CN104741090B - 一种扩张床吸附(eba)介质和其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于扩张床(EBA)的离子交换介质，该介质母体基质主要由琼脂糖包裹碳化钨并交联琼脂糖，形成圆形通透具有空隙结构的复合物珠粒；介质基质活化并偶联配基后形成交换膜的复合介质。该介质基质活化先通过烯丙基化、氧化和溴化分步反应，再偶联3，3‑二胺基二丙基胺(DADPA)或2‑氯三乙胺(DEAE)配基，形成复合离子交换介质。本发明的离子交换介质是一种合适粒径合适密度合适吸附特性蛋白质和合适吸附容量的离子交换介质，该介质可用于柱层析纯化蛋白质和核酸，尤其是可应用于EBA技术纯化血液制品中的特殊蛋白质和核酸类物质。

Description

一种扩张床吸附(EBA)介质和其制备方法

技术领域

本发明涉及一种离子交换介质，具体涉及一种用于扩张床吸附的介质。

本发明还涉及该离子交换介质的制备方法。

背景技术

扩张床吸附(expanded bed adsorption,EBA)技术是利用介质对样品的不同的成分有不同强度的吸附作用，在洗脱过程中得以分离的一种技术。扩张床技术核心是利用吸附剂本身的物理性质，这些吸附剂有适当的密度和粒径，还有一定的密度和粒径分布。由于基质中的聚合物多呈疏松的凝胶状，密度小，故增重剂是绝大多数扩张床基质不可缺少的组成部分，也是扩张床基质区别于固定床基质最显著的特征之一。当料液从扩张床底部泵入时，吸附剂能在扩张床中膨胀，相互间的空隙增大，并且形成了梯度分布，大而重的颗粒在扩张床的底部，小而轻的颗粒在扩张床的上部。这种分层现象限制了颗粒的运动。如条件控制适当时，颗粒分离成层，而不相混合。因而颗粒的轴向混合程度很低，也无沟流，单个颗粒仅在小范围内作圆周运动，且液相流动为平推流，从而得到稳定的扩张床，这种稳定分层的床层是扩张床操作的基础。

扩张床吸附基质的特点主要是粒径和密度两个方面：

1、粒径和密度：在扩张床(流化床)中，颗粒的终点沉降速度μ_t与颗粒的直径d_p、密度ρ_p和液相的粘度η、密度ρ_l有关。为满足过程的高处理量要求和与料液中的悬浮颗粒区分开来，必须提高基质的终点沉降速度。这可以从两个方面着手，一是增加颗粒的直径，二是增加颗粒的密度。在蛋白质的层析过程中，颗粒内扩散是整个传质过程的控制步骤，基质粒径的大小会直接影响分离的效率。粒径的增加，将难以解决为维持合适的扩张率而要求增加流速和为满足较慢的吸附动力学而要求降低流速之间的矛盾。同时，当粒径与柱径之比d_p/d_c<0.01时，层析柱的壁效应会导致床层的不稳定。粒径太小，就要求扩张床的下分布器具有更小的网孔，这会使料液中的细胞和细胞碎片更容易堵塞分布器的进口。通常用于扩张床的基质粒径在50～400μm之间。可见，增加基质的密度是制备扩张床吸附基质的最佳办法。目前有两种方法：采用高密度的大孔匀质材料，如多孔玻璃，氟化二氧化锆，聚丙烯酰胺复合陶瓷等；和采用亲水性材料包裹高密度的惰性材料，如琼脂糖－石英砂，琼脂糖－不锈钢，葡聚糖－二氧化硅，纤维素－二氧化钛，聚乙烯醇－全氟聚合物等。使用高密度的基质，可以降低基质的粒径，从而提高传质的效果。一般认为，基质密度为1.3～1.5g/ml时最佳，能够较好地平衡床层扩张、过程有效性和吸附容量之间的关系。

