ES2621945T3 - Medio de cromatografía - Google Patents

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ES2621945T3
ES2621945T3 ES14786703.0T ES14786703T ES2621945T3 ES 2621945 T3 ES2621945 T3 ES 2621945T3 ES 14786703 T ES14786703 T ES 14786703T ES 2621945 T3 ES2621945 T3 ES 2621945T3
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English (en)
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Oliver HARDICK
Daniel Gilbert BRACEWELL
Stewart DODS
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Puridify Ltd
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Abstract

Un proceso para preparar un medio de cromatografía polimérico funcionalizado, proceso que comprende (I) proporcionar dos o más hojas no tejidas apiladas una encima de la otra, comprendiendo cada dicha hoja una o más nanofibras de polímero, donde las nanofibras de polímero tienen diámetros medios de 10 nm a 1000 nm, (II) calentar y comprimir simultáneamente la pila de hojas para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras de hojas adyacentes, y (III) poner en contacto el producto comprimido y calentado con un reactivo que funcionaliza el producto de la etapa (II) como medio de cromatografía.

Description

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DESCRIPCION
Medio de cromatograffa Campo de la invencion
La invencion se refiere a medios de cromatograffa funcionalizados que son adecuados para aislar moleculas biologicas de fases moviles.
Antecedentes a la invencion
El mercado de la biotecnologfa es el sector que esta creciendo mas rapido dentro del mercado farmaceutico mundial, representando el 20 % (153 billones de dolares) de todas las ventas en el mercado en 2012. Este crecimiento del 10 % de la participacion de mercado en 2002 esta establecido que crezca el 41 % entre 2012 y 2018 de 153 billones de dolares a 215 billones de dolares. Actualmente hay aproximadamente 200 productos de anticuerpos monoclonales (mAb) en el mercado y con mas de 1000 en ensayos clfnicos la necesidad de avance tecnologico en esta area es evidente. Con respecto a la ultima decada, los tftulos de fermentacion tfpicos de biomoleculas han crecido de 0,5 g/l - 50 g/l, y mientras que los procesos de purificacion aguas abajo tambien han recibido alguna investigacion y desarrollo, mejoras en este area no se han correspondido con aquellas aguas arriba. Las operaciones de unidades de cromatograffa fuertemente basadas en unir / eluir son, en terminos economicos, la clave para avances en el procesamiento aguas abajo de biomoleculas, tales como mAb. La cromatograffa explica una parte muy significativa de los costes de procesamiento aguas abajo de las biomoleculas, que a su vez afecta los costes globales de las propias biomoleculas.
Historicamente, la cromatograffa de lecho empaquetado convencional ha sido una herramienta de separacion extremadamente poderosa. Sin embargo, esta siendo cada vez mas evidente que deben emplearse sistemas radicalmente nuevos para permitir que las biomoleculas se recuperen eficiente y economicamente despues de la preparacion.
Un area que ha visto desarrollo es la sfntesis de nuevos ligandos para sustituir los actuales ligandos de afinidad caros.
Otra via que ha sido explorada es la modificacion de estructuras de soporte convencionales tales como adsorbentes de lecho empaquetado de perlas porosas. Esto es normalmente para tratar inconvenientes asociados a tales adsorbentes, en particular problemas con la cafda de presion y los tiempos de residencia. Estos inconvenientes normalmente producen separaciones ineficientes. El desarrollo de nuevas estructuras de adsorbente que permitan operacion independiente del caudal ofrece la ventaja de elevado rendimiento, pero solo se ha demostrado que es generalmente util a pequena escala. Los problemas con el incrustamiento de adsorbente son comunes, y esto limita frecuentemente las tecnicas de separacion cromatografica a operaciones de pulido de etapa tardfa. Debe hacerse una compensacion entre la incrustacion y la capacidad de captura con respecto a los tamanos de poro de adsorbente. Se requieren pequenos tamanos de poro para la buena separacion con curvas de rendimiento afiladas, pero producen elevado incrustamiento. En cambio, adsorbentes de tamano de poro mas grande (10 pm - 150+pm) pueden ofrecer mejor manipulacion de los incrustantes, pero biomoleculas diana pequenas pueden pasar a traves de un adsorbente tal sin union.
Mas recientemente, se ha informado de cromatograffa de membrana como una alternativa potencialmente viable en el modo de captura de contaminantes.
Otro foco de la investigacion ha sido el desarrollo de estructuras monolfticas que han demostrado ofrecer buena separacion para biomoleculas grandes tales como plasmidos y virus debido a poros relativamente grandes presentes sobre la superficie. La tendencia de la industria actual a moverse hacia sistemas de un solo uso favorece la cromatograffa de membrana, ya que la economfa de las membranas de un solo uso es mas favorable que las columnas de lecho empaquetado de un solo uso.
