KR102017649B1 - 알릴아민에 기반한, 단백질 정제용 신규한 크로마토그래피 매체 및 이의 유도체 - Google Patents

알릴아민에 기반한, 단백질 정제용 신규한 크로마토그래피 매체 및 이의 유도체 Download PDF

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Abstract

알릴아민 또는 폴리알릴아민으로 유도화된 다공성 매체 입자의 크로마토그래피 매체는 직접적으로 또는 그 표면상에서 분자간 중합화를 통해서 얻어지고, 그러한 매체는 추가의 관능화 기에 의해 관능화된다. 그러한 매체는 특히 생체 분자를 분리하는 데 유용하다.

Description

알릴아민에 기반한, 단백질 정제용 신규한 크로마토그래피 매체 및 이의 유도체{A NOVEL CHROMATOGRAPHIC MEDIA BASED ON ALLYLAMINE AND ITS DERIVATIVE FOR PROTEIN PURIFICATION}
본 발명은 일련의 신규한 크로마토그래피 매체들의 제조, 및 이 매체들을 생체 분자들을 분리하고 정제하는 목적에 사용하는 용도, 특히, 항체 및 다른 관련 단백질의 분리와 정제로의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 주요 리간드로서 알릴아민 및 폴리알릴아민의 기반된 신규한 크로마토그래피 매체 및 상이한 관능기로 변형하여 독특한 분리 특성을 지닌, 이온 교환, 소수성 및 다른 기능성 그로마토그래피 매체를 제조하는 것을 개시한다. 본 발명은 독특한 리간드 구조, 제조방법, 및 독특한 분리 성능으로 인해 상업적으로 이용가능한 크로마토그래피 매체와 다르다.
크로마토그래피 방법은 일반적으로 생체 분자들의 분리 및 정제에 있어서 가장 중요한 도구이다. 상위 기술들이 빠르게 발전함에 따라, 치료적 생체 분자들이 다량 및 고 농도로 생성될 수 있다. 하위 공정에 대한 출발 물질의 불순물 프로필은 발현 시스템, 성장 매체의 유형, 역가 농도와 같은 몇 가지 요인에 의존한다. 이것은 다양한 공정- 및 생산물-관련 불순물을 초래하게 되고 이는 반드시 최소의 단계를 가지는 강력한 정제 방법으로 제거되어야만 한다. 그러나, 능력과 분리 효율 면에서 하위적 발전 사항이 동시적으로 증가한 것은 아니었다. 이러한 요건을 충족시키기 위해, 고 단백질 결합능 및 분리 효율을 가진 크로마토그래피 매체가 활발하게 개발되고 있다.
일반적으로, 대부분 크로마토그래피 매체들은 상이한 유형의 흡착 및 분리를 제공하는 특정 관능 리간드를 가진 실리카 또는 폴리머 물질에 기반하고 있다. 예를 들어, 설폰산이나 카르복실산과 같은 음이온성 리간드는 양하전된 용질을 흡착할 것이고, 따라서, 양이온성 교환 기작에 기반한 분리를 수행한다; 그리고 특정 pH에서의 아민류와 같은 양이온성 리간드들은 음하전된 용질을 흡착할 것이고 따라서 음이온 교환 기작에 기반한 분리를 수행한다. 기본적으로, 리간드들의 본질이 분리 기작을 결정하며 한편으로 그 리간드들의 밀도가 매체의 능력에 큰 역할을 한다. 또한, 매체 능력은 표면적과 공극 부피와 같은 많은 다른 요소에 의해 조절되며, 소수성과 리간드 구조와 같은 요소들은 결합을 및 그래서 분리 특성을 결정짓는다. 또한, 리간드와 결합하는 스페이서의 본질 및 매체의 백본 표면 또한 스페이서의 친수성 또는 소수성에 따라 분리에 영향을 미친다. Macro-Prep® Ion Exchange Supports (Bio-Rad), POROS (Applied Biosystems), Sepharose FastFlow® (GE Healthcare Life Sciences), Toyopearl®(Tosoh Bioscience), PolyPEI 및 PolyCSx (Avantor Performance Materials, Inc. formerly Mallinckrodt Baker, Inc.)와 같은 상업적으로 이용가능한 크로마토그래피 매체는 표면에 부착된 상이한 기능성 이온교환 및 소수성 기를 포함하고 및 상이한 유형의 독점적 스페이서 또는 코팅물을 가지고 있다. 예를 들어, 폴리아민은 미국 특허 공개 제 2002/0134729호에 설명된 크로마토그래피 매체에 사용되었다; 그리고, 폴리에틸렌이민은 미국 특허 제4,551,245호에 설명된 크로마토그래피 매체 생성물에 사용되었다.
2002/0134729에서, 음이온 교환체들은 폴리머 표면을 고분자량 폴리아민, 바람직하게는 적어도 50,000의 분자량을 가지는 폴리에틸렌이민으로 개질함으로써 제조되었다. 미국 특허 제2005/0203029호에서, 폴리머 표면을 폴리에틸렌이민으로 개질하여 크로마토그래피 분리용의 원하는 표면 특성을 생성하였다. 이러한 과정에서, 일차 및 이차 아미노기들을 또한 폴리며 표면에 도입하였다. 그러한 아미노기들을 또한 이용하여 다양한 크로마토그래피 리간드들과 반응시켜 강한 양이온 교환체, 약한 양이온 교환체, 및 소수성 매체와 같은 상이한 매체를 제조하였다. 개질된 폴리머의 총 질소 함량은 통상 4 내지 7 %였다.