2、粒径和密度的分布：形成稳定分级的床层是扩张床吸附过程操作的基础。基质的密度和粒径应该存在一定的分布，这样，扩张时大的、重的颗粒分布在床层下部，小的、轻的分布在上部，分级限制了基质的上下运动，轴向混合近似于固定床。一般认为，当基质颗粒的最大粒径与最小粒径之比大于2.2时，能形成稳定的分级床层。一般基质的密度分布范围十分窄，而粒径的分布或多或少有一些偶然的因素，存在批间的分布差异。商业化的基质的分布比较确定，可能经过了仔细的筛分和配比，如Streamline基质，粒径和密度的分布近似于高斯函数。但从严格意义上讲，分布应是一个连续函数。

离子交换层析(ion-exchange chromatograpHy，简写IEC)就是利用蛋白质带电性的差异，在离子吸附剂上静电吸附能力不同，对蛋白质分离的柱层析技术。是发展最早的层析技术之一。离子交换中主要技术有几个重要的方面，分别是：

1.交联度：离子交换剂的基质通过交联剂将线性大分子交联形成的网孔状颗粒的程度为交联度。不同的离子交换剂使用不同的交联剂，交联度的大小影响着离子交换剂的很多特性，包括机械强度、膨胀度、网孔大小、交换容量等。一般交联度越高，网孔的孔径越小；交联度越低，网孔孔径越大。仅琼脂糖交换剂是例外，这种介质所形成的网孔结构是由琼脂糖的胶束构成的，其孔径仅与琼脂糖的浓度有关，交联剂的用量对孔径影响不大。

2.电荷密度：是指在基质颗粒上单位表面积的取代基(功能集团)的数量，它决定着离子交换剂的交换容量、膨胀度等性质。对小分子进行离子交换时，离子与功能基团间按1：1的物质量的比结合，但蛋白质类分子离子交换所用的介质电荷密度往往较低。

3.交换容量：交换容量是指离子交换剂能够结合溶液中可交换离子的能力，通常分为总交换容量和有效交换容量。总交换容量又称总离子容量，用每克干介质或每毫升湿胶包含的带电功能基团的数量来表示，其数值的大小取决于离子交换剂的取代程度也就是电荷密度。有效交换容量，指每克干介质或每毫升湿胶在一定的实验条件下吸附某种分子的实际容量。由于有效容量是一个变值，在说明其数值时应当同时指出实验条件，比如pH和离子强度。

4.结合能力：目的物与离子交换剂的结合能力首先取决于溶液pH，它决定了目的物的带电状态，此外还取决于溶液中离子的种类和离子的强度，起始条件下溶液中离子强度较低，上样后，目的物与交换剂之间结合能力更强，能取代离子而吸附到交换剂；洗脱时，往往通过提高溶液的离子强度，增加离子竞争性结合能力，使得样品从交换剂上解吸。离子交换剂由不溶性高分子基质、荷电或功能基团和与功能基团电性相反的离子组成，在水溶液中，与功能基团带相反电荷的离子(包括缓冲液中的离子、蛋白质形成的离子)依靠静电引力能够吸附在表面，各种离子与离子交换剂结合存在竞争关系。

5.等电点：蛋白质的等电点对于离子交换时介质的选择和溶液pH的选择是十分重要的，一般遵循以下规律：

如果样品在它的等电点下更稳定，应选择阳离子交换剂。

如果样品在它的等电点上更稳定，应选择阴离子交换剂。

如果样品在它的等电点上下一个比较宽的范围内比较稳定，两种离子交换剂都可选择。

离子交换色谱的分离性能受到流动相和固定相的影响。对于流动相，通过改变pH和离子强度可以改变蛋白质与介质所带电荷，从而影响二者间静电相互作用，实现蛋白的吸附与解吸，这已成为IEC过程开发的主要调节参数。对于固定相，配基密度和介质孔径是最关键的因素，然而目前相关研究却不够深入。配基密度决定了静电相互作用的强弱，对目标蛋白的静态吸附、动态吸附和吸附动力学都有较大的影响。研究表明，对于特定的目标蛋白，配基密度并不是越大越好。增加配基密度可以提高蛋白吸附的可能性，但也会带来介质内部的空间位阻，增加传质阻力。介质孔径则影响蛋白质的孔内传质，对于生物大分子尤为重要，但孔结构的表征十分困难。一般情况下，同一种交换剂对于分子量小的蛋白质有效交换容量较大，而对于分子量大的蛋白质有效容量较小；对于同一种蛋白质，离子交换剂的交联度越小有效容量越大，而交联度越大有效容量越小。

