JPWO2014171437A1 - 抗体タンパク質の精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
−CR1R2−CR3(−SO3H)− ・・・(1)
−CH(−OH)−CH2−SO3H ・・・(2)
−CH(−SO3H)−CH2−OH ・・・(3)
上記化学式(2)のモノマー単位のスルホン酸基は、少なくとも−CH(−OH)−CH2−を含むリンカーを介して、主鎖に結合している。また、上記化学式(3)のモノマー単位のスルホン酸基は、少なくとも−CH−を含むリンカーを介して、主鎖に結合している。リンカーにより立体障害が減るため、凝集体等の不純物が、スルホン酸基にすばやく結合することが可能になりうる。
実施例1では、原子移動ラジカル重合法によって、スルホン酸基を有するビーズ状のカチオン性イオン交換担体を合成した。
架橋ポリビニルアルコールビーズ1g(粒径100μm)を純水で湿潤させ、300mLのガラス製三角フラスコに入れた。三角フラスコに、テトラヒドラフラン(安定剤不含、関東化学(株)社製)200mL、2−ブロモイソ酪酸ブロミド(東京化成工業(株)製)1.23mL、及びトリエチルアミン(和光純薬工業(株)社製)1.40mLを加え、室温で16時間震とうさせた。反応後、ろ過してから200mLエタノールで3回洗浄し、脱水イソプロパノール中で保存した。これにより、架橋ポリビニルアルコールビーズ表面に原子移動ラジカル重合(ATRP)開始剤である2−ブロモイソ酪酸ブロミドが導入された。
スルホン酸基の前駆体モノマーであるグリシジルメタクリレート(GMA、東京化成工業(株)製)を、N−イソプロピルアクリルアミドに対して1mol%の割合で含有するモノマー組成物を調整した。具体的には、N−イソプロピルアクリルアミド(IPAAm、和光純薬工業(株)製)18.40g、GMA0.231g、ブチルメタクリレート(BMA、東京化成工業(株)製)1.217g、塩化銅I(CuCl、和光純薬工業(株)製) 0.085g、及び塩化銅II(CuCl2、和光純薬工業(株)製)0.012gを90容量%イソプロパノール(IPA)水溶液42.8mLに溶解させ、30分間、窒素バブリングした。その後、窒素雰囲気下で溶液にトリス(2−ジメチルアミノエチル)アミン(Me6TREN)(Alfa Aesar社製)0.221gを加えて、5分間攪拌しCuCl/CuCl2/Me6TRENの触媒を形成させた。この反応溶液を窒素雰囲気下で開始剤導入架橋ポリビニルアルコールビーズに反応させ、室温で16時間のATRPをおこなった。反応後、エタノール、50mmol/L―EDTA水溶液、純水の順に洗浄し、モノマー、ポリマー、及び銅触媒を洗浄した。
原子移動ラジカル重合法によりグラフト鎖を導入したビーズを、亜硫酸ナトリウムと、IPAと、の混合水溶液(亜硫酸ナトリウム/IPA/純水=10/15/75wt%)200gに投入し、80℃で24時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。反応後、このビーズを純水で洗浄した。その後、このビーズを0.5mol/L硫酸中に投入し、80℃で2時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。反応後、このビーズを純水で洗浄し、実施例1に係るカチオン性イオン交換担体とした。カチオン性イオン交換担体を、カラムに充填した。
スルホン酸基の前駆体モノマーであるグリシジルメタクリレート(GMA、東京化成工業(株)製)を、N−イソプロピルアクリルアミドに対して1mol%の割合で含有するモノマー組成物を用い、基材を用いずに共重合体を重合した。具体的には、上記2)記載の反応溶液を窒素雰囲気下で2−ブロモイソ酪酸エチルに反応させ、室温で16時間のATRPをおこなった。反応後、反応溶液を透析膜(Spectra/por Dialysis Membrane,MWCO1000,Spectrum Laboratories社製)に入れ、エタノール、50mmol/L―EDTA水溶液、純水の順に浸漬することにより、モノマー、及び銅触媒を除去した。次に反応溶液を凍結乾燥することで得られた共重合体を、亜硫酸ナトリウムと、IPAと、の混合水溶液(亜硫酸ナトリウム/IPA/純水=10/15/75wt%)200gに投入し、80℃で24時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。反応後、反応溶液を透析膜に入れ、純水に浸漬することにより、亜硫酸ナトリウムとIPAを除去し、さらに反応溶液を凍結乾燥することで共重合体を得た。
抗体タンパク質として、AE6F4抗体(ヒトモノクロナール抗体)を0.115mg/L含む培養上澄みを用意した。AE6F4産生細胞は、九州大学大学院農学研究院、片倉喜範准教授よりご提供頂いた。AE6F4抗体産生細胞の培養は、文献(日本生物工学会講演要旨集、1994年、65巻、65ページ)を参考に培養した。AE6F4抗体産生細胞を含む培養液を、ろ過膜(旭化成メディカル社製、商品名 BioOptimal(登録商標) MF−SL)を用いてろ過し、不純物と抗体を含む混合溶液(培養上澄)を取得した。ろ過は、提供者の取扱い説明書を参考に実施した。
