CN108883394B - 色谱基质 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于纯化生物大分子的分离基质，其包含多个具有核区域(2)和壳区域(3)的颗粒(1)，其中：a)所述壳区域对于目标生物大分子可接近；b)所述核区域比所述壳区域对于所述目标生物大分子较不易接近；和c)所述核区域包含含有至少一种可聚合单体的残基的接枝聚合物。

Description

色谱基质
发明技术领域
本发明涉及色谱领域，且更具体地涉及具有致密核区域和多孔壳区域的色谱基质。
发明背景
在液相色谱分离中，分辨率随着多孔装填材料的粒度的减小而增加。这是由于颗粒内部的扩散距离较短，导致较高的柱效率，通常以柱的板数来衡量。然而，缺点是较小的粒度导致较高的柱背压，这是一种强成本驱动因素，特别是对于其中柱的小型化不是可能途径的制备型色谱。
将分辨率与粒度断开联系的一种方式是使用薄膜介质，其中无孔核由薄的多孔固定相材料层涂覆。然而，这种介质在很大程度上未被用于生物大分子的制备型分离，由于难以制造具有与常规使用的生物大分子分离介质的性质等同的性质的薄膜介质，其中蛋白质等的低程度的非特异性吸附、生物大分子的高可接近性和高结合能力是重要的参数。
因此，在该领域中需要新的开发，允许具有改进的分辨率的生物大分子分离，同时保持非薄膜生物大分子分离介质的优点，例如低非特异性吸附、合理的能力和对重要目标生物大分子的高选择性。
发明概述
本发明的一个方面是提供用于纯化生物大分子如蛋白质的高分辨率分离基质。这通过包含多个具有核区域和壳区域的颗粒的基质实现，所述核区域包含接枝聚合物，其中所述壳区域对于目标生物大分子可接近，且核区域比壳区域对于目标生物大分子较不易接近。
一个优点是可以提供高分辨率而不必求助于小颗粒，其导致高背压和低流速的问题。
本发明的第二方面是提供一种制造高分辨率分离基质的方法。这通过包括以下步骤的方法实现：
a) 提供包含多孔载体材料的多个颗粒；
b) 在多孔载体材料上引入接枝位点；
c) 灭活壳区域中的接枝位点；
d) 在包含可聚合单体的组合物中孵育颗粒；和
e) 引发聚合。
该方法产生如上所述的基质并具有相同的优点。
本发明的第三方面是提供一种如下从样品分离目标生物分子的方法：将样品输送通过装填有如上公开的分离基质的柱，任选地将洗涤液输送通过柱并将洗脱液输送通过所述柱以回收洗出液中的目标生物大分子。
本发明的第四方面是提供上文公开的分离方法用于改善目标生物大分子和至少一种污染物之间的分辨率的用途。
在从属权利要求中描述本发明的其它合适的实施方案。
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，且应理解为还包括抗体片段，包含抗体或抗体片段的融合蛋白和包含抗体或抗体片段的缀合物。
术语“亲和色谱基质”在本文中是指具有配体(此处描述为“亲和配体”或“包含亲和基团的配体”)的分离基质，其能够以小于约10-5M，例如10-14至10-6M的平衡解离常数KD结合目标物类。KD在此定义为KD = [L]*[T]/[LT]，其中[L]是游离配体的浓度，[T]是游离目标物类的浓度，且[LT]是配体-目标物类复合物的浓度。大多数这样的配体/基团是蛋白质，且可以例如包括细菌免疫球蛋白结合蛋白及其变体、抗体、链霉亲和素、凝集素等。目标物类可以例如是蛋白质，如免疫球蛋白。
附图简述
图1显示本发明的基质的示意图。
图2显示制造本发明的基质的方案。
图3显示用于装填有原型2D和2I以及40微米基础载体交联琼脂糖珠的柱的不同分子量的葡聚糖的尺寸排阻色谱数据，表示为Kav。
图4显示原型1C和参考SP Sepharose 6 FastFlow(SP FF)上的mAb-细胞色素C混合物的色谱图。
图5显示原型1D和参考SP Sepharose 6 FastFlow(SP FF)上的伴清蛋白+多克隆IgG +细胞色素C +溶菌酶混合物的色谱图。
图6显示原型1A-1D和参考SP Sepharose 6 FastFlow(SP FF)上的蛋白质对：伴清蛋白+细胞色素C和细胞色素C +溶菌酶的分辨率数据。
图7显示在与荧光单克隆IgG抗体孵育后，a)SP Sepharose 6 FastFlow和b)原型1E的共聚焦显微术珠横截面。
图8显示来自图7b)的共聚焦显微术横截面的横截面强度分布。
实施方案详述
在一个方面，本发明公开用于纯化生物大分子的分离基质。分离基质包含多个具有中心核区域2和外围壳区域3的颗粒1。核区域包含含有至少一种可聚合单体的残基的接枝聚合物(P)，例如乙烯基单体，且虽然壳区域对于目标生物大分子可接近，核区域比壳区域对于目标生物大分子较不易接近。核区域中的目标生物大分子的扩散速度例如可以为壳区域中的目标生物大分子的扩散速率的小于10%，且适当地，核区域可以对于目标生物大分子基本上不可接近。可接近性可在20-50cm/h的流速下通过反向尺寸排阻色谱测量，如在Gel Filtration Principles and Methods, 第5版, Pharmacia LKB 1991 (ISBN 91-97-0490-2-6), pp 8-11中和在实施例中概述。或者，共聚焦显微术可用于评估可接近性。在这种情况下，荧光标记的目标生物大分子可以用作探针且可以在共聚焦显微镜中测量不同区域的荧光强度，并视为可接近性的量度。核区域中的荧光强度可以例如是壳区域中的荧光强度的小于90%，例如小于70%，小于50%或小于10%。目标生物大分子可以是例如具有> 5、>20或超过50kDa的分子量的蛋白质，且特别是具有约150kDa的分子量的免疫球蛋白如IgG。核区域可适当地含有至少50mg/ml的接枝聚合物，例如至少70mg/ml或50-300，例如50-200或70-150mg/ml，以显著降低对常见生物大分子的可接近性。聚合物量的确定可以在如实施例中所示的制造期间进行，或在最终产品上进行。在后一种情况下，例如可以使用光谱方法或元素分析。与具有随后用多孔材料涂覆的核的薄膜基质相比，本发明的基质具有更加良好控制的结构且更容易制造，且在壳厚度和聚合物含量中具有受控变化。
