側のシェルは不活性であり、かつその孔径はウイルス抗原より小さい。夾雑タンパク質はシェルを貫通してコアに侵入可能であり、タンパク質はそこでリガンドによって強く結合される。他方、ウイルス粒子は結合されずにカラムを通過するため、フロースルー中に回収することができる。そのような媒体はＣａｐｔｏ（商標）Ｃｏｒｅ７００の名称でＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢから市販されている。同様の媒体は国際公開第９８３９３６４号、同２００９１３１５２６号、及び米国特許第７２０８０９３号にも記載されている。なお、これらの特許文献はその全体が参照によって本願明細書に援用されている。

大半の抗原は、製造時のイオン強度が生理的条件下で正常とされる値に近い。すなわち、約０．１〜０．２ｍｏｌ／ｌであり、これは約１０〜２０ｍＳ／ｃｍの導電率に相当する。こうした条件下では、既存製品の結合容量、特に電荷相互作用の仕組みに基づく結合容量に限界がある。したがって、供給材料をクロマトグラフィー媒体に送る前に希釈や緩衝液交換をしなくて済むように、高塩条件での結合容量を高めることが望ましいと思われる。

さらに、クロマトグラフィー媒体は再利用して分離サイクルを何度も行うことが望ましい。そのためには、サイクルとサイクルの間に媒体を清浄化（再生とも言う）して吸着タンパク質を除去することが必要になる。疎水性部分が存在するとそれが困難な場合があり、アルコール等の溶媒の追加が必要なことがある。これは作業時に火災及び爆発の危険性を生む。高イオン強度での結合容量を高めるためにリガンドの疎水性を高める場合に、この問題はいっそう悪化する。

以上のように、夾雑タンパク質を除去してワクチン抗原及びその他の生物粒子を高イオン強度において精製可能にするとともに、再利用の前に安全かつ容易な清浄化を可能にする新しいマトリックスが求められている。

国際公開第２０１３０２８３３０号

本発明の一態様は、多量のタンパク質を高イオン強度において結合でき、かつ生物粒子をフロースルー画分中に回収できる、再生可能な分離マトリックスを提供することである。これは請求項１に規定される分離マトリックスを用いて実現される。

ひとつの利点は、マトリックスが１００〜２００ｍＭ以上のイオン強度において、一般的な夾雑タンパク質に対して依然として高い結合容量を有することである。さらなる利点は、マトリックスがウイルス粒子もしくはウイルス様粒子を結合しないこと、及び無溶媒再生液の使用によって広範囲の強吸着性夾雑タンパク質が容易に除去でき、マトリックスが簡単に再利用できることである。

本発明の第２の態様は、生物粒子の分離方法を提供することである。これは特許請求の範囲に規定される方法を用いて実現される。この方法の利点として、多量の夾雑タンパク質を高イオン強度において結合できること、及びマトリックスが容易に再生できること、が挙げられる。

本発明の第３の態様は、生物粒子の精製用分離マトリックスの用途を提供することである。これは特許請求の範囲に規定される方法を用いて実現される。

本発明の第４の態様は、生物粒子の精製に好適な分離マトリックスの製造方法を提供することである。これは特許請求の範囲に規定される方法を用いて実現される。

本発明のさらなる好適な実施形態は従属請求項に記載されている。

本発明のマトリックスの概略的な構造図である。 リガンドに関する例として、ａ）リガンド前駆体であるトリス（２−アミノエチル）アミン、ｂ）トリス（２−アミノエチル）アミンが結合したリガンド、ｃ）リガンド前駆体である１，３−ジアミノ−２−プロパノール、ｄ）１，３−ジアミノ−２−プロパノールが結合したリガンド、ｅ）リガンド前駆体であるポリアリルアミン、ｆ）ポリアリルアミンが結合したリガンドを示す図である。 本発明の合成経路の例として、ａ）アリル化、ｂ）臭素化、ｃ）不活性化、ｄ）結合を示す図である。 次に示す異なる再生液で再生した後の、大腸菌汚染されたＣａｐｔｏ（商標）Ｃｏｒｅ７００の抽出物についてチップ電気泳動データを示す図である。レーン１：分子量マーカー；同２：１Ｍ ＮａＯＨ；同３：２Ｍ ＮａＯＨ；同４：２Ｍ ＮａＯＨ＋３０％ ２−プロパノール；同５：３０％ ２−プロパノール；同６：１Ｍ ＮａＯＨ＋２０％ １−プロパノール；同７：１Ｍ ＮａＯＨ＋１０％ １−プロパノール；同８：１Ｍ ＮａＯＨ＋５％ １−プロパノール；同９：２０％ １−プロパノール；同１０：０．５Ｍ ＮａＯＨ／１０ｍＭ ＨＣｌ／０．５Ｍ ＮａＯＨ；同１１：１Ｍ ＮａＯＨ／１０ｍＭ ＨＣｌ／１Ｍ ＮａＯＨ；同１２：２０％プロピレングリコール；同１３：４０％プロピレングリコール；同１４：１Ｍ ＮａＯＨ＋２０％プロピレングリコール；同１５：１Ｍ ＮａＯＨ＋４０％プロピレングリコール；同１６：８Ｍ尿素／１Ｍ ＮａＯＨ；同１７：１Ｍ尿素／１Ｍ ＮａＯＨ；同１８：８Ｍ尿素；同１９：８Ｍ尿素＋０．１Ｍクエン酸；同２０：８Ｍ尿素＋１Ｍ ＮａＣｌ＋０．１Ｍクエン酸。 次に示す異なる再生液で再生した後の、大腸菌汚染されたポリアリルアミンプロトタイプの抽出物についてチップ電気泳動データを示す図である。レーン１：１Ｍ ＮａＯＨ；同２：２Ｍ ＮａＯＨ；同３：１Ｍ ＮａＯＨ＋３０％ ２−プロパノール；同４：１Ｍ ＮａＯＨ＋２０％ １−プロパノール；同５：８Ｍ尿素；同６：８Ｍ尿素＋０．１Ｍクエン酸；同７：６Ｍ塩酸グアニジン；同８：０．５Ｍ ＮａＯＨ＋１Ｍ ＮａＣｌ；同９：１Ｍ ＮａＯＨ／１０ｍＭ ＨＣｌ／０．５Ｍ ＮａＯＨ；同１０：１Ｍ尿素／１Ｍ ＮａＯＨ；同１１：再生なし；同１２：分子量マーカー。 次に示す異なる再生液で再生した後の、大腸菌汚染されたトリス（２−アミノエチル）アミンプロトタイプの抽出物についてチップ電気泳動データを示す図である。レーン１：１Ｍ ＮａＯＨ；同２：２Ｍ ＮａＯＨ；同３：１Ｍ ＮａＯＨ＋３０％ ２−プロパノール；同４：１Ｍ ＮａＯＨ＋２０％ １−プロパノール；同５：８Ｍ尿素；同６：８Ｍ尿素＋０．１Ｍクエン酸；同７：６Ｍ塩酸グアニジン；同８：０．５Ｍ ＮａＯＨ＋１Ｍ ＮａＣｌ；同９：１Ｍ ＮａＯＨ／１０ｍＭ ＨＣｌ／０．５Ｍ ＮａＯＨ；同１０：１Ｍ尿素／１Ｍ ＮａＯＨ；同１１：再生なし；同１２：分子量マーカー。