リン酸緩衝液(20mmol/Lリン酸ナトリウム+150mmol/L NaCl(pH8.0))150mLで平衡化したプロテインAカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス製、MabSelect Sureを充填したもの)に、ろ過した混合溶液を2L添加し、プロテインAに抗体タンパク質を吸着させた。次に、カラムにリン酸緩衝液(20mmol/Lのリン酸ナトリウム+150mmol/L NaCl(pH8.0))20mLを通液して洗浄した後、カラムに溶出緩衝液(100mmol/Lクエン酸ナトリウム(pH3.6))を240mL通液して、プロテインAカラムから抗体タンパク質を溶出させて、不純物がある程度低減された混合溶液を回収した。
得られた溶出画分に、溶出画分の体積の0.5%の1mol/LTris−HCl(pH8.0)を加えて、溶出画分の水素イオン指数をpH4に調整した。さらに、溶出画分に酢酸を滴下して、溶出画分の水素イオン指数をpH3.5にして、溶出画分を一時間放置し、ウイルスの不活性化処理を行った。その後、トリス緩衝液を用いて、溶出画分の水素イオン指数をpH5.0にし、酢酸バッファー(15mmol/L酢酸バッファー(pH6.0))にバッファー交換を行い、混合溶液1を得た。
カラム:Tskgel G3000SWXL(東ソー社製)
カラム温度:30℃
ポンプ:LC−20AD(島津製作所社製)
検出器:SPD−20A(島津製作所社製)
オートサンプラー:SIL−20AC(島津製作所社製)
カラムオーブン:CTO−20AC(島津製作所社製)
デガッサー:DGU−20AC3
移動相:0.1mol/Lリン酸水素二ナトリウム+0.2mol/L L(+)−アルギニン水溶液(塩酸でpH6.7に調整)
その結果、図1に示すように、吸光ピークの立ち上がりが急峻ではなく、抗体タンパク質の単量体のみならず、抗体タンパク質の凝集体成分(不純物)も含んでいることを示していた。図1のピークを拡大したものが図2である。ここで、図2のように単量体のピークを(3)、それより短時間で回収された凝集体ピークをそれぞれ(1)、(2)とすると、(1)のピークで現れる凝集体成分の含有量は0.67mg、含有率は1.2%であり、(2)のピークで現れる凝集体成分の含有量は0.95mg、含有率は1.7%であり、(3)のピークで現れる抗体タンパク質の単量体の含有量は54.44mg、含有率は97.1%であった。回収された抗体の凝集体及び単量体の総量は56.06mgであった(混合溶液1)。
カチオン性イオン交換担体脂を充填したカラムに、ウイルス不活性化処理を行ったプロテインAカラムからの溶出画分(混合溶液1)を加え、カチオン性イオン交換担体に、抗体タンパク質の凝集体成分(不純物)と単量体成分(目的の生理活性物質)を含む混合溶液を接触させた。加えた溶出画分の量は12mL(4.7mg/ml)であり、流速は0.4mL/minであり、温度は20℃であった。その後、流速は0.4mL/minで流れる20℃の酢酸バッファー(15mmol/L酢酸バッファー(pH6.0))で温度応答性カチオン性イオン交換担体を充填したカラムを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、32ml(1.6mg/ml)の溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC:Size Exclusion Chromatography)にかけた。この場合も、吸光度を示すグラフ(不図示)において、抗体タンパク質の単量体のみならず、抗体タンパク質の凝集体成分(不純物)も含んでいることを示していた。ただし、図5に示すように、不純物の含有量は僅かであった。
なお、カチオン性イオン交換担体で処理前の混合溶液及びカチオン性イオン交換担体で処理後の回収溶液に含まれる凝集体成分及び単量体成分の質量割合を含有率として示した。
また、プロテインA溶出画分に含まれる抗体タンパク質の総量(凝集体成分と単量体成分を含む)を100%としたとき、カチオン性イオン交換担体を充填したカラムをフロースルーして回収された抗体タンパク質の総量(凝集体成分と単量体成分を含む)を抗体回収率として示した。
凝集体の吸着率は、カチオン性イオン交換担体を充填したカラムをフロースルーした後の(1)及び(2)のピークで現れる凝集体成分の合計含有量を、カチオン性イオン交換担体を充填したカラムをフロースルーする前の(1)及び(2)のピークで現れる凝集体成分の合計含有量で除したものを、1から引いてパーセント表示したものである。単量体回収率は、カチオン性イオン交換担体を充填したカラムをフロースルーした後の単量体の含有量を、カチオン性イオン交換担体を充填したカラムをフロースルーする前の単量体の含有量で除したものをパーセント表示したものである。