선행 미국 특허 공개 제 2008/003922호 및 제 2005/094581호에서, 폴리머 백본 표면을 비닐기를 포함하는 분자 또는 폴리에틸렌이민으로 개질하여 원하는 표면 특성을 크로마토그래피 분리용 매체에 제공하였다. 그러한 매체에서, 일차 및 이차 아미노기들을 또한 폴리머 표면 상에 도입하였다. 그러한 일차 또는 이차 아미노기들을 또한 이용하여 다양한 크로마토그래피 리간드들과 반응시켜, 강한 양이온 교환체, 약한 양이온 교환체 및 소수성 매체와 같은 상이한 매체를 제조하였다.
그러므로, 향상된 크로마토그래피 매체에 대한 필요, 및 이의 제조방법은, 물론 생체분자를 분리하는 데 사용되는 이의 적절한 용도가 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 크로마토그래피 매체, 및 예를 들어, 에폭시화된 또는 할로알킬화된 폴리메타크릴레이트와 같은, 에폭시 기 함유 또는 할로알킬 함유 고형 다공성 매체 지지체를, 알릴아민과 또는, 25000 이하의 분자량을 가지는 폴리알릴아민을 반응시킴으로써 직접적으로 얻어진 또는 접합된 알릴아민을 통한 분자간 중합화에 의해 얻어진, 알릴아민의 폴리알릴아민 유도체와 반응시킴으로써 신규한 크로마토그래피 매체를 제조하는 방법을 제공한다. 그의 백본의 표면 상에 알릴아민 또는 폴리알릴아민을 가진, 결과된 고형 크로마토그래피 매체 지지체는 다음, 다른 적절한 시약과 관능화시킴으로써 더 관능화되어 다양한 기능적 이온 교환 또는 소수성 매체를 제공한다. 상기 알릴아민 유도체들은 치환체를 가지거나 가지지 않은 폴리알릴아민을 포함한다. 에폭시 또는 할로알킬기 함유 폴리머와 같은 다공성 고형 매체 지지체는, 35 내지 110 미크론의 평균 직경을 가진, 구형 폴리머, 특히 폴리메타크릴레이트 또는 유사 폴리머일 수 있다. 본 발명에 사용하기 적절한 에폭시 또는 할로알킬기를 가진 다른 다공성 고형 지지체들은 예를 들어 에폭시화된 또는 할로알킬화된 폴리스티렌류, 폴리아크릴레이트류, 폴리메타크릴레이트류, 폴리디비닐벤젠류, 실리카, 키토산, 셀룰로스, 및 아가로스 기재 비드들을 포함한다. 단백질의 크로마토그래피성 분리에 사용되는 폴리머성 물질은 다음과 같은 특정 특성을 가질 것이다:
1) 공극 크기는 단백질만큼 큰 분자가 수지 입자 내로 및 밖으로 빠르게 확산시킬 수 있을 정도로 충분히 크다;
2) 상기 수지 입자는 단단하게 되어 크로마토그래피 작동 중에 만나는 압력 하에서 압축과 유동 속도의 감소를 피하게 될 것이다; 및
3) 상기 수지는 분리 과정에서 만나는 모든 조건 하에서 화학적으로 안정적이어야 한다.
본 발명에서, 알릴아민, 및 직접적으로 또는 분자간 중합화를 통해서 얻어진, 25000 미만의 분자량을 가진, 폴리알릴아민을 일차 리간드로서 사용할 수 있고, 또한 개질하여 구별된 특성을 지닌 약한 음이온, 약한 양이온 및 소수성 크로마토그래피 매체로서 사용될 수 있음이 발견되었다. 알릴아민 또는 폴리알릴아민 리간드로 생성된 상기 약한 음이온 매체는 단백질 분리에 직접적으로 사용될 수 있고, 또는 더 개질하여 강한 양이온 교환 매체, 강한 음이온 교환 매체 또는 소수성 크로마토그래피 매체를 생성할 수 있다. 기본적으로, 알릴아민이나 폴리알릴아민의 아미노기는 상기 폴리머 내의 에폭시 또는 할로젠화된 기와 반응하고, 이는 직접 사용시 약한 음이온 교환작용을 할 수 있다. 또한, 잔류하는 아미노 기들은 상이한 관능화 시약들과 더 반응하여 양이온 교환, 음이온 교환 또는 소수성 매체와 같은 상이한 관능성을 가진 크로마토그래피 매체를 만들 수 있다. 또한, 알릴아민이 반응물로서 사용된다면, 그 이중결합은 분자간 중합화와 같은 추가의 개질 및 추가의 관능화에 대한 가능성을 제공하여 새로운 이온 교환 또는 소수성 매체를 제공한다.
본 발명의 더 나은 이해를 위해, 다른 및 추가의 목적과 장점과 더불어, 하기 실시예와 연계하여, 하기 상세한 설명을 참조하며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에서 지적될 것이다. 하기 상세한 설명은 상기 설정된 장점들에 의해서 본 발명을 제한하는 것으로 의도된 것이 아니다.