在大规模分离的粗分离阶段，采用扩张床吸附技术能够取得较好的效果。该技术的优势在于包含细胞碎片等颗粒状物质在内的样品无需要经过澄清可以直接进行分离。STREAMLINE系列是专门为膨胀床吸附技术设计的吸附剂，它们能够直接从粗样品中吸附包含目标分子在内的可交换分子，将澄清、浓缩和收集功能汇集于一体，减少了操作步骤，是对粗样品进行分离的非常经济有效的手段。此方法可以大大提高分离速度，当然也会使分辨率变低，适合在规模化分离的前期使用。目前此方法介质的流体性质和填充性质相对不太重要，高交换容量的Sephadex系列离子交换剂是比较理想的选择,也有公司根据产物的性质在介质厂家定制特殊设计的介质用于多成分的初步分离,目前这种技术由原来在乳制品应用扩大到血液制品和基因工程产品的产业化应用,应用领域多元化大大推动了该技术的发展。

接着应考虑目的物的分子大小和离子交换剂的有效交换容量。在分离分子量较大的目标分子时，需要采用孔径尺寸较大的基质，在各种离子交换剂中，基于纤维素和琼脂糖的交换剂形成的孔径是最大的，一般目的物分子量通常都低于它们的排阻极限。在分离分子量较小的目的物时，网孔较小的介质具有一定的优势，基于交联葡聚糖的交换剂属于此类。

以上考虑主要针对离子交换剂基质的选择，而在确定所选用的基质后，选择何种功能基团是另一个关键所在，这主要取决于目标分子的带电性质和pH稳定性。

多数情况下，人们对样品的了解程度并没有达到上述要求，此时离子交换剂功能基团的选择依赖于对目的物的等电点和pH稳定性的了解。

功能化离子交换剂基质是指偶联了配基的基质。通过反相悬浮法制得的基质由于缺少特异性吸附位点而不适合直接使用，一般需负载上特定的配基，以提高其对目标物的特异性吸附能力，从而提高扩张床操作的选择性和操作效率。扩张床离子交换剂基质的聚合物骨架材料一般为碳水化合物，富含羟基(-OH)，要制备功能化离子交换剂，就必须对羟基进行修饰改造。羟基的化学活性较低，因此首先要将其活化。常用的羟基活化剂多含环氧基和双键的双官能团化合物，如环氧氯丙烷、烯丙基溴和二乙烯基砜等。经过活化的基质能较容易地与配基发生偶联，从而制得性能不同的功能化离子交换剂。

离子交换剂功能化的配基即可以含有疏水性基团(如苯环、烷基等)，同时还可以含有亲水性离子交换基团(如氨基、羧基等)，这样介质在不同条件下能够和目标分子以不同的方式作用。在离子强度较低时，蛋白质通过离子交换机理吸附在配基的亲水基团附近，而当离子强度逐渐增大时，由于蛋白质外层的电荷被盐离子屏蔽，蛋白质表现出显著的疏水性，从而与配基的疏水部位相结合。经过功能化的介质属于pH和离子强度依赖型介质，因此使用时具有较大的灵活性，特别适合从组成复杂的料液中捕获目标物。

介质的离子交换容量E是表征离子交换介质性能的一个重要参数。对于DEAE、CM等类离子交换介质来说，其功能基团所带电荷为1价，所以其离子交换容量实际上就是介质上离子交换基团的数目。对同一类介质来说，交换容量越大，相应地介质的吸附容量也越大，在层析时所能吸附的蛋白质量也越多。

目前EBA技术已经广泛应用于蛋白质的纯化，早期的法玛西亚(Amersham)公司现GE公司生产的STEAMLINE介质就是应用于EBA技术的离子交换介质，但是针对不同的蛋白种类的需要合成何种需求的离子交换介质尤其是用于EBA技术的离子交换介质一直是生物和化学领域的一个具有挑战性的工作。