在某些实施方案中，壳区域具有1-15微米的平均厚度d。可替代地或可附加地，平均厚度可以为颗粒的体积加权中值直径或球当量直径的0.5至6%。颗粒可以基本上是球形，但它们也可以偏离球形，例如具有至少0.9，例如至少0.95或至少0.98的平均球形度(球具有1的球形度)。颗粒可以例如具有10-400微米，例如20-400、30-100微米或50-100微米的体积加权中值直径。
在某些实施方案中，壳区域和核区域都包含多孔载体材料。多孔载体材料可以例如包含多糖，其可以是交联的。合适的多糖的实例包括琼脂糖和琼脂，其提供对蛋白质具有高可接近性的开孔结构，且适合于通过接枝乙烯基聚合物进行孔填充。
在一些实施方案中，核区域具有1至500kDa，例如60-500、80-200或80-140kDa的球状蛋白质的截止分子量。
聚合物(Pol)可以例如与载体材料(Sup)接枝，即通过单体聚合，导致聚合物链共价连接到载体材料。聚合物链和载体材料之间的键或接头可以例如具有结构I、II、III、IV或V。
Sup-O-CH2-CH2-CH2-Pol (I)
Sup-O-CH2-CH(CH3)-Pol (II)
Sup-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2-Pol (III)
Sup-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH(CH3)-Pol (IV)
Sup-O-Pol (V)
结构I和II可以例如通过经由烯丙基的接枝形成，所述烯丙基通过载体羟基与烯丙基卤化物反应引入，且结构III和IV可以通过经由烯丙基的接枝形成，所述烯丙基通过载体羟基与烯丙基缩水甘油醚反应引入。结构V可以例如通过在载体上从固定的过氧化物或氢过氧化物接枝形成。通过单体的接枝聚合连接聚合物具有以下优点：可以实现高浓度的接枝聚合物，因为小的单体分子仍然可以扩散到核中，同时通过用接枝聚合物填充逐渐阻塞孔。现成的聚合物的连接通常不太成功，因为一旦孔填充开始，大的聚合物分子将至少部分地从核排除。聚合物(P)可以是乙烯基聚合物且可以例如包含乙烯基酰胺单体残基，例如选自N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基甲酰胺和N-乙烯基乙酰胺的残基。它可以例如包含N-乙烯基吡咯烷酮残基，其对于用1M NaOH清洁是稳定的且是亲水的。
壳区域可以不含生物大分子(例如蛋白质)结合官能团，在这种情况下，颗粒可以用于尺寸排阻色谱分离(也称为凝胶过滤)。然而，在某些实施方案中，壳区域包含能够结合目标生物大分子的配体。这使得颗粒能够用于一系列色谱技术。对于离子交换色谱，配体可包含带正电荷(阴离子交换)或带负电荷(阳离子交换)的基团。带正电荷的基团的实例包括季铵基团和胺，而带负电荷的基团的实例包括例如磺酸根、硫酸根、羧酸根和膦酸根。配体也可以或可替代地包含疏水基团，例如烷基-亚烷基-、芳基-或烷基芳基。这些可用于疏水相互作用色谱。具有包含带电荷和疏水基团的配体的基质可用于多峰色谱分离，且这种多峰配体的实例包括N-苄基-N-甲基乙醇胺、N-苯甲酰基高半胱氨酸、4-巯基乙基吡啶、对氨基苯甲酰基乙酸、色氨酸、苯丙氨酸等。配体可以进一步包含亲和基团，使得基质可用于亲和色谱。这种亲和基团的实例包括蛋白A和蛋白A变体、蛋白L、蛋白G、抗体、凝集素、生物素、抗生物素蛋白、适体等。壳区域中的配体的量可以根据配体的施加和类型而变化，但是根据经验，壳区域可以例如包含10-20000μmol配体/ml壳区域，例如10-10000μmol/ml或10-2000μmol/ml。壳区域配体含量可以通过共聚焦显微术中的光密度测定法，使用结合到配体的荧光染料和来自具有已知配体浓度的颗粒的校准曲线来确定。还可以从滴定整体颗粒，得到每体积基质的配体含量并除以基质的壳体积分数来确定。
在第二方面，本发明公开一种制造如上公开的分离基质的方法。该方法包括以下步骤：
a) 提供包含具有接枝位点101的多孔载体材料的多个颗粒。
载体材料可包括固有的接枝位点，例如具有残留乙烯基的聚二乙烯基苯珠或具有适合于环氧化物等的阴离子聚合的羟基，或具有适合于通过例如铈离子引发的自由基接枝的α碳的多糖珠。或者，可以在步骤a)之前在步骤a’)中将接枝位点引入到多孔载体材料。这可能涉及例如羟基在具有烯丙基或其它可共聚基团的多糖珠中衍生化或它可以涉及自由基引发剂官能团，例如过氧化物或氢过氧化物的固定化。引入接枝位点的不同方法在US20120029154中和在A Bhattacharya等, Prog. Polym. Sci. 767-814 (2004)中讨论，其全部内容通过引用并入本文。如上讨论，多孔载体材料可以是交联的或非交联的多糖颗粒/珠，例如琼脂或琼脂糖颗粒/珠，但它也可以是其它类型的材料，例如多孔合成聚合物颗粒/珠(例如，由二乙烯基苯或苯乙烯/二乙烯基苯聚合物或各种丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯或乙烯基醚聚合物制成)，二氧化硅或玻璃颗粒/珠等。
b) 灭活壳区域102中的接枝位点。