N−イソプロピルアクリルアミド8.090g、グリシジルメタクリレート0.102g、ブチルメタクリレート0.208gを25容量%t−ブチルアルコール(和光純薬工業(株)社製)水溶液500mLに溶解させ、30分間、窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25umのポリエチレン多孔質中空糸6.000g(15cm、30本)を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線200kGyを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス反応管に移し、200Pa以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに40℃に調整した上記反応液を、250mL導入し、16時間静置した。その後、中空糸をエタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させた。
放射線グラフト重合法によりグラフト鎖を導入した中空糸を、亜硫酸ナトリウムと、IPAと、の混合水溶液(亜硫酸ナトリウム/IPA/純水=10/15/75wt%)200gに投入し、80℃で24時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。反応後、この中空糸を純水で洗浄した。その後、この中空糸を0.5mol/L硫酸中に投入し、80℃で2時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。これをモジュール化(膜体積0.6mL)し、実施例3に係るカチオン交換膜とした。
熱分解装置:PY2020D(フロンティア・ラボ株式会社)
熱分解温度:600℃
GC装置:アジレント6890(アジレント・テクノロジー株式会社)
MS装置:アジレント6973(アジレント・テクノロジー株式会社)
カラム:DB−1(アジレント・テクノロジー株式会社)
0.25mm i.d. × 30m 液相厚 0.25um
カラム温度:40℃(5分保持)→(20℃/分昇温)→320℃(11min保持)
注入口温度:320℃
スプリット比:1/100
カラム流量:1.0ml/分 (ヘリウム)
イオン化法:電子イオン化(EI法)
イソプロピルアミン部位の検出時間:1分24秒
イソプロピルイソシアネートの検出時間:1分46秒
N−イソプロピルアクリルアミドモノマー部位の検出時間:8分9秒
カラム;ACQUITY YPLC BEH200 SEC1.7um(Waters社製)
カラム温度:30℃
システム:ACQUITY UPLC H CLASS(waters社製)
移動相:0.1mol/Lリン酸水素二ナトリウム+0.2mol/L L(+)−アルギニン水溶液(塩酸でpH6.7に調整)
その結果、図3のピークが得られ、それを拡大したものが図4である。なお、実施例3では、実施例1及び2とは異なる装置で吸光度を測定したが、装置の同等性は確認できた。ここでも、図4のように単量体のピークを(3)、それより短時間で回収された凝集体ピークをそれぞれ(1)、(2)とすると(1)のピークで現れる凝集体成分の含有量は1.41mg、含有率は1.9%であり、(2)のピークで現れる凝集体成分の含有量は1.11mg、含有率は1.5%であり、(3)のピークで現れる抗体タンパク質の単量体の含有量は71.65g、含有率は96.6%であった。回収された抗体の凝集体及び単量体の総量は74.17gであった。
モジュール化したカチオン交換膜に、ウイルス不活性化処理を行ったプロテインAカラムからの溶出画分(混合溶液3)を加え、カチオン交換膜に、抗体タンパク質の凝集体成分(不純物)と単量体成分(目的の生理活性物質)を含む混合溶液を接触させた。加えた溶出画分の量は15mL(4.9mg/ml)であり、流速は6.0mL/minであり、温度は35℃であった。その後、流速は6.0mL/minで流れる35℃の酢酸バッファー(15mmol/L酢酸バッファー(pH6.0))でモジュール化したカチオン交換膜を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、27ml(2.3mg/ml)の溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC:Size Exclusion Chromatography)にかけた。この場合も、吸光度を示すグラフ(不図示)において、抗体タンパク質の単量体のみならず、抗体タンパク質の凝集体成分(不純物)も含んでいることを示していた。ただし、図5に示すように、不純物の含有量は僅かであった。
Claims (40)
- 不純物と生理活性物質を含む混合溶液から、前記生理活性物質を精製する精製方法であって、
基材と、前記基材表面に固定された、少なくともN−イソプロピルアクリルアミドをモノマー単位として含む共重合体と、を備えるイオン交換クロマトグラフィー担体を使用し、
前記混合溶液を、前記担体を格納する容器に一定温度でフロースルーさせることによって、前記生理活性物質を回収する、
生理活性物質を精製する方法。 - 不純物と生理活性物質を含む混合溶液から、前記生理活性物質を精製する精製方法であって、
少なくとも1つの温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体を使用し、