WO2004/020994采用修饰有机化学技术，对于琼脂糖表面进行修饰，制备一种新的离子交换介质，但该方法合成时间长，活化的基团错配率较高。

WO2004/082397A1和WO2009/071560A1描述了一种琼脂糖包裹碳化钨的技术，并将该介质应用到蛋白的纯化中，但是对于形成的基质表面的有机修饰部分叙述简单。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于扩张床(EBA)的离子交换介质，该介质母体基质主要由琼脂糖包裹碳化钨并交联琼脂糖，形成圆形通透具有空隙结构的复合物珠粒；介质基质活化并偶联配基后形成交换膜的复合介质。该介质基质活化先通过烯丙基化、氧化和溴化分步反应，再偶联3，3-二胺基二丙基胺(DADPA)或2-氯三乙胺(DEAE)配基，形成复合离子交换介质。

本发明的另一个目的在于提供所述离子交换介质的制备方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种用于扩张床的离子交换介质，以下述方法制备：

1)将琼脂糖与碳化钨反应制备琼脂糖-碳化钨复合物珠粒，再将所述琼脂糖-碳化钨复合物珠粒与交联剂环氧氯丙烷反应制备交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒；其中琼脂糖用量为3％～9％重量，在90～95℃条件下，熔融共混琼脂糖和碳化钨，碳化钨和琼脂糖的质量比为1:0.2-～1:2，交联剂环氧氯丙烷添加量为0.1-0.3mL/mL凝胶。

2)通过烯丙基化、氧化和溴化分步反应活化步骤1)制备的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒；

3)在步骤2)活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒上偶联3，3-二胺基二丙基胺或2-氯三乙胺配基，形成所述用于扩张床的离子交换介质。

其中：

步骤1)中，以反相悬浮液热再生方式制备琼脂糖-碳化钨复合物珠粒，其中使用的油相有机溶剂为石蜡、石油醚、氯苯、真空油或其中两种的混合物，琼脂糖水溶液和有机溶剂的体积比为6：1～2：1；

步骤2)中所述烯丙基化过程中，通过添加烯丙基缩水甘油醚开环联接烯丙基，烯丙基缩水甘油醚的添加量为1～4mmol/mL凝胶，以三氟化硼乙醚为催化剂，二氧六环为溶剂反应；交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒内孔联接的烯丙基以油相保护，交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒外表层联接烯丙基以KMO4、H₂O₂水相氧化，油相保护使用的有机溶剂为苯、甲苯、乙苯、丙苯或者其中两种的混合物；

烯丙基化、氧化后的溴化过程中，滴加Br₂的量为0.03-0.1mL/ml凝胶；

步骤3)中活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒偶联3，3-二胺基二丙基胺配基过程中，3，3-二胺基二丙基胺的添加量为10-30mmoL/ml凝胶；或者

步骤3)中活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒偶联2-氯三乙胺配基过程中，将活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒经过2.5-3.5mol/L NaOH溶液处理后偶联2-氯三乙胺，2-氯三乙胺的添加量为6-9mmoL/mL凝胶。

本发明的离子交换介质是一种合适粒径合适密度合适吸附特性蛋白质和合适吸附容量的离子交换介质，该介质可用于柱层析纯化蛋白质和核酸，尤其是可应用于EBA技术纯化血液制品中的特殊蛋白质和核酸类物质。

附图简述

图1为烯丙基化交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒示意图；

图2为部分氧化交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒上烯丙基示意图；

图3为介质的膨胀率(E)与流速的关系图；

图4为介质的Bo准数与流速的关系图；

图5为介质的轴向扩散系数与线性流速的关系图；

图6为第六次的血浆层析图谱；

图7为第六次层析后各组分的SDS-PAGE结果。

具体实施方式

通过以下较佳实施方式的详细描述，进一步说明但不限制本发明。

所有材料如无特别说明均为商业购买。

实施例1交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒的制备

取2g抽干的琼脂糖凝胶、0.5g NaCl制成4％(W/W)琼脂糖-水悬浮液。按照反相悬浮液热再生的传统方法，将50g 4％琼脂糖-水悬浮液转移至烧瓶中，室温下搅拌混合15分钟，添加一系列不同量的碳化钨(xlwc100，潮州翔鹭钨业，中国，平均颗粒大小9-11μm)，添加碳化钨和琼脂糖凝胶的质量比分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1和2，600rpm搅拌混合物15min，加热至93℃保持60min，作为水相备用。然后，将200mL石蜡和石油醚(10:1,V/V)、4％乳化剂(Span80:Tween80＝10:4)混合液超声5～10min，93℃水浴中预热作为油相备用。趁热将预热好的油相加入到水相中，3000rpm转速下搅拌30min，之后140-180rpm低速搅拌，缓慢降至室温(每分钟2℃)，再继续将温度降至10℃以下。过滤收集琼脂糖-碳化钨复合物珠粒，用大量石油醚、无水乙醇、去离子水冲洗产物。

