CN115135392A - 制备聚合物填充的色谱树脂的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了制备聚合物填充的色谱树脂的方法及其用途。

Description

制备聚合物填充的色谱树脂的方法
背景技术
从较小的杂质中纯化病毒、与大颗粒结合的蛋白质和其他生物大分子，目前涉及使用多种分离方法，包括但不限于尺寸排阻色谱(SEC)、离子交换色谱(IEX)、疏水相互作用色谱(HIC)和/或离心。SEC要求装满昂贵的尺寸排阻树脂的大型色谱柱、低流速和有限的上样量。IEX和HIC的选择性有限。离心只能应用于大生物分子，其与悬浮生物分子的介质相比相对致密。
发明内容
提供了制备包含不溶性多孔聚合物的色谱树脂的方法。在一些实施方式中，该方法包括将色谱树脂添加到包含熔融的聚合物的溶液中，同时搅拌，以允许熔融的聚合物吸收或以其它方式进入色谱树脂的孔。然后，雾化该溶液，并在水浴中收集不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂珠。然后，从不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂珠中除去多余的聚合物，通过，例如，使不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂珠通过具有约50μm至约200μm开口的筛和/或洗涤不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂珠。在一些实施方式中，熔融的聚合物溶液的温度为约100℃。在一些实施方式中，聚合物是琼脂糖，且琼脂糖的浓度范围为约0.5％至约8％。在某些实施方式中，色谱树脂是大孔树脂。在一些实施方式中，色谱树脂是羟基磷灰石微球。在一些实施方式中，大孔树脂包含丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯或二氧化硅。在一些实施方式中，大孔树脂包括3-烯丙氧基-1，2-丙二醇和乙烯基吡咯烷酮用N，N’-亚甲基双丙烯酰胺交联的共聚物。在一些实施方式中，大孔树脂包含甲基丙烯酸缩水甘油酯和二甲基丙烯酸二甘醇酯。在某些实施方式中，雾化该溶液包括用空气流(例如，约20℃至约90℃，速度为约15L/分钟至约25L/分钟)包围从喷嘴喷出的溶液。在一些实施方式中，水浴的温度为约4℃至约40℃。
还提供了使用聚合物填充的色谱树脂进行色谱的方法。在一些实施方式中，该方法包括在使得目标不被色谱树脂捕获的条件下，使包含目标分子的样品与不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂接触，并从不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂收集目标分子。在一些实施方式中，样品包含由色谱树脂捕获的污染物。在一些实施方式中，目标分子是蛋白质-纳米颗粒偶联物，且所述污染物是游离(未偶联的)蛋白质。在一些实施方式中，样品包含蛋白质-纳米颗粒偶联物、游离蛋白质和缓冲液。某些实施方式中，目标是病毒。在一些实施方式中，样品进一步包含表面活性剂(例如，聚亚烷基二醇或Pluronic F-68)。在某些实施方式中，收集步骤包括从所述不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂收集富含所述目标分子的一个或多个级分。在一些实施方式中，收集步骤包括对所述不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂施加离心力或真空，并从所述不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂收集富含所述目标分子的一个或多个级分。在一些实施方式中，蛋白质是抗体。在一些实施方式中，蛋白质是IgG抗体。在某些实施方式中，蛋白质-纳米颗粒偶联物是蛋白质-聚合物点偶联物。在一些实施方式中，样品进一步包括游离的纳米颗粒，所述不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂将所述游离的纳米颗粒与所述偶联物分离。
附图简要说明
图1A显示琼脂糖填充的羟基磷灰石微球的图像。
图1B显示了在使用pH＝3.5的HAc-NaAc缓冲液分散羟基磷灰石后，染色的琼脂糖-羟基磷灰石微球的图像。
图2显示了琼脂糖填充的UNOsphere的图像。
具体实施方式
本发明人已经发现了一种制备具有多模式特性(即，尺寸排阻模式和捕获模式)的不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂的新方法。本发明人还发现可以将不溶性多孔聚合物引入树脂中而不会显著影响树脂选择性或结合能力。可规模化的方法不使用有机溶剂，因此是环境友好的。该方法产生分开的聚合物填充的色谱树脂珠，而没有聚合物中的珠簇(cluster of the bead)。