灭活可以适当地通过加入控制量(不足量)的灭活接枝位点的试剂来进行，且由于试剂从颗粒外部加入，试剂将主要与外围壳区域中的接枝位点反应。合适地，试剂和接枝位点之间的反应速率高于颗粒中的试剂的扩散速率，从而在到核中的任何明显的扩散发生之前消耗试剂。然后可以通过加入的试剂的量来控制灭活的壳层的厚度。为了计算壳厚度，可以假设壳中的所有接枝位点已被灭活试剂消耗，且核中的所有接枝位点都保留。灭活后的接枝位点含量(ga)和灭活前的接枝位点含量(gb)之比将等于核/(核+壳)体积比。因此，壳厚度d将是d = R(1-(ga/gb)1/3)，其中R是珠半径。灭活试剂的性质根据接枝位点的结构而变化。对于不饱和的接枝位点(烯丙基、乙烯基等)，卤素如溴可能是合适的选择。卤素与双键快速反应，且使它们在聚合中不反应。在水溶液中与卤素反应，例如使用溴水还具有形成卤代醇的优点，其可用于用配体(例如亲核配体前体试剂，如胺、硫醇或亚硫酸根离子)使壳区域衍生化。然而，不饱和的接枝位点也可以以其它方式灭活，例如通过与硫醇的加成反应。作为接枝位点的羟基可以通过与其中大量在本领域中已知的羟基保护基团反应而灭活。例如通过US20120029154的方法引入的氢过氧化物或过氧化物可以通过用还原剂例如硫醇或还原金属离子例如Fe2+处理来灭活。
c) 使颗粒与包含可聚合单体103的组合物接触。
可以将颗粒浸入一种或多种可聚合单体的溶液中，允许溶液扩散到颗粒中并与接枝位点紧密接触。一种或多种单体可以合适地具有低分子量，例如低于200Da或低于100Da，即使在步骤d)中核开始被接枝聚合物链阻塞，也可确保易于渗透到核中。合适的单体可以是乙烯基单体(包括例如乙烯基酰胺、乙烯基酯、乙烯基醚、乙烯基芳基、丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酰胺)。一种或多种单体可以例如包括乙烯基酰胺单体，例如选自N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基甲酰胺和N-乙烯基乙酰胺的单体。它可以例如包含N-乙烯基吡咯烷酮。其它合适的单体包括乙烯基醚，例如羟乙基乙烯基醚、二乙二醇乙烯基醚或甲基丙烯酸酯，如甲基丙烯酸羟乙酯或单甲基丙烯酸甘油酯。还可以使用单体的混合物，例如包括交联(双官能或多官能)单体。乙烯基酰胺如N-乙烯基吡咯烷酮可以例如与双官能或多官能甲基丙烯酸酯如甘油二甲基丙烯酸酯结合。除乙烯基单体外，还可以使用其它可聚合单体，例如环氧化物单体如氧化乙烯或氧化丙烯或氧杂环丁烷。
d) 引发可聚合单体104的聚合。
聚合可以如下引发：加入引发剂，或在步骤c)中具有引发剂作为单体组合物的组分并触发引发，例如通过提高热引发剂的温度，为双引发剂体系加入共引发剂，或通过UV或可见光照射光引发剂。如果接枝位点是固定的引发剂基团，这也适用于这种情况。或者，可以通过用电离辐射(例如γ辐射或电子束)照射来引发聚合。在聚合后，可以从颗粒洗去任何残留的单体和其它试剂以及非接枝的聚合物。如果使用交联单体，水平应当低以避免交联的反应溶液，优选低于2%(基于单体的总量计算)。所形成的聚合物的分子量和形态可通过改变引发剂浓度、单体浓度、交联剂浓度，通过使用链转移剂或不同的反应溶剂来控制。
该方法还可包括使颗粒与配体前体试剂反应以将配体偶联到壳区域的步骤e)。步骤e)可以在步骤d)之后或在步骤b)之后且在步骤c)和d)之前进行。如果b)中的接枝位点的灭活涉及同时产生适合于与配体前体试剂反应的基团的反应，步骤e)可有利地在步骤b)之后进行。这可以是例如当不饱和的接枝位点被含水卤素灭活时，形成易于与亲核配体前体试剂如胺和亚硫酸根离子反应的卤代醇的情况。在大配体，如例如蛋白质性亲和配体的情况下，在步骤d)之后进行步骤e)可能是有利的，因为接枝聚合物防止大配体分子进入核且不存在通过在核中偶联而损失昂贵配体的风险。在配体仅在壳中偶联的情况下，它们都可用于结合并有助于结合能力。
在一些实施方案中，多孔载体材料包含碳结合的羟基，且该方法包括：
在步骤a’)中使颗粒与烯丙基化试剂反应以获得至少50μmol/ml的共价连接到颗粒的烯丙基；和
在步骤b)中首先使颗粒与卤素反应至多30分钟的时间，且然后与碱性水溶液反应。
在第三方面，本发明公开一种分离目标生物大分子的方法，包括以下步骤：
a) 提供包含目标生物大分子的样品；
b) 将样品输送通过装填有如上公开的分离基质的柱；
c) 任选地将洗涤液输送通过柱；和
d) 将洗脱液输送通过柱并回收洗出液中的目标生物大分子。
在一些实施方案中，步骤b)和/或d)中通过柱的流速为至少70cm/h，例如至少150，至少200或70-500，例如70-300或150-300cm/h。
在第四方面，本发明公开上文公开的分离方法用于改善目标生物大分子和至少一种污染物之间的分辨率的用途。分辨率可以例如与高于70cm/h，高于150或高于200cm/h的流速的均质基质相比，得到改善。此处的分辨率根据标准定义来定义，其中色谱图中的两个峰的分辨率Rs为：
Rs = 2 * [(tR)B-(tR)A]/[WA+WB]
其中(tR)A是峰A的保留时间，(tR)B是峰B的保留时间，WA是峰A的宽度且WB是峰B的宽度。宽度在这里以时间单位测量。然而，同样可以输入峰A和B的保留体积，且在这种情况下以体积单位使用峰宽度测量。在液相色谱中，由于峰变宽，分辨率通常在流速增加时降低，但本发明的基质不易受这种损失的影响。
实施例(除非另有说明，否则均在22 +/- 2℃下进行)
实施例1- 96微米颗粒原型的合成
烯丙基化
将300g中值直径(d50v)95.8微米的排干的交联琼脂糖珠(Mw 50kDa的葡聚糖的Kav = 0.5，用蒸馏水洗涤)，在2升烧瓶中与300ml 50% NaOH水溶液混合。烧瓶配备有顶置式搅拌器并浸入50℃水浴中。在搅拌下30分钟后，加入93.2ml烯丙基缩水甘油醚(AGE)并使反应再进行18.5h。用蒸馏水(一个凝胶体积)、乙醇(一个凝胶体积)和最后蒸馏水(8个凝胶体积)洗涤凝胶。烯丙基含量(下面的方法)为0.288mmol/ml。