도 1은 실시예 1에 따라 제조된 매체를 사용하여 실시예 2의 방식으로 단백질을 분리할 때, UV 검출기에 기록된 용출 프로필의 그래프이다;
도 2는 실시예 3에 따라 제조된 매체를 사용하여 실시예 4의 방식으로 단백질을 분리할 때, UV 검출기에 기록된 용출 프로필의 그래프이다;
도 3은 실시예 5에 따라 제조된 매체를 사용하여 실시예 6의 방식으로 단백질을 분리할 때, UV 검출기에 기록된 용출 프로필의 그래프이다;
도 4는 실시예 7에 따라 제조된 매체를 사용하여 실시예 8의 방식으로 단백질을 분리할 때, UV 검출기에 기록된 용출 프로필의 그래프이다;
도 5는 실시예 9에 따라 결정된 결합능의 차트이다;
도 6은 실시예 10에 따라 결정된 결합능의 차트이다;
도 7은 실시예 11에 따라 결정된 결합능의 차트이다; 및
도 8은 실시예 12에 따라 결정된 결합능의 차트이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 에폭시 또는 할로알킬기를 가진 구형 고체 다공성 매체로부터 신규한 크로마토그래피 매체의 제조 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따라서, 알릴아민 또는 이의 폴리알릴아민 유도체를 사용하여 다공성 매체를 개질하고, 이 후, 적절한 관능기를 가진 상이한 리간드들을 사용하여 추가로 관능화시킨다. 본 발명에 따라서, 강한 양이온 교환 매체는 (1) 에폭시 또는 할로알킬기를 함유한 다공성 고형 매체 비드와 반응시킴으로써, 및 조건적으로 (2) 그렇게 생성된 알릴아민 개질 매체를 추가의 다른 관능기, 예를 들어, 말레산 무수물과 반응시키고, 및 다음 (3) 그 생성물을 소듐 메타비설파이트 (Na2S205)와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 반응 온도 및 시간은 각각 40℃내지 80℃ 및 약 3시간 내지 약 16시간으로 가변될 수 있다. 알릴아민 또는 폴리알릴아민-유도 매체 입자와의 반응에 적절한 다른 적합한 관능화 시약은, 예를 들어, 글루타르산과 석신산 무수물과 같은 환형 카르복실산 무수물, 말레산 무수물과 같은 불포화 카르복실산 무수물, 바이설파이트 및 소듐 메타바이설파이트와 같은 설폰화 제제, 염화 부티릴 및 아세트산이나 부티르산 무수물과 같은 알킬 염화물이나 무수물, 및 (3-클로로-2-하이드록시프로필)트리메틸암모늄 클로라이드과 같은 4급 암모늄 관능성을 가지는 알킬 염화물, 및 이들 관능화 시약들의 혼합물이다.
일 구체예에서, 일차 리간드의 제조는 25000 미만의 분자량을 가진 폴리알릴아민과 에폭시, 또는 아민 관능기와 반응할 수 있는 할로알킬기, 예를 들어, 클로로메틸, 브로모메틸기를 가진 고형 다공성 입자와 반응함으로써 수행된다. 대안적으로, 유사한 일차 알릴아민 리간드는, 알릴아민을, 에폭시 또는 할로알킬기를 함유하는 고형 다공성 입자와 반응시킨 후, 자유라디칼 또는 분자간 중합화를 통한 다른 중합화 공정을 사용하여 부착된 알릴아민을 중합화함으로써 제조될 수 있다.
다른 구체예에서, 일차 리간드의 제조는 알릴아민을 에폭시, 또는 클로로메틸, 브로모메틸과 같은 할로알킬기를 함유하는 고형 다공성 입자와 먼저 반응시키고; 또는 다른 적절한 반응성 분체와 반응시킨 후 접합된 알릴아민을 과량의 알릴아민과 중합화시킨 다음, 아민과 반응시켜 다양한 관능기를 얻음으로써 알릴아민의 분자간 중합화를 통해 수행될 수 있다.
다른 구체예에서, 일차 알릴아민 리간드를 가진 매체의 제조는 에폭시나 할로알킬, 또는 아민과 반응하여 다양한 관능기를 얻을 수 있는 다른 적절한 반응분체를 가진 고형 다공성 입자와 반응시킴으로써 수행된다.
다른 구체예에서, 약한 양이온 교환 매체, 강한 양이온 교환 매체, 및 소수성 매체와 같은 다른 관능성들은 하기 실시예에 제시된 바와 같은, 적절한 관능화기를 가진 다른 관능 리간드를 사용하여 일차 알릴아민 리간드로부터 제조된다.