将洗净过滤的琼脂糖-碳化钨复合物珠粒加入到等体积的二甲基亚砜的水溶液中，加入10mL环氧氯丙烷，20℃水浴条件下，150rpm搅拌30min。向反应体系中缓慢加入2gNaOH和0.2g NaBH₄，将温度升到45℃，150rpm搅拌12h，反应完成后，搅拌降至室温，过滤收集交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒，用大量丙酮、去离子水冲洗产物，以标准筛过筛，分离得粒径为50-250μm交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒，20％乙醇、4℃保存。

实施例2：交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒的烯丙基化

将50mL交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒(见实施例1)水洗抽干，依次用30％、70％丙酮和100％二氧六环洗涤，抽干后转移至500mL具塞三角瓶中，加入50mL二氧六环、10g烯丙基缩水甘油醚(东京化成工业株式会社)和1.5mL三氟化硼乙醚，水浴摇床35℃、140rpm搅拌反应45min，反应产物依次用大量30％、70％丙酮和大量去离子水冲洗产物。反应式见图1。

取1mL的实施例2制备的烯丙基化产物、添加过量韦氏(Wijs)试剂，超声15min后放置1h，加入碘化钾和水，用硫代硫酸钠溶液滴定，根据试样消耗硫代硫酸钠的量计算交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒联接烯丙基的含量。在一般情况下，烯丙基含量范围从170μmol/mLgel-230μmol/mL gel。

实施例3：交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒上烯丙基的部分氧化

将50mL实施例2制备的丙基化产物依次用乙醇(99.5％)、甲苯(99％)洗涤，除掉复合物珠粒上部分甲苯并转移至烧瓶内，添加50mL去离子水，搅拌悬浮液。添加0.81g KMnO₄，反应混合物变成紫色，持续搅拌15分钟。添加20mL50％氢氧化钠水溶液，反应混合物立刻变成了褐色，室温条件下，持续搅拌1h。添加约10mL浓醋酸，调溶液pH＝5。小心地添加2mL30％过氧化氢水溶液，使反应混合物变成灰色。反应产物依次用大量去离子水、乙醇(99.5％)、去离子水冲洗产物。氧化反应过程见图2。

采用实施例2所述方法测定部分氧化后复合物珠粒中烯丙基含量，与初始的烯丙基含量比较，部分氧化反应后复合物珠粒中烯丙基含量下降了8至25％。

实施例4：溴化交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒上残留烯丙基

将10mL 1％NaAc转移至烧瓶中，添加40mL实施例3制备的部分氧化产物和40mL去离子水，快速搅拌15min。在室温条件下，将约2mL Br₂以滴加的方式添加到烧瓶中直到悬浊液保持黄色，持续搅拌15min。添加甲酸钠溶液至悬浊液黄色消失，用大量去离子水冲洗。反应产物直接用于衍生离子交换介质。

实施例5：衍生离子交换介质的制备

5-1偶联3，3-二胺基二丙基胺(DADPA)

通常情况下，将50mL实施例4制备的溴化产物、75mL 3，3-二胺基二丙基胺(diaminodipropylamine，DADPA，瑞士Fluka)和30mL去离子水分别转移至烧瓶中，室温条件下，搅拌混合物约15min。然后在60℃、搅拌条件下反应进行18h。将反应混合物冷却至室温，冰浴条件下，用浓乙酸中和反应混合物，用大量去离子水冲洗产物。

DADPA凝胶离子交换介质容量范围从146μmol/mL gel-196μmol/mL gel。

5-2偶联2-氯三乙胺(DEAE)