滴定烯丙基
用蒸馏水洗涤凝胶，且取出1ml排干的凝胶样品，并悬浮在烧瓶中的9ml水中。加入饱和溴水直到由于存留过量的Br2而呈现黄色。在搅拌下将样品抽空以除去过量的溴。然后将混合物转移到滴定容器中并用蒸馏水补足至20ml。在用AgNO3滴定游离溴离子之前加入2-3滴浓硝酸。
壳区域的溴化
将600g(mL)烯丙基化琼脂糖珠与3L蒸馏水一起排干到4L圆底烧瓶中。应用机械搅拌(250rpm)。
制备3.375mL溴在400mL水中的溶液。在约15分钟期间以300rpm的搅拌速度通过滴液漏斗加入溴溶液(相当于95.8μm珠的7μm壳中的烯丙基)。在20分钟后，凝胶用蒸馏水以10x1GV洗涤。
壳区域的阳离子交换剂官能化
将619g(mL)壳溴化的凝胶转移到2L圆底烧瓶中。加入124mL蒸馏水和148.5g亚硫酸钠。应用机械螺旋桨搅拌并将溶液以250rpm放置30min。通过加入50% NaOH将pH调节至12.5，并将烧瓶浸入50℃的水浴中。反应进行21h。用10xGV蒸馏水将凝胶洗涤。通过标准NaOH滴定发现磺酸根阳离子交换剂基团的含量为0.073mmol/ml。阳离子交换剂用作接枝的中间体。
壳厚度的测定
将6g(mL)壳溴化的凝胶转移到Falcon管中。加入5.4mL蒸馏水和624µL 50% NaOH水溶液。将管放置在50℃的摇动台中。反应进行18h。用10×GV蒸馏水洗涤凝胶。然后通过如上所述的滴定测定残留烯丙基的量，且发现其为0.288mmol/ml。为了计算壳厚度，假设壳中的所有烯丙基已被溴化/碱水解消耗且核中的所有烯丙基都保留。那么溴化/碱处理后的烯丙基含量(aa)和这些处理前的烯丙基含量(ab)之比将等于核/核+壳体积比。因此，壳厚度d将是d = R(1-(aa/ab)1/3)，其中R是珠半径(47.9微米)。在aa = 0.214mmol/ml且ab = 0.288的情况下，那么d将为4.5微米。
乙烯基吡咯烷酮在烯丙基核中的接枝
将25.4g烯丙基化的凝胶浆料(中间体)转移到玻璃过滤器(por.3)。用7×2GV蒸馏水洗涤凝胶，然后用3×1.5GV 1M Na2SO4洗涤并吸干。将干燥的凝胶转移到100mL烧瓶中，且加入1M Na2SO4溶液直到36.6g的总重量。加入3.87mL乙烯基吡咯烷酮(VP)，36.3μL甘油二甲基丙烯酸酯(GDMA)和0.081g α,α-偶氮二异丁脒二盐酸盐(ADBA)引发剂。用巴斯德吸管将氮气鼓泡通过反应溶液20min。将烧瓶浸入甘油浴中，温度设定在45℃，且搅拌速率为250rpm。在17小时后，加入32.5g蒸馏水，并将悬浮液在反应温度下搅拌30分钟。将凝胶转移到玻璃过滤器中并用10GV蒸馏水洗涤。将反应在冰箱中放置在水中48h，且然后用5×1GV乙醇洗涤，且最后用10×1GV水洗涤。
在1M Na2SO4中的进一步接枝实验以相同的方式进行，其量在表1中显示。在水中的实验以相同的方式进行，除了初始洗涤，其中凝胶用10×GV蒸馏水洗涤，且根据上表将蒸馏水加入到总重量。
表1. 不同原型的接枝条件
实验 H<sub>2</sub>O/1 M Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> g凝胶 %GDMA µLGDMA %VP+GDMA mL VP %引发剂 g ADBA
1A 1 M Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 15 1 36.3 10 3.870 2 0.081
1B 1 M Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 15 1 36.3 10 3.870 5 0.203
1C H<sub>2</sub>O 15 1 72.6 20 7.739 2 0.163
1D H<sub>2</sub>O 15 1 72.6 20 7.739 5 0.407
1E H<sub>2</sub>O 15 0 0 22.5 8.795 5 0.457
1F 1 M Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 15 0 0 11 4.300 20 0.894
反应混合物具有不同的粘度且在反应后并非同样容易洗涤。与在硫酸钠中进行的实验相比，在水中进行的实验更粘稠且起初更难洗涤。原型A和B在它们用水洗涤时具有两层，一个漂浮在水面上的轻层和一个沉淀在底部的重层。
干重(固体含量)测定
在接枝反应后，在蒸发天平(水分分析仪)上记录1ml基质的干重，且结果在表2中显示。接枝的乙烯基吡咯烷酮-甘油二甲基丙烯酸酯共聚物(PVP-GDMA)的量由接枝和洗涤的原型和接枝前的多孔载体材料之间的干重差计算。
表2. 接枝原型的干重
原型 干重[mg/mL] 干重基础载体[mg/mL] PVP-(GDMA)或连接的PVP[mg/mL]
1A 184 107 77
1B 204 107 97
1C 188 107 81
1D 204 107 97
1E 204 107 97
1F 233 107 126
葡聚糖与烯丙基核的偶联
将40g排干的中间体与45ml水混合，并在搅拌下加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)。在氮气氛下加入自由基引发剂2,2'-偶氮双-(2-氨基丙烷)HCl，且在室温下继续氮气流15min，然后将温度升至55℃并在55°C下继续反应2.5h。然后过滤凝胶并用蒸馏水、丙酮和蒸馏水洗涤。在将凝胶储存在冰箱中过周末后，将30g排干的凝胶与30g葡聚糖(1G和1H为Mw 5000且1I为Mw 3500)在60ml蒸馏水中的溶液混合。加入7.91ml 50% NaOH水溶液且将反应混合物在50℃下搅拌过夜。然后过滤凝胶并用水洗涤。
