JP2012502924A - タンパク質分離処理における温度応答性重合体粒子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】タンパク質含有溶液からタンパク質を単離する方法であって、以下の工程を含むタンパク質単離方法。
(a)タンパク質含有溶液を、温度応答性共重合体で官能化された架橋重合体粒子に接触させる。温度応答性共重合体は、特定割合のイオン化可能な化学基を含み、前記接触が、30℃〜80℃の温度範囲内で行なわれ、架橋重合体粒子によってタンパク質の保持が促進される。
(b)タンパク質含有溶液を、洗浄溶液で置換する。
(c)洗浄溶液を、架橋重合体粒子によって保持せしめられたタンパク質を溶離させるのに有効な溶離溶液で置換する。
(d)タンパク質を含有する溶離溶液を単離する。
【選択図】なし
Description
(a)タンパク質含有溶液を、温度応答性共重合体で官能化された架橋重合体粒子に接触させる工程であって、温度応答性共重合体は、特定割合のイオン化可能な化学基を含み、前記接触が、30℃〜80℃の温度範囲内で行なわれ、架橋重合体粒子によってタンパク質の保持を促進させる工程、
(b)タンパク質含有溶液を、洗浄溶液で置換する工程、
(c)洗浄溶液を、架橋重合体粒子からタンパク質を、溶離溶液中に溶離させるのに有効な溶離溶液で置換する工程、
(d)タンパク質を含有する溶離溶液を単離する工程。
(a)共重合体に温度応答性を付与するモノマー単位;
(b)共重合体にイオン化可能な化学基を付与するモノマー単位。
(a)タンパク質含有溶液を、温度応答性共重合体で官能化された架橋重合体粒子に接触させる工程であって、温度応答性共重合体は、特定割合のイオン化可能な化学基を含み、前記接触が、30℃〜80℃の温度範囲内で行なわれ、架橋重合体粒子によってタンパク質の保持を促進させる工程、
(b)タンパク質含有溶液を、洗浄溶液で置換する工程、
(c)洗浄溶液を、架橋重合体粒子からタンパク質を、溶離溶液中に溶離させるのに有効な溶離溶液で置換する工程、
(d)タンパク質を含有する溶離溶液を単離する工程。
(a)架橋ヒドロキシル重合体粒子を供給する工程、
(b)架橋ヒドロキシル重合体粒子を化学修飾して、重合開始可能な官能基を有する架橋ヒドロキシル重合体粒子を供給する工程、
(c)架橋ヒドロキシル重合体粒子を、モノマー溶液に接触させる工程であって、架橋ヒドロキシル重合体粒子は、重合開始可能な官能基を有し、モノマー溶液は、共重合体に温度応答性を付与可能な少なくとも1のモノマーと共重合体にイオン化可能な化学基を付与可能な少なくとも1のモノマーを含有し、前記接触によりモノマーの重合が開始される工程、
(d)温度応答性共重合体で官能化された架橋ヒドロキシル重合体粒子を単離する工程であって、温度応答性共重合体は、特定割合のイオン化可能な化学基を有する工程。
その方法は、以下の工程を含む。
(a)タンパク質含有溶液を、温度応答性共重合体で官能化された架橋重合体粒子に接触させる工程であって、温度応答性共重合体は、特定割合のイオン化可能な化学基を含み、前記接触が、30℃〜80℃の温度範囲内で行なわれ、架橋重合体粒子によってタンパク質の保持を促進させる工程、
(b)タンパク質含有溶液を、洗浄溶液で置換する工程、
(c)洗浄溶液を、架橋重合体粒子からタンパク質を、溶離溶液中に溶離させるのに有効な溶離溶液で置換する工程、
(d)タンパク質を含有する溶離溶液を単離する工程。
(i)温度応答性を共重合体に付与するモノマー単位;
(ii)イオン化可能な化学基を共重合体に付与するモノマー単位。
(a)タンパク質含有溶液を、温度応答性共重合体で官能化された架橋重合体粒子に接触させる工程であって、温度応答性共重合体は、特定割合のイオン化可能な化学基を含み、前記接触が、30℃〜80℃の温度範囲内で行なわれ、架橋重合体粒子によってタンパク質の保持を促進させる工程、
(b)タンパク質含有溶液を、洗浄溶液で置換する工程、
(c)洗浄溶液を、架橋重合体粒子からタンパク質を、溶離溶液中に溶離させるのに有効な溶離溶液で置換する工程、
(d)タンパク質を含有する溶離溶液を単離する工程。
(i)温度応答性を共重合体に付与するモノマー単位;
(ii)イオン化可能な化学基を共重合体に付与するモノマー単位。
(ii)温度応答性を共重合体に付与するモノマー単位;
(iii)イオン化可能な化学基を共重合体に付与するモノマー単位。
その方法は、以下の工程を含む。
(a)架橋ヒドロキシル重合体粒子を供給する工程、
(b)架橋ヒドロキシル重合体粒子を化学修飾して、重合開始可能な官能基を有する架橋ヒドロキシル重合体粒子を供給する工程、
(c)架橋ヒドロキシル重合体粒子を、モノマー溶液に接触させる工程であって、架橋ヒドロキシル重合体粒子は、重合開始可能な官能基を有し、モノマー溶液は、共重合体に温度応答性を付与可能な少なくとも1のモノマーと共重合体にイオン化可能な化学基を付与可能な少なくとも1のモノマーを含有し、前記接触によりモノマー重合が開始される工程、
(d)温度応答性共重合体で官能化された架橋ヒドロキシル重合体粒子を単離する工程であって、温度応答性共重合体は、特定割合のイオン化可能な化学基を有する工程。