Otra via para el desarrollo es un cambio a procesamiento continuo. La marcha hacia el procesamiento continuo puede permitir lograr eficiencias en muchos sistemas. Asf, la operacion continua presenta oportunidades para la monitorizacion de procesos en tiempo real y el control automatizado con posibles beneficios que incluyen especificacion de producto predecible, costes de laboratorio reducidos e integracion con otros procesos continuos. Sin embargo, hasta la fecha se ha desarrollado poco con respecto a la operacion de cromatograffa realmente continua.
Por tanto, se apreciara que hay muchas vfas diferentes de investigacion que se emplean para proporcionar procesos mejorados para recuperar biomoleculas.
Las nanofibras polimericas electrohiladas tienen propiedades que ofrecen una posible solucion a los problemas observados con matrices de soporte convencionales usadas en el bioprocesamiento aguas abajo. Sus propiedades
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se prestan facilmente a superficies de soporte de ligando con las posibilidades de operaciones de alta capacidad y de alta velocidad de transferencia de masa, dando asf union independiente del caudal con una alta porosidad y sistema de tamano de poro de superficie relativamente pequena.
Se ha informado de cartuchos de adsorbente que contienen nanofibras polimericas electrohiladas con funcionalidad de dietilaminoetilo (DEAE) con capacidades de union de aproximadamente el 10 % de un sistema de lecho empaquetado ffpico, pero con caudales de aproximadamente cincuenta veces el de un sistema de lecho empaquetado ffpico. Tales sistemas de nanofibra presentan una relacion de area superficial con respecto a volumen similar a la de un sistema de perlas poroso. Sin embargo, tales sistemas de nanofibra existentes tienen capacidades de union algo mas bajas que los sistemas de lecho empaquetado ffpicos. Los sistemas de nanofibra conocidos tambien muestran mala reproducibilidad cuando la misma membrana se usa multiples veces. Esto representa un ffmite sobre su utilidad en la recuperacion de biomoleculas.
Asf, previamente no ha sido posible preparar sistemas de adsorbente de nanofibra con capacidades de union superiores a aproximadamente el 10 % de un sistema de lecho empaquetado ffpico mientras que retienen la porosidad y operaciones reproducibles robustas asociadas a tales sistemas de nanofibra.
El espesor de los sistemas de adsorbente de nanofibra producidos por electrohilado esta limitado durante la fabricacion, ya que la deposicion de nanofibras sobre una superficie de colector conectado a tierra da una superficie menos conectada a tierra a medida que aumenta la deposicion. La carga residual en las fibras depositadas hace, por tanto, que el area sea menos atractiva a la deposicion continuada, haciendo que las fibras se extiendan ademas sobre la superficie del colector. Esto tiene el efecto de limitar el espesor de las esteras de nanofibra producidas por el electrohilado a aproximadamente 100-200 pm. El espesor limitado de estas esteras de nanofibra trae consigo un ffmite inherente en la resistencia ffsica de la estera global que limita la utilidad de materiales para aplicaciones de proceso tales como cromatograffa.
Un sistema de adsorbente de nanofibra conocido se describe en Ma, et al, Journal of Membrane Science 265 (2005) 115-123. Este documento describe un proceso de produccion de una membrana de nanofibra de celulosa, que implica tratar termicamente una unica capa de malla de fibra no tejida que consiste en nanofibras de acetato de celulosa, tratar las fibras de acetato de celulosa calentadas con NaOH y funcionalizar las fibras de celulosa resultantes con Cibacron Blue. Pueden apilarse juntas multiples membranas, pegarse los bordes y colocarse la pila en un portafiltros.
Sumario de la invencion
Se ha encontrado ahora que una serie espedfica de etapas de procesamiento ffsico y qrnmico aumenta enormemente la capacidad de union de sistemas de adsorbente de nanofibra, normalmente aumentando dicha capacidad de union mas del 250 % bajo condiciones de operacion ffpicas. Tambien se ha encontrado que ciertas etapas de procesamiento ffsico espedfico mejoran la resistividad qrnmica de sistemas de adsorbente de nanofibra. Esto significa que tanto los sistemas de adsorbente de la invencion pueden usarse bajo condiciones mas agresivas, como tambien que los sistemas de adsorbente pueden usarse multiples veces sin perdida de rendimiento.
Por consiguiente, la presente invencion proporciona un proceso para preparar un medio de cromatograffa polimerico funcionalizado, proceso que comprende
(I) proporcionar dos o mas hojas no tejidas apiladas una encima de la otra, comprendiendo cada dicha hoja una o mas nanofibras de poffmero,
(II) simultaneamente calentar y comprimir la pila de hojas para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras de hojas adyacentes, y
(III) poner en contacto el producto comprimido y calentado con un reactivo que funcionaliza el producto de la etapa (II) como medio de cromatograffa.