前記混合溶液を、前記担体を格納する容器に一定温度でフロースルーさせることによって、前記生理活性物質を回収する、
生理活性物質を精製する方法。 - 不純物と生理活性物質を含む混合溶液から、前記不純物を除去する方法であって、
基材と、前記基材表面に固定された、少なくともN−イソプロピルアクリルアミドをモノマー単位として含む共重合体と、を備えるイオン交換クロマトグラフィー担体を使用し、
前記混合溶液を、前記担体を格納する容器に一定温度でフロースルーさせることによって、不純物を除去する方法。 - 不純物と生理活性物質を含む混合溶液から、前記不純物を除去する方法であって、
少なくとも1つの温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体を使用し、
前記混合溶液を、前記担体を格納する容器に一定温度でフロースルーさせることによって、不純物を除去する方法。 - 前記一定温度が、前記担体に前記不純物を質量分率で50%以上吸着させられ、かつ、前記生理活性物質を質量分率で70%以上回収できる温度である、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記担体を格納する容器から回収した溶液の質量に対する前記不純物の質量の割合が2%以下である、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記温度が5℃以上60℃以下である、請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記温度が20℃以上35℃以下である、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記混合溶液をフロースルーさせる時の流速が、前記イオン交換クロマトグラフィー担体の体積の0.1倍の体積/分以上、前記担体の体積の30倍の体積/分以下である、請求項1ないし8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記混合溶液をフロースルーさせる時の流速が、前記イオン交換クロマトグラフィー担体の体積の1倍の体積/分以上、前記担体の体積の10倍の体積/分以下である、請求項1ないし9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生理活性物質が抗体タンパク質の単量体である、請求項1ないし10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記不純物が前記抗体タンパク質の二量体以上の凝集体成分である、請求項1ないし11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記イオン交換クロマトグラフィー担体が、カチオン交換担体であり、ビーズ状である、請求項1ないし12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記イオン交換クロマトグラフィー担体が、カチオン交換担体であり、膜状である、請求項1ないし12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記カチオン交換担体が、中空糸膜である、請求項14に記載の方法。
- 前記イオン交換クロマトグラフィー担体を格納する容器に前記混合液をフロースルーさせることの前に、
アフィニティークロマトグラフィーにより前記混合溶液を精製することを更に含む、
請求項1ないし15のいずれか1項に記載の方法。 - 前記アフィニティークロマトグラフィーにプロテインA担体を使用する、請求項16に記載の方法。
- 前記アフィニティークロマトグラフィーに、酸溶出型アフィニティークロマトグラフィー担体を使用する、請求項16又は17に記載の方法。
- 前記アフィニティークロマトグラフィーに、温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体を使用する、請求項16又は17に記載の方法。
- 当該精製方法において移動相として用いられる緩衝液が0.5〜20mS/cmの伝導率を有する、請求項1ないし19のいずれか1項に記載の方法。
- 当該精製方法において移動相として用いられる緩衝液の水素イオン指数がpH3.0〜9.0範囲内にある、請求項1ないし20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記イオン交換クロマトグラフィー担体が少なくとも強カチオン交換基を有する共重合体を備え、
前記共重合体が、前記強カチオン交換基を、N−イソプロピルアクリルアミドに対してモノマー換算で0.01〜500.00mol%含有する、
請求項1ないし21のいずれか1項に記載の方法。 - 前記イオン交換クロマトグラフィー担体が少なくとも強カチオン交換基を有する共重合体を備え、
前記共重合体が、前記強カチオン交換基を、N−イソプロピルアクリルアミドに対してモノマー換算で1〜300.00mol%含有する、