(i)架橋ヒドロキシル重合体粒子をエポキシド基で官能化する工程、
(ii)エポキシド基をアンモニアと反応させて、アミン基で官能化された架橋ヒドロキシル重合体粒子を提供する工程、
(iii)アミン基を少なくとも1のカルボン酸基を有する重合開始剤と反応させる工程。
温度は、特定割合のタンパク質が官能化された架橋重合体粒子によって保持されるような温度である。一般的には、温度は30℃〜80℃の範囲内である。幾つかの実施形態において、温度は30℃〜60℃の範囲内であり、さらなる実施形態において、温度は45℃〜55℃の範囲内である。幾つかの実施形態において、タンパク質溶液が架橋重合体粒子と接触する温度は、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃及び80℃からなる群から選択される。他の実施形態において、温度は、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、及び60℃からなる群から選択される。さらに他の実施形態において、温度は、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃及び55℃からなる群から選択される。幾つかの具体的な実施形態において、タンパク質が官能化された架橋重合体粒子と接触する温度は、50℃が選択される。他の具体的な実施形態において、タンパク質が官能化された架橋重合体粒子と接触する温度は、40℃が選択される。さらなる他の具体的な実施形態において、タンパク質が官能化された架橋重合体粒子と接触する温度は、60℃が選択される。
架橋アガロース粒子(セファロース 6ファストフロー(Sepharose(登録商標) 6 fast flow))は、Pharmacia Biotech(Sweden)から得られ、ラクトフェリン試料は、Food Science Australia(Werribee)によって提供された。N−イソプロピルアクリルアミド(97%)、tert−ブチルアクリルアミド(97%)、アクリル酸(≧98%)、1−(エトキシカルボニル)−2−エトキシ−1,2−ジヒドロ−キノリン(≧99%)、4,4’−アゾビス(4−シアノ吉草酸)(≧98%)、N,N−ジメチルホルムアミド(≧99.8%)及びN,N’−メチレンビスアクリルアミド(≧98%)は、シグマ・アルドリッチ(Sigma Aldrich)(USA)から得られた。
N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)を溶媒として及び1−(エトキシカルボニル)−2−エトキシ−1,2−ジヒドロキノリン(EEDQ)を縮合剤として用いてアミノ官能化セファロース6FF(Sepharose(登録商標) 6FF)上に、重合開始剤である4,4’−アゾビス(4−シアノ吉草酸)(ACV)を、共有結合によって固定した(Yakushijiら著、Anal.Chem.,1999年,71,1125〜1130ページに記載された方法を応用した)。モノマーとして、N−イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)、アクリル酸(AAc)及びtert−ブチルアクリルアミド(tBAAm)を、架橋剤として、N,N’−メチレンビスアクリルアミド(MBBA)を用いて、ラジカル重合によって、ACV固定セファロース(Sepharose)上に架橋重合体マトリックスを展開した。粒子はItBAとして表示された。
1.セファロース6ファストフロー(Sepharose(登録商標) 6FF)のアミノ官能化
1.1)エピクロロヒドリンによるセファロース6FF(Sepharose(登録商標) 6FF)の活性化
セファロース6FF(Sepharose(登録商標) 6FF)(100g)を焼結ガラス漏斗上に採取し、蒸留水で洗浄した(5×湿潤ゲルの体積)。洗浄されたゲルを吸引乾燥し、500mLのSchottビンに移した。NaBH4(0.187g)を含有する2MのNaOH溶液(100mL)を添加し、懸濁液を、28℃において2時間、揺動プラットホーム上で175rpmの速度で混合した。エピクロロヒドリン(60mL)をゲルスラリーに添加し、次いで28℃においてさらに21時間、揺動プラットホーム上で175rpmの速度で混合した。次に、エポキシ活性化ゲルを真空濾過によって採取し、蒸留水で洗浄した。
エポキシ活性化セファロース(Sepharose(登録商標))(95g)を焼結ガラス漏斗上に採取し、蒸留水で洗浄した(5×湿潤ゲルの体積)。洗浄されたゲルを吸引乾燥し、500mLのSchottビンに移した。2Mのアンモニア水溶液(95mL)を添加した。スラリーを揺動プラットホーム上で28℃において21時間混合した。活性化セファロース(Sepharose(登録商標))ゲルを真空濾過によって採取し、濾液のpHが8より小さくなるまで(pH<8)、多量の蒸留水で洗浄した。さらなる使用まで、ゲルを4℃の20%v/vの水性エタノール中に貯蔵した。