一態様において、本発明は、図１と図２に示すように、生物粒子の精製用分離マトリックスを開示している。同分離マトリックスは複数の粒子１００を含む。粒子１００は、多孔質コア体１０１と、コア体を覆う多孔質シェル体１０２とを有する。好適には、上記複数個における各粒子１００は、多孔質シェル体１０２によって覆われる多孔質コア体１０１を有しうる。コア体１０１は、共有結合で結合したリガンド上に５０マイクロモル／ｍｌ以上の第１級アミンを含んでいて、リガンド１個当たり２個以上の第１級アミンを呈する。シェル体１０２は２０マイクロモル／ｍｌ未満（例えば、１０マイクロモル／ｍｌ未満、又は１マイクロモル／ｍｌ未満）の第１級アミンを含む。ここで「呈する」とは、リガンドが付加状態にあるときにリガンドがリガンド１個当たり２個以上の第１級アミンを有することを意味する。コア体よりもリガンド含有量が低いシェル体が存在することは、例えば顕微鏡検査によって検出できる。粒子は、酸性の蛍光染料（例えば、フルオレセイン）、又は第１級アミン類に対して反応性を有する蛍光染料（例えば、５−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）と接触させればよく、蛍光発生の空間分布は共焦点顕微鏡で測定することができる。或いは、粒子を染色して樹脂中に埋め込み、ミクロトームで薄片を作成して従来型の顕微鏡で観察してもよい。いずれの方法でも、２領域における相対的なリガンド濃度はデンシトメトリと絶対濃度によって評価できる。絶対濃度は、例えば、当該技術分野で周知の滴定による方法又は分光的な方法によって決定された、マトリックスの全リガンド含有量を乗じることによって計算できる。

ある実施形態では、マトリックスは、１０ｍＳ／ｃｍ以上（例えば、２０ｍＳ／ｃｍ以上）の導電率を有する水性緩衝液中でマトリックス１ｍｌ当たり２０ｍｇ以上のオボアルブミン（例えば、３０ｍｇ以上又は４０ｍｇ以上のオボアルブミン）を結合することができる。１０ｍＳ／ｃｍの値は約０．１ＭのＮａＣｌに、また２０ｍＳ／ｃｍの値は約０．２ＭのＮａＣｌに相当する。細胞培養物、卵の液状部分、血漿、牛乳等、大半の生理的システムは導電率が上記の範囲内にあるため、オボアルブミンによって例示されるように、これらの条件下において高いタンパク質結合容量を有することは有利である。マトリックスは、さらに高い導電率、例えば、２０〜３０又は３０〜４０ｍＳ／ｃｍ等においても結合が可能である。このような高い導電率は、例えば、液体がイオン交換マトリックスもしくはＨＩＣマトリックスからの溶出液である場合に関心を引く。結合容量の試験は、トリス緩衝液中かつｐＨ７．５において、また実施例に記載するような接触時間が６０分の静的な結合容量試験を用いることで好適に実施できる。

ある実施形態では、上記リガンドは、リガンド１個当たり少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、又は少なくとも４つ）の第１級アミンを呈する。リガンド１個について利用可能な第１級アミンの数は、高イオン強度での結合容量にとって有利に作用するようであり、少なくとも２つであるべきだと思われる。アミノメチル基Ｈ₂Ｎ−ＣＨ２−やアミノエチル基Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−のように、第１級アミンが第１級炭素原子に結合し、かつもう１つの炭素原子との間が単結合の場合は、さらに有利となりうる。その場合、第２級もしくは第３級炭素原子に結合する第１級アミンに比べてタンパク質に容易にアクセスできる。リガンドは分子量が異なってもよく、単量体でも重合体でもよく、またより大きな構造体の一部を形成するものであってもよい。

ある実施形態では、リガンドは第２級又は第３級アミン結合を介してコア体に結合する。アミン結合は化学的に安定であり、リガンド前駆体のアミンと支持材料（例えば、エポキシドやハロヒドリン等）の求電子基との結合によって容易に形成される。リガンド前駆体が３以上の第１級アミンを含み、かつ１つの第１級アミンを消費して付加結合を形成し、結合先のマトリックスにおいてリガンド１個当たり残る２以上の第１級アミンが呈されるような種となれば好適である。

ある実施形態では、上記リガンドにおける窒素原子と酸素原子の合計含有量は２０重量％以上である。付加されたリガンドにおける第１級アミン窒素の含有量は１８重量％以上とすれば好都合である。第１級アミンと窒素原子の合計量との比は、０．５以上（例えば、０．７以上又は０．９以上）でありうる。こうした比では、リガンドは親水性となる、すなわち、タンパク質と不可逆的に結合することがなく、第１級アミンの含有量は、高イオン強度において高い結合容量を実現できるほど十分に高くなる。

ある実施形態では、リガンドは、トリス（２−アミノエチル）アミン及びポリアリルアミンからなる群から選択される。これらのリガンドは親水性であり、アミンを介して付加される場合であっても複数の第１級アミンを呈する。リガンドは、例えば、分子量が１ｋＤａ以上（例えば、５ｋＤａ以上又は１０ｋＤａ以上）のポリアリルアミンを含みうる。ポリアリルアミンは非架橋型であり、それによって移動性とタンパク質へのアクセスを実現すれば好適である。付加は一点付加であっても多点付加であってもよい。一点付加は、例えば、グラフト重合やポリアリルアミンの反応性末端基を介した結合によって実現できる。多点付加は、当該技術分野で周知の方法によって、ポリアリルアミンをコア体の求電子基もしくはアルデヒドに、アミンを介して結合することによって実現できる。