通常情况下，将50mL实施例4制备的溴化产物、150mL 3mol/L NaOH溶液分别转移至烧瓶中，65℃条件下，快速搅拌1h。添加130mL 2.5mol/L盐酸2-氯三乙胺(diethylchloroethylamine hydrochloride，DEAE，美国Sigma公司)，65℃、搅拌条件下反应进行2h。冷却至室温，用3mol/L盐酸水溶液中和反应混合物，分别用大量去离子水、1mol/L NaCl水溶液冲洗产物。

DEAE凝胶离子交换介质容量范围从111μmol/mL gel-154μmol/mL gel。

实施例6 加入不同比例碳化钨对介质理化性质的影响

加入不同比例碳化钨对介质(4％琼脂糖)理化性质的影响结果见表1。介质的湿真密度(Wet density)指单位体积湿态微球的质量，随碳化钨添加量的增多，添加碳化钨的密度(15.5g mL^～1)远大于琼脂糖密度，介质的湿真密度明显增大。介质含水率(Watercontent)指湿态微球所含水分质量占介质总质量的百分率，随碳化钨添加量的增多，碳化钨不溶于水，介质含水率明显降低。平均粒径(mean partical sizes)指介质微球的直径，随碳化钨添加量的增多，粒径无明显变化，介质粒径基本不受碳化钨添加量的影响。孔度(Porosity)指微球内部孔隙占微球体积的百分率，孔度表征基质内部的孔道空间，随碳化钨添加量的增多，孔度降低。

表1 介质的理化性质

加入不同比例碳化钨对介质球体大小的影响见表2。

表2 碳化钨的加入对球体大小的影响

由表2可见，六种介质的粒径分布在100-140μm范围内变化不大，为此介质粒径大小筛选范围确定为50-250μm。六种介质的粒径分布趋势是非常相似的，碳化钨的添加量的大小对介质粒径几乎没有影响。

实施例7 加入不同比例碳化钨对介质扩张特性的影响

扩张床内介质的稳定分级分布是分离效率的重要保证，探讨介质的扩张特性(膨胀特性)，评价床层稳定性，十分必要。测定介质装填高度(H₀)，改变流速，测定床层的膨胀高度H，计算膨胀率E＝H/H₀。图3是六种介质在不同流速下的膨胀率(E)的比较。

在相同流动相，相同流速的条件下，随着介质中碳化钨添加比例的增加，床层扩张率(E)显著下降，说明较高密度的吸附剂可以适应高流速的操作需要。由于泵等原因造成液相流速的小幅变化时，密度较大介质的膨胀率变化小于密度较小介质，也就是说，较高密度的介质能够承受的流速扰动范围也较大，实际应用中较容易控制。

实施例8 加入不同比例碳化钨对介质流体混合性质的影响

床层稳定性通常由扩张床内的流体混合性能来表征，主要有Bodenstein准数(Bo)和轴向混合系数(Dax)。Bo表示轴向对流传递速率与轴向扩散传递速率的相对大小，一般认为Bo值在40以上，床内的流动近似为平推流。图4给出了六种介质的Bo随流速的变化情况。

为了消除床层高度的差异对Bo准数的影响,以Bo/H₀对线性流速(U)作图(见图4)。从图4中可以看出,六种介质的Bo随流速的变化情况。随着线性流速的增加，密度大的介质的Bo值先增大，达到最大值之后又迅速减小,而随着流速的增加,Bo值随介质密度的增加而下降。可以看出，Bo值均大于40(H₀大于10)，液流轴向混合小，床层稳定。

Dax表征轴向扩散程度，其值愈大，反混程度越大。图5给出了六种介质的轴向扩散系数与线性流速的关系。由图5可见，流速越大，Dax越大，床层轴向扩散系数几乎与介质的密度无关，而相对于流速呈近视线性关系增加。

实施例9 介质对BSA的静态吸附

配制50mmol/L Tris-HCl缓冲液(p H为8.6)。并用此溶液配制不同浓度BSA溶液,在280nm下测量吸光值,绘制出BS A的标准曲线。

取0.5m L经过缓冲液平衡的介质置于25m L离心管,分别加入不同浓度的BS A溶液20m L,在恒温摇床(30℃)上慢速振荡6h,离心,用紫外分光光度计280nm检测上清液蛋白含量。根据加入的蛋白总量和上清液中所剩下的蛋白之间的差值,计算出此蛋白浓度下介质对蛋白的吸附容量，见表3.改变NaCl浓度时，测定介质(添加碳化钨和琼脂糖凝胶的质量比为1)吸附的白蛋白量，见表4，结果为在0.25M NaCl时，吸附容量为68.7mg/g介质(相当于97.1mg/ml介质)。