ACV(20.25mmol、5.67g)及びEEDQ(40.5mmol、10.01g)を500mLの3首丸底フラスコ内のDMF(270mL)に溶解した。アミノ官能化セファロース(Sepharose(登録商標))(90g)を50%、75%及び100%のエタノール(各々100mL)でそれぞれ洗浄した。ゲルをACVとEEDQとを含有する溶液に添加した。窒素を45分間通気し、その後に、真空脱気して(3分)スラリー混合物を脱気した。次に、IKA(登録商標)オーバーヘッド攪拌機(RW20、IKA Labortechnik)による一定した攪拌で、カップリング反応を25℃のアルゴン雰囲気下で6時間実施した。ACV固定ゲルを焼結ガラス漏斗上に採取し、DMF及びエタノールで洗浄した。次にさらなる使用まで、ゲルを4℃の20%v/vの水性エタノール中に貯蔵した。
NIPAAm(112.5mmol、12.73g)、tBAAm(6.25mmol、0.79g)、AAc(6.25mmol、0.43mL)及びMBBA(1.25mmol、0.19g)を250mLの3首丸底フラスコ内のエタノール(125mL)中に溶解した。ACV固定Sepharose(登録商標) FF(25g、20%、50%、75%及び100%のエタノールで洗浄された)を溶液混合物に添加した。30分間窒素を通気し、その後に、真空脱気して(3分)混合物を脱気した。IKA(登録商標)オーバーヘッド攪拌機による一定した攪拌で、重合反応を80℃のアルゴン雰囲気内で16時間実施した。ゲルを焼結ガラス漏斗上に採取し、100%、75%、50%、20%のエタノールでそれぞれ洗浄し、最後に冷水で洗浄した。次にさらなる使用まで、ゲルを4℃の20%v/vの水性エタノール中に貯蔵した。
共重合体中のNIPAAmとtBAAmとの比は、溶媒としてCDCl3を用いてBruker400MHz NMR分光計を使用して得られた1H−NMRスペクトルのデータから推定された。1H NMRスペクトルは、粒子官能化プロセスの間に得られた上澄み液からの遊離(フリー)の共重合体を用いて得られた。CDCl3中の遊離(フリー)の共重合体の1H NMRスペクトルは、フリーの共重合体中のNIPAAmの、tBAAmに対する比が23:2であることを裏づけた。検査された溶液中のフリーの共重合体の組成は、樹脂上に固定された共重合体の組成に類似するものと仮定して、ItBA樹脂上のモノマーであるNIPAAm、tBAAm、AAの比は、NIPAAm:tBAAm:AA=86:8:6であると推定される。この比は、重合プロセスにおいて使用されたモノマーの比(90:5:5)に類似する。
ItBAのNIPAAm及びtBAAmの総合含有量を、元素窒素分析(Carlo Erba Elemental Analyser EA 1108,Thermo Fisher Scientific,Milan,Italy)を用いて定量した。この分析を用いて、凍結乾燥ゲルのItBA中に存在するNIPAAm及びtBAAmの総合含有量を定量すると2060±62μmol/gであった。
共重合体の下部臨界溶解温度を定量するために、温度制御されたキュベットチャンバを有する紫外/可視分光光度計(SpectraMax Plus,Molecular Devices,Sunnyvale,USA)を用いて、24℃及び38℃で0.5%(w/w)共重合体水溶液の500nmにおける光学的透過率を測定した。特性決定された共重合体は、粒子官能化プロセスの間に得られた上澄み液から得られた。
セファロース6FF(Sepharose(登録商標) 6FF)(15g)を焼結ガラス漏斗上に採取し、蒸留水で洗浄した(5×湿潤ゲルの体積)。洗浄されたゲルを吸引乾燥し、50mLのファルコンチューブに移した。11MのNaOH(15mL)をファルコンチューブに添加し、28℃において回転輪(Ratek,Australia)を用いて45分間混合した。次いで1.4Mのクロロ酢酸(15mL)をファルコンチューブに添加し、さらに3時間混合した。最後に樹脂を真空濾過によって採取し、濾液のpHが8より小さくなるまで(pH<8)、多量の蒸留水で洗浄した。次に、さらなる使用まで、ゲルを4℃の20%v/vの水性エタノール中に貯蔵した。カルボキシメチル修飾セファロース6FF(Sepharose(登録商標) 6FF)はCMと称された。
開発された樹脂の酸基濃度を定量するために、0.02MのNaOHで樹脂を滴定し、Metrohm自動滴定装置(Metrohm Titrando 808,Switzerland)を用いてpHを監視した。樹脂に結合した酸基濃度は、凍結乾燥樹脂1gに対する濃度(μmol/g)で報告された。
6.1)平衡吸着等温線
6.1a)ラクトフェリンの吸着等温線
開発された熱応答性カチオン交換樹脂(ItBA)が、低高温域における特異的な保持に有効であることを示すために、ItBAについてのラクトフェリンの平衡吸着等温線を20℃及び50℃において測定した(図1)。対照実験として、ItBAのイオン交換能力と同様なイオン交換能力を有するカルボキシメチルセファロース(Sepharose)(CM)についても平衡吸着等温線を得た。