請求項1ないし21のいずれか1項に記載の方法。 - 前記強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部が、アクリル酸誘導体又はメタクリル酸誘導体であり、下記化学式(1)又は(2)で示される基を有する、請求項22又は23に記載の方法。
−CH(−OH)−CH2−SO3H ・・・(1)
−CH(−SO3H)−CH2−OH ・・・(2) - 前記強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部が、スルホン酸基を有するビニルモノマー由来である、請求項22又は23に記載の方法。
- 前記強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部が、R1、R2、R3のそれぞれをH又はMeとして下記化学式(3)で示される、請求項22ないし25のいずれか1項に記載の方法。
−CR1R2−CR3(−SO3H)− ・・・(3) - 前記イオン交換クロマトグラフィー担体が少なくとも強カチオン交換基を有する共重合体を備え、
前記共重合体が、前記強カチオン交換基を有するモノマー及び/又は強カチオン交換基導入前駆体モノマーを、N−イソプロピルアクリルアミドに対して0.01〜500.00mol%の割合で含有するモノマー組成物を、重合法によって重合して形成された、
請求項1ないし21のいずれか1項に記載の方法。 - 前記イオン交換クロマトグラフィー担体が少なくとも強カチオン交換基を有する共重合体を備え、
前記共重合体が、前記強カチオン交換基を有するモノマー及び/又は強カチオン交換基導入前駆体モノマーを、N−イソプロピルアクリルアミドに対して1〜300.00mol%の割合で含有するモノマー組成物を、重合法によって重合して形成された、
請求項1ないし21のいずれか1項に記載の方法。 - 前記強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部が、アクリル酸誘導体又はメタクリル酸誘導体であり、下記化学式(4)又は(5)で示される基を有する、請求項27又は28に記載の方法。
−CH(−OH)−CH2−SO3H ・・・(4)
−CH(−SO3H)−CH2−OH ・・・(5) - 前記強カチオン交換基導入前駆体モノマーの少なくとも一部が、アクリル酸誘導体又はメタクリル酸誘導体であり、前記共重合体が、下記化学式(6)又は(7)で示される側鎖を有する、請求項27又は28に記載の方法。
−CH(−OH)−CH2−SO3H ・・・(6)
−CH(−SO3H)−CH2−OH ・・・(7) - 前記強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部が、スルホン酸基を有するビニルモノマー由来である、請求項27又は28に記載の方法。
- 前記強カチオン交換基を有するモノマーの少なくとも一部が、スルホン酸基を有するビニルモノマーである、請求項27ないし31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部が、R1、R2、R3のそれぞれをH又はMeとして下記化学式(8)で示される、請求項27ないし32のいずれか1項に記載の方法。
−CR1R2−CR3(−SO3H)− ・・・(8) - 前記強カチオン交換基がスルホン酸基である、請求項22ないし33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記カチオン交換基密度が30mmol/L以上である、請求項22ないし34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記重合法が、表面リビングラジカル重合法である、請求項27ないし33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記重合法が、放射線グラフト重合法である、請求項27ないし33のいずれか1項に記載の方法。
- 基材と、前記基材表面に固定された、少なくともN−イソプロピルアクリルアミドをモノマー単位として含む共重合体と、を備えるイオン交換クロマトグラフィー担体であって、
前記共重合体が少なくとも強カチオン交換基を有し、
前記共重合体が、前記強カチオン交換基を有するモノマー及び/又は強カチオン交換基導入前駆体モノマーを、N−イソプロピルアクリルアミドに対して0.01〜500.00mol%の割合で含有するモノマー組成物を、重合法によって重合して形成されている、カチオン交換担体であるイオン交換クロマトグラフィー担体。 - 基材と、前記基材表面に固定された、少なくともN−イソプロピルアクリルアミドをモノマー単位として含む共重合体と、を備えるイオン交換クロマトグラフィー担体であって、
前記共重合体が少なくとも強カチオン交換基を有し、
前記共重合体中のN−イソプロピルアクリルアミドの質量割合が、1〜99%である、
カチオン交換担体であるイオン交換クロマトグラフィー担体。 - 前記共重合体中のN−イソプロピルアクリルアミドの質量割合が、20〜80%である請求項39に記載のカチオン交換担体であるイオン交換クロマトグラフィー担体。
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