ある実施形態では、シェル体は平均厚さが１〜１０μｍ（例えば、１〜６μｍ）である。シェルの厚さを最小限とすることで、リガンドと結合する生物粒子が分離マトリックス粒子の外部では得られないようにしている。他方、コア体内のタンパク質に対する結合容量を最大化するために、シェルの厚さは大きすぎないようにするのが好適である。粒子は実質的に球形であり、例えば、体積加重平均直径は１５〜４００μｍである。その場合、シェル体の平均厚さは粒子の体積加重平均直径の０．５〜６％となりうる。粒子が非球形の場合、シェル体の平均厚さは粒子の球相当径の０．５〜６％となりうる。粒子の平均球形度は、ある所与の粒子の表面積に対する球（その粒子と体積が同じもの）の表面積の比として定義され、上記粒子では少なくとも０．９（例えば、少なくとも０．９７）でありうる。シェルの厚さは、上述のように、染色した粒子に対する顕微鏡検査によって決定できる。分離マトリックスの粒子は、例えば後述の方法に従って製造できる。その場合、シェルの厚さは部分不活性化プロセスによって制御できる。

ある実施形態では、シェル体は、球状タンパク質に対する分子量カットオフ値が６０〜１０００ｋＤａ（例えば、１００〜１０００ｋＤａ、又は４００〜８００ｋＤａ）である。これは夾雑タンパク質を粒子へ、及び粒子から、高速に質量輸送できる一方、生物粒子がコア体に到達するのを防止する点で有利である。カットオフ値は、例えば、分子量が異なるタンパク質がリガンドに結合する条件下においてそれらのタンパク質に対する結合容量を比較することによって測定できる。

第２の態様において、本発明は、生物粒子の精製方法を開示する。その方法は、
ａ）上に開示した任意の実施形態に係わる分離マトリックスを提供する工程と、
ｂ）上記マトリックスを、生物粒子及び１種以上の夾雑タンパク質を含む液体に、上記夾雑タンパク質が上記マトリックスに結合するように接触させる工程と、
ｃ）上記液体を上記マトリックスから分離し、精製された生物粒子とともに上記液体を回収する工程と、
を含む。

液体は、例えば、卵からの尿膜腔液、細胞培養上清、細胞溶解物等でありえ、その導電率は１０ｍＳ／ｃｍ以上、或いはときに１５ｍＳ／ｃｍ以上でさえありうる。このことは、液体を大幅に希釈する必要がないことを意味する。１種類以上の夾雑タンパク質に加え、例えばＤＮＡ及び／又はエンドトキシン等の他の夾雑物がマトリックスに結合しえ、したがって除去されうる。上記方法はクロマトグラフィーの方法でありうる。このとき、マトリックスはカラム内に充・される。しかし、上記方法は、バッチ吸着法（例えば、磁性マトリックスを使用）であってもよいし、例えば、拡張床吸着法（例えば、高密度充・剤粒子を含むマトリックスを使用）であってもよい。マトリックスをカラム内の充・層として用いる場合、カラムは１ｍｍ〜１ｍ（例えば、１ｃｍ〜３０ｃｍ、又は１ｃｍ〜１０ｃｍ）の層高さを有しうる。充・層は本発明のマトリックスのみを含むものでありうるが、他のマトリックスとの混合層も想定される。

ある実施形態では、上記方法は、
ｄ）上記マトリックスを再生液に接触させることによって上記マトリックスを再生する工程と、
ｅ）工程ａ）〜ｃ）を１回以上（例えば、５回以上、１０回以上又は５０回以上）繰り返す工程と、
をさらに含む。再生液は有機溶媒を含まないか、又は可燃性溶媒を含むがその含有量が１５重量％未満（例えば、５重量％未満、又は１重量％未満）であれば好適である。これは、処理において高価な防爆型装置及び場所を使う必要がないという点で有利である。これはまた、より環境に優しい処理を実現する。

ある実施形態では、再生液は、例えば０．１〜２Ｍの濃度（例えば０．５〜２Ｍ）のアルカリ（ＮａＯＨ等）を含む。アルカリ、特にＮａＯＨは、タンパク質を加水分解する点、及び洗浄及び中性化後に有毒となりうる残留物を一切残さない点で、有用な清浄化剤である。

ある実施形態では、工程ｄ）後のマトリックス中の残留タンパク質含有量は、マトリックス１ｍｌ当たり１００μｇ未満である。残留タンパク質の量は、０．５％ＳＤＳ＋２８ｍＭ ＤＴＴ抽出液中での沸騰による全抽出と、チップ電気泳動による抽出タンパク質の検出によって決定できる。これについては実施例に記載の通りである。

ある実施形態では、生物粒子は、ウイルス、ウイルス様粒子、細胞、細胞小器官（オルガネラ）、及びプラスミドからなる群から選択される。

ある実施形態では、４０ｍｇ以上／ｍｌ（例えば、６０ｍｇ以上／ｍｌ）の上記夾雑タンパク質がマトリックスと結合する。マトリックスに多量の液体を添加できれば好都合であり、この新しいマトリックスではそれが可能である。周知のように、添加はマトリックスの結合容量を超えないものとする。結合容量を超えると破過現象が発生し、その結果、除去性能が低くなることが予想される。

ある実施形態では、液体は緩衝物質を含む。この緩衝物質は、例えば、緩衝カチオン（例えば、トリス、ビス−トリス、トリシン、又はピペラジン）、及び／又は１価の緩衝アニオン（例えば、酢酸イオン、乳酸イオン等）を含みうる。液体が、例えばリン酸イオン等の多価アニオンを含まなければ好都合でありうる。多価アニオンは一部の条件下においてリガンドと強く相互作用しすぎるおそれがあるためである。

ある実施形態では、液体のｐＨは６．０〜８．５（例えば、６．５〜８．５、又は６．５〜８．０）である。生存生物粒子の精製を行う場合、それらはｐＨの影響をきわめて受けやすいため、ｐＨの使用可能範囲は限られる。

ある実施形態では、夾雑タンパク質はアルブミン（例えば、オボアルブミン又は血清アルブミン）である。アルブミンは、卵由来の供給材料にも細胞培養物にも含まれる、一般的な夾雑タンパク質である。

ある実施形態では、生物粒子はインフルエンザウイルスを含む。液体は、例えば受精卵に由来する尿膜腔液を含んでもいいし、或いは細胞培養上清又は細胞溶解物を含んでもよい。

ある実施形態では、上記方法は、工程ｂ）の前に、クロスフロー濾過（例えば、限外濾過及び／又は精密濾過）によって上記液体をコンディショニングする工程ａ’）をさらに含みうる。精密濾過（例えば中空ファイバを用いたもの）は、クロマトグラフィーカラムの目詰まりを起こしうる粒子状物質の除去に用いうる。所望の場合、生物粒子の濃度を高めるために、液体をマトリックスに添加する前に液体にさらに限外濾過を実施してもよい。