Mas espedficamente, fusionar puntos contacto entre las nanofibras de hojas adyacentes implica fusionar puntos de contacto entre secciones de una nanofibra de poffmero en una hoja con secciones de una nanofibra de poffmero en una hoja adyacente. Normalmente, esto tambien implica fusionar puntos de contacto entre secciones de una nanofibra de poffmero en una hoja con otras secciones de la misma nanofibra.
La presente invencion tambien proporciona:
- Un medio de cromatograffa funcionalizado obtenible por el proceso de la presente invencion.
- Un proceso para preparar un cartucho de cromatograffa, proceso que comprende llevar a cabo el proceso de la presente invencion e incorporar el producto asf obtenido en un cartucho.
- Un cartucho de cromatograffa que (a) es obtenible por dicho proceso, o (b) que comprende uno o mas medios de cromatograffa funcionalizados de la invencion.
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- Uso de un medio de cromatograffa funcionalizado de la invencion o un cartucho de cromatograffa de la invencion en cromatograffa.
- Un proceso para aislar una o mas moleculas biologicas de una fase movil, proceso que comprende poner en contacto una o mas moleculas biologicas en una fase movil con un medio de cromatograffa funcionalizado de la invencion o un cartucho de cromatograffa de la invencion.
Breve descripcion de las fiauras
La Figura 1 muestra el rendimiento de un medio de cromatograffa funcionalizado de la invencion en cromatograffa de intercambio anionico.
La Figura 2 muestra el rendimiento de un medio de cromatograffa funcionalizado de la invencion en cromatograffa de intercambio anionico.
La Figura 3 muestra un sistema experimental para determinar la estabilidad qufmica de membranas de cromatograffa.
La Figura 4 muestra fotograffas de una membrana no segun la invencion y una membrana segun la invencion tras la exposicion a NaOH.
La Figura 5 muestra el espesor y las densidades de membranas no segun la invencion y membranas segun la invencion.
La Figura 6 muestra las propiedades de flujo de membranas no segun la invencion y membranas segun la invencion.
La Figura 7 muestra el efecto de presion sobre el espesor y las densidades de membranas segun la invencion.
La Figura 8 muestra el efecto de presion sobre las propiedades de flujo de membranas segun la invencion.
La Figura 9 muestra el efecto de presion sobre la capacidad de union dinamica de membranas segun la invencion.
La Figura 10 muestra el efecto del numero de ciclos de funcionalizacion sobre las propiedades de flujo de membranas segun la invencion.
La Figura 11 muestra el efecto del numero de ciclos de funcionalizacion sobre la capacidad de union dinamica de membranas segun la invencion.
La Figura 12 muestra las propiedades de union - elucion de una membrana funcionalizada con SP de la invencion.
La Figura 13 muestra las propiedades de union - elucion de una membrana funcionalizada con CM de la invencion.
La Figura 14 muestra las propiedades de union - elucion de una membrana funcionalizada con Q de la invencion.
La Figura 15 muestra las propiedades de union - elucion de una membrana funcionalizada con protefna A de la invencion.
La Figura 16 muestra las propiedades de union - elucion de una membrana funcionalizada con fenilo de la invencion.
La Figura 17 muestra fotograffas de membranas no segun la invencion tras la exposicion a NaOH.
La Figura 18 muestra el espesor y las densidades de membranas no segun la invencion y membranas segun la invencion.
La Figura 19 muestra las propiedades de flujo de membranas no segun la invencion y membranas segun la invencion.
La Figura 20 muestra la capacidad de union dinamica de membranas no segun la invencion y membranas segun la invencion.
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La Figura 21 muestra fotograffas de una membrana segun la invencion (imagen superior) y una membrana no segun la invencion (imagen inferior) siguiendo multiples ciclos de funcionalizacion.
Descripcion detallada de la invencion
Nanofibras de polfmero
Los medios de cromatograffa funcionalizados de la presente invencion se forman a partir de una o mas nanofibras de polfmero. Las nanofibras de polfmero normalmente son nanofibras de polfmero electrohiladas. Tales nanofibras de polfmero electrohiladas son muy conocidas para el experto en la materia y condiciones optimizadas para su produccion pueden encontrarse en, por ejemplo, O. Hardick, et al, J. Mater. Sci. 46 (2011) 3890. Los procesos de la presente invencion normalmente comprenden una etapa inicial de electrohilado de un polfmero para producir una o mas nanofibras de polfmero. Esto puede implicar electrohilar un polfmero para producir una o mas hojas no tejidas, comprendiendo cada una una o mas nanofibras de polfmero
Las nanofibras de polfmero para su uso en la presente invencion tienen diametros medios de 10 nm a 1000 nm. Para algunas aplicaciones, son apropiadas nanofibras de polfmero que tienen diametros medios de 200 nm a 800 nm. Las nanofibras de polfmero que tienen diametros medios de 200 nm a 400 nm pueden ser apropiadas para ciertas aplicaciones.