また、ラクトペルオキシダーゼを使用して、上述の方法によって製造されたItBAに関する吸着等温線を測定した。ラクトペルオキシダーゼ溶液(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、及び40mg/mL)を10mMのリン酸緩衝液(pH6.5)中で調製した。20℃又は50℃において、500μlの一定分量を0.05gの試料と35分間混合した。50℃で保温するため、混合前にタンパク質溶液及び樹脂試料を50℃に予備平衡化した。
また、パパインを使用して、上述の方法によって製造されたItBAに関する吸着等温線を測定した。パパインの吸着等温線をラクトペルオキシダーゼと同様に作成した。ただし、混合前に50℃での予備平衡化を行なわずに、50℃で保温した。次に、最大保持能力Bmax値を吸着等温線から計算した。図3における吸着等温線は3つの実験の平均であり、各実験では、異なるバッチの樹脂を使用した。
6.2a)さまざまな塩濃度におけるItBAとCM間の比較検討
塩の存在は樹脂上のタンパク質とイオン交換基との間の静電相互作用を妨げ、それによってイオン交換体のタンパク質の吸着速度及び吸着能力を低下させる(Yamamoto及びその他の者、1988年)。塩の存在は、疎水性相互作用を低減させないことが知られている。ラクトフェリンと樹脂間における相互作用メカニズムについて、より良い理解を得るために、様々な塩濃度における保持の検討を実施した。結果を図4に示す。
ナトリウム濃度の僅かな差が、ラクトフェリンのItBAへの静的保持に与える影響を調べるために、20℃及び50℃において20mM又は約13mMのナトリウム含有ラクトフェリン溶液を樹脂(0.05g)と35分間混合した。次に、20℃又は50℃において混合物を10分間沈殿させ、上澄み液を取り除いた。15,000×gの条件で3分間、上澄み液を遠心分離機にかけた。上澄み液中のラクトフェリン濃度は、280nmにおける吸光度を測定することによって定量された。次に、最大保持能力Bmax値を吸着等温線から算出した。
ItBAの最も将来有望な処理の一つは、50℃において標的タンパク質の溶液を接触させ、標的タンパク質を保持し、次に、単に温度を20℃に低下させることによって保持された材料の特定割合を解放させることを含む。
また、N−ビニルカプロラクタムは、N−イソプロピルアクリルアミド重合体と同様にLCST値を有する温度応答性重合体を製造するために使用されるモノマーである。それは、温度応答性イオン交換樹脂を製造するために使用してもさしつかえないN−イソプロピルアクリルアミンのより安価な代替物である。N−フェニルアクリルアミドは、tert−ブチルアクリルアミド及びブチルメタクリレートのコモノマーと比べて、より疎水性のモノマーである。また、N−フェニルアクリルアミドは、改良された温度感受性及び保持能力を有する温度応答性イオン交換樹脂を製造するためのコモノマーとして使用されてもよい。
ItBAの合成と同様な方法を用いて新規な樹脂を合成した。しかしながら、モノマーのタイプ及び濃度を変化させた。簡単に言えば、セファロース6FF(Sepharose(登録商標) 6FF)は、上に略説されたようにエピクロロヒドリンで活性化された。次に、ここに記載された方法によってアンモニア水を用いてエポキシ活性化セファロース(Sepharose(登録商標))をアミノ官能化した。カップリング剤としてEEDQ及び溶媒としてDMFを用いて、フリーラジカル重合開始剤(ACV)をアミノ官能化セファロース(Sepharose(登録商標))上に固定した。最後に、以下の表にあるモノマーに加えて架橋剤N,N−メチレンビスアクリルアミド(MBBA)との重合を不活性雰囲気下において80℃で16時間実施した。
ItBAを開発するために使用された方法は、トヨパール(Toyopearl)(登録商標)をベースとした温度応答性イオン交換樹脂(Toyopearl(登録商標)−ItBA)の開発に使用されている。ACVをトヨパールAF−アミノ−650M(Toyopearl(登録商標)AF−アミノ−650M)上に固定し、ItBAに使用された技術と同じ技術を用いて重合体が開発された(上記参照)。20℃及び50℃において実施例6.1に使用された静的保持方法論を用いてトヨパール−ItBA(Toyopearl(登録商標)−ItBA)の温度応答性を検査した。ItBAと同じように、トヨパール−ItBA(Toyopearl(登録商標)−ItBA)は、20℃の場合と比べて50℃の場合において250%多いタンパク質を保持した(図11)。これらの結果は、開発されたトヨパール(Toyopearl)(登録商標)をベースとした温度応答性イオン交換樹脂がセファロース(Sepharose)(登録商標)をベースとした温度応答性イオン交換樹脂と同様に機能することを示す。