定义
术语″羟基磷灰石″指的是结构式为Ca10(PO4)6(OH)2的不溶性磷酸钙羟基化矿物。羟基磷灰石色谱树脂被认为是多模式树脂，因为它与生物分子具有多种相互作用模式。其主要相互作用模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和作用。羟基磷灰石是市售可得的，以多种形式，包括但不限于，羟基磷灰石微球，其为羟基磷灰石的化学纯形式，已在高温下烧结，以将其从结晶形式改性为陶瓷形式。羟基磷灰石微球是球形的，粒径范围为约10微米至约100微米，通常可以是20微米、40微米和80微米的标称直径。羟基磷灰石微球(或HAM)是大孔的，有三种类型：I型，具有中等孔隙率和相对较高的结合能力，II型，具有更大的孔隙率和较低的结合能力，以及XT型，具有中等孔隙率、相对较高的结合能力和出色的压力流动特性。本段中的所有磷灰石基树脂均可从生物辐射实验室股份有限公司(Bio-RadLaboratories，Inc.)(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules))获得。
术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段形式。该术语包括但不限于：源自人或其它哺乳动物细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类的多克隆或单克隆抗体，包括天然形式或遗传修饰形式，如人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移接和体外生成的抗体。“抗体”包括复合形式，包括但不限于具有免疫球蛋白部分的融合蛋白。“抗体”还包括抗体片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc和其他组合，无论它们是否保留抗原结合功能。
术语“蛋白质”可用于表示氨基酸聚合物或一组两个或更多个相互作用或结合的氨基酸聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物，包含修饰残基的那些，和非天然产生的氨基酸聚合物。
术语“样品”是指含有需要被纯化的目标分子的任何组合物。在一些实施方式中，待纯化的目标分子是蛋白质-纳米颗粒偶联物(例如，抗体-纳米颗粒偶联物)或病毒。
术语“污染物”是指要从样品去除的任何杂质。在一些实施方式中，样品是抗体-纳米颗粒偶联物和未反应组分的偶联反应混合物，污染物是未偶联的(未反应或游离的)抗体(和任选地未偶联的纳米颗粒)。
如本文所用，术语“一个”、“一种”和“该”旨在表示“一个或多个”。如本文中所用，术语“约”是指所列的数字以及所列数字10％范围内的任何值。因此，“约5”是指在4.5-5.5之间的任何值，包括4.5和5.5。
制备聚合物填充的色谱树脂的方法
在一些实施方式中，制备聚合物填充的色谱树脂的方法包括将色谱树脂添加到包含熔融的聚合物的溶液中，同时搅拌，以允许熔融的聚合物吸收或以其它方式进入色谱树脂的孔。在实施方式中，聚合物分散在加热到聚合物熔融点以上的温度的水中。在一个实施方式中，聚合物是不溶的，使得色谱的水性条件在色谱过程中不会从色谱树脂去除聚合物。在实施方式中，聚合物是足够多孔的，使得填充色谱树脂不会阻止大分子(例如蛋白质、核酸等)与色谱树脂内的位点相互作用，从而基本上保持色谱树脂的选择性和结合能力。色谱树脂是多孔的，并且允许目标分子至少部分地通过树脂中的孔与色谱树脂相互作用。因此，聚合物不应显著干扰这种相互作用。
多种聚合物可以用于填充色谱树脂。在一些实施方式中，聚合物是琼脂糖。通过加热琼脂糖以熔融琼脂糖并将熔融的琼脂糖溶液与色谱树脂混合，可以将琼脂糖(例如，0.5-8％)引入色谱树脂中。在一些实施方式中，琼脂糖溶液被加热到约100℃。在某些实施方式中，琼脂糖溶液被加热，约60℃至约100℃。
然后，通过下述方式雾化熔融的聚合物/色谱树脂溶液：使溶液流过喷嘴并用空气流包围从喷嘴喷出的溶液，以形成其中聚合物被覆在珠的外表面且在珠的孔内的色谱树脂珠和粘性聚合物液滴。在一些实施方式中，喷嘴是二元喷嘴，例如，其中合并的热空气和悬浮液流到喷嘴开口。在一些实施方式中，空气流的温度为约20℃至约90℃。在某些实施方式中，空气流的速度为约15L/分钟至约25L/分钟(例如，约20L/分钟)。为了防止树脂珠和聚合物液滴的重组，在雾化后立即在水浴中收集树脂珠和聚合物液滴。聚合物液滴和纳入在树脂孔内和树脂表面上的聚合物固化。聚合物填充的树脂珠被收集在水浴底部，而多余的聚合物(即固体聚合物液滴)仍然悬浮在水中。将多余聚合物从不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂珠去除，例如，通过使悬浮在水中的珠通过具有约50μm至约200μm范围的开口的筛。在一些实施方式中，120μm和65μm的筛用于去除多余的聚合物。作为一种选择，通过洗涤聚合物填充的树脂珠来去除多余的聚合物。在一些实施方式中，通过倾析悬浮液去除多余聚合物。在一些实施方式中，喷嘴直径为1-3mm直径，例如2mm直径。在一些实施方式中，水浴的温度为约4℃至约40℃。