본 발명의 다른 관점은 하기를 포함한다. 일 관점은 다공성 매체 입자를 가지는 크로마토그래피 매체를 포함하는 것으로, 그 입자의 표면상에서 알릴아민 또는 폴리알릴아민으로 유도화된 다공성 매체입자를 가진다. 다른 관점은 그러한 크로마토그래피 매체를 포함하고, 여기서 상기 다공성 매체 입자들이 에폭시화 또는 할로알킬화된 실리카, 키토산, 셀룰로스, 아가로스, 폴리스티렌류, 폴리아크릴레이트류나 폴리메타크릴레이트류, 및 폴리디비닐벤젠류로 구성되는 군으로부터 선택되는 입자들을 포함한다. 다른 관점은 그러한 크로마토그래피 매체를 포함하는 데, 여기서, 상기 다공성 매체 입자는 에폭시화된 또는 할로알킬화된 폴리아크릴레이트류 또는 폴리메타크릴레이트류 폴리머를 포함한다. 또 다른 관점은 크로마토그래피 매체를 포함하며, 여기서 상기 입자의 표면상의 알릴아민 또는 폴리알릴아민으로 유도화된 다공성 매체 입자들은 적어도 하나의 다른 관능화 시약을, 상기 폴리머 수지의 표면상의 알릴아민이나 폴리알릴아민의 말단 아미노기와 반응함으로써 더 관능화된다. 또 다른 관점을 그러한 크로마토그래피 매체를 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 다른 관능화 제제는: 산 무수물, 설폰화 제제, 알킬 염화물, 4급 암모늄 관능성을 함유한 알킬 염화물, 및 이의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다. 또 다른 관점은 그러한 크로마토그래피 매체를 포함하는 데, 여기서 상기 관능화 시약은 환형 카르복실산 무수물, 불포화 카르복실산 무수물, 바이설파이트, 알킬 염화물, 알킬 무수물, 4급 암모늄 관능성을 함유한 알킬 염화물 및 이의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다른 관점은 그러한 크로마토그래피 매체를 포함하고 여기서 상기 적어도 하나의 다른 관능화 시약은 글루타르산 무수물, 석신산 무수물, 말레산 무수물, 소듐 메타-바이설파이트, 염화 부티릴, 아세트산 무수물, 부티르산 무수물, (3-클로로-2-하이드록시프로필) 염화 트리메틸암모늄, 및 이의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 관점은 전술한 크로마토그래피 매체 중 임의의 것으로 채워진 크로마토그래피용 컬럼을 포함한다. 본 발명의 또 다른 관점은 용액의 성분을 분리하는 방법으로서, 상기 용액을 그러한 크로마토그래피 컬럼을 통과시키고 및 상기 용액의 성분들을 용출하는 것을 포함한다. 본 발명의 다른 관점은 그러한 방법으로서, 여기서 상기 용액은 생체 분자를 함유하는 용액이다.
본 발명의 다른 관점에서, 에폭시 기 또는 할로알킬 기를 함유하는 고형 다공성 매체 입자들을 알릴아민 또는 폴리알릴아민 유도체와 반응시키는 것을 포함하는, 크로마토그래피 매체를 만드는 방법이 제공된다. 상기 만드는 방법의 다른 관점에서, 상기 폴리알릴아민은 알릴아민 또는 25000 이하의 분자량을 가지는 폴리알릴아민을 반응시킴으로써 또는 접합된 알릴아민을 통하여 분자간 중합화시킴으로써 수득된다.
다른 관점에서, 상기 크로마토그래피 매체는: i) 에폭시기 또는 할로알킬기를 함유하는 고형 다공성 매체입자를 알릴아민과 반응시켜 알릴아민이 접합된 폴리머를 형성하고, 및 ii) 상기 알릴아민이 접합된 중합체의 분자간 중합화를 개시함으로써 만들어질 수 있다. 다른 관점에서, 상기 분자간 중합화 단계는 라디칼 개시제와 과량의 알릴아민에 의해서 개시되며, 다른 관점에서, 라디칼 개시제는 아조비스이소부티로니트릴, 아세틸 페록사이드 또는 벤조일 페록사이드의 군으로부터 선택된다.
본 발명은 알릴아민, 및 직접적으로 또는 분자간 중합화를 통해 수득한 25000 미만의 분자량을 가지는 폴리알릴아민과 같은 그의 폴리머는 일차 리간드로서 사용될 수 있고, 이는 개질되어 독특한 특성을 지닌 약한 음이온, 약한 양이온 및 소수성 매체로서 사용될 수 있다는 것을 제공한다. 본 발명 하에서 생성된 크로마토그래피 매체는 공지된 기술과 화학 및 성능 면에서 완전히 다르며 독특한 것이다. 폴리에틸렌이민을 사용하면, 일차, 이차 및 삼차 아민들 제공하게 되는 반면 폴리알릴아민은 오로지 일차 아민 만을 제공한다. 그 백본 또한 상이하다. 폴리알릴아민은 현수 아민기를 가진 선형 알킬 사슬을 가진다. 본 발명자들은 본 발명의 방법과 조성물에 의해 얻어진 이러한 특징은 독특한 속성을 지는 상이한 생성물을 제공한다는 것을 밝혀냈다. 예를 들어, 개질된 폴리머의 총 질소 함량은 통상 1.0 내지 3.5 %의 범위이다. 상기 생성된 약한 음이온 교환체들은 직접적으로 단백질 분리에 사용되거나 또는 더 개질되어 강한 양이온 교환체, 음이온 교환체 또는 소수성 크로마토그래피 매체를 생성할 수 있다. 이러한 리간드는 알릴아민이나 폴리알릴아민의 아미노산을 상기 폴리머의 에폭시기와 반응시킴으로써 고정화되어, 약한 음이온 교환 크로마토그래피 매체를 제공할 수 있다.
또한, 잔류 아미노기들은 상이한 시약들과 더 반응하여 양이온 교환, 음이온 교환 또는 소수성 매체와 같은 상이한 기능성을 가진 크로마토그래피 매체를 만들 수도 있다. 또한, 상기 알릴아민 내의 알릴기는 분자간 중합화와 같은 추가의 개질에 대한 가능성을 제공하며 관능화되어 새로운 이온교환 또는 소수성 매체를 제공한다.