表3. 葡聚糖偶联原型
原型 GMA (g) 引发剂 (mg) 干重基础载体(mg/mL) 与GMA的干重(mg/mL) 连接的GMA(mg/mL) 与葡聚糖的干重 (mg/mL) 连接的葡聚糖(mg/mL)
1G 2.5 48 114 142 20 151 8.7
1H 3.8 72 114 172 58 176 4.8
1I 5.1 96 114 194 80 206 12.9
如从表3可见，连接的葡聚糖的量非常低，表明葡聚糖分子没有有效地渗透到核中。
实施例2- 40微米颗粒原型的合成
烯丙基
300g中值直径(d50v)40微米的排干的交联琼脂糖珠(Mw 124kDa的葡聚糖的Kav =0.5，根据美国专利号6,602,990中描述的方法制备，在此通过引用整体并入本文)用蒸馏水洗涤并在2升烧瓶中与300ml 50% NaOH水溶液混合。烧瓶配备有顶置式搅拌器并浸入50℃水浴中。在搅拌下30分钟后，加入93.2ml烯丙基缩水甘油醚(AGE)并使反应再进行18.5h。用蒸馏水(一个凝胶体积)、乙醇(一个凝胶体积)和最后蒸馏水(8个凝胶体积)洗涤凝胶。烯丙基含量(下面的方法)为0.283mmol/ml。
壳区域的溴化(针对5微米壳厚度)
将245g烯丙基化凝胶浆料(含有140ml排干的凝胶)转移到玻璃过滤器中并用水洗涤三次。在排干后，将凝胶转移到2L烧瓶中，且加入水以得到800g的总重量。在剧烈搅拌下，在30-60s的时间内将227.9g溴水(1.60%w/w)加入到烧瓶中。使反应再进行15min。然后用水(5个凝胶体积)洗涤凝胶。
2A. 壳区域的灭活
将30ml溴化凝胶用25ml水和5.07ml 50% NaOH水溶液(1.6M)在250ml烧瓶中浆化。在搅拌下，将烧瓶浸入50℃水浴中18h。然后用水(10个凝胶体积)洗涤凝胶。在该凝胶样品上测定剩余的烯丙基含量(对于5微米壳，理论烯丙基水平应为0.121mmol/ml)。烯丙基含量为0.182mmol/ml，其对应于如上所述计算的3微米的壳厚度。
2B. 壳区域的阳离子交换剂官能化
在250ml烧瓶中，用55ml水中的16.5g亚硫酸钠将54ml溴化凝胶浆化。通过加入50%NaOH水溶液将pH调节至11.9。在搅拌下，将烧瓶浸入50℃水浴中18h。在用60%乙酸中和后，然后用水(10个凝胶体积)洗涤凝胶。通过标准NaOH滴定发现磺酸根阳离子交换剂基团的含量为0.065mmol/ml。
2C. 壳区域的阴离子交换剂官能化
在250ml烧瓶中，用20ml水和9.8ml三甲基氯化铵(TMAC)将54ml溴化凝胶浆化。通过加入50% NaOH水溶液将pH调节至11.5。在搅拌下，将烧瓶在室温(22℃)下放置18h。在用60%乙酸中和后，然后用水(10个凝胶体积)洗涤凝胶。通过标准氯离子容量滴定发现季铵阴离子交换基团的含量为0.101mm/ml。
2D. 核区域的灭活(阳离子交换剂壳)
将25ml来自B. 的凝胶用25ml水和1.0g NaOAc * 3H2O在烧瓶中浆化。在摇动后，加入溴水直到获得持久的黄色。然后加入甲酸钠以淬灭过量的溴。用10体积的水洗涤凝胶，且在排干后，在100ml烧瓶中与20.8ml水和4.225ml 50% NaOH水溶液(1.6M)混合。在搅拌下，将烧瓶浸入50℃水浴中19h。然后用水(10个凝胶体积)洗涤凝胶并储存在含有0.2M乙酸盐的20%乙醇水溶液中。
2E. 核区域的灭活(阴离子交换剂壳)
将25ml来自C. 的凝胶用25ml水和1.0g NaOAc * 3H2O在烧瓶中浆化。在摇动后，加入溴水直到获得持久的黄色。当溴化烯丙基核时比D需要更少的Br2(aq)。然后加入甲酸钠以淬灭过量的溴。用10体积的水洗涤凝胶，且在排干后，在100ml烧瓶中与20.8ml水和4.225ml 50% NaOH水溶液(1.6M)混合。在搅拌下，将烧瓶浸入50℃水浴中19h。然后用水(10个凝胶体积)洗涤凝胶并储存在20%乙醇水溶液中。
2F. 在烯丙基核、灭活壳中接枝乙烯基吡咯烷酮
将10g来自A. 的排干的凝胶与65g水在250ml烧瓶中混合。将0.5g 2,2'-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐(AAPH)引发剂和24.5g乙烯基吡咯烷酮(VP)加入到烧瓶中。在用N2鼓泡4分钟后，将烧瓶浸入55℃水浴中18h。然后将高粘度浆料在玻璃过滤器上用水(5个凝胶体积)，乙醇(> 10个凝胶体积)洗涤并用水(每次5个凝胶体积)洗涤10次，并将凝胶储存在20%乙醇水溶液中。
2G. 乙烯基吡咯烷酮在烯丙基核、阳离子交换剂壳中的接枝
与F中相同的程序，但使用来自B的凝胶。将产物储存在含有0.2M乙酸盐的20%乙醇水溶液中。
2H. 乙烯基吡咯烷酮在烯丙基核、阴离子交换剂壳中的接枝
与F中相同的程序，但使用来自C的凝胶。将产物储存在20%乙醇水溶液中。
2I. 将烯丙基葡聚糖与烯丙基核偶联并将乙烯基吡咯烷酮接枝到烯丙基葡聚糖
将15ml凝胶2A、15ml水和0.6g NaOAc * 3H2O在100ml烧瓶中混合。加入溴水直到获得持久的黄色。通过加入甲酸钠淬灭过量的溴。然后用5体积的水洗涤凝胶。
将溴化凝胶加入到15g烯丙基葡聚糖(Mw 70000，烯丙基含量1.4mmol/g)在15ml水中的溶液中，并将温度升至50℃。再加入5ml。在90分钟后，加入2.0ml 50% NaOH水溶液和80mg硼氢化钠，且在搅拌下使反应进行16.5h。然后用水洗涤凝胶10次。
将13g排干的凝胶与84.5g水和0.65g AAPH引发剂混合，并加入31.9g乙烯基吡咯烷酮。在氮气鼓泡5分钟后，将混合物加热至55℃并使其反应18.5h。然后将粘稠混合物在玻璃过滤器上用水洗涤5次，用乙醇洗涤5次，用水洗涤10次。