在一些实施方式中，加热的琼脂糖溶液中的琼脂糖浓度(例如，大于约0.5％、1％、2％、3％或4％琼脂糖)足以填充色谱树脂的孔并被覆色谱树脂的外侧。珠内的琼脂糖溶液在低于约40℃的温度下形成不溶性凝胶。
在一些实施方式中，琼脂糖不会被交联。例如，如实施例中所述，可以将琼脂糖以非交联形式引入色谱树脂中。然而，在一些实施方式中，琼脂糖已填充色谱树脂之后，引入交联剂(例如，化学交联剂，包括但不限于，二乙烯基砜、表氯醇、丁二醇二缩水甘油醚、1，3-二氯丙醇、2，3-二溴丙醇2，3)。因此，在一些实施方式中，色谱树脂内的琼脂糖将被交联。
通常，琼脂糖不会被官能化。因此，在一些实施方式中，琼脂糖不会被修饰以在色谱期间与样品的组分相互作用，从而提供与不含聚合物的色谱树脂基本相同的选择性。
适用于色谱的多种大孔树脂可用于本文所述的方法中。在一些实施方式中，色谱树脂是陶瓷羟基磷灰石。在一些实施方式中，可以使用I型或II型陶瓷羟基磷灰石(即，可以使用任一孔隙率)。在一些实施方式中，用例如离子交换官能团、疏水相互作用官能团、混合模式官能团或亲和配体官能化树脂。任何特定蛋白质分离或纯化的最佳孔隙率将随蛋白质或源混合物(source mixture)的组成而变化。在某些实施方式中，色谱树脂是包含丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯或二氧化硅的大孔树脂。在一个实施方式中，大孔树脂包括3-烯丙氧基-1，2-丙二醇和乙烯基吡咯烷酮用N，N’-亚甲基双丙烯酰胺交联的共聚物。在另一个实施方式中，大孔树脂包含甲基丙烯酸缩水甘油酯和二甲基丙烯酸二甘醇酯。这种大孔树脂的例子包括但不限于：UNOsphere Q、UNOsphere S、UNOsphere Rapid S、Macro-PrepHigh Q、Macro-Prep DEAE、Macro-Prep 25 Q、Macro-Prep CM、Macro-Prep 25 S、Nuvia S和Nuvia Q(全部来自生物辐射实验室股份有限公司(Bio-Rad))。.大孔树脂的其他例子包括但不限于：东曹生命科学公司(Tosoh Bioscience)的Toyopearl SP、CM Q、DEAE、DGigaCap S、CM、Q，来自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)的Poros HS、XS、HQ、XQ。来自密理博公司(Millipore)的Eshmuno S、Q、CPX、CPS、HCX，和来自GE医疗公司(GE healthcare)的Sepharose Q、Sepharose S、Capto Q、Capto S、Capto MMC、CaptoAdhere。
聚合物填充的树脂可以填充床的形式用作色谱固相，并且可以构成整个填充床或填充床的主要部分，例如，填充床的50％或更多体积。填充床可以保留于任何构造的容器中，在树脂中进行的纯化以及清洁和再生都可以作为间歇过程(batch process)、连续过程或混合间歇/连续过程进行。在一个实施方式中，容器是相对于宽度具有合适长度的柱，并且合适的过程包括连续过程，例如流穿柱的连续流动。
色谱树脂(例如色谱珠)可以具有尺寸排阻模式和捕获模式。尺寸排阻模式根据分子、复合物或颗粒的大小或分子量分离它们。所述珠具有的孔尺寸使得超过尺寸阈值的分子、复合物或颗粒被排除进入孔，并且被收集在空隙体积、排除体积或色谱柱流穿物中。较小的蛋白质和其他分子可以进入珠的孔并被珠捕获。如本文所用，珠的分子量截留尺寸是指能够进入孔的蛋白质或分子的最大尺寸。随着填充羟基磷灰石微球的孔的琼脂糖百分比增加，孔变得更小，导致分子量截留尺寸降低。因此，4％琼脂糖填充的珠的分子量截留值将小于0.5％琼脂糖填充的珠的分子量截留值。
使用聚合物填充的色谱树脂的方法
如本文所述的聚合物填充的色谱树脂可用于色谱方法中。在一个实施方式中，该方法包括在使得目标不被珠捕获的条件下，使包含目标分子的样品与聚合物填充的色谱树脂(例如，多个琼脂糖填充的羟基磷灰石微球)接触。在一个实施方式中，样品包含由聚合物填充的色谱树脂捕获的污染物。
在将样品应用于聚合物填充的色谱树脂之前，树脂通常在用于加载样品的缓冲液或盐中平衡。通常，使用与标准色谱法相同的条件和试剂。例如，对于基于陶瓷羟基磷灰石的色谱，可以使用多种缓冲剂或盐中的任何一种，包括具有阳离子如钠、钾、铵、镁和钙，以及阴离子如氯、氟、乙酸、磷酸和柠檬酸的那些。平衡溶液的pH通常为约6.0或更高，在许多情况下，pH在约6.5至约8.6或约6.5至约7.8的范围内。在一些实施方式中，平衡可以在包含Tris或磷酸钠缓冲液的溶液中发生。磷酸钠缓冲液可以，例如，以约0.5mM至约50mM，或约10mM至约35mM的浓度存在。