La longitud de las nanofibras de polfmero para su uso en la presente invencion no esta particularmente limitada. Asf, procesos de electrohilado convencionales pueden producir nanofibras de polfmero de muchos cientos de metros o incluso kilometros de longitud. Normalmente, sin embargo, la una o mas nanofibras de polfmero tienen una longitud de hasta 10 km, preferentemente de 10 m a 10 km.
La una o mas nanofibras de polfmero se proporcionan en forma de dos o mas hojas no tejidas, comprendiendo cada una una o mas nanofibras de polfmero. Una hoja no tejida que comprende una o mas nanofibras de polfmero es una estera de dicha una o mas nanofibras de polfmero con cada nanofibra orientada esencialmente al azar, es decir, no ha sido fabricada de tal manera que la nanofibra o nanofibras adopten un patron particular. Hojas no tejidas que comprenden nanofibras de polfmero normalmente se proporcionan por metodos conocidos, tales como el desvelado en O. Hardick, et al, J. Mater. Sci. 46 (2011) 3890. Hojas no tejidas pueden, en ciertas circunstancias, consistir en una unica nanofibra de polfmero. Alternativamente, las hojas no tejidas pueden comprender dos o mas nanofibras de polfmero, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nanofibras de polfmero.
Las hojas no tejidas normalmente tienen densidades de area de 1 a 40 g/m2, preferentemente de 5 a 25 g/m2, en algunas circunstancias de 1 a 20 o 5 a 15 g/m2.
Las hojas no tejidas normalmente tienen un espesor de 5 a 120 pm, preferentemente de 10 a 100 pm, en algunas circunstancias de 50 a 90 pm, en otras circunstancias de 5 a 40, 10 a 30 o 15 a 25 pm.
El polfmero usado para producir las nanofibras usadas en los procesos de la presente invencion no esta particularmente limitado, siempre que el polfmero sea adecuado para su uso en aplicaciones de cromatograffa. Asf, normalmente, el polfmero es un polfmero adecuado para su uso como un medio de cromatograffa, es decir, un adsorbente, en un metodo de cromatograffa. Polfmeros adecuados incluyen poliamidas tales como nailon, acido poliacrflico, acido polimetacrflico, poliacrilonitrilo, poliestireno, polisulfonas, policaprolactona, colageno, quitosano, poli(oxido de etileno), agarosa, acetato de agarosa, celulosa, acetato de celulosa, y combinaciones de los mismos. Se prefieren celulosa y acetato de celulosa.
Normalmente, el proceso de la presente invencion es para preparar un medio de cromatograffa de celulosa funcionalizado, y el proceso comprende proporcionar dos o mas nanofibras de acetato de celulosa. Preferentemente, el proceso comprende proporcionar dos o mas hojas no tejidas, comprendiendo cada una una o mas nanofibras de acetato de celulosa. El acetato de celulosa se electrohila facilmente y puede transformarse facilmente en celulosa despues del electrohilado. Asf, el proceso comprende preferentemente proporcionar dos o mas hojas no tejidas, comprendiendo cada una una o mas nanofibras de acetato de celulosa electrohiladas.
Modificacion ffsica de nanofibras
Los procesos de la presente invencion implican modificacion ffsica de nanofibras de polfmero en las hojas no tejidas, concretamente calentamiento y compresion, antes de la modificacion qufmica. Estas etapas mejoran la estabilidad estructural del material. Las condiciones de compresion y calentamiento tambien pueden variarse para alterar el espesor y/o la porosidad del material resultante.
El uso de multiples hojas no tejidas de nanofibras de polfmero permite preparar un material mas grueso que tiene una mayor capacidad de adsorbencia (una vez funcionalizado). Tambien se ha encontrado que las membranas producidas calentando y comprimiendo multiples hojas no tejidas de nanofibras de polfmero tienen propiedades mejoradas en comparacion con pilas formadas a partir de hojas individuales de nanofibras de polfmero tratadas con calor. Asf, el proceso de la presente invencion comprende proporcionar dos o mas hojas no tejidas apiladas una
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encima de la otra, comprendiendo cada dicha hoja una o mas nanofibras de polfmero, y simultaneamente calentar y comprimir la pila de hojas para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras de hojas adyacentes. Asf, el proceso de la presente invencion implica proporcionar una pila de dos o mas hojas no tejidas, como se define en el presente documento, en la etapa (I) y la presente invencion proporciona un proceso para preparar un medio de cromatograffa polimerico funcionalizado, proceso que comprende
(I) proporcionar una pila de dos o mas hojas no tejidas, comprendiendo cada dicha hoja una o mas nanofibras de
polfmero,
(II) simultaneamente calentar y comprimir la pila de hojas para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras
de hojas adyacentes, y
(III) poner en contacto el producto comprimido y calentado con un reactivo que funcionaliza el producto de la
etapa (II) como medio de cromatograffa.