실시예
본 발명은 하기 대표적인 실시예에 의해 더 예증되나 그러나 이로 한정되지 않으며, 이들은 본 발명을 설명하기 위해 의도된 것으로 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 폴리알릴아민을 가진 일차 리간드 및 이온 교환 크로마토그래피 매체의 제조
15,000의 분자량을 가진 15 (w/w) % 폴리알릴아민을 함유한 수용액 100 ml 및 탈이온수 300 ml를 교반기, 콘덴서, 질소 유입구 및 온도 조절기가 구비된 1 리터들이 3-목 플라스크에 두었다. 활성 에폭시 기를 함유하는 35 미크론의 중간 입자 크기를 가진 폴리메타크릴레이트 폴리머 25 그람을 교반하면서 상기 반응기에 서서히 첨가하였다. 다음, 상기 플라스크를 80℃로 가열하고, 16 시간 반응시켰다. 반응 생성물을 탈이온수로 한 번 세척한 후, 1-메톡시-2-프로판올로 네 번 세척하였다. 원소 분석: C, 58.3%, H, 7.3%, N, 1.1%.
상기 반응에서 얻은 폴리머를 교반기, 콘덴서, 질소 유입구 및 온도 조절기가 구비된 1 리터들이 건조된 3-목 플라스크에 옮겼다. 1-메톡시-2-프로판올 400 ml 및 말레산 무수물 14.5 g을 질소하에서 상기 플라스크에 첨가하였다. 다음, 상기 플라스크를 60℃로 가열하고 3 시간 반응시켰다. 생성물을 탈이온수로 네 번 세척하였다.
상기 반응으로부터 얻은 말레산염화된 폴리머를 동일한 반응 기구로 다시 옮기고, 여기에 400 ml의 0.01 M NaOH 용액 및 56 g의 소듐 메타바이설파이트를 첨가하였다. 다음, 상기 플라스크를 80℃로 가열하고 4 시간 반응시켰다. 생성물을 탈이온수로 네 번 세척하였다. 원소 분석: C, 55.8%; H, 7.2%; N, 1.0%; S, 1.0%.
실시예 2: 실시예 1의 매체를 이용한 분리
실시예 1의 생성물을 100 x 7.75 mm ID 컬럼에 채웠다. 상기 컬럼을 50 mM MES (2-(N-모르폴리노)에탄설폰산) pH 5.6 완충액 (결합 완충액)으로 평형화시켰다. 평형화 후, 상기 컬럼에 2.0 mg/ml 오발부민, 2.0 mg/ml 토끼 IgG, 2.0 mg/ml 라이소자임을 함유한 결합 완충액 100 ul을 0.9 ml/분에서 주입하였다. 다음 컬럼을 1.0 M NaCl을 가진 0 내지 100% 선형구배의 50 mM MES pH 5.6 완충액 (용출 완충액)으로 26 분간 용출한 후, 100% 용출 완충액으로 또다른 12 분간 용출하였다. 실시예 1의 매체를 사용하여, 실시예 2에 따라서 시행하여, 분리한 결과가 도 1의 그래프에 도시되어 있다.
실시예 3: 분자간 중합화를 통한 일차 매체의 제조
10 g의 알릴아민을 400 ml의 l-메톡시-2-프로판올에 녹이고, 이 용액을 상기 반응에서 얻은 폴리머를 교반기, 콘덴서, 질소 유입구 및 온도 조절기가 구비된 1 리터들이 건조된 3-목 플라스크에 옮겼다. 활성 에폭시기를 함유한, 35 미크론의 중간 입자 크기를 가진 25 g의 폴리메타크릴레이트 폴리머를 상기 반응기에 서서히 첨가하였다. 다음, 상기 플라스크를 80℃로 가열하고 16 시간 반응시켰다. 반응 생성물을 탈이온수로 세척한 후, 알코올로 네 번 세척하였다.
상기 반응에서 얻은 알릴아민이 접합된 폴리머를 교반기, 콘덴서, 질소 유입구 및 온도 조절기가 구비된 1 리터들이 건조된 3-목 플라스크에 옮겼다. 이 플라스크에, 미리 질소로 정화시킨, 400 ml의 에탄올을 첨가하였다. 이 플라스크를 80℃로 가열하고, 0.6 g AIBN을 첨가한 다음, 주사기 펌프를 통해, 15 g의 알릴아민을 0.2 ml/분의 유동 속도로 첨가하고, 6 시간 반응시켰다. 생성물을 탈이온수로 세척한 후 1-메톡시-2-프로판올로 세 번 세척하였다. 원소 분석: C, 59.0 %; H, 7.7 %; N, 3.1 %.
다음, 상기 반응으로부터 얻은 폴리머를 교반기, 콘덴서, 질소 유입구 및 온도 조절기가 구비된 1 리터들이 건조된 3-목 플라스크로 옮겼다. 이 플라스크에, 400 ml의 l-메톡시-2-프로판올 및 14.5 g 말레산 무수물을 질소하에서 첨가하였다. 다음, 상기 플라스크를 80℃로 가열하고 3 시간 반응시켰다. 생성물을 탈이온수로 네 번 세척하였다.
상기 반응으로부터 얻은 말레산염화된 폴리머를 동일한 반응 기구로 다시 옮기고, 여기에 400 ml의 0.01 M NaOH 용액 및 56 g의 소듐 메타바이설파이트를 첨가하였다. 다음, 상기 플라스크를 80℃로 가열하고 4 시간 반응시켰다. 생성물을 탈이온수로 네 번 세척하였다. 원소 분석: C, 54.5 %; H, 7.8 %; N, 3.0 %; S, 2.0 %.
