CN106000364B - 琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质及制备方法与应用 - Google Patents

琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质及制备方法与应用。琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质；其色谱介质是平均粒径50‑170μm的琼脂糖凝胶颗粒，表面通过环氧基间隔臂引入聚乙烯亚胺接枝链，然后通过聚乙烯亚胺接枝链上的氨基与琥珀酸酐相结合，得到羧基离子交换容量为150‑970mmol/L的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质。本发明的琥珀酸酐修饰量的聚乙烯亚胺接枝介质或对蛋白质具有较高的吸附速率或对蛋白质具有很强的吸附特性，表现出了较高的静态吸附容量，且对盐浓度有较好的耐受性。介质清洗、除菌方便，易于再生，生物相容性好，制备方法简单、价格低廉，在蛋白质的分离纯化中将有广阔的应用前景。

Description

琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质及制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质及制备方法与应用，属于生物技术领域中的蛋白质色谱分离技术。
背景技术
基因工程和重组DNA技术的发展促进了对重组或天然蛋白以及生物大分子如质粒DNA和病毒样颗粒的需求。对于生物制药行业来说，核心问题就是向一个高要求和规范化的市场提供这些新的治疗产品。虽然这些生物大分子的上游加工过程在产品产量方面取得了明显的进步，但下游的生物加工和纯化过程依然制约着生物大分子的生产，需要加以简化并降低生产成本。色谱技术尤其是离子交换色谱，因其分离精度高，设备简单，操作方便，广泛用于生物大分子下游加工过程中。
目前接枝型介质以其在高流速下仍具有高动态结合容量的特性而受到广泛关注，成为近年来研究的热点。相较于传统的非接枝介质，接枝层的存在，能够使蛋白的吸附从二维表面扩展到三维空间，提升了介质的静态吸附容量。同时接枝层内部存在的静电耦合，链传递等传质机理能够极大的提高蛋白质的吸附速率。
聚乙烯亚胺是一种具有良好生物相容性的线性分支聚合物，其分支中伯仲叔胺的比例为1:2:1。Lin-Ling Yu等人将适量的聚乙烯亚胺作为接枝链接枝到传统的色谱介质上，获得了一种性质优良的具有高静态吸附容量和吸附速率的阴离子交换色谱介质(Protein adsorption to poly(ethylenimine)-modified Sepharose FF:I.A criticalionic capacity for drastically enhanced capacity and uptake kinetics[J].Journal of Chromatography A,2013,1305(1):76-84),同时此介质在高盐条件下也有良好的表现(Protein adsorption to poly(ethylenimine)-modified Sepharose FF:II.Effect of ionic strength[J].Journal of Chromatography A,2013,1305(1):85-93)。为进一步扩展聚乙烯亚胺接枝介质在阳离子交换色谱中的应用，本发明利用琥珀酸酐进一步修饰聚乙烯亚胺，使聚乙烯亚胺接枝介质转化为表面带有羧基基团的阳离子交换色谱介质。通过调节琥珀酸酐的修饰量得到具有不同羧基离子交换容量的介质，该介质具有高蛋白吸附速率或高静态吸附容量。制备工艺简单，生物相容性好，成本低廉，非常适用于蛋白质的分离纯化过程中。
发明内容
本发明的目的在于在聚乙烯亚胺接枝介质的基础上，进一步开发一种具有羧基离子交换基团的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝阳离子交换色谱介质。所述介质 或能明显提高蛋白的吸附速率，或能大幅提高蛋白的静态吸附容量，且可在较宽的盐浓度范围内使用。介质制备方法过程简单，羧基离子交换容量可调节。
本发明的技术方案概述如下：
一种琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质；其色谱介质是平均粒径50-170μm的琼脂糖凝胶颗粒，表面通过环氧基间隔臂引入聚乙烯亚胺接枝链，然后通过聚乙烯亚胺接枝链上的氨基与琥珀酸酐相结合，得到具有羧基离子交换基团的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质。
本发明的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质的制备方法；步骤如下：
1)通过环氧基间隔臂在琼脂糖凝胶表面引入聚乙烯亚胺接枝链，然后将离子交换容量为740mmol/L的聚乙烯亚胺接枝介质利用N,N-二甲基甲酰胺浸泡，直至将孔内溶剂完全替换为N,N-二甲基甲酰胺；
2)将步骤1)得到的介质加入到N,N-二甲基甲酰胺中，制备介质悬浮液，N,N-二甲基甲酰胺体积用量为介质体积量的4倍；
3)向步骤2)得到的介质悬浮液中加入琥珀酸酐，琥珀酸酐用量为0.0222-0.74g/g介质；混合均匀后置于室温水浴过夜；然后依次用N,N-二甲基甲酰胺，乙醇和水冲洗介质，制得琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质。