Normalmente, se proporciona una pila de dos a treinta hojas no tejidas. En ciertas circunstancias, puede proporcionarse una pila de entre cinco y veinticinco hojas no tejidas. En ciertas circunstancias, puede proporcionarse una pila de entre 10 y 20 hojas no tejidas. El numero de hojas no tejidas empleado afectara el espesor del eventual medio de cromatograffa, y su permeabilidad a los lfquidos. Asf, un medio mas grueso generalmente tendra una permeabilidad mas baja que un medio mas delgado. Asf, donde se requiera una alta permeabilidad, normalmente se empleara un numero mas bajo de hojas. Donde se requiera un medio de permeabilidad mas baja, puede emplearse un numero mas alto de hojas.
Para evitar dudas, las hojas no tejidas se comprimen (con calentamiento) en una direccion paralela a su dimension mas delgada. Las hojas no tejidas normalmente tendran dos dimensiones que son mucho mas grandes en la tercera dimension, y las hojas se comprimen paralelas a esta tercera dimension. Donde se proporcionan y comprimen dos o mas hojas no tejidas, las dos o mas hojas no tejidas se apilan una encima de la otra de manera que se solapen sustancialmente y se alinee la dimension mas pequena de cada hoja no tejida. Esto forma una pila de hojas que es posteriormente calentada y comprimida. Las hojas en la pila se solapan entre sf y se alinea la dimension mas pequena de cada hoja no tejida.
Normalmente, el comprimir las hojas no tejidas implica someterlas a una presion de 0,01 a 5 MPa, mas normalmente de 0,05 a 3 MPa, por ejemplo de 0,1 a 1 MPa. Presiones adecuadas para su uso en el proceso de la presente invencion normalmente son mayores que 1 kPa, preferentemente superiores a 5 kPa, en algunas circunstancias superiores a 10 kPa. Normalmente, se usan presiones de no superiores a 500 kPa, preferentemente no superiores a 200 kPa, mas preferentemente no superiores a 150 kPa, por ejemplo no superiores a 100 kPa, 50 kPa o 30 kPa. Intervalos de presion adecuados pueden ser, por ejemplo, de 1 a 500 kPa, de 5 a 200 kPa, de 5 a 150 kPa, de 5 a 100 kPa de 5 a 50 kPa, o de 10 a 30 kPa. La presion puede aplicarse por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, puede aplicarse presion usando una prensa manual o prensa hidraulica. La presion aplicada puede variarse para alterar las propiedades ffsicas de los medios. Generalmente, una presion mas alta producira un medio mas robusto, que tiene una porosidad mas baja y espesor mas bajo. Una presion mas baja tiende a dar un medio comparativamente menos robusto, con una porosidad mas alta y espesor mas alto. Pueden preferirse medios de cromatograffa mas gruesos cuando se desean maximizar las propiedades de union.
La longitud de tiempo durante la que las hojas no tejidas se comprimen no esta particularmente limitada, y tiempos de compresion tfpicos pueden ser determinados por un experto en la materia. El calentamiento y la compresion simultaneos de las dos o mas hojas no tejidas normalmente se lleva a cabo durante de 1 a 30 minutos, preferentemente de 1 a 10 minutos, mas preferentemente de 3 a 7 minutos, incluso mas preferentemente durante aproximadamente 5 minutos.
El calentamiento de las dos o mas hojas no tejidas puede efectuarse mediante medios convencionales, por ejemplo usando un horno. El calentamiento y la compresion simultaneos de las dos o mas hojas no tejidas pueden efectuarse por una prensa calentada o colocando las dos o mas hojas no tejidas entre pesos, por ejemplo hojas metalicas, en un horno calentado.
La pila de hojas no tejidas se calienta y comprime para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras de hojas adyacentes.
Donde dos o mas hojas no tejidas, comprendiendo cada una una o mas nanofibras, se apilan una encima de la otra y se someten a condiciones de calor y presion, las secciones de una nanofibra de polfmero en una hoja pueden estar en contacto con secciones de la misma nanofibra, y/o con secciones de otras nanofibras en la misma hoja no tejida, y/o con secciones de nanofibras en hojas adyacentes no tejidas. Secciones de nanofibras en hojas no tejidas no estan normalmente en contacto con secciones de nanofibras en otras hojas no tejidas que no son adyacentes.