如上所述，本文所述的色谱步骤可以在常规纯化配置中进行，包括但不限于填充柱和流化床或膨胀床柱，并且可以通过任何常规色谱方法进行，包括加载、洗涤和洗脱的间歇模式，以及连续或流穿模式。在一些实施方式中，介质被填充在直径从小于0.5厘米到大于1米，柱高从小于1厘米到大于30厘米的柱中。在一个实施方式中，树脂在离心柱中提供。样品被应用于离心柱的顶部，随后通过离心或真空迫使样品通过柱。在一些情况下，树脂在色谱柱中提供，样品被应用于柱的顶部，通过重力迫使样品通过柱。柱可以在有压或无压的情况下从上到下或从下到上运行，并且在此过程中可以反转柱内流体的流动方向。在一些情况下，在保持填充床的填充构造的同时使液体反向流动可能是有利的。
本文所述的方法可用于纯化多种类型的目标分子，包括病毒、天然存在的蛋白质和重组蛋白质。在一些实施方式中，目标分子被偶联或附接至报告物(reporter)，例如，纳米颗粒。在一些实施方式中，目标分子是偶联至纳米颗粒的抗体(例如IgG)。纳米颗粒是纳米级尺寸的颗粒，例如从约1nm至约1000nm。在一些实施方式中，颗粒在1-300nm、5-500nm或10-50nm之间。许多纳米颗粒的形状大致为球形，这使得尺寸是球形颗粒的半径或直径。流体动力学半径或直径也可用于定义纳米颗粒尺寸。
在一些实施方式中，纳米颗粒是荧光半导体聚合物点(pdot)。这种点的例子描述于，例如，Wu，C.，等，Chem.Mater.21：3816-3822(2009)；Rahim，N.A.A.，等，Adv.Mater.21：3492-3496(2009)，Rong等，ACS Nano 7(1)：376-84(2013)；专利公开US 2013/0266957；WO2012/054525；和US 2012/0282632。发色pdot可以通过将聚合物塌缩成稳定的亚微米尺寸的颗粒来产生。本文提供的pdot纳米颗粒可以通过本领域已知的用于使聚合物塌缩的任何方法形成，包括但不限于依赖于沉淀的方法、依赖于乳液(例如微乳液或微乳液)的形成的方法和依赖于缩合的方法。pdot纳米颗粒大小取决于用于生成pdot的聚合物的分子量(参见，例如，Zhang，Y.，等，Chem Sci.6(3)：2102-2109(2015)和美国专利9382473)。在一些实施方式中，各个pdot的分子量范围为约500,000道尔顿至约15,000,000道尔顿，或约1,800,000道尔顿至约7,000,000道尔顿。
其他可用在本文所述的方法中的示例性纳米颗粒，包括但不限于磁性纳米颗粒、量子点和金纳米颗粒。磁性纳米颗粒是一类可以使用磁场梯度进行操作的纳米颗粒。磁性纳米颗粒由磁性或顺磁性元素形成，包括但不限于铁、镍和钴及其化合物。量子点是由无机半导体材料形成的纳米颗粒。金纳米颗粒(例如胶体金)具有有利于生物医学应用的光学特性，并描述于，例如，Huang，X.，等，Journal of Advanced Research 1(1)：13-28(2010)。
可以根据需要对纳米颗粒进行官能化以将纳米颗粒连接至蛋白质。纳米颗粒的示例性官能化描述于前述美国专利公开号2012/0282632中。例如，纳米颗粒可以被官能化以呈现一个或多个羧酸部分，其进而可用于将一个或多个接头连接至蛋白质。偶联物组分(例如蛋白质和纳米颗粒)可以共价或非共价地连接。非共价连接的一个例子是生物素-链霉亲和素亲和连接，其中偶联物的一个成员被生物素化，而偶联物的另一个成员连接至链霉亲和素。连接选择的其他例子包括但不限于，纳米颗粒与蛋白质胺的直接偶联；用马来酰亚胺修饰纳米颗粒并随后连接到具有暴露的巯基的蛋白质上(例如，通过用巯基乙胺或2-亚氨基硫烷(2-iminothiolane)(塔氏试剂(Traut’s reagent))处理蛋白质)；用肼修饰纳米颗粒并连接到有氧化聚糖(醛)的蛋白质；或使用点击化学(例如，用张力炔烃(strainedalkyne)修饰纳米颗粒并连接到用叠氮化物修饰的蛋白质)。
任何类型的偶联方法都可用于将蛋白质偶联至纳米颗粒。通常，为了产生所需产量的偶联物，在偶联反应中提供过量的蛋白质。这会在偶联反应后产生大量的游离(未偶联)蛋白质。在一些实施方式中，反应混合物中还存在一定量的游离未偶联纳米颗粒。本文所述的方法可用于从偶联反应的游离未偶联成员中纯化偶联物。在一些实施方式中，应用试剂，所述试剂将与剩余的反应基团反应并防止进一步反应。例如，马来酰亚胺官能化的纳米颗粒与硫醇化或还原的蛋白质之间的偶联将用包括但不限于N-乙基马来酰亚胺的烷基化试剂停止或淬灭。附加NHS的纳米颗粒和蛋白质之间的反应将被胺(包括但不限于乙醇胺)停止或淬灭。