所述室温过夜条件优选为：25℃的恒温水浴，170rpm反应24h。
制得的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质的羧基离子交换容量为150-970mmol/L。
本发明的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质应用于蛋白质分离纯化。
本发明的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质，结构示意表达式如下，但不代表真实的配基比例及分布：
其中黑色树枝状接枝层为简化聚乙烯亚胺结构式，聚乙烯亚胺分子量(MW)为1200–750000Da，结构式如下，
琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质应用于蛋白质分离纯化中，合适的羧基离子交换容量能够提升蛋白质的吸附速率或宽盐浓度范围(20-150mol/L)内蛋白质的静态吸附容量。
离子交换容量为740mmol/L的聚乙烯亚胺接枝介质已经证实具有良好的蛋白吸附性能(Protein adsorption to poly(ethylenimine)-modified Sepharose FF:I.Acritical ionic capacity for drastically enhanced capacity and uptake kinetics[J].Journal of Chromatography A,2013,1305(1):76-84)。
本发明主要是琥珀酸酐用量的选择，合适的琥珀酸酐量有利于获得具有不同羧基离子交换容量的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质。
经实验证明，本发明的琥珀酸酐修饰量的聚乙烯亚胺接枝介质或对蛋白质具有较高的吸附速率或对蛋白质具有很强的吸附特性，表现出了较高的静态吸附容量，且对盐浓度有较好的耐受性。介质清洗、除菌方便，易于再生，生物相容性好，制备方法简单、价格低廉，在蛋白质的分离纯化中将有广阔的应用前景。
附图说明
图1：溶菌酶在实施例4中琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质和商品化SPSepherose FF介质中的溶液溶度随时间的变化曲线；
图2：实施例5和实施例6所制备的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质与商品化SPSepharose FF介质在不同氯化钠浓度下(0、20、50、100、150mmol/L)对溶菌酶的静态吸附容量。
具体实施方式
下面的实例将对本发明的方法予以进一步的说明。
实施例1
1)通过环氧基间隔臂在琼脂糖凝胶表面引入聚乙烯亚胺接枝链，然后取5g离子交换容量为740mmol/L的聚乙烯亚胺接枝介质利用N,N-二甲基甲酰胺浸泡，直至将孔内溶剂完全替换为N,N-二甲基甲酰胺；
2)将步骤1)得到的介质利用G3漏斗抽干后置于50mL锥形瓶中，然后向锥形瓶中继续加入20mL N,N-二甲基甲酰胺，混合均匀，制备介质悬浮液；
3)向步骤2)得到的介质悬浮液中加入0.111g琥珀酸酐，混合均匀后置于25℃的恒温水浴，170rpm反应24h，之后依次用N,N-二甲基甲酰胺，乙醇和水冲洗介质，获得羧基离子交换容量为150mmol/L的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质。
实施例2
将实施例1中琥珀酸酐的加入量变为0.2294g，其他条件不变的情况下，获得羧基离子交换容量为240mmol/L的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质。
实施例3
将实施例1中琥珀酸酐的加入量变为0.296g，其他条件不变的情况下，获得羧基离子交换容量为270mmol/L的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质。
实施例4
将实施例1中琥珀酸酐的加入量变为0.37g，其他条件不变的情况下，获得羧基离子交换容量为350mmol/L的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质。
实施例5
将实施例1中琥珀酸酐的加入量变为0.555g，其他条件不变的情况下，获得羧基离子交换容量为570mmol/L的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质。
实施例6
将实施例1中琥珀酸酐的加入量变为3.7g，其他条件不变的情况下，获得羧基离子交换容量为970mmol/L的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质。
实施例7
将实施例4中介质用20mmol/L Tris–HCl缓冲液(pH 8)平衡后，经G3漏斗抽干后称取0.3g加入100mL含有1mg/mL的溶菌酶的相应平衡缓冲液中，上述介质悬浮液置于25℃恒温水浴，搅拌速度为280rpm，通过实时在线检测蛋白质溶液在280nm下的吸光值，从而确定蛋白质溶液浓度随时间变化的曲线，求得蛋白质在介质中的传质速率，用有效孔扩散系数与溶菌酶在自由溶液中扩散系数的比值(De/D0)来代表。在实验条件下下，介质的De/D0值为0.64±0.03。