典型的な牛乳乳清タンパク質溶液(α−ラクトアルブミン(13mg/mL)、β−ラクトグロブリン(15mg/mL)及びラクトフェリン(27mg/mL)の混合物)を用いてItBAの分離能力を検討した。検討のために使用した方法は、実施例6.3に使用した方法と同様であった。図12及び13のクロマトグラムは、典型的なタンパク質溶液の保持及び溶離プロファイルを示す。典型的なタンパク質溶液が20℃のカラム上に注入されたとき、タンパク質の大部分は保持されず、通過画分としてカラムから溶離された。しかしながら、典型的なタンパク質溶液が50℃のカラム上に注入されたとき、ラクトフェリンの50%が樹脂によって保持されたのに対し、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンは全く保持されなかった。その代わりとして、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンは通過画分としてカラムから溶離された。保持されたラクトフェリンの大部分(52%)は移動相及びカラム温度を50℃から20℃に低下させることによって溶離された。残存する保持されたラクトフェリンの大部分(44%)は、20℃において0.1MのNaClと共にカラムから溶離された(表3及び4を参照のこと)。これらの結果は、ItBAが20℃では最少量のカチオン性タンパク質及びアニオン性タンパク質を保持し、50℃では選択的にカチオン性タンパク質(例えば、ラクトフェリン)を保持し、次に、温度変化(例えば、20℃に低下させる)及び塩によって保持されたカチオン性タンパク質の大部分を解放する能力を有することを示す。
20℃及び50℃におけるItBAによる他の基礎的なタンパク質の保持プロファイルを調べるために、チトクロームC(pI:10−10.5)を用いて静的保持実験を行なった。20℃及び50℃で、ItBA(0.1g)を1時間チトクロームC溶液(5mg/mLの1mL)と混合した。樹脂を沈殿させ、保持されないタンパク質量を定量するために、280nmにおける上澄み液の吸光度を測定し、そして次に、それにより樹脂によって保持されたタンパク質の量が得られた。ItBAは、20℃と比較して50℃では50%多いチトクロームCを保持することが見出された(図14)。
純粋なラクトフェリン溶液(0.9〜45mg/mL)、新鮮な乳清溶液及び濃縮乳清溶液を用いて、ItBAの動的ラクトフェリンの保持特性をさらに検討した。
新鮮な乳清溶液は、乳清タンパク質とラクトフェリン(0.2〜21.8mg/mL)とを含有する。濃縮乳清溶液は、濃縮乳清タンパク質(約10倍の濃縮物)とラクトフェリン(0.6〜22.2mg/mL)とを含有する。使用した方法は実施例6.3において使用した方法と同様であるが、しかしながら、接触は50℃でのみ実施し、溶離は0.1MのNaClと共に20℃でのみ実施した。
Claims (56)
- タンパク質含有溶液からタンパク質を単離する方法であって、以下の工程を含むタンパク質単離方法。
(a)タンパク質含有溶液を、温度応答性共重合体で官能化された架橋重合体粒子に接触させる工程であって、温度応答性共重合体は、特定割合のイオン化可能な化学基を含み、前記接触が、30℃〜80℃の温度範囲内で行なわれ、架橋重合体粒子によってタンパク質の保持を促進させる工程、
(b)タンパク質含有溶液を、洗浄溶液で置換する工程、
(c)洗浄溶液を、架橋重合体粒子からタンパク質を溶離させるのに有効な溶離溶液で置換する工程、
(d)タンパク質を含有する溶離溶液を単離する工程。 - 溶離溶液の温度が、タンパク質含有溶液を架橋重合体粒子と接触させた温度より低い、請求項1に記載のタンパク質単離方法。
- タンパク質溶液及び洗浄溶液の温度が30℃〜60℃である請求項1又は2に記載のタンパク質の単離方法。
- タンパク質溶液及び洗浄溶液の温度が40℃〜60℃である請求項1〜3のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- 溶離溶液の温度が0℃〜30℃である請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- 溶離溶液の温度が0℃〜20℃である請求項1〜5のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- 溶離溶液がイオン性溶質を含有する請求項1〜6のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- イオン性溶質がアルカリ金属ハロゲン化物又はアルカリ土類金属ハロゲン化物である請求項7に記載のタンパク質の単離方法。
- イオン性溶質が塩化ナトリウムである請求項7又は8に記載のタンパク質の単離方法。
- 温度応答性共重合体が、下記を含有する請求項1〜9のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
(a)共重合体に温度応答性を付与するモノマー単位