2J. 烯丙基葡聚糖与烯丙基核的偶联和将乙烯基吡咯烷酮接枝到烯丙基葡聚糖、阳离子交换剂壳
与2I中的程序相同，但用凝胶2B开始。
2K. 烯丙基葡聚糖与烯丙基核的偶联和将乙烯基吡咯烷酮接枝到烯丙基葡聚糖，阴离子交换剂壳
与2I中相同的程序，但用凝胶2C开始。
表4. 烯丙基葡聚糖原型的干重
原型 起初烯丙基核凝胶的干重(mg/ml) 烯丙基葡聚糖偶联后的干重(mg/ml) 连接的烯丙基葡聚糖(mg/ml) PVP接枝后的干重(mg/ml) 连接的PVP (mg/ml)
2I 140 184 44 322 138
2J 158 184 26 300 142
2K 170 192 22 N/A
实施例3-通过共聚焦显微术评估核和壳区域的蛋白质可接近性
使用荧光标记的蛋白质探针通过共聚焦荧光显微术评估可接近性，其允许探针如何穿透到不同区域的三维高分辨率成像。
探针
单克隆IgG抗体，用Alexa 488荧光染料(Molecular Probes)牛血清白蛋白(BSA)标记，用Cy5荧光染料(GE Healthcare)细胞色素C标记，用Cy5荧光染料(GE Healthcare)标记
原型
1E(来自实施例1)。具有壳区域中的磺酸根阳离子交换配体(总配体含量0.073mmol/ml基质)和核区域中的接枝聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的96微米琼脂糖珠。
参考物-SP Sepharose 6FF，(GE Healthcare)，90微米交联的琼脂糖珠，其具有均匀分布在整个珠中的磺酸根阳离子交换配体(0.194mmol/ml基质)。
方法
将珠在探针溶液(300mg蛋白质/ml凝胶)中在Eppendorf管中孵育4h。然后将它们洗涤或直接在配备有63×1.20水浸物镜的共聚焦显微镜(SP8，Leica)中观察。
将Cy5标记的蛋白质(BSA和细胞色素C)在xy方向上并用截面系列扫描(在z方向上100个光学截面(步长~3.5μm)。扫描速度400；像素大小：512 x 512；帧平均值2。激发波长633nm。在650-800nm之间检测到发射的荧光。
对于Mab-Alexa 488激发波长488nm。在490-555nm之间检测到发射的荧光。其它设置与上面相同。
对于Mab-Alexa 488和BSA-Cy5，在孵育后直接扫描颗粒而不进行任何洗涤。由于细胞色素C溶液产生更高的背景，通过反复稀释、离心和倾析用缓冲液洗涤颗粒。
结果
如图7a)中所示，参考珠在整个珠中均匀地吸附蛋白质。然而，仅在壳区域中具有配体且具有PVP接枝的核的原型珠仅在珠的最外侧7-8微米中吸附蛋白质，珠的最外侧7-8微米对应于壳区域(图7b和8)。小蛋白细胞色素C(12kDa)能够在一定程度上穿透PVP接枝的核，但在洗涤后不会留在那里，显示它仅在壳区域结合。结果还显示，壳区域的厚度可以从共焦显微镜中获得的强度分布精确确定(图8)。
实施例4-通过尺寸排阻色谱评估核和壳区域的蛋白质可接近性
通过尺寸排阻色谱评估原型2D和2I以及未修饰的40微米琼脂糖基础颗粒。将珠装填在色谱柱中，并将不同分子量的葡聚糖溶液施加到柱并洗脱。根据标准方法，如在GelFiltration Principles and Methods第5版，Pharmacia LKB 1991 (ISBN 91-97-0490-2-6), pp 8-11中所述，从保留时间计算不同葡聚糖的Kav值(对于特定分子量的探针分子可接近的孔体积的分数)。获得的Kav对log Mw曲线显示在图3和表5中，并证明通过核接枝显著降低葡聚糖的平均可接近性。
表5. 使用葡聚糖探针的反向尺寸排阻色谱
载体材料 原型2D 原型2I
葡聚糖, Mw K<sub>AV</sub> K<sub>AV</sub> K<sub>AV</sub>
196000 0,38 0,04 0,03
123600 0,50 0,04 0,02
66700 0,62 0,04 0,01
21400 0,80 0,04 0,03
4440 0,95 0,08 0,14
1080 0,99 0,21 0,49
实施例5- 96微米原型的色谱评估
将阳离子交换剂原型装填在柱中，并注入不同的标准蛋白质混合物并以不同的流速洗脱。确定特定蛋白质对之间的峰宽度和分辨率。用β-乳球蛋白测定动态结合能力。
测试蛋白质混合物
混合物1-IgG单克隆抗体和细胞色素C
混合物2-伴清蛋白，多克隆IgG，细胞色素C和溶菌酶
混合物3-IgG单克隆抗体，细胞色素C和溶菌酶
原型
表6. 评估的90-96微米原型
原型 接枝的/偶联的聚合物(mg/ml)
1A PVP/GDMA核 77
1B PVP/GDMA核 97
1C PVP/GDMA核 81
1D PVP/GDMA核 97
1E PVP核 97
1F PVP核 126
Ref (SP FF) 均质 -
方法
将原型以3.0ml/min的最终装填流速在具有10mm内径的Tricorn 10/150柱(GEHealthcare)中装填至8mm的床高度。
在以1ml/min注射200μl样品之前用3体积的50mM乙酸钠pH5.0(A缓冲液)以2ml/min平衡柱。在以1ml/min(在流速变化测试中1-3ml/min)用100%A缓冲液至100%B缓冲液(25mM磷酸钠，pH7.0 + 0.4M NaCl)的15个柱体积梯度洗脱之前，用2体积的A缓冲液以2ml/min进行洗涤。用2体积B缓冲液以1/1-3ml/min(即流速76和76-230cm/h)进一步洗脱柱，并用A缓冲液以2ml/min再平衡。