表3 介质对BSA的静态吸附情况

表4不同NaCl浓度下介质的浓度和对BSA的静态吸附情况的变化

实施例10 介质纯化人血浆

用合成的介质(添加碳化钨和琼脂糖凝胶的质量比为1)作为EBA柱的填料，进行人血浆的纯化实验。将原料血浆(液态)稀释三倍后直接上样，按照1.5L血浆/L吸附剂的量(已经稀释和调整完pH)/进样，不同条件下进行六次层析，实验结果见表5。其中第六次样品进行非还原SDS-PAGE。

表5.EBA纯化血浆六次的层析结果

从层析图谱可见(见图6)流穿峰、洗脱1、洗脱2和洗脱3分别在280nm处有组分峰，通过与图7的非还原SDS-PAGE分析结果表明，非吸附血浆组分和析出液含有α－1蛋白酶抑制剂(α-1-PI)；洗脱组分1主要是白蛋白(Albumin)组分；洗脱组分2主要是免疫球蛋白(IgG)；洗脱组分3主要是纤维蛋白原(Fibrinogen)，即每个组分中定性的蛋白组成基本是相同的。

Claims (7)

1.一种用于扩张床的离子交换介质，其特征在于通过下述方法制备：

1)取2g抽干的琼脂糖凝胶、0.5g NaCl制成重量比为4％的琼脂糖-水悬浮液；将50g4％琼脂糖-水悬浮液转移至烧瓶中，室温下搅拌混合15分钟，分别按照碳化钨与琼脂糖凝胶的质量比为0.2、0.4、0.6、0.8、1和2的配比添加碳化钨，所述碳化钨的平均颗粒大小9-11μm，然后以600rpm搅拌所得混合物15min，加热至93℃保持60min，作为水相备用；取200mL混合溶剂，所述混合溶剂含有体积比为10:1的石蜡和石油醚，往所述混合溶剂添加4％乳化剂得到混合液，所述乳化剂为10:4的Span80和Tween80；超声混合液5～10min，93℃水浴中预热作为油相备用；趁热将预热好的油相加入到水相中，3000rpm转速下搅拌30min，之后140-180rpm低速搅拌，以每分钟2℃速率降至室温，再继续将温度降至10℃以下；过滤收集琼脂糖-碳化钨复合物珠粒，用石油醚、无水乙醇、去离子水冲洗产物；

将过滤洗净后的琼脂糖-碳化钨复合物珠粒加入到等体积的二甲基亚砜的水溶液中，加入10mL环氧氯丙烷，20℃水浴条件下，150rpm搅拌30min；向反应体系中缓慢加入2g NaOH和0.2g NaBH₄，将温度升到45℃，150rpm搅拌12h，反应完成后，搅拌降至室温，过滤收集交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒，用丙酮、去离子水冲洗产物，以标准筛过筛，分离得粒径为50-250μm交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒；

2)通过烯丙基化、氧化和溴化依次反应活化步骤1)制备的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒，获得活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒；

3)在步骤2)活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒上偶联3，3-二胺基二丙基胺或2-氯乙基二乙胺，形成所述用于扩张床的离子交换介质；

所述离子交换介质的湿密度为1.07～1.61g/ml，水重量比含量为88.3～51.2％，粒径范围为50～250μm，孔度为80.3-77.1％，所述孔度指介质微球内部孔隙占微球体积的百分率。

2.根据权利要求1所述的离子交换介质，其特征在于步骤2)中所述烯丙基化过程中，通过添加烯丙基缩水甘油醚开环联接烯丙基，烯丙基缩水甘油醚的添加量为1～4mmol/mL琼脂糖凝胶，以三氟化硼乙醚为催化剂，二氧六环为溶剂反应；