(b)共重合体にイオン化可能な化学基を付与するモノマー単位 - 共重合体に温度応答性を付与する前記モノマー単位が、N−イソプロピルアクリルアミド単位、ビニルメチルエーテル単位またはN−ビニルカプロラクタム単位からなる群から選択される請求項1〜10のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- 温度応答性を付与する前記モノマー単位が、N−イソプロピルアクリルアミド単位である請求項1〜11のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- イオン化可能な化学基を付与する前記モノマー単位が、アクリル酸単位、メタクリル酸単位、エタクリル酸単位、ナトリウム2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホネート単位、ナトリウム3−アクリルアミド−3−メチルブタノエート単位、(3−アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド単位、N,N−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド単位、N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート単位、N,N−ジメチルアミノエチルアクリレート単位、及び4−ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド単位からなる群から選択される請求項1〜12のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- イオン化可能な化学基を付与する前記モノマー単位が、アクリル酸単位である請求項1〜13のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- 温度応答性共重合体が、少なくとも1の二官能性モノマー単位をさらに含有する請求項1〜14のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- 二官能性モノマー単位が、エチレングリコールジメタクリレート単位、1,4−ブタンジオールジメタクリレート単位、1,6−ヘキサンジオールジメタクリレート単位、エチレングリコールジアクリレート単位、1,4−ブタンジオールジアクリレート単位、1,6−ヘキサンジオールジアクリレート単位、及びN,N−メチレンビスアクリルアミド単位からなる群から選択される請求項15に記載のタンパク質の単離方法。
- 温度応答性共重合体が、少なくとも1の付加的なモノマー単位をさらに含有する請求項1〜16のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- 付加的なモノマー単位が、メチルアクリレート単位、エチルアクリレート単位、プロピルアクリレート単位、ブチルアクリレート単位、メチルメタクリレート単位、エチルメタクリレート単位、プロピルメタクリレート単位、N−イソプロピルメタクリアミド単位、ブチルメタクリレート単位、N−tert−ブチルアクリルアミド単位、N,N−ジメチルアクリルアミド単位、N,N−ジエチルアクリルアミド単位、及びN−フェニルアクリルアミド単位からなる群から選択される請求項17に記載のタンパク質の単離方法。
- 付加的なモノマー単位が、N−tert−ブチルアクリルアミド単位である請求項17または18に記載のタンパク質の単離方法。
- 温度応答性共重合体が、N−イソプロピルアクリルアミド単位、tert−ブチルアクリルアミド単位及びアクリル酸単位の比が、N−イソプロピルアクリルアミド単位:tert−ブチルアクリルアミド単位:アクリル酸単位=(84〜96):(8〜2):(8〜2)となるように、N−イソプロピルアクリルアミド単位、tert−ブチルアクリルアミド単位及びアクリル酸単位を含有する請求項18に記載のタンパク質の単離方法。
- 温度応答性共重合体が、N−イソプロピルアクリルアミド単位、N−フェニルアクリルアミド単位及びアクリル酸単位の比が、N−イソプロピルアクリルアミド単位:N−フェニルアクリルアミド単位:アクリル酸単位=(84〜96):(8〜2):(8〜2)となるように、N−イソプロピルアクリルアミド単位、N−フェニルアクリルアミド単位及びアクリル酸単位を含有する請求項18に記載のタンパク質の単離方法。
- 架橋重合体粒子が、架橋アガロース粒子、架橋セルロース粒子、親水性架橋ビニル重合体粒子、及びメタクリレートをベースとした重合体樹脂粒子からなる群から選択される請求項1〜21のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- 架橋重合体粒子が、Sepharose(登録商標)、Sephacel(登録商標)、Toyopearl(登録商標)、及びFractogel(登録商標)からなる群から選択される請求項1〜22のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- 工程(a)〜(c)が、入口と出口とを有するクロマトグラフィー用カラム内で行なわれる請求項1〜23のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- 温度応答性共重合体で官能化された架橋重合体粒子が、入口と出口との間の通路内に充填される請求項24に記載のタンパク質の単離方法。
- タンパク質含有溶液、洗浄溶液及び溶離溶液が、入口を通して連続的に注入され、出口から採取される請求項24または25に記載のタンパク質の単離方法。
- 溶離溶液が、不連続に一定容積で採取される請求項24〜26のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- 一定容積毎のタンパク質濃度が、定量される請求項27に記載のタンパク質の単離方法。