Asf, el calentar y comprimir una pila de dos o mas hojas no tejidas puede fusionar puntos de contacto entre secciones de una nanofibra en una hoja con otras secciones de la misma nanofibra, y/o entre secciones de una nanofibra en una hoja con secciones de otra nanofibra (si esta presente) en la misma hoja no tejida, y/o o entre secciones de una nanofibra en una hoja con secciones de una nanofibra en una hoja no tejida adyacente.
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Normalmente, calentar y comprimir simultaneamente dos o mas hojas no tejidas fusiona puntos de contacto entre secciones de una nanofibra de polfmero en una hoja con secciones de una nanofibra de polfmero en una hoja adyacente. Preferentemente, calentar y comprimir simultaneamente dos o mas hojas no tejidas fusiona puntos de contacto entre secciones de una nanofibra de polfmero en una hoja con otras secciones de la misma nanofibra, y fusiona puntos de contacto entre secciones de la nanofibra de polfmero en la hoja con secciones de una nanofibra de polfmero en una hoja adyacente. Mas preferentemente, calentar y comprimir dos o mas hojas no tejidas fusiona puntos de contacto entre secciones de una nanofibra en una hoja con otras secciones de la misma nanofibra, y entre secciones de una nanofibra en una hoja con secciones de otra nanofibra (si esta presente) en la misma hoja no tejida, y/o entre secciones de una nanofibra con secciones de una nanofibra en una hoja no tejida adyacente. Lo mas preferentemente, calentar y comprimir dos o mas hojas no tejidas fusiona puntos de contacto entre secciones de una nanofibra en una hoja con otras secciones de la misma nanofibra, y entre secciones de la nanofibra en la hoja con secciones de otra nanofibra (si esta presente) en la misma hoja no tejida, y entre secciones de la nanofibra en la hoja con secciones de una nanofibra en una hoja no tejida adyacente.
En un ejemplo simple donde se proporcionan dos hojas no tejidas, cada hoja no tejida que contiene una unica nanofibra de polfmero, calentar y comprimir la primera y segunda hojas no tejidas fusiona preferentemente puntos de contacto entre secciones de la nanofibra de polfmero en la primera hoja no tejida con otras secciones de la nanofibra de polfmero en la primera hoja no tejida, y entre secciones de la nanofibra de polfmero en la primera hoja no tejida con secciones de la nanofibra de polfmero en la segunda hoja no tejida, y normalmente tambien entre secciones de la nanofibra de polfmero en la segunda hoja no tejida con otras secciones de la nanofibra de polfmero en la segunda hoja no tejida.
Normalmente, las hojas no tejidas se calientan a una temperatura por debajo del punto de fusion del polfmero. El uso de una temperatura mas alta podrfa producir la destruccion de la estructura de la nanofibra. En algunas circunstancias es ventajoso usar una temperatura que esta por debajo de la temperatura de transicion vftrea del polfmero. En otras circunstancias puede usarse una temperatura por encima de la temperatura de transicion vftrea del polfmero. Los puntos de fusion y las temperaturas de transicion vftrea de polfmeros adecuados para su uso en los procesos reivindicados son muy conocidos para el experto.
Normalmente, se calientan hojas no tejidas a una temperatura entre una temperatura a la que los puntos de contacto entre secciones de la una o mas nanofibras de polfmero empiezan a fundir y el punto de fusion del polfmero. Preferentemente, las hojas no tejidas se calientan a una temperatura entre una temperatura a la que los puntos de contacto entre secciones de la una o mas nanofibras de polfmero empiezan a fundir y la temperatura de transicion vftrea del polfmero.
Normalmente, se usa una temperatura superior a 40 °C, preferentemente 30 °C, mas preferentemente 20 °C, por debajo del punto de fusion del polfmero. Normalmente, se usa una temperatura no superior a 1 °C, preferentemente 2 °C, mas preferentemente 5 °C, por debajo del punto de fusion del polfmero. Asf, normalmente se usa un intervalo de temperatura de 40 °C por debajo del punto de fusion del polfmero a 1 °C por debajo del punto de fusion del polfmero, preferentemente de 30 °C por debajo del punto de fusion del polfmero a 2 °C por debajo del punto de fusion del polfmero, mas preferentemente de 20 °C por debajo del punto de fusion del polfmero a 5 °C por debajo del punto de fusion del polfmero.
En el caso en el que el polfmero sea acetato de celulosa, las hojas no tejidas, comprendiendo cada una una o mas nanofibras de acetato de celulosa, se calientan a o a una temperatura entre 190 y 220 °C, preferentemente de 195 a 218 °C, por ejemplo de 195 a 215 °C, 195 a 210 °C, 190 a 210 °C, 195 a 205 °C o 210 a 215 °C. Otros intervalos de temperatura adecuados que pueden usarse incluyen 200 a 220 °C, preferentemente de 205 a 218 °C, por ejemplo de 205 a 210 °C o 210 a 215 °C. El calentamiento y compresion simultaneos de hojas de acetato de celulosa no tejidas normalmente emplea una temperatura de entre 190 y 220 °C, por ejemplo de 190 a 210 °C, 195 a 218 °C, 195 a 215 °C, 195 a 210 °C, 195 a 205 °C, 210 a 215 °C, 200 a 220 °C, 205 a 218 °C, o 205 a 210 °C, en algunas circunstancias aproximadamente 207 °C.