其中烯丙基化、氧化后的溴化过程中，滴加Br₂的量为0.03-0.1mL/ml琼脂糖凝胶。

3.根据权利要求1所述的离子交换介质，其特征在于步骤2)所述的氧化过程中，交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒内孔联接的烯丙基以油相保护，交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒外表层联接烯丙基以KMnO₄、H₂O₂水相氧化，油相保护使用的有机溶剂为苯、甲苯、乙苯、丙苯或者其中两种的混合物。

4.根据权利要求1所述的离子交换介质，其特征在于所述步骤3)中活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒偶联3，3-二胺基二丙基胺配基过程中，3，3-二胺基二丙基胺的添加量为10-30mmoL/ml琼脂糖凝胶。

5.根据权利要求1所述的离子交换介质，其特征在于所述步骤3)中活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒偶联2-氯乙基二乙胺过程中，将活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒经过2.5-3.5mol/L NaOH溶液处理后偶联2-氯乙基二乙胺，2-氯乙基二乙胺的添加量为6-9mmoL/mL琼脂糖凝胶。

6.根据权利要求1所述的离子交换介质，其特征在于所述离子交换介质在0-800cm/h流速范围内扩张床相对稳定；静态吸附白蛋白的量为50～98mg/ml介质。

7.一种用于扩张床的离子交换介质的制备方法，包括下述步骤：

1)取2g抽干的琼脂糖凝胶、0.5g NaCl制成重量比为4％的琼脂糖-水悬浮液；将50g4％琼脂糖-水悬浮液转移至烧瓶中，室温下搅拌混合15分钟，分别按照碳化钨与琼脂糖凝胶的质量比为0.2、0.4、0.6、0.8、1和2的配比添加碳化钨，所述碳化钨的平均颗粒大小9-11μm，然后以600rpm搅拌所得混合物15min，加热至93℃保持60min，作为水相备用；取200mL混合溶剂，所述混合溶剂含有体积比为10:1的石蜡和石油醚，往所述混合溶剂添加4％乳化剂得到混合液，所述乳化剂为10:4的Span80和Tween80；超声混合液5～10min，93℃水浴中预热作为油相备用；趁热将预热好的油相加入到水相中，3000rpm转速下搅拌30min，之后140-180rpm低速搅拌，以每分钟2℃速率降至室温，再继续将温度降至10℃以下；过滤收集琼脂糖-碳化钨复合物珠粒，用石油醚、无水乙醇、去离子水冲洗产物；

将洗净过滤后的琼脂糖-碳化钨复合物珠粒加入到等体积的二甲基亚砜的水溶液中，加入10mL环氧氯丙烷，20℃水浴条件下，150rpm搅拌30min；向反应体系中缓慢加入2g NaOH和0.2g NaBH₄，将温度升到45℃，150rpm搅拌12h，反应完成后，搅拌降至室温，过滤收集交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒，用丙酮、去离子水冲洗产物，以标准筛过筛，分离得粒径为50-250μm交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒；

2)通过烯丙基化、氧化和溴化依次反应活化步骤1)制备的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒，获得活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒；所述烯丙基化过程中，通过添加烯丙基缩水甘油醚开环联接烯丙基，烯丙基缩水甘油醚的添加量为1～4mmol/mL琼脂糖凝胶，以三氟化硼乙醚为催化剂，二氧六环为溶剂反应；所述氧化过程中，交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒内孔联接的烯丙基以油相保护，交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒外表层联接烯丙基以KMnO₄、H₂O₂水相氧化，油相保护使用的有机溶剂为苯、甲苯、乙苯、丙苯或者其中两种的混合物；

烯丙基化、氧化后的溴化过程中，滴加Br₂的量为0.03-0.1mL/ml琼脂糖凝胶；

3)在步骤2)活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒上偶联3，3-二胺基二丙基胺或2-氯乙基二乙胺，形成所述用于扩张床的离子交换介质，活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒偶联3，3-二胺基二丙基胺配基过程中，3，3-二胺基二丙基胺的添加量为10-30mmoL/ml琼脂糖凝胶；或者

步骤3)中活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒偶联2-氯乙基二乙胺过程中，将活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒经过2.5-3.5mol/L NaOH溶液处理后偶联2-氯乙基二乙胺，2-氯乙基二乙胺的添加量为6-9mmoL/mL琼脂糖凝胶。