ある実施形態では、上記方法は、工程ｃ）の後に、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換クロマトグラフィー）を行う工程ｃ’）をさらに含みうる。何らかの正電荷汚染物質が残っている場合は後続のカチオン交換工程によって除去すればよい。後続の工程は、機能性のコア体と不活性のシェル体とを備えたマトリックスに対してさらにフロースルー精製を行う工程をも含みうる。

第３の態様において、本発明は、生物粒子の精製用上記分離マトリックスの用途を開示する。生物粒子は、例えば、ウイルス、ウイルス様粒子、細胞、オルガネラ、及びプラスミドからなる群から選択される。この用途は例えば上で開示した方法に含まれうる。

第４の態様において、本発明は、上記の分離マトリックスの製造方法を開示する。その方法は、
ａ）複数の多孔質多糖粒子（例えば架橋アガロースゲル粒子）を提供する工程と、
ｂ）共有結合によって上記粒子に付加した、少なくとも５０、少なくとも１００、又は少なくとも２００マイクロモル／ｍｌのアリル基を得るために、上記粒子をアリル化剤と反応させる工程と、
ｃ）上記粒子を最長３０分の期間にわたってハロゲンと反応させ、その後、アルカリ性水溶液と反応させる工程と、
ｄ）複数の第１級アミンを含むリガンド前駆体を残ったアリル基と結合させる工程と、
を含む。

アリル化剤は、例えば、アリルグリシジルエーテル、又はハロゲン化アリル（例えば臭化アリル）でありうる。ハロゲンは好適には臭素であり、水溶液中に添加できる。工程ｂ）において、アリル基は粒子全体にわたって均一に導入される一方、工程ｂ）では臭素との接触時間が短いため、各粒子の最外部にあるアリル基と臭素との反応しか起こらない。臭素との反応によってブロモヒドリンが形成される。これは水性アルカリ中で親水性かつ非反応性のジオールに変化し、不活性のシェル体が形成されることになる。アルカリ水溶液が多価アルコールを含む場合、その多価アルコールがブロモヒドリンと反応し、親水性かつ非反応性部分として非流動化しうる。このような方法は、シェル体の細孔構造の微調整にも使用できる。内部のアリル基は未反応のまま残り、後にコア体となる部分に含まれるリガンドの結合に使用できる。シェル体の厚さは、第一に、工程ｃ）で用いられるハロゲンとの接触時間及びハロゲンの量によって制御することができる。

ある実施形態では、支持体粒子は実質的に球形で、体積平均直径は１５〜４００μｍ（例えば３０〜１００μｍ）である。支持体粒子は、例えば、デキストラン、アガロース、寒天、カラギーナン、アルギナート、セルロース、コンニャクその他の好適な多糖類から形成されうる。アガロース、アガロース誘導体（例えば、ヒドロキシエチルアガロース）、寒天、及びセルロースは特に好適でありうる。好適な多孔率及び剛性を有するものが都合よく作製できるからである。支持体粒子は架橋されたものでありえ、その方法は、エピクロロヒドリンやジエポキシド等の架橋剤による直接的な架橋でもいいし、米国特許第６６０２９９０号に記載されるような２段階架橋でもよい。後者の方法は高い剛性を実現する。

ある実施形態では、リガンド前駆体は１分子当たり３以上の第１級アミンを有する。リガンド前駆体は、最初にアリル基を水性ハロゲン（ａｑｕｅｏｕｓ ｈａｌｏｇｅｎ）（例えば臭素）と反応させた後にアルカリ性条件下でリガンド前駆体と反応させることによってアリル基に結合する。

ある実施形態では、リガンド前駆体は、トリス（２−アミノエチル）アミン及びポリアリルアミン（例えば、分子量が５ｋＤａ以上、例えば１０ｋＤａ以上のポリアリルアミン）からなる群から選択される。

実施例１：プロトタイプの合成
支持体粒子
使用した支持体粒子は高度に架橋したアガロースビーズであった。これは米国特許第６６０２９９０号に記載される方法によって調製した。なお、同明細書はその全体が参照によって本願明細書に援用されている。ビーズの体積加重平均直径（Ｄ５０，ｖ）は８８μｍであり、孔径分布は、分子量１１０ｋＤａのデキストラン分子が細孔容積の６９％を使用できるというものであった。これは、次の文献に記載される方法に従って測定したときに、ビーズにおけるデキストラン１１０ｋＤａのＫｄが０．６９であったと表現することもできる：『Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｃａｌｅ−Ｕｐ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ』（１９９７）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．Ｇａｉｌ Ｓｏｆｅｒ＆Ｌａｒｓ Ｈａｇｅｌ編。ＩＳＢＮ０−１２−６５４２６６−Ｘ、３６８ページ。

アリル化
中間体５８０３
４００ｍＬ（ｇ）の支持体粒子をゲル体積の６倍量の蒸留水で洗浄した後、ゲル体積の３倍量の５０％ＮａＯＨで洗浄した。次に、ゲルを完全に吸い取り２Ｌの丸底フラスコに移した。５０％ＮａＯＨを７７５ｍＬ添加して機械式翼攪拌を行い、フラスコを５０℃の水浴中に浸漬した。３０分後、アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）を１２８ｍＬ添加した。反応は１７時間にわたって進行した。ゲルをゲル体積と同量の蒸留水、ゲル体積の５倍量のエタノール、さらにゲル体積の８倍量の蒸留水で順に洗浄した。

中間体５８４０
１２０ｍＬ（ｇ）の支持体粒子をゲル体積の６倍量の蒸留水で洗浄した後、真空によって乾燥させ、２５０ｍＬの丸底フラスコに移した（９０．７ｇ）。５０％ＮａＯＨを１４９．３ｍＬ添加（１１．８Ｍ）して機械式翼攪拌を行い、フラスコを５０℃の水浴中に浸漬した。３０分後、ＡＧＥを３６ｍＬ添加した。反応は１７時間にわたって進行した。ゲルをゲル体積と同量の蒸留水、ゲル体積の３倍量のエタノール、さらにゲル体積の８倍量の蒸留水で順に洗浄した。

中間体６３８３
蒸留水に入れた２００ｍＬ（ｇ）のアリル化した支持体粒子５８０３を、ガラスフィルタ上でゲル体積の３倍量の５０％ＮａＯＨ水溶液によって洗浄した。次に、ゲルを完全に吸い取り１Ｌの丸底フラスコに移した。５０％ＮａＯＨ水溶液を３８８ｍＬ添加して機械式翼攪拌を行い、フラスコを５０℃の水浴中に浸漬した。３０分後、アリルグリシジルエーテルを６４ｍＬ添加すると、反応は１６時間にわたって進行した。ゲルをゲル体積と同量の蒸留水、ゲル体積の５倍量のエタノール、さらにゲル体積の８倍量の蒸留水で順に洗浄した。