一旦进行了偶联，调节所得偶联物混合物(例如，纳米颗粒/蛋白质偶联物、未反应的游离蛋白质和任选的游离纳米颗粒)以建立适当的pH、电导率和/或盐浓度。可以通过例如用色谱树脂平衡缓冲液交换偶联物缓冲液来对偶联混合物(即要纯化的样品)进行调整。示例性缓冲化合物包括但不限于磷酸盐、HEPES、MES和Tris。在一些实施方式中，平衡缓冲液包含约10mM至约30mM(例如，10mM、20mM或30mM)的量的HEPES。在一些实施方式中，平衡缓冲液包含约5mM至约50mM(例如，5mM、10mM、25mM)的量的磷酸盐(PO4 3-)。在某些实施方式中，平衡缓冲液的pH范围为约5至约8(例如，约6、约7或约8)。在一些实施方式中，平衡缓冲液包含至少10至100mM Na+或K+(例如，在10-150mM、20-200mM或100-300mM之间)。在某些实施方式中，平衡缓冲液是20mM HEPES-KOH(pH 7.3)。在一些实施方式中，平衡缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS＝10mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH 7.8)。
混合物中也可包含一种或多种表面活性剂。可以包含足量的表面活性剂以稳定偶联物以防止混合物中偶联物的聚集和沉淀，尤其是在引入高离子强度缓冲液时，否则可能导致偶联物的聚集或沉淀。在一些实施方式中，所述表面活性剂是非离子型聚亚烷基二醇表面活性剂，例如聚乙二醇。在一些实施方式中，所述表面活性剂是包含聚氧丙烯的表面活性剂，例如泊洛沙姆表面活性剂。泊洛沙姆表面活性剂的特征在于聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中央疏水链侧接聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两条亲水链。因为聚合物嵌段的长度可以定制，所以存在许多不同的泊洛沙姆，它们的特性略有不同。泊洛沙姆共聚物通常以字母″P″(代表泊洛沙姆)后跟三位数字命名，前两位数字x 100给出了聚氧丙烯核心的大致分子量，最后一个数字x 10给出了聚氧乙烯含量的百分比(例如，P407＝聚氧丙烯分子量为4,000g/mol和70％聚氧乙烯含量的泊洛沙姆。对于Pluronic和Synperonic泊洛沙姆商品名，这些共聚物的编码以一个字母开头，以定义其在室温下的物理形式(L＝液体，P＝糊剂，F＝片状(固体))，后跟两位或三位数字。数字名称中的第一个数字(三位数字中的两位数)乘以300表示疏水链的大致分子量；最后一位数字x 10给出了聚氧乙烯含量的百分比(例如，F-68表示聚氧丙烯的分子量为1,800g/mol和80％的聚氧乙烯含量)。示例性泊洛沙姆表面活性剂包括但不限于Pluronic F-68。所用表面活性剂的浓度可以根据经验确定(即滴定以使偶联物不发生沉淀)。在一些实施方式中，表面活性剂的浓度为0.02％-1％，例如，0.05-0.2％，例如，0.1％。
在将样品(例如，偶联物混合物)与聚合物填充的色谱树脂接触之前，可以平衡树脂以建立合适的pH、电导率和/或盐浓度。
在将样品与聚合物填充的色谱树脂接触后，目标分子(例如，蛋白质-纳米颗粒偶联物)从聚合物填充的树脂孔中排除，并收集在树脂的流穿物中。污染物，例如游离抗体(和任选地未偶联的纳米颗粒)被珠孔中的树脂基团捕获。
可以根据需要监测树脂的输出中是否存在目标分子或样品的其他组分，以确定含有目标分子的级分，并且与原始样品相比，这些级分没有污染物，或至少污染物的数量减少。在一些实施方式中，样品中至少90％、95％、99％的污染物在所得纯化的目标分子级分中被去除。用于测量输出的示例性方法包括监测目标分子的特征吸收波长。术语“级分”用于指色谱输出的部分，并不旨在限制输出的收集方式或输出是部分收集还是连续收集。
实施例
实施例1-3％琼脂糖填充的羟基磷灰石微球(HAM)的制备和表征
琼脂糖填充的HAM的制备：
通过将4.0g琼脂糖(Hispanagar D5高凝胶强度)分散在100℃的140mL水中制成3％琼脂糖溶液。将210克干燥的HAM(Bio-RadXT型)和700mL加热的熔融琼脂糖溶液在700ml烧瓶中混合，然后搅拌60分钟以在HAM的孔内形成不溶性凝胶。然后，通过使加热的溶液流过内径2mm的被约25℃的速度为约20L/分钟空气流包围的喷嘴，雾化加热的溶液。然后，所得颗粒被收集在约20℃-30℃的水浴中。然后用120μm和65μm筛筛选颗粒，以去除多余的琼脂糖薄片。然后将筛选的琼脂糖填充的HAM悬浮在水中以去除多余的琼脂糖。参考图1A(用光学显微镜的珠图像)，所得的琼脂糖填充的HAM包含孔中有琼脂糖的单独的HAM，而琼脂糖中没有HAM簇。为了证明琼脂糖存在于HAM的孔隙中，琼脂糖填充的HAM用pH＝3.5的乙酸缓冲液处理以分散羟基磷灰石，然后染色。参见图1B为通过光学显微镜获得的珠的图像。
琼脂糖填充的HAM的表征：
甲状腺球蛋白静态结合能力测定
将整个最终树脂产品重悬在水中。将一些浆料转移到离心柱中，直到树脂的床高达到柱的0.5ml标记线(用注射器从柱底部吸取液体，轻敲柱的侧面直到介质沉降)。树脂在真空下干燥20秒。然后加入1ml超纯水，与树脂充分混合，并将0.3ml浆料转移到新柱中。在真空下用5ml 10mM MES(pH 6.5)在新柱中洗涤树脂。树脂在真空下干燥20秒。将半干树脂转移到2-ml Eppendorf管中。向试管中加入1ml甲状腺球蛋白样品。将试管置于转子混合器上并旋转60分钟。然后试管以3000rpm离心4分钟。在分光光度计中在280nm处测量上清和甲状腺球蛋白样品各自的UV吸光度。使用以下等式计算静态结合能力(SBC)：