对于动态能力测定，用100mM柠檬酸盐pH3.0平衡柱，并以2ml/min加载在100mM柠檬酸盐pH3.0中的3.8mg/ml β-乳球蛋白，直到流出物吸光度(A280)达到进料吸光度(A280)的20%。然后以1ml/min用两体积1M NaOH清洗柱，并用100mM柠檬酸盐pH 3.0再平衡。
还以非结合模式用50mM磷酸钠pH 6.8 + 0.4M NaCl中的细胞色素C以1ml/min流速测试柱。测量柱体积(Vc)、细胞色素C洗脱体积(Vt)、峰不对称性(As)、板数(N/m)和板高度(h)。
结果
表7. 细胞色素C，非结合条件
原型 床高度(cm) Vc (ml) Vt (ml) As N/m H (cm)
1A 14.4 11.3 6 1.64 600 0.167
1B 15 11.8 5.82 1.83 476 0.21
1C 15.4 12.1 6.05 1.92 954 0.105
1D 15.6 12.3 5.86 1.77 1501 0.067
1E 15.3 12.0 5.7 1.78 1654 0.06
1F 14.6 11.5 5.33 2.18 1343 0.074
Ref (SP FF) 14.3 11 12.23 1.22 966 0.105
表7中的细胞色素C结果显示PVP/GDMA和PVP核材料的保留体积Vt约为参考物的Vt的一半，显示细胞色素C仅在珠的壳中阻滞。
表8. 用蛋白质混合物1评估
原型 Vt mAb (ml) 峰宽度mAb (ml) Vt cyt C (ml) 峰宽度cyt C (ml) 分辨率
1A 77.5 4.09 107.5 3.15 4.9
1B 80.0 4.2 112.7 3.98 4.7
1C 74.5 3.2 110.8 2.51 7.5
Ref (SP FF) 93 6.8 126 4.99 3.35
表8和图4中的结果显示，与参考物相比，原型在mAb和细胞色素C之间产生显著较窄的峰和增加的分辨率。
表9. 用蛋白质混合物2评估
原型 分辨率conalb/cyt C 分辨率cyt C/lys 峰宽度cyt C(ml) 峰宽度lys(ml) Vt conalb(ml) Vt cyt C(ml) Vt lys(ml)
1A 2.29 2.6 3.8 4.4 78 118.9 136.8
1B 2.28 2.32 5 5.2 79.3 122.7 142.8
1C 2.91 3.84 3.2 4.2 77 122.5 146.6
1D 2.86 3.85 3.25 4.2 78.6 124.4 148.9
1E 3 4.08 3.03 3.67 76.5 121.4 144.6
1F 2.73 3.8 2.84 3.34 75.2 117.5 137.5
Ref (SPFF) 1.6 1.6 5.8 6.6 90.7 137.7 154.5
如表9和图5中所示，与参考物相比，所有PVP/GDMA和PVP原型显示显著降低的峰宽度和增加的分辨率。
表10. 蛋白质混合物3在不同流速下的峰宽度
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表11. 蛋白质混合物3在不同流速下的分辨率值
Figure DEST_PATH_IMAGE004
表10和表11再次显示，原型比参考物产生更窄的峰和更高的分辨率。它们还显示，与参考物相比，原型对在较高流速下的峰变宽和分辨率损失不太敏感。
表12. 具有β-乳球蛋白的10%突破(Qb 10%)的动态能力
原型 Qb 10 %(mg/ml)
1D 38.6
1E 38.6
1F 38.5
Ref (SP FF) 106.8
尽管原型仍具有显著的结合能力，但与参考物相比，它们已经损失约2/3的能力。预计这可以通过改变壳厚度和配体含量来优化。
实施例6- 40微米原型的色谱评估
将原型2G和2J以及参考材料Capto SP ImpRes(基于40微米高度交联的琼脂糖珠的SP阳离子交换剂，具有0.13-0.16mmol/l均质配体含量)装填在Tricorn 10/100柱中至6.5cm的床高度和5.0ml的床体积。装填流速22-38ml/min。
峰宽度通过单一蛋白质注射细胞色素C(4mg/ml，200μl)和溶菌酶(4mg/ml，200μl)，用A缓冲液50mM乙酸钠pH 5.0和B缓冲液25mM磷酸钠pH6.8 + 0.4M NaCl和15个柱体积0-100%B缓冲液线性梯度，在1.0ml/min流速下评估。结果在表13中显示且表明与均质参考物相比，这些原型也降低峰宽度。
表13. 峰宽度40微米原型
原型 峰宽度cyt C (ml) 峰宽度lys (ml)
2G 1.37 1.92
2J 1.18 1.56
Ref (SP ImpRes) 2.26 2.27
以76-306cm/h的流速用β-乳球蛋白测量动态能力(Qb 10%)，且结果在表14中显示。与参考物相比，能力损失为约50%。
表14. 动态能力40微米原型
Figure DEST_PATH_IMAGE006
该书面说明书使用实例来公开本发明，包括最佳模式，且还使本领域技术人员能够实施本发明，包括制造和使用任何设备或系统以及执行任何并入的方法。本发明的可专利范围由权利要求限定，且可包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这些其它实例具有与权利要求的字面语言没有不同的结构要素，或如果它们包括与权利要求的字面语言无实质差别的等效结构要素，则这些其它实例意图在权利要求的范围内。本文中提到的所有专利和专利申请都通过引用整体并入本文，如同它们单独地并入一样。

Claims (45)

1.一种用于纯化生物大分子的分离基质，其包含多个具有核区域(2)和壳区域(3)的颗粒(1)，其中所述壳区域和所述核区域均包含多孔载体材料，并且其中：