中間体３２６６Ａ
２５６ｍＬ（ｇ）の支持体粒子をガラスフィルタ上で蒸留水によって、そして５０％ＮａＯＨ水溶液によって洗浄した。次に、ゲルを完全に吸い取り１Ｌの丸底フラスコに移した。５０％ＮａＯＨ水溶液を２００ｍＬ添加して機械式翼攪拌を行い、フラスコを５０℃の水浴中に浸漬した。３０分後、ＡＧＥを２００ｍＬ添加すると、反応は１７時間にわたって進行した。ゲルを蒸留水、エタノール、さらに蒸留水で洗浄した。

部分臭素化とシェルの不活性化
中間体６４７８
１９２ｇ（ｍＬ）のアリル化した支持体粒子６３８３を１７２８ｍＬの蒸留水とともに３Ｌの丸底フラスコにすべて移し、機械的攪拌を行った。１０００μＬの臭素を２００ｍＬの水に加えた溶液を調製した。この臭素溶液（８８μｍのビーズの５μｍのシェルに含まれるアリル基の量に相当）を３００ｒｐｍの攪拌速度で約２分間かけてゆっくり添加した。２０分後、ゲルをゲル体積の１０倍量の蒸留水で洗浄した。

１９６ｇ（ｍＬ）の部分的に活性化したゲルを１Ｌの丸底フラスコにすべて移した。蒸留水１７５．３ｇと５０％ＮａＯＨ（１Ｍ）２０．７ｍＬとを添加して機械的攪拌を行った。フラスコを５０℃の水浴中に沈めると、反応は１８．５時間にわたって進行した。次に、ゲルをゲル体積１０倍量の蒸留水で洗浄した。２×１ｍＬの滴定を行って残留アリルの含有量を調べた。

中間体５８６０
１１５ｇ（ｍＬ）のアリル化した支持体粒子５８４０を１０３５ｍＬの蒸留水とともに２Ｌの丸底フラスコにすべて移し、機械的攪拌を行った。４０８μＬの臭素を１００ｍＬの水に加えた溶液を調製した。この臭素溶液（８８μｍビーズの５．５μｍのシェルに含まれるアリルの量に相当）を２５０ｒｐｍの攪拌速度で約２分間かけてゆっくり添加した。Ｅフラスコから注ぐ際に一部の臭素が操作中に失われた。次に、プラスチックピペットを用いて添加を行った。２０分後、ゲルをゲル体積の１０倍量の蒸留水で洗浄した。

１１６ｇ（ｍＬ）の部分的に活性化したゲルを５００ｍＬの丸底フラスコにすべて移した。蒸留水１０４ｇと５０％ＮａＯＨ（１Ｍ）１２．２５ｍＬとを添加して機械的攪拌を行った。フラスコを５０℃の水浴中に沈めると、反応は１６．５時間にわたって進行した。次に、ゲルをゲル体積の１０倍量の蒸留水で洗浄した。２×１ｍＬの滴定を行って残留アリルの含有量を調べた。

中間体３２６６Ｂ
２６０ｇ（ｍＬ）のアリル化した支持体粒子３２６６Ａを２３００ｍＬの蒸留水とともに３Ｌの丸底フラスコにすべて移し、機械的攪拌を行った。３．５５ｇの臭素を２５０ｍＬの水に加えた溶液を調製した。この臭素溶液を攪拌しながらゆっくり添加した。５分後、ゲルを蒸留水で洗浄した。

部分的に活性化したゲルを１Ｌの丸底フラスコにすべて移した。２Ｍ ＮａＯＨ水溶液を２５０ｍＬ添加して機械的攪拌を行った。フラスコを５０℃の水浴中に沈めると、反応は１７時間にわたって進行した。次に、ゲルを蒸留水で洗浄した。２×１ｍＬの滴定を行って残留アリルの含有量を調べた。

コアの臭素化
８０ｇ（ｍＬ）のアリル化したコア用支持体粒子６４７８を、８０ｍＬの水及び３．２ｇの酢酸ナトリウムとともに５００ｍＬのＥフラスコにすべて移した。次に、黄色い色が消えなくなるまで臭素の水溶液を添加した。ギ酸ナトリウム（約２ｇ）を添加して過剰な臭素をなくした。ゲルはゲル体積の１０倍量の蒸留水で洗浄した。
アリル及び残留アリルの滴定（不活性化したシェルの厚さを決定するため）
・ゲルを水で洗浄する。
・１．０ｍＬのゲルを立方体で測定し、それを９ｍＬの蒸留水とともに吸引フラスコに移す。
・臭素を水に溶かした飽和溶液を、過剰なＢｒ₂による黄色い色が消えなくなるまで添加する。
・サンプルを磁気攪拌しながら５分間、放置する。
・サンプルを磁気攪拌しながら真空（水吸引）下に置き、過剰な臭素を除去する。
・次に、フラスコを１０ｍＬの蒸留水ですすぎ、サンプルを滴定ビーカーに移す。
・アリル含有量を間接的に測定するため、濃硝酸を２、３滴、加えてから、０．１Ｍ ＡｇＮＯ₃による滴定を開始する。
・結果はゲル１ｍｌ当たりのマイクロモル数で与えられる。
・理論上のシェル厚は、部分臭素化及び不活性化後の残留アリル含有物がシェルに囲まれたコア内にすべて存在し、かつシェルはアリル基を含まないと仮定したモデルを用いて計算される。ビーズの直径が８８μｍで、シェルの厚さがｘμｍのとき、臭素化・不活性化の前後におけるアリル含有量の比は４４³／（４４−ｘ）³であり、この式からｘが得られる。

リガンドの結合
１，３−ジアミノ−２−プロパノールの結合
２４．８ｇの１，３−ジアミノ−２−プロパノール（２７０ｍｍｏｌ、３４当量）を１００ｍＬの丸底フラスコに移した。フラスコを６０℃の水浴中に沈め、７５分間リガンドを溶解させた。

３０ｍＬ（ｇ）の活性アリル化コア用支持体粒子６４７８（７．９２ｍｍｏｌアリル、１当量）をフラスコにすべて移し、機械式翼攪拌（２３０ｒｐｍ）を行った。反応は１７時間にわたって進行した。フラスコを冷却した後にｐＨを測定したら約１２であった。ゲルをゲル体積の１２倍量の蒸留水で洗浄した。