Las hojas no tejidas normalmente se calientan durante de 1 a 120 minutos, por ejemplo de 5 a 60 minutos. Las hojas no tejidas se calientan y comprimen simultaneamente, y el calentamiento se lleva a cabo normalmente durante de 1 a 30 minutos, preferentemente de 1 a 10 minutos, mas preferentemente de 3 a 7 minutos, incluso mas preferentemente durante aproximadamente 5 minutos.
Normalmente, las hojas no tejidas tienen un tamano de poro promedio despues de la compresion y calentamiento, es decir, el producto comprimido y calentado resultante, de 0,1 a 1,0 pm, preferentemente de 0,3 a 0,9 pm, mas preferentemente de 0,4 a 0,8 pm, incluso mas preferentemente de 0,5 a 0,7 pm, todavfa mas preferentemente de 0,6 a 0,7 pm, por ejemplo de 0,6 a 0,65pm.
Normalmente, las hojas no tejidas tienen una densidad promedio despues de la compresion y calentamiento, es decir, el producto comprimido y calentado resultante, de 200 a 1000 kg/m3, preferentemente 250 a 750 kg/m3, mas preferentemente de 350 a 650 kg/m3, en algunas circunstancias de 450 a 550 kg/m3. Otras densidades preferibles incluyen de 200 a 750 kg/m3, 200 a 650 kg/m3, 200 a 550 kg/m3, 250 a 750 kg/m3, 250 a 650 kg/m3 y 250 a 550
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Las hojas no tejidas se calientan y comprimen simultaneamente. El calentamiento y la compresion simultaneos normalmente se llevan a cabo en una prensa calentada o colocando las nanofibras de poffmero u hojas no tejidas entre pesos, por ejemplo hojas metalicas, en un horno calentado.
El proceso de la presente invencion puede tambien implicar humedecer las hojas no tejidas antes de la compresion y el calentamiento. Asf, el proceso puede implicar una etapa adicional entre las etapas (I) y (II) de humedecer la pila de hojas. Alternativamente, el proceso puede implicar formar una pila de hojas no tejidas humedecidas en la etapa
(I). Normalmente se usa un disolvente organico acuoso opcional para humedecer las hojas no tejidas/pila de hojas, preferentemente un disolvente organico acuoso. Los disolventes organicos normalmente se eligen para disolver las nanofibras de poffmero. Un experto sabra que disolventes pueden usarse para disolver las nanofibras de poffmero Se prefieren los alcoholes como disolvente organico, por ejemplo metanol, etanol o isopropanol, preferentemente etanol. Se prefiere etanol acuoso en algunos casos. Asf, algunas realizaciones pueden implicar humedecer, tras calentar y comprimir simultaneamente. Normalmente, las hojas comprimidas y calentadas, es decir, el producto comprimido y calentado, tienen un espesor de 0,05 a 10 mm, por ejemplo 0,1 a 5 mm.
Modificacion qufmica de nanofibras
Los procesos de la presente invencion normalmente implican modificacion qufmica de las dos o mas hojas no tejidas para funcionalizarlas para su uso en cromatograffa. En su forma mas simple esto implica poner en contacto las dos o mas hojas no tejidas (que han sido simultaneamente comprimidas y calentadas) con un reactivo para funcionalizar el producto como medio de cromatograffa.
Opcionalmente, antes de esta etapa de poner en contacto con un reactivo, las dos o mas hojas no tejidas (que han sido simultaneamente comprimidas y calentadas) pueden tratarse para desproteger o activar cualquier grupo funcional sobre el poffmero.
La desproteccion de los grupos funcionales normalmente se efectua de manera que los grupos funcionales puedan reaccionar con el reactivo. Por ejemplo, cuando el poffmero es celulosa, normalmente se proporcionan dos o mas hojas no tejidas, comprendiendo cada una una o mas nanofibras de acetato de celulosa, y, antes de poner en contacto con un reactivo, el acetato de celulosa se trata para convertirlo en celulosa. Esto implica la desproteccion de grupos hidroxilo acetilados para dar grupos hidroxilo. La conversion de acetato de celulosa a celulosa normalmente se efectua usando alcali acuoso, preferentemente NaOH en agua:etanol, mas preferentemente agua:etanol 2:1, durante un periodo superior a 12 h, por ejemplo de 12 a 36 horas. Esta etapa normalmente tiene lugar despues de que las dos o mas hojas no tejidas, que comprenden cada una una o mas nanofibras de acetato de celulosa, hayan sido comprimidas y calentadas. Alternativamente, esta etapa puede llevarse a cabo antes de que las dos o mas u hojas no tejidas, comprendiendo cada una una o mas nanofibras de acetato de celulosa, hayan sido comprimidas y calentadas. La activacion de grupos funcionales se trata mas adelante.