실시예 4: 실시예 3에서 얻은 매체를 이용한 분리
실시예 3의 생성물을 100 x 7.75 mm ID 컬럼에 채웠다. 상기 컬럼을 50 mM MES pH 5.6 완충액 (결합 완충액)으로 평형화시켰다. 평형화 후, 상기 컬럼에 2.0 mg/ml 오발부민, 2.0 mg/ml 토끼 IgG, 2.0 mg/ml 라이소자임을 함유한 결합 완충액 100 ul을 0.9 ml/분의 속도로 주입하였다. 다음 컬럼을 1.0 M NaCl을 가진 0 내지 100% 선형구배의 50 mM MES pH 5.6 완충액 (용출 완충액)으로 26 분간 용출한 후, 100% 용출 완충액으로 추가로 12 분간 용출하였다. 실시예 3의 매체를 사용하여, 실시예 4에 따라서 시행하여 분리한 결과가 도 2의 그래프에 도시되어 있다.
실시예 5: 알릴아민을 가진 일차 매체의 제조
5 g의 알릴아민을 200 ml의 l-메톡시-2-프로판올에 녹이고, 이 용액을 교반기, 콘덴서, 질소 유입구 및 온도 조절기가 구비된 1 리터들이 3-목 플라스크에 옮겼다. 교반 하에서, 활성 에폭시기를 함유한, 35 미크론의 중간 입자 크기를 가진 폴리메타크릴레이트 폴리머 12.5 g을 상기 반응기로 서서히 첨가하였다. 다음, 상기 플라스크를 80℃로 가열하고 6 시간 반응시켰다. 반응 생성물을 탈이온수로 세척한 후 후속적으로 1-메톡시-2-프로판올로 네 번 세척하였다. 원소 분석: C, 58.9 %; H, 7.3 %; N, 2.5 %.
다음 상기 반응에서 얻은 폴리머를 교반기, 콘덴서, 질소 유입구 및 온도 조절기가 구비된 1 리터들이 건조된 3-목 플라스크에 첨가하였다. 이 플라스크에, 200 ml의 l-메톡시-2-프로판올 및 7.3 g의 말레산 무수물을 질소하에서 첨가하였다. 다음, 상기 플라스크를 80℃로 가열하고 3 시간 반응시켰다. 생성물을 탈이온수로 네 번 세척하였다.
상기 반응으로부터 얻은 말레산염화된 폴리머를 동일한 반응 기구로 다시 옮기고, 여기에 200 ml의 0.01 M NaOH 용액 및 28 g의 소듐 메타바이설파이트를 첨가하였다. 다음, 상기 플라스크를 80℃로 가열하고 4 시간 반응시켰다. 생성물을 탈이온수로 네 번 세척하였다. 원소 분석: C, 52.4 %; H, 6.8 %; N, 2.3 %; S, 2.0 %.
실시예 6: 실시예 5의 매체를 사용한 분리
실시예 5의 생성물을 100 x 7.75 mm ID 컬럼에 채웠다. 상기 컬럼을 50 mM MES pH 5.6 완충액 (결합 완충액)으로 평형화시켰다. 평형화 후, 상기 컬럼에 2.0 mg/ml 오발부민, 2.0 mg/ml 토끼 IgG, 2.0 mg/ml 라이소자임을 함유한 결합 완충액 100 ul을 0.9 ml/분의 속도로 주입하였다. 다음 컬럼을 1.0 M NaCl을 가진 0 내지 100% 선형구배의 50 mM MES pH 5.6 완충액 (용출 완충액)으로 26 분간 용출한 후, 100% 용출 완충액으로 추가로 12 분간 용출하였다. 실시예 5의 매체를 사용하여, 실시예 6에 따라서 시행하여 분리한 결과가 도 3의 그래프에 도시되어 있다.
실시예 7: 폴리알릴아민을 가진 일차 리간드 및 이온 교환 크로마토그래피 매체의 제조
1000의 분자량을 가진 15 (w/w) % 폴리알릴아민을 함유한 수용액 100 ml 및 탈이온수 300 ml를 교반기, 콘덴서, 질소 유입구 및 온도 조절기가 구비된 1 리터들이 3-목 플라스크에 두었다. 활성 에폭시 기를 함유하는 35 미크론의 중간 입자 크기를 가진 폴리메타크릴레이트 폴리머 25 g을 교반하면서 상기 반응기에 서서히 첨가하였다. 다음, 상기 플라스크를 80℃로 가열하고, 16 시간 반응시켰다. 반응 생성물을 탈이온수로 한번 세척한 후, 1-메톡시-2-프로판올로 네번 세척하였다. 원소 분석: C, 58.3 %; H, 7.9 %; N, 1.7 %.
다음 상기 반응에서 얻은 폴리머를 교반기, 콘덴서, 질소 유입구 및 온도 조절기가 구비된 1 리터들이 건조된 3-목 플라스크에 첨가하였다. 이 플라스크에, 400 ml의 l-메톡시-2-프로판올 및 14.5 g의 말레산 무수물을 질소하에서 첨가하였다. 다음, 상기 플라스크를 80℃로 가열하고 3 시간 반응시켰다. 생성물을 탈이온수로 네 번 세척하였다.
상기 반응으로부터 얻은 말레산염화된 폴리머를 동일한 반응 기구로 다시 옮기고, 여기에, 400 ml의 0.01 M NaOH 용액 및 56 g의 소듐 메타바이설파이트를 첨가하였다. 다음, 상기 플라스크를 80℃로 가열하고 4 시간 반응시켰다. 생성물을 탈이온수로 네 번 세척하였다. 원소 분석: C, 54.3 %; H, 7.3 %; N, 1.5 %; S, 1.2 %.