トリス（２−アミノエチル）アミンの結合
４０ｍＬ（ｇ）の活性アリル化コア用ベースマトリックス６４７８（１０．５６ｍｍｏｌアリル、１当量）を２５０ｍＬの丸底フラスコにすべて移した。３９．６ｍＬのトリス（２−アミノエチル）アミン（２６４．３ｍｍｏｌ、２５当量）を添加し、機械式翼攪拌（２００ｒｐｍ）を行った。反応は１７時間にわたって進行した。ｐＨを測定すると８．８であった。ゲルをゲル体積の１０倍量の蒸留水で洗浄した。

ポリアリルアミンの結合
３７ｍＬ（ｇ）の活性アリル化コア用ベースマトリックス３２６６Ｂを２５０ｍＬの丸底フラスコにすべて移した。分子量１５ｋＤａのポリアリルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ、２８３２１５）１１．３ｇを２０ｍｌの蒸留水＋２ｍｌの５０％ＮａＯＨ水溶液に溶かし、上記のフラスコに添加した。機械式翼攪拌（２００ｒｐｍ）を行い、５０℃で１７時間にわたって反応させた。ゲルを０．５Ｍ ＨＣｌ、１ｍＭ ＨＣｌ、及びゲル体積の１０倍量の蒸留水で順に洗浄した。

アミン含有量の滴定
・ゲルを水で洗浄する。
・ゲルを０．５Ｍ ＨＣｌで３回洗浄した後、１ｍＭ ＨＣｌで３回洗浄する。
・１．０ｍＬのゲルを立方体で測定し、１９ｍＬの蒸留水とともに滴定カップに移す。
・アミン含有量を間接的に測定するため、濃硝酸を２、３滴、加えてから、０．１Ｍ ＡｇＮＯ₃による滴定を開始する。
・結果はゲル１ｍｌ当たりのマイクロモル数で与えられる。

実施例２：プロトタイプでのタンパク質に対する結合容量
空の９６ウェルフィルタプレートの各ウェルに６μＬのゲルを充・した。プレート実験では表３に記載の方法を用いた。定温放置後の洗浄回数は、非結合タンパク質を洗い落とすのに必要な内容に応じて２回と３回の間で変動した。

分析
２８０ｎｍにおける吸光度と校正曲線から計算した濃度とによって非結合タンパク質を分析する。

結合されたタンパク質の量は、添加したタンパク質と非結合タンパク質との量の差から計算する。

濃度から各ウェルの容量を計算する。

最大結合容量はｇ／Ｌで表す。これは、ＵＶ測定を伴わないキュベットでの各実験に対してタンパク質溶液を調製する際の計算に基づく。

他のＵＶ吸収材料による干渉を排除するため、タンパク質を添加しない無添加実験を各シリーズについて実施した。

ＰＡＡでのＢＳＡ及びオボアルブミンに対する結合容量の結果
プロトタイプ：ポリアリルアミン
イオン容量：２１０μｍｏｌ／ｍｌ
タンパク質１：ＢＳＡ２ｇ／ｌ、ＩＰ約４．７
タンパク質２：オボアルブミン２ｇ／ｌ、ＩＰ約４．７
緩衝系１：４０ｍＭトリス ｐＨ７．２〜８．２
緩衝系２：２０ｍＭピペラジン ｐＨ６
塩：ＮａＣｌ

表４に示すように、ポリアリルアミンプロトタイプは２５０ｍＭ ＮａＣｌのときにＢＳＡに対する結合容量が最大となった。１２５０ｍＭ ＮａＣｌではポリアリルアミンプロトタイプはＢＳＡに対して結合容量を示さない。このことは、ＢＳＡの塩溶出が良好に可能であることを示している。

緩衝系としてピペラジンを用いる場合、表５の列Ａと列Ｅに示すように、ポリアリルアミンは無塩のときにＢＳＡとオボアルブミンの両方に対して最大の結合容量を示す。ただし、結合容量は２５０ｍＭ ＮａＣｌを添加した場合もまだ良好である。

プロトタイプ：ポリアリルアミン
イオン容量：２１０μｍｏｌ／ｍｌ
タンパク質：オボアルブミン２ｇ／ｌ、ＩＰ約４．７
緩衝系：２０〜４０ｍＭリン酸塩 ｐＨ７〜７．５
塩：ＮａＣｌ

プロトタイプ：ポリアリルアミン
イオン容量：２１０μｍｏｌ／ｍｌ
タンパク質１：オボアルブミン４ｇ／ｌ、ＩＰ約４．７
タンパク質２：ＢＳＡ４ｇ／Ｌ、ＩＰ約４．７
緩衝系：４０ｍＭトリス ｐＨ７．２〜８．２
塩：ＮａＣｌ

表６では、ポリアリルアミンは塩の添加がないときにオボアルブミンに対する結合容量が最大となっている。リン酸塩系ではｐＨによる影響は見られない。

表６と表７を比較すると、ポリアリルアミンはリン酸塩緩衝系よりもトリス緩衝系を用いたときのほうがオボアルブミンに対する結合容量が高いことが明らかである。

表７のトリス系では、ポリアリルアミンに対する結合容量はｐＨの低下とともに向上している。オボアルブミンに対する結合容量に対するｐＨの影響はＢＳＡの場合よりも大きい。

プロトタイプ：ポリアリルアミン
イオン容量：２１０μｍｏｌ／ｍｌ
タンパク質：オボアルブミン２ｇ／ｌ、ＩＰ約４．７
緩衝系：４０ｍＭトリス ｐＨ７．２〜７．５
塩：ＮａＣｌ

この場合も、ポリアリルアミンとトリスがオボアルブミンに対して高い結合容量を示すことがわかる（表参照）。結合容量は塩の添加によって低下するが、それでもまだ高い。

ポリアリルアミンプロトタイプ及びＣａｐｔｏ（商標）Ｃｏｒｅ７００でのオボアルブミンに対する結合容量の比較
プロトタイプ：ポリアリルアミン
イオン容量：２１０μｍｏｌ／ｍｌ
参照媒体：Ｃａｐｔｏ（商標）Ｃｏｒｅ７００
イオン容量：４０〜８５μｍｏｌ／ｍｌ
タンパク質：オボアルブミン３ｇ／ｌ、ＩＰ約４．７
緩衝系：４０ｍＭトリス ｐＨ７．２〜７．５
塩：ＮａＣｌ