SBC(mg/mL)＝(使用的蛋白质总mg-未结合蛋白质mg)/树脂体积(mL)
UV吸光度用于确定蛋白质浓度，蛋白质的分子量用于确定蛋白质mg。
SBC结果见表1。
γ-球蛋白静态结合能力测定
将整个最终树脂产品重悬在水中。将一些浆料转移到离心柱中，直到树脂的床高达到柱的0.5ml标记线(用注射器从柱底部吸取液体，轻敲柱的侧面直到介质沉降)。树脂在真空下干燥20秒。然后加入1ml超纯水，与树脂充分混合，并将0.3ml浆料转移到新柱中。在真空下用5mL 20mM Tris-HCl，150mM NaCl(pH 7.5)在新柱中洗涤树脂。树脂在真空下干燥20秒。将半干树脂转移到2-ml Eppendorf管中。向试管中加入1mlγ-球蛋白样品。将试管置于旋转混合器上并旋转60分钟。试管以3000rpm离心4分钟。在分光光度计中在280nm处测量上清和γ-球蛋白样品各自的UV吸光度。静态结合能力(SBC)结果见表1。
表1
Figure BDA0003804447680000111
参见表1，对于琼脂糖填充的树脂，琼脂糖阻止蛋白质进入微球的孔以结合至内表面。因此，与相应的对照样品相比，SBC降低。蛋白质尺寸越大，SBC减少的越多。甲状腺球蛋白和γ-球蛋白的分子量分别为660kDa和150kDa。因此，对于琼脂糖填充的树脂，较大的甲状腺球蛋白的SBC比γ-球蛋白的降低更多。γ-球蛋白的SBC有一些降低，表明较小尺寸蛋白质的γ-球蛋白可以进入孔以结合至树脂。
实施例2：琼脂糖填充的HAM与HAM的色谱特性比较
本实施例的目的是确定HAM的色谱特性是否通过用琼脂糖填充HAM的孔而改变。将IgG-pdot偶联物(其具有约25nm的直径)应用于各树脂以确定偶联物是否与各树脂结合或排除在空隙体积中。未偶联的pdot也应用于3％琼脂糖填充的HAM，以确定琼脂糖填充的孔是否允许未偶联的pdot进入琼脂糖填充的HAM的孔并被琼脂糖填充的HAM捕获。
色谱特性比较
四个一次性柱(Bio-Rad Micro Bio-SpinTM色谱柱；在重力模式下使用)用0.5mL树脂填充，如表1中所述。柱用(具有0.1％pluronic F68(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher)的)1-2mL HEPES缓冲液(pH 7.3)平衡。将500μL纯化的山羊抗兔IgG-pdot偶联物样品或未偶联pdot样品(HEPES缓冲液中)应用于各柱。制备偶联物，通过用马来酰亚胺修饰pdot，然后通过巯基(通过用塔氏试剂处理抗体产生)将pdot连接到IgG。pdot在470纳米处吸收并具有红棕色；因此，偶联物具有红棕色。
应用样品后，用2mL HEPES缓冲液清洗柱。样品与树脂的结合是目测确定的，即柱顶部的红色或分散在整个树脂中的红色表明样品结合至树脂。如果柱保持白色，则样品未结合至树脂(例如，样品未结合)。结果总结在表2中。
表2
Figure BDA0003804447680000121
表2中的结果表明IgG-pdot偶联物结合至HAM，但不结合至3％琼脂糖填充的HAM。因此，用3％琼脂糖填充孔并被覆HAM表面会阻止大偶联物结合至HAM，同时允许较小的未偶联pdot进入孔并结合到HAM孔内的表面。
实施例3-3％琼脂糖填充的UNOsphere Q的制备和表征
琼脂糖-UNOsphere Q的制备
在250ml烧瓶中，通过将3.0g琼脂糖(Hispanagar D5高凝胶强度)分散在100℃的100mL水中制成3％琼脂糖溶液。将15mL UNOsphere(生物辐射实验室股份有限公司UNOsphereTM Q强阴离子交换介质)混合到250ml烧瓶中，然后搅拌60分钟以在介质孔内形成不溶性凝胶。然后，通过使加热的溶液流过内径2mm的被约25℃的速度为约20L/分钟的空气流包围的喷嘴，雾化加热的溶液。然后，所得颗粒被收集在约20℃-30℃的水浴中。然后用120μm的筛筛选颗粒，以去除多余的琼脂糖薄片。然后将筛选的琼脂糖填充的UNOsphere悬浮在水中以去除多余的琼脂糖。所得的琼脂糖填充的UNOsphere包含孔中具有琼脂糖的分开的UNOsphere珠，且在琼脂糖中没有UNOsphere珠簇(参见图2中的通过光学显微镜获得的填充琼脂糖的UNOsphere珠的图像)。
琼脂糖-UNOsphere Q的表征
甲状腺球蛋白静态结合能力测定