실시예 8: 실시예 7의 매체를 이용한 분리
실시예 7의 생성물을 100 x 7.75 mm ID 컬럼에 채웠다. 상기 컬럼을 50 mM MES pH 5.6 완충액 (결합 완충액)으로 평형화시켰다. 평형화 후, 상기 컬럼에 2.0 mg/ml 오발부민, 2.0 mg/ml 토끼 IgG, 2.0 mg/ml 라이소자임을 함유한 결합 완충액 100 ul을 0.9 ml/분의 속도로 주입하였다. 다음 컬럼을 1.0 M NaCl을 가진 0 내지 100% 선형구배의 50 mM MES pH 5.6 완충액 (용출 완충액)으로 26 분간 용출한 후, 100% 용출 완충액으로 추가로 12 분간 용출하였다. 실시예 7의 매체를 사용하여, 실시예 8에 따라서 시행하여 분리한 결과가 도 4의 그래프에 도시되어 있다.
실시예 9: 실시예 7의 매체를 이용한 처리능 시험
실시예 7의 생성물을 VersaTen (100 X 7.75 mm ID) 컬럼에 채웠다. 상기 컬럼을, 전도도가 NaCl에 의해 3 mS/cm로 조절된 50 mM MES pH 5.6 완충액 (결합 완충액)으로 평형화시켰다. IgG 샘플 용액을 만들기 위해, 360 mg의 인간 감마 글로불린 (Sigma PN G4386)을 180 ml의 결합 완충액에 용해하였다. 정제하고 초음파 처리후, 샘플 용액을 상기 컬럼에 1.0 ml/분의 유동속도로 주입하였다. 샘플 주입 후, 상기 컬럼을 결합 완충액으로 20 분간 세척하고; 결합된 IgG를 1.0 M NaCl을 함유한 50 mM MES pH 5.0 완충액으로 동일한 유동 속도로 용출하였다. 여과물을 UV 280 nm로 조사하였다. 10% 격변(breakthrough)에서의 동적 결합능이 66.5 mg/ml으로 계산되었다. 실시예 7의 매체에 대한 실시예 9에 따른 처리능 시험 결과가 도 5에 도시되어 있다.
실시예 10: 실시예 1의 매체에 대한 처리능 시험
실시예 1의 생성물을 VersaTen (100 X 7.75 mm ID) 컬럼에 채웠다. 상기 컬럼을, 전도도가 NaCl에 의해 3 mS/cm로 조절된 50 mM MES pH 5.6 완충액 (결합 완충액)으로 평형화시켰다. IgG 샘플 용액을 만들기 위해, 360 mg의 인간 감마 글로불린을 180 ml의 결합 완충액에 용해하였다. 정제하고 초음파 처리후, 이 샘플 용액을 상기 컬럼에 1.0 ml/분의 유동속도로 주입하였다. 샘플 주입 후, 상기 컬럼을 결합 완충액으로 20 분간 세척하고; 결합된 IgG를 1.0 M NaCl을 함유한 50 mM MES pH 5.0 완충액으로 동일한 유동 속도로 용출하였다. 여과물을 UV 280 nm에서 조사하였다. 10% 격변 (breakthrough)에서의 동적 결합능이 52.1 mg/ml으로 계산되었다. 실시예 1의 매체에 대한 실시예 10에 따른 처리능 시험 결과가 도 6에 도시되어 있다.
실시예 11: 실시예 5의 매체에 대한 처리능 시험
실시예 5의 생성물을 VersaTen (100 X 7.75 mm ID) 컬럼에 채웠다. 상기 컬럼을, 전도도가 NaCl에 의해 3 mS/cm로 조절된 50 mM MES pH 5.6 완충액 (결합 완충액)으로 평형화시켰다. IgG 샘플 용액을 만들기 위해, 400 mg의 인간 감마 글로불린을 200 ml의 결합 완충액에 용해하였다. 정제하고 초음파 처리후, 이 샘플 용액을 상기 컬럼에 2.0 ml/분의 유동속도로 주입하였다. 샘플 주입 후, 상기 컬럼을 결합 완충액으로 20 분간 세척하고; 결합된 IgG를 1.0 M NaCl을 함유한 50 mM MES pH 5.0 완충액으로 동일한 유동 속도로 용출하였다. 여과물을 UV 280 nm에서 조사하였다. 10% 격변 (breakthrough)에서의 동적 결합능이 54.3 mg/ml으로 계산되었다. 실시예 5의 매체에 대한 실시예 11에 따른 처리능 시험 결과가 도 7에 도시되어 있다.
실시예 12: 실시예 3의 매체에 대한 처리능 시험
실시예 3의 생성물을 VersaTen (100 X 7.75 mm ID) 컬럼에 채웠다. 이 컬럼을, 전도도가 NaCl에 의해 3 mS/cm로 조절된 50 mM MES pH 5.6 완충액 (결합 완충액)으로 평형화시켰다. IgG 샘플 용액을 만들기 위해, 400 mg의 인간 감마 글로불린을 200 ml의 결합 완충액에 용해하였다. 정제하고 초음파 처리후, 이 샘플 용액을 상기 컬럼에 2.0 ml/분의 유동속도로 주입하였다. 샘플 주입 후, 상기 컬럼을 결합 완충액으로 20 분간 세척하고; 결합된 IgG를 1.0 M NaCl을 함유한 50 mM MES pH 5.0 완충액으로 동일한 유동 속도로 용출하였다. 여과물을 UV 280 nm에서 조사하였다. 10% 격변 (breakthrough)에서의 동적 결합능이 55.6 mg/ml으로 계산되었다. 실시예 3의 매체에 대한 실시예 12에 따른 처리능 시험 결과가 도 8에 도시되어 있다.