- 溶離溶液中のタンパク質濃度が、連続的に測定される請求項24〜28のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- タンパク質含有溶液、洗浄溶液及び溶離溶液が、ポンプによって入口に導入される請求項24〜29のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- タンパク質含有溶液、洗浄溶液及び溶離溶液が、重力送りによって入口に導入される請求項23〜30のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- タンパク質が、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、パパイン及びチトクロームCからなる群から選択される請求項1〜31のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- タンパク質が、ラクトフェリンである請求項1〜32のいずれか一項に記載のタンパク質の単離方法。
- 温度応答性共重合体で官能化された架橋ヒドロキシル重合体粒子であって、前記温度応答性共重合体が、特定割合のイオン化可能な化学基を含む架橋ヒドロキシル重合体粒子。
- 温度応答性共重合体が、下記を含有する請求項34に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子。
(a)共重合体に温度応答性を付与するモノマー単位
(b)共重合体にイオン化可能な化学基を付与するモノマー単位 - 温度応答性を共重合体に付与するモノマー単位が、N−イソプロピルアクリルアミド単位、ビニルメチルエーテル単位またはN−ビニルカプロラクタム単位からなる群から選択される請求項35に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子。
- 温度応答性を付与するモノマー単位が、N−イソプロピルアクリルアミド単位である請求項35または36に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子。
- イオン化可能な化学基を付与するモノマー単位が、アクリル酸単位、メタクリル酸単位、エタクリル酸単位、ナトリウム2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホネート単位、ナトリウム3−アクリルアミド−3−メチルブタノエート単位、(3−アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド単位、N,N−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド単位、N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート単位、N,N−ジメチルアミノエチルアクリレート単位、及び4−ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド単位からなる群から選択される請求項35〜37のいずれか一項に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子。
- イオン化可能な化学基を付与するモノマー単位が、アクリル酸単位である請求項35〜38のいずれか一項に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子。
- 温度応答性共重合体が、少なくとも1の二官能性モノマー単位をさらに含有する請求項35〜38のいずれか一項に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子。
- 二官能性モノマー単位が、エチレングリコールジメタクリレート単位、1,4−ブタンジオールジメタクリレート単位、1,6−ヘキサンジオールジメタクリレート単位、エチレングリコールジアクリレート単位、1,4−ブタンジオールジアクリレート単位、1,6−ヘキサンジオールジアクリレート単位、及びN,N−メチレンビスアクリルアミド単位からなる群から選択される請求項41に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子。
- 二官能性モノマー単位が、N,N−メチレンビスアクリルアミド単位である請求項40または41に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子。
- 温度応答性共重合体が、少なくとも1の付加的なモノマー単位をさらに含有する請求項34〜42のいずれか一項に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子。