将整个最终树脂产品重悬在水中。将一些浆料转移到离心柱中，直到树脂的床高达到柱的0.5ml标记线(用注射器从柱底部吸取液体，轻敲柱的侧面直到介质沉降)。树脂在真空下干燥20秒。然后加入1ml超纯水，与树脂充分混合，并将0.3ml浆料转移到新柱中。在真空下用5ml20mM Bis-Tris，50mM NaCl(pH 7.0)在新柱中洗涤树脂。树脂在真空下干燥20秒。将半干树脂转移到2-ml Eppendorf管中，然后向试管中加入1ml甲状腺球蛋白样品。将试管置于转子混合器上并旋转30分钟。试管以3000rpm离心4分钟。在分光光度计中在280nm处测量上清和甲状腺球蛋白样品各自的UV吸光度。静态结合能力(SBC)结果见表2。
γ-球蛋白静态结合能力测定
将整个最终树脂产品重悬在水中。将一些浆料转移到离心柱中，直到树脂的床高达到柱的0.5ml标记线(用注射器从柱底部吸取液体，轻敲柱的侧面直到介质沉降)。树脂在真空下干燥20秒。然后加入1ml超纯水，与树脂充分混合，并将0.3ml浆料转移到新柱中。在真空下用5mL 20mM Tris-HCl(pH 9.5)在新柱中洗涤树脂。树脂在真空下干燥20秒。将半干树脂转移到2-ml Eppendorf管中。向试管中加入1ml γ-球蛋白样品。将试管置于旋转混合器上并旋转30分钟。试管以3000rpm离心4分钟。在分光光度计中在280nm处测量上清和γ-球蛋白样品各自的UV吸光度。如前所述计算SBC。SBC结果见表3。
表3
Figure BDA0003804447680000141
表3中琼脂糖填充的UNOsphere Q的结果显示，与γ-球蛋白相比，较大的甲状腺球蛋白的SBC下降更多。这表明较大的蛋白质被阻止以无法进入琼脂糖填充的树脂的孔以结合至内表面。
实施例4：琼脂糖填充的UNOsphere Q与UNOsphere Q的色谱特性比较
本实施例的目的是确定UNOsphere Q的色谱特性是否被通过琼脂糖填充UNOsphere Q的孔而改变。将IgG-pdot偶联物(其具有约25nm的直径)应用于各树脂以确定偶联物是否与各树脂结合或排除在空隙体积中。未偶联的pdot也应用于3％琼脂糖填充的UNOsphere Q，以确定琼脂糖填充的孔是否允许未偶联的pdot进入琼脂糖填充的UNOsphereQ的孔并被琼脂糖填充的UNOsphere Q捕获。
色谱性能比较
四个一次性柱(Bio-Rad Micro Bio-SpinTM色谱柱；在重力模式下使用)用0.25mL树脂填充，如表1中所述。用1-2mL 20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)平衡色谱柱。将500μL纯化的山羊抗兔IgG-pdot偶联物样品或未偶联pdot样品(20mM Tris-HCl缓冲液中)应用于各柱。制备偶联物，通过用马来酰亚胺修饰pdot，然后通过巯基(通过用塔氏试剂处理抗体产生)将pdot连接到IgG。pdot在470纳米处吸收并具有红棕色；因此，偶联物具有红棕色。
应用样品后，用1mL Tris-HCl缓冲液清洗柱。样品与树脂的结合是目测确定的，即柱顶部的红色或分散在整个树脂中的红色表明样品结合至树脂。如果柱保持白色，则样品未结合至树脂(例如，样品未结合)。结果总结在表4中。
表4
Figure BDA0003804447680000151
表4中的结果表明IgG-pdot偶联物和Pdot结合至UNOsphere Q，但不结合至3％琼脂糖填充的UNOsphere Q。因此，用3％的琼脂糖填充UNOsphere Q的孔并被覆其表面会阻止偶联-Pdot和Pdot结合至UNOsphere Q。
应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

Claims (30)

1.一种制备聚合物填充的色谱树脂的方法，所述方法包括：
将色谱树脂添加到包含熔融的聚合物的溶液中，同时搅拌，以允许加热的聚合物吸收或以其它方式进入色谱树脂的孔；
雾化所述溶液，并在水浴中收集不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂珠；和
从所述不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂珠去除多余的聚合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述去除步骤包括将所述不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂珠通过一个或多个具有约50μm至约200μm的开口的筛。