将商品化介质SP Sepharose FF用20mmol/L Tris–HCl缓冲液(pH 8)平衡后，经G3漏斗抽干后称取0.3g加入100mL含有1mg/mL的溶菌酶的相应的平衡缓冲液中，上述介质悬浮液置于25℃恒温水浴，搅拌速度为280rpm，通过实时在线检测蛋白质溶液在280nm下的吸光值，从而确定蛋白质溶液浓度随时间变化的曲线，求得蛋白质在介质中的传质速率，用有效孔扩散系数与溶菌酶在自由溶液中扩散系数的比值(De/D0)来代表。在实验条件下下，介质的De/D0值为0.12±0.01。
溶菌酶在琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质(实施例4)和商品化SP SepharoseFF介质中的溶液溶度随时间变化的曲线如图1所示。
由结果可知，在上述实验条件下，琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质(实施例4)对溶菌酶的吸附速率是商品化介质SP Sepharose FF的5.33倍。这说明合适的琥珀酸酐修饰密度的聚乙烯亚胺接枝介质能够显著提升蛋白质的吸附速率。
实施例8
将实施例5中琥珀酸酐修饰的聚乙烯亚胺接枝介质分别用含有不同浓度(0、20、50、100、150mmol/L)的氯化钠的20mmol/L Tris–HCl缓冲液(pH 8)平衡后，再将G3漏斗抽干的0.05g平衡后介质分别加入到5mL用平衡缓冲液配制的含有不同浓度的溶菌酶溶液中，上述介质悬浮液置于25℃，170rpm恒温水浴震荡24h后，离心收集上清液在280nm下测吸光值，通过物料衡算确定蛋白质在介质上的吸附量。在0-150mmol/L氯化钠浓度下，介质的静态吸附容量为101-307mg/mL。
将实施例6中琥珀酸酐修饰的聚乙烯亚胺接枝介质分别用含有不同浓度(0、20、50、100、150mmol/L)的氯化钠的20mmol/L Tris–HCl缓冲液(pH 8)平衡后，再将G3漏斗抽干的0.05g平衡后介质分别加入到5mL用平衡缓冲液配制的含有不同浓度的溶菌酶溶液中，上述介质悬浮液置于25℃，170rpm恒温水浴震荡24h后，离心收集上清液在280nm下测吸光值，通过物料衡算确定蛋白质在介质上的吸附量。在0-150mmol/L氯化钠浓度下，介质的静态吸附容量为217-280mg/mL。
比较：将商品化介质SP Sepharose FF分别用含有不同浓度(0、20、50、100、150mmol/L)的氯化钠的20mmol/L Tris–HCl缓冲液(pH 8)平衡后，再将G3漏斗抽干的0.05g平衡后介质分别加入到5mL用平衡缓冲液配制的含有不同浓度的溶菌酶溶液中，上述介质悬浮液置于25℃，170rpm恒温水浴震荡24h后，离心收集上清液在280nm下测吸光值，通过物料衡算确定蛋白质在介质上的吸附量。在0-150mmol/L氯化钠浓度下，介质的静态吸附容量为64-216mg/mL。
琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质(实施例5和实施例6)与商品化介质SPSepharose FF在不同氯化钠浓度下对溶菌酶的静态吸附容量如表1所示，相应的静态吸附容量随盐浓度的变化曲线如图2所示。
表1介质在不同氯化钠浓度下对溶菌酶的静态吸附容量(mg/mL)。
由结果可知，在上述实验中的氯化钠浓度下，琥珀酸酐修饰的聚乙烯亚胺接枝介质(实施例5和实施例6中介质)对溶菌酶的静态吸附容量及其对盐浓度的耐受程度均高于商品化介质SP Sepharose FF。这说明合适的琥珀酸酐修饰密度的聚乙烯亚胺接枝介质明显提高了蛋白质的静态吸附容量。
本发明提出的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质在提高蛋白质的吸附速率或静态吸附容量中的应用，已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (2)

1.一种琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝阳离子交换色谱介质；其特征是色谱介质是平均粒径50-170μm的琼脂糖凝胶颗粒，表面通过环氧基间隔臂引入聚乙烯亚胺接枝链，然后通过聚乙烯亚胺接枝链上的氨基与琥珀酸酐相结合，得到羧基离子交换容量为150-570mmol/L的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝阳离子交换色谱介质；其具体制备方法如下：
1)通过环氧基间隔臂在琼脂糖凝胶表面引入聚乙烯亚胺接枝链，然后将离子交换容量为740mmol/L的聚乙烯亚胺接枝介质利用N,N-二甲基甲酰胺浸泡，直至将孔内溶剂完全替换为N,N-二甲基甲酰胺；
2)将步骤1)得到的介质加入到N,N-二甲基甲酰胺中，制备介质悬浮液，N,N-二甲基甲酰胺体积用量为介质体积量的4倍；
3)向步骤2)得到的介质悬浮液中加入琥珀酸酐，琥珀酸酐用量为0.0222-0.111g/g介质；混合均匀后置于室温水浴过夜；然后依次用N,N-二甲基甲酰胺，乙醇和水冲洗介质，制得琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝阳离子交换色谱介质。
2.如权利要求1所述一种琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝阳离子交换色谱介质，其特征是所述室温过夜条件为：25℃的恒温水浴，170rpm反应24h。
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