Ｃａｐｔｏ（商標）Ｃｏｒｅ７００（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）は市販の製品である。これは、体積加重平均直径が８５〜９０μｍの、高度に架橋したアガロースビーズと、分子量カットオフ値が７００ｋＤａの不活性シェルと、アミン窒素を介して結合したオクチルアミンリガンドによって誘導体化されたコアとをベースとする。シェル構造は現在調製されているプロトタイプときわめて類似しており、例えばウイルス粒子との間で相互作用が実質的にないことが知られている。

トリス緩衝系の場合、オボアルブミンに対する結合容量はポリアリルアミンのほうが優れている。

ポリアリルアミンのまとめ
ポリアリルアミンを用いる場合、リガンドに対する等電点（ＩＰ）は好適に検討され、緩衝液のｐＨはリガンドのＩＰに近くない。そのためそれは帯電しない。ポリアリルアミンのＩＰは８．７程度である。

ポリアリルアミンはオボアルブミン及びＢＳＡに対してきわめて良好に作用する。オボアルブミンはこれまで最も多く試験されており、トリス緩衝系を使うとリン酸塩緩衝液より結合容量が上がることが明確である。ＢＳＡに対する結合容量は１．２５Ｍ ＮａＣｌにおいてゼロである（表４参照）。これは塩を溶出できることを示している。ＢＳＡとオボアルブミンの特性は類似しているため、オボアルブミンも塩によってポリアリルアミンから溶出できそうである。
１，３−ジアミノ−２−プロパノールプロトタイプ及びトリス（２−アミノエチル）アミンプロトタイプでの結果
プロトタイプ：１，３−ジアミノ−２−プロパノール
リガンド密度：８４μｍｏｌ／ｍｌ
プロトタイプ：トリス（２−アミノエチル）アミン
リガンド密度：５５μｍｏｌ／ｍｌ
タンパク質溶液：オボアルブミン２ｇ／Ｌ、ＩＰ約４．７
緩衝系１：５０ｍＭトリス ｐＨ７．４
緩衝系２：５０ｍＭリン酸塩 ｐＨ７．２
塩：ＮａＣｌ
１ウェル当たりのマトリックス量：６μＬ

列Ａからわかるように、１，３−ジアミノ−２−プロパノールプロトタイプ及びトリス（２−アミノエチル）アミンプロトタイプは高い塩濃度において結合する。オボアルブミンに対する結合容量はトリス（２−アミノエチル）アミンのほうが高く、オボアルブミンの結合に対してはいずれのプロトタイプもトリスのほうが効果的である。

実施例３：汚損プロトタイプの清浄化
この研究はウェルのサイズが８００μＬの９６ウェルフィルタプレートを用いて行った。プレートのすべてのウェルに２０μＬのマトリックスを充・し、大腸菌のホモジネートで汚染した。複数種類の再生液を用いて清浄化を行い、ビーズにまだ残留する汚染物質を、２４ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とともに沸騰させて溶解した後、Ｃａｌｉｐｅｒ ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬａｂＣｈｉｐシステムにおいてチップ電気泳動で解析した。

大腸菌溶解物
媒体の汚染には大腸菌ホモジネートを用いた。凍結した大腸菌ホモジネートを解凍し、ガラス繊維フィルタ、続いて０．４５μｍのメンブレンフィルタによって分級した。

プレート実験
空のフィルタプレートの各ウェルに２０μＬのゲルを充・した。プレート実験では表に記載した方法を用いた。１枚のプレートを各溶液で３回処理した。ＣＩＰにおける定温放置時間は１５分であった。

ビーズの遠心処理が終わったら、フィルタプレートの上に回収プレートを接続してゴムバンドで固定し、媒体片を回収プレートに移した。積み重ねたプレートを上下逆にしてフィルタプレートが上になるようにし、５分間遠心処理した（９７２ｘｇ）。次に、回収プレートのすべてのウェルに２００μＬのＣａｌｉｐｅｒサンプル緩衝液を添加した。ウェルをマイクロホイルシールで覆い、マイクロプレートシェーカに２分間かけた。プレートを加熱室（１０４℃）に５分間入れた。加熱後、サンプルをさらに２分間シェイクして２分間の遠心処理（５００ｘｇ）を行い、ゲル粒子を沈殿させた。４０μＬの上清をＰＣＲプレート（円錐底面）に慎重に移した。ゲル片をフィルタプレートから回収プレートに移す間にサンプルの順序が反転しているので、ここでピペットを使って列Ｈのサンプルを列Ａに移動する等、順序を元に戻した。夾雑しているかもしれないゲル粒子を沈降させるため、ＰＣＲプレートを１分間遠心処理（５００ｘｇ）した。これでプレートをＣａｌｉｐｅｒチップ電気泳動装置（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、米国）に入れる準備が整った。

Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ電気泳動
ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬａｂＣｈｉｐ（商標）Ｋｉｔのユーザガイド（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、２０１０年１１月）に従い、チップ、バッファストリップ、及び分子量マーカーを用意した。ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２００ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙのプログラムを実行した。

結果を図４〜図６に示す。Ｃａｐｔｏ（商標）Ｃｏｒｅ７００上では、イソプロパノールを含有する溶液のみがすべての汚染物質を除去するのに実際に有効であった。一方、ポリアリルアミンプロトタイプ上では、８Ｍ尿素を除くすべての溶液は効率的な不純物除去を示した。また、ジアミノプロパノールとトリスアミノエチルアミンプロトタイプも、８Ｍ尿素及び８Ｍ尿素＋クエン酸を除くすべての溶液によって効率的に清浄化できた。

本明細書は、最良の形態を含む例を用いて本発明を開示している。また、装置もしくはシステムの作製と使用、並びに内包される方法の実施を含め、当業者が本発明を実施できるように書かれている。本発明の特許可能範囲は特許請求の範囲によって規定されるとともに、当業者が想到する他の例を含みうる。そのような他の例は、特許請求の範囲の文言とは異ならない構造要素を有する場合、或いは特許請求の範囲の文言と大差のない等価な構造要素を有する場合に、特許請求の範囲の範囲内にあるものと考えられる。

Claims (12)