3.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括清洗所述不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂珠。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述聚合物是琼脂糖且所述琼脂糖浓度为约0.5％至约8％。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述色谱树脂是大孔树脂。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述大孔树脂是羟基磷灰石微球。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述大孔树脂包含丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯或二氧化硅。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述大孔树脂包含3-烯丙氧基-1，2-丙二醇和乙烯基吡咯烷酮用N，N’-亚甲基双丙烯酰胺交联的共聚物。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述大孔树脂包含甲基丙烯酸缩水甘油酯和二甲基丙烯酸二甘醇酯。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述熔融的聚合物处于至少约100℃。
11.如权利要求1所述的方法，其中雾化所述溶液包括用空气流包围从喷嘴喷出的所述溶液。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述空气流的温度为约20℃至约90℃。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述空气流的速度为约15L/分钟至约25L/分钟。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述水浴的温度为约4℃至约40℃。
15.一种进行色谱分析的方法，所述方法包括
使包含目标分子的样品与权利要求1-13中任一项所述的方法制备的不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂接触，所述接触在使得所述目标不被所述不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂捕获的条件下进行；和
从所述不溶性多孔聚合物填充色谱树脂收集所述目标分子。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述样品包含被不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂捕获的污染物。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述目标分子是蛋白质-纳米颗粒偶联物，且所述污染物是游离蛋白质。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述样品包含蛋白质-纳米颗粒偶联物、游离蛋白质和缓冲液。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述样品进一步包含表面活性剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述表面活性剂是聚亚烷基二醇。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述表面活性剂是Pluronic F-68。
22.如权利要求15所述的方法，其中所述目标分子为病毒。
23.如权利要求15所述的方法，其中所述收集步骤包括从所述不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂收集富含所述目标分子的一个或多个级分。
24.如权利要求15所述的方法，其中所述收集步骤包括对所述不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂施加离心力或真空，并从所述不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂收集富含所述目标分子的一个或多个级分。
25.如权利要求17-24中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是IgG抗体。
26.如权利要求17-25中任一项所述的方法，其中所述蛋白质-纳米颗粒偶联物是蛋白质-聚合物点偶联物。
27.如权利要求17-26中任一项所述的方法，其中所述样品进一步包括游离的纳米颗粒，并且所述不溶性多孔聚合物填充的色谱树脂将所述游离的纳米颗粒与所述偶联物分离。
28.如权利要求15-27中任一项所述的方法，其中所述色谱树脂是陶瓷羟基磷灰石。
29.如权利要求15-27中任一项所述的方法，其中所述色谱树脂是大孔树脂，其包括3-烯丙氧基-1，2-丙二醇和乙烯基吡咯烷酮用N，N’-亚甲基双丙烯酰胺交联的共聚物。
30.如权利要求15-29中任一项所述的方法，其中所述聚合物是浓度为约0.5％至约8％的琼脂糖。
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