- 付加的なモノマー単位が、メチルアクリレート単位、エチルアクリレート単位、プロピルアクリレート単位、ブチルアクリレート単位、メチルメタクリレート単位、エチルメタクリレート単位、プロピルメタクリレート単位、N−イソプロピルメタクリアミド単位、ブチルメタクリレート単位、N−tert−ブチルアクリルアミド単位、N,N−ジメチルアクリルアミド単位、N,N−ジエチルアクリルアミド単位、及びN−フェニルアクリルアミド単位からなる群から選択される請求項43に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子。
- 付加的なモノマー単位が、N−tert−ブチルアクリルアミド単位である請求項43または44に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子。
- 温度応答性共重合体が、N−イソプロピルアクリルアミド単位、tert−ブチルアクリルアミド単位及びアクリル酸単位の比が、N−イソプロピルアクリルアミド単位:tert−ブチルアクリルアミド単位:アクリル酸単位=(84〜96):(8〜2):(8〜2)となるように、N−イソプロピルアクリルアミド単位、tert−ブチルアクリルアミド単位及びアクリル酸単位を含有する請求項44に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子。
- 温度応答性共重合体が、N−イソプロピルアクリルアミド単位、N−フェニルアクリルアミド単位及びアクリル酸単位の比が、N−イソプロピルアクリルアミド単位:N−フェニルアクリルアミド単位:アクリル酸単位=(84〜96):(8〜2):(8〜2)となるようにN−イソプロピルアクリルアミド単位、N−フェニルアクリルアミド単位及びアクリル酸単位を含有する請求項44に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子。
- 架橋ヒドロキシル重合体が、架橋アガロース、架橋セルロース、ヒドロキシ官能性架橋ビニル重合体、ヒドロキシ官能性架橋アクリル重合体及びヒドロキシ官能性架橋メタクリル重合体からなる群から選択される請求項34〜47のいずれか一項に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子。
- 請求項34〜48のいずれか一項に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子を製造する方法であって、以下の工程を含む架橋ヒドロキシル重合体粒子の製造方法。
(a)架橋ヒドロキシル重合体粒子を供給する工程、
(b)架橋ヒドロキシル重合体粒子を化学修飾して、重合開始可能な官能基を有する架橋ヒドロキシル重合体粒子を供給する工程、
(c)架橋ヒドロキシル重合体粒子を、モノマー溶液に接触させる工程であって、架橋ヒドロキシル重合体粒子は、重合開始可能な官能基を有し、モノマー溶液は、共重合体に温度応答性を付与可能な少なくとも1のモノマーと共重合体にイオン化可能な化学基を付与可能な少なくとも1のモノマーを含有し、前記接触によりモノマーの重合が開始される工程、
(d)温度応答性共重合体で官能化された架橋ヒドロキシル重合体粒子を単離する工程であって、温度応答性共重合体は、特定割合のイオン化可能な化学基を有する工程。 - 架橋ヒドロキシル重合体粒子を化学修飾して、重合開始可能な官能基を有する架橋ヒドロキシル重合体粒子を供給する工程が、下記工程を含む請求項49に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子の製造方法。
(a)架橋ヒドロキシル重合体粒子を少なくとも1のエポキシド基で官能化する工程、
(b)エポキシド基をアンモニアと反応させて、アミン基で官能化された架橋ヒドロキシル重合体粒子を提供する工程、
(c)アミン基を少なくとも1のカルボン酸基を有する重合開始剤と反応させる工程。 - 架橋ヒドロキシル重合体粒子を少なくとも1のエポキシド基で官能化する工程が、ヒドロキシル重合体粒子をエピクロロヒドリンと水酸化ナトリウム及び水素化ホウ素ナトリウムの存在下で反応させる工程を包含する請求項50に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子の製造方法。
- カルボン酸基を有する重合開始剤とアミン基を反応させる工程が、縮合剤の存在下で行なわれる請求項50または51に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子の製造方法。
- 縮合剤が、1−(エトキシカルボニル)−2−エトキシ−1,2−ジヒドロキノリンである請求項52に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子の製造方法。
- 少なくとも1のカルボン酸基を有する重合開始剤が、4,4’−アゾビス(4−シアノ吉草酸)である請求項50〜53のいずれか一項に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子の製造方法。
- 実質的に明細書に記載されたものである請求項1、24又は49に記載の製造方法。
- 実質的に明細書に記載されたものである請求項34に記載の架橋ヒドロキシル重合体粒子。
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