1. 多孔質コア体（１０１）とコア体（１０１）を覆う多孔質シェル体（１０２）とを有する複数の粒子（１００）を含んでおり、
   ａ）コア体（１０１）が、共有結合で結合したリガンド上に５０マイクロモル／ｍｌ以上の第１級アミンを含んでいて、リガンド１個当たり２個以上の第１級アミンを呈し、
   ｂ）シェル体（１０２）が２０マイクロモル／ｍｌ未満の第１級アミンしか含まない、
   生物粒子の精製用の分離マトリックスであって、
   該マトリックスは、１０ｍＳ／ｃｍ以上の導電率を有する水性緩衝液中でマトリックス１ｍｌ当たり２０ｍｇ以上のオボアルブミンを結合することができる、分離マトリックス。
2. 多孔質コア体（１０１）とコア体（１０１）を覆う多孔質シェル体（１０２）とを有する複数の粒子（１００）を含んでおり、
   ａ）コア体（１０１）が、共有結合で結合したリガンド上に５０マイクロモル／ｍｌ以上の第１級アミンを含んでいて、リガンド１個当たり２個以上の第１級アミンを呈し、
   ｂ）シェル体（１０２）が２０マイクロモル／ｍｌ未満の第１級アミンしか含まない、
   生物粒子の精製用の分離マトリックスであって、
   ａ）リガンドが第２級又は第３級アミン結合を介してコア体（１０１）に結合する、
   ｂ）リガンドの窒素及び酸素原子含有量が２０重量％以上である、
   ｃ）第１級アミン窒素の含有量が１８重量％以上である、
   ｄ）第１級アミンと、窒素原子の合計量との比が、０．５以上である、
   ｅ）リガンドがトリス（２−アミノエチル）アミン及びポリアリルアミンからなる群から選択され、アミンを介して結合している、および／または
   ｆ）リガンドが、分子量１ｋＤａ以上のポリアリルアミンを含む、選択的にはポリアリルアミンが非架橋型である、分離マトリックス。
3. 多孔質コア体（１０１）とコア体（１０１）を覆う多孔質シェル体（１０２）とを有する複数の粒子（１００）を含んでおり、
   ａ）コア体（１０１）が、共有結合で結合したリガンド上に５０マイクロモル／ｍｌ以上の第１級アミンを含んでいて、リガンド１個当たり２個以上の第１級アミンを呈し、
   ｂ）シェル体（１０２）が２０マイクロモル／ｍｌ未満の第１級アミンしか含まない、
   生物粒子の精製用の分離マトリックスであって、
   ｃ）シェル体（１０２）が１〜１０μｍの平均厚さを有する、
   ｄ）シェル体（１０２）が、粒子（１００）の直径又は球相当径の０．５〜６％の平均厚さを有する、
   ｅ）シェル体（１０２）が、球状タンパク質に対して６０〜１０００ｋＤａの分子量カットオフを有する、および／または、
   ｆ）粒子（１００）が実質的に球形である
   分離マトリックス。
4. １０ｍＳ／ｃｍ以上の導電率を有する水性緩衝液中でマトリックス１ｍｌ当たり２０ｍｇ以上のオボアルブミンを結合することができる、請求項２又は３記載の分離マトリックス。
5. ａ）リガンドが第２級又は第３級アミン結合を介してコア体（１０１）に結合する、
   ｂ）リガンドの窒素及び酸素原子含有量が２０重量％以上である、
   ｃ）第１級アミン窒素の含有量が１８重量％以上である、
   ｄ）第１級アミンと、窒素原子の合計量との比が、０．５以上である、
   ｅ）リガンドがトリス（２−アミノエチル）アミン及びポリアリルアミンからなる群から選択され、アミンを介して結合している、および／または
   ｆ）リガンドが分子量１ｋＤａ以上のポリアリルアミンを含む、選択的にはポリアリルアミンが非架橋型である、
   請求項３に記載の分離マトリックス。
6. ａ）リガンドが第２級又は第３級アミン結合を介してコア体（１０１）に結合する、
   ｂ）リガンドの窒素及び酸素原子含有量が２０重量％以上である、
   ｃ）第１級アミン窒素の含有量が１８重量％以上である、
   ｄ）第１級アミンと、窒素原子の合計量との比が、０．５以上である、
   ｅ）リガンドが、トリス（２−アミノエチル）アミン及びポリアリルアミンからなる群から選択され、アミンを介して結合している、および／または
   ｆ）リガンドが、分子量１ｋＤａ以上のポリアリルアミンを含む、選択的にはポリアリルアミンが非架橋型である、且つ
   ｇ）シェル体（１０２）が１〜１０μｍの平均厚さを有する、
   ｈ）シェル体（１０２）が、粒子（１００）の直径又は球相当径の０．５〜６％の平均厚さを有する、
   ｉ）シェル体（１０２）が、球状タンパク質に対して６０〜１０００ｋＤａの分子量カットオフを有する、および／または
   ｊ）粒子（１００）が実質的に球形である
   請求項１記載の分離マトリックス。
7. 生物粒子の精製方法であって、
   ａ）請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の分離マトリックスを用意する工程と、
   ｂ）前記マトリックスを、生物粒子及び１種以上の夾雑タンパク質を含む液体に、夾雑タンパク質がマトリックスに結合するように接触させる工程と、
   ｃ）液体をマトリックスから分離し、精製生物粒子とともに液体を回収する工程と、
   を含む、生物粒子の精製方法。
8. 液体が１０ｍＳ／ｃｍ以上の導電率を有する、請求項７記載の方法。
9. ｄ）有機溶媒を１５％未満の割合で含む再生液にマトリックスを接触させることによってマトリックスを再生する工程と、
   ｅ）工程ａ）〜ｃ）を１回以上繰り返す工程と
   をさらに含む、請求項７又は請求項８記載の方法。
10. ａ）再生液はアルカリを含む、
    ｂ）工程ｄ）の後のマトリックス中の残留タンパク質含有量が１００μｇ／ｍｌ未満である、
    ｃ）生物粒子がウイルス、ウイルス様粒子、細胞、オルガネラ、及びプラスミドからなる群から選択される、
    ｄ）少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ以上の上記夾雑タンパク質がマトリックスと結合する、
    ｅ）液体は、緩衝物質を含み、選択的には、緩衝カチオン及び／又は１価の緩衝アニオンを含み、および／または
    ｆ）液体のｐＨは６．０〜８．５である
    請求項９記載の方法。
11. 夾雑タンパク質はアルブミンであり、生物粒子はインフルエンザウイルスを含み、液体は受精卵に由来する尿膜腔液を含む請求項７乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 請求項１乃至６のいずれか１項に係る分離マトリックスの製造方法であって、
    ａ）複数の多孔質多糖粒子を提供する工程と、
    ｂ）共有結合によって上記粒子に結合した、少なくとも５０マイクロモル／ｍｌのアリル基を得るために、上記粒子をアリル化剤と反応させる工程と、
    ｃ）上記粒子を最長３０分の期間にわたってハロゲンと反応させ、その後、アルカリ性水溶液と反応させる工程と、
    ｄ）複数の第１級アミンを含むリガンド前駆体を残ったアリル基と結合させる工程と
    を含む、方法。