상기 설정된 실시예들은 본 발명의 실제 작용 구체예를 특정적으로 설명한 것이다. 도면에서 설정된 결과들은 본 발명을 사용하여 독특하고 높은 효율적인 분리 특성을 증명하고 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예라고 현재 고려되는 것들이 설명되어 있지만, 당해 분야의 숙련자들은 본 발명의 사상을 이탈하지 않고 변화와 변형이 가능하다는 것을 이해하고 있고, 그러한 변화와 변형 모두는 본 발명의 진정한 범위내에 있다는 것을 청구하는 것으로 의도된다.

Claims (23)

  1. 에폭시화된 또는 할로알킬화된 폴리아크릴레이트류 폴리머 또는 폴리메타크릴레이트류 폴리머 및 폴리알릴아민 간의 반응; 또는 에폭시화된 또는 할로알킬화된 폴리아크릴레이트류 폴리머 또는 폴리메타크릴레이트류 폴리머를 알릴아민과 접합하여 수득한 폴리머와 알릴아민의 분자간 중합화를 통해 그 표면 상에서 알릴아민 또는 폴리알릴아민으로 유도화된 다공성 매체 입자를 포함하는 크로마토그래피 매체.
  2. 제1항에 있어서, 표면 상에서 알릴아민이나 폴리알릴아민으로 유도화된 상기 다공성 매체 입자는 적어도 하나의 다른 관능화 시약과, 상기 알릴아민이나 폴리알릴아민의 말단 아미노기와 반응함으로써 더 관능화된, 크로마토그래피 매체.
  3. 제1항에 있어서, 표면 상에서 알릴아민이나 폴리알릴아민으로 유도화된 상기 다공성 매체 입자는 적어도 하나의 다른 관능화 시약과, 상기 폴리머 수지의 표면상의 상기 알릴아민이나 폴리알릴아민의 말단 아미노기와 반응함으로써 더 관능화된, 크로마토그래피 매체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다른 관능화 제제는: 산 무수물, 설폰화 제제, 알킬 염화물, 및 4급 암모늄 관능성을 함유한 알킬 염화물, 및 이의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는, 크로마토그래피 매체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 관능화 시약은 환형 카르복실산 무수물, 불포화 카르복실산 무수물, 바이설파이트, 알킬 염화물, 알킬 무수물, 4급 암모늄 관능성을 함유한 알킬 염화물 및 이의 혼합물로부터 구성되는 군으로부터 선택되는, 크로마토그래피 매체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다른 관능화 시약은: 글루타르산 무수물, 석신산 무수물, 말레산 무수물, 소듐 메타-바이설파이트, 염화 부티릴, 아세트산 무수물, 부티르산 무수물, (3-클로로-2-하이드록시프로필)트리메틸암모늄 클로라이드, 및 이의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는, 크로마토그래피 매체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 다공성 매체 입자는 25000 미만의 분자량을 가지는 폴리알릴아민으로 유도화되는, 크로마토그래피 매체.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제3항의 크로마토그래피 매체로 채워진, 크로마토그래피용 컬럼.
  11. 제6항의 크로마토그래피 매체로 채워진, 크로마토그래피용 컬럼.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 용액의 성분들을 분리하는 방법에 있어서, 상기 용액을 제10항의 크로마토그래피 컬럼을 통해 통과시키고, 및 상기 용액의 성분들을 용출시키는 것을 포함하는 방법.
  15. 용액의 성분들을 분리하는 방법에 있어서, 상기 용액을 제11항의 크로마토그래피 컬럼을 통해 통과시키고, 및 상기 용액의 성분들을 용출시키는 것을 포함하는 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 용액은 생체 분자를 함유하는 용액인 방법.
  17. 에폭시기 또는 할로알킬기를 함유하는 고형 다공성 매체 입자를 알릴아민 또는 폴리알릴아민 유도체와 반응시키는 것을 포함하는, 제 1항에 따른 크로마토그래피 매체를 제조하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 폴리알릴아민은 알릴아민 또는 25000 이하의 분자량을 가지는 폴리알릴아민을 반응시킴으로써 또는 접합된 알릴아민을 통한 분자간 중합화에 의해 얻어지는, 방법.
  19. i) 에폭시기 또는 할로알킬기를 함유하는 고형 다공성 매체입자를 알릴아민과 반응시켜 알릴아민이 접합된 폴리머를 형성하고, 및
    ii) 상기 알릴아민으로 접합된 폴리머의 분자간 중합화를 개시하는 것을 포함하는, 제 1항에 따른 크로마토그래피 매체 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 분자간 중합화 개시 단계는 라디컬 개시제 및 과량의 알릴아민에 의해 개시되는, 크로마토그래피 매체 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 라디컬 개시제는 아조비스이소부티로니트릴, 아세틸 페록사이드 또는 벤조일 페록사이드의 군으로부터 선택되는, 크로마토그래피 매체 제조 방법.

  22. 삭제
  23. 삭제
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