a) 所述壳区域对于目标生物大分子可接近；
b) 所述核区域比所述壳区域对于所述目标生物大分子较不易接近；和
c) 所述核区域包含含有至少一种可聚合单体的残基的接枝聚合物。
2.权利要求1的分离基质，其中所述核区域对于所述目标生物大分子不可接近。
3.权利要求1或2的分离基质，其中所述目标生物大分子在所述核区域中的扩散速率为所述目标生物大分子在所述壳区域中的扩散速率的小于10%。
4.权利要求1或2的分离基质，其中所述目标生物大分子是分子量超过5kDa的蛋白质。
5.权利要求1或2的分离基质，其中所述目标生物大分子是分子量超过20kDa的蛋白质。
6.权利要求1或2的分离基质，其中所述目标生物大分子是免疫球蛋白。
7.权利要求1或2的分离基质，其中所述目标生物大分子是IgG。
8.权利要求1或2的分离基质，其中所述壳区域具有1-15微米的平均厚度。
9.权利要求1或2的分离基质，其中所述壳区域具有所述颗粒的直径或球当量直径的0.5至6%的平均厚度。
10.权利要求1或2的分离基质，其中所述核区域具有1至500kDa的球状蛋白质的截止分子量。
11.权利要求1或2的分离基质，其中所述核区域具有60-500kDa的球状蛋白质的截止分子量。
12.权利要求1或2的分离基质，其中所述核区域具有80-200kDa的球状蛋白质的截止分子量。
13.权利要求1或2的分离基质，其中所述核区域具有80-140kDa的球状蛋白质的截止分子量。
14.权利要求1或2的分离基质，其中所述颗粒是球形的。
15.权利要求1或2的分离基质，其中所述颗粒具有10-400微米的体积加权中值直径。
16.权利要求1或2的分离基质，其中所述多孔载体材料包括多糖。
17.权利要求16的分离基质，其中所述多糖包括琼脂糖或琼脂。
18.权利要求16的分离基质，其中所述多糖是交联的。
19.权利要求1或2的分离基质，其中所述包含至少一种可聚合单体的残基的接枝聚合物是乙烯基聚合物。
20.权利要求19的分离基质，其中所述乙烯基聚合物与所述多孔载体材料接枝。
21.权利要求19的分离基质，其中所述乙烯基聚合物经由结构I、II、III、IV或V的接头与所述多孔载体材料接枝：
Sup-O-CH2-CH2-CH2-Pol (I)
Sup-O-CH2-CH(CH3)-Pol (II)
Sup-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2-Pol (III)
Sup-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH(CH3)-Pol (IV)
Sup-O-Pol (V)，
其中Sup表示载体材料且Pol表示乙烯基聚合物。
22.权利要求19的分离基质，其中所述乙烯基聚合物包括乙烯基酰胺单体残基。
23.权利要求19的分离基质，其中所述乙烯基聚合物包含N-乙烯基吡咯烷酮单体残基。
24.权利要求1或2的分离基质，其中所述核区域包含至少50mg/ml所述接枝聚合物。
25.权利要求1或2的分离基质，其中所述壳区域包含能够结合所述目标生物大分子的配体。
26.权利要求25的分离基质，其中所述配体包含带正电荷或带负电荷的基团。
27.权利要求25的分离基质，其中所述配体包括疏水基团。
28.权利要求25的分离基质，其中所述壳区域包含多峰配体。
29.权利要求28的分离基质，其中所述壳区域包含选自N-苄基-N-甲基乙醇胺、N-苯甲酰基高半胱氨酸、4-巯基乙基吡啶、对氨基苯甲酰氨基乙酸、色氨酸和苯丙氨酸的配体。
30.权利要求25的分离基质，其中所述配体包含亲和基团。
31.权利要求25的分离基质，其中所述壳区域包含10-20000μmol/ml配体。
32.一种制造根据权利要求1-31中任一项的分离基质的方法，包括以下步骤：
a) 提供包含具有接枝位点的多孔载体材料的多个颗粒；
b) 灭活壳区域中的所述接枝位点；
c) 将所述颗粒在包含可聚合单体的组合物中孵育；和
d) 引发所述可聚合单体的聚合。
33.权利要求32的方法，还包括在步骤a)之前，在多孔载体材料上引入接枝位点的步骤a')。
34.权利要求32或33的方法，其中所述可聚合单体是乙烯基单体。
35.权利要求32或33的方法，还包括使所述颗粒与配体前体试剂反应以将配体偶联到所述壳区域的步骤f)。
36.权利要求32或33的方法，其中所述多孔载体材料包含碳结合的羟基，且其中所述方法包括：
在步骤a)之前，使所述颗粒与烯丙基化试剂反应以获得至少50μmol/ml的共价连接到颗粒的烯丙基；和
在步骤b)中使所述颗粒与卤素反应至多30分钟的时间，且然后与碱性水溶液反应。
37.权利要求34的方法，其中所述乙烯基单体是乙烯基酰胺。
38.权利要求37的方法，其中所述乙烯基酰胺是N-乙烯基吡咯烷酮。
39.一种分离目标生物大分子的方法，包括以下步骤：
a) 提供包含所述目标生物大分子的样品；
b) 将所述样品输送通过装填有权利要求1-31中任一项的分离基质的柱；和
c) 将洗脱液输送通过所述柱并回收洗出液中的所述目标生物大分子。
40.权利要求39的方法，还包括在步骤c)之前，将洗涤液输送通过所述柱。
41.权利要求39的方法，其中步骤b)和/或d)中通过所述柱的流速为至少70cm/h。
42.权利要求39-41中任一项的方法用于改善目标生物大分子和至少一种污染物之间的分辨率的用途。
43.权利要求42的用途，用于在高于70cm/h的流速下改善所述分辨率。
44.权利要求1-31中任一项的分离基质用于改善目标生物大分子和至少一种污染物之间的分辨率的用途。
45.权利要求44的用途，包括权利要求32-41中任一项的方法。
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