El reactivo normalmente funcionaliza el medio de cromatograffa introduciendo uno o mas restos que convierten el producto funcionalizado que comprende el uno o mas restos adecuados para su uso como un medio de cromatograffa. El uno o mas restos introducidos dependeran de la tecnica de cromatograffa particular para la que el medio va a usarse. Restos y reactivos adecuados se tratan ademas mas adelante. Normalmente, el reactivo reacciona con uno o mas grupos funcionales presentes sobre la una o mas nanofibras de poffmero contenidas dentro de las dos o mas hojas no tejidas, para crear el uno o mas restos. Grupos funcionales ffpicos incluyen grupos hidroxilo, amino y carboxi. Asf, normalmente uno o mas grupos hidroxilo, amino y/o carboxi estan funcionalizados en el proceso de la presente invencion.
Aunque la presente invencion preve procesos que implican solo un unico tratamiento con un reactivo, se prefieren procesos que implican multiples etapas de funcionalizacion. Tales procesos pueden conducir a productos con propiedades de union mejoradas.
Asf, normalmente, la funcionalizacion poniendo en contacto con un reactivo se efectua poniendo en contacto en un modo discontinuo dos o mas veces con un reactivo. Funcionalizacion discontinua significa que el material de nanofibra de poffmero (que ha sido comprimido, calentado y opcionalmente desprotegido y/o activado) se hace reaccionar con un reactivo para funcionalizarlo, reaccion que entonces se detiene y el material (parcialmente) funcionalizado resultante reacciona con un lote separado de reactivo. La reaccion en un modo discontinuo no se refiere simplemente a anadir, por ejemplo, mas porciones de reactivo a un recipiente de reaccion.
La funcionalizacion discontinua normalmente se lleva a cabo de dos a diez veces, es decir, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces. Preferentemente, la funcionalizacion discontinua se lleva a cabo entre dos y cuatro veces.
Cada etapa de poner en contacto con un reactivo en un modo discontinuo normalmente comprende (a) poner en contacto con el reactivo, (b) aislar el producto de la etapa (a) del reactivo, (c) opcionalmente tratar el producto de la etapa (b) con alcali acuoso, y (d) opcionalmente lavar el producto de la etapa (b)/(c) con agua. Preferentemente,
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cada etapa de poner en contacto con un reactivo en un modo discontinuo comprende (a) poner en contacto con el reactivo, (b) aislar el producto de la etapa (a) del reactivo, (c) tratar el producto de la etapa (b) con alcali acuoso, y (d) opcionalmente lavar el producto de la etapa (b)/(c) con agua. Mas preferentemente, cada etapa de poner en contacto con un reactivo en un modo discontinuo comprende (a) poner en contacto con el reactivo, (b) aislar el producto de la etapa (a) del reactivo, (c) tratar el producto de la etapa (b) con alcali acuoso, y (d) lavar el producto de la etapa (b)/(c) con agua.
Las etapas para tratar con alcali acuoso normalmente emplean alcali acuoso caliente, es decir, entre 70 y 90 °C. Alternativamente, la etapa para tratar con alcali acuoso puede llevarse a cabo a temperature ambiente.
El reactivo usado en cada etapa de poner en contacto con un reactivo en un modo discontinuo puede ser igual o diferente, pero es preferentemente el mismo.
En circunstancias donde se emplean entre dos y cuatro etapas de poner en contacto con un reactivo en un modo discontinuo, las dos o mas hojas no tejidas, comprendiendo cada una una o mas nanofibras de polfmero, que han sido comprimidas, calentadas y opcionalmente desprotegidas, normalmente se tratan
- (1) (a1) poniendo en contacto con el reactivo, (b1) aislando el producto de la etapa (a1) del reactivo, (c1) opcionalmente tratando el producto de la etapa (b1) con alcali acuoso, y (d1) opcionalmente lavando el producto de la etapa (b1)/(c1) con agua, y
(2) (a2) poniendo en contacto el producto de la etapa (b1)/(c1)/(d 1) con el reactivo, (b2) aislando el producto de la etapa (a2) del reactivo, (c2) opcionalmente tratando el producto de la etapa (b2) con alcali acuoso, y (d2) opcionalmente lavando el producto de la etapa (b2)/(c2) con agua; o
- (1) (a1) poniendo en contacto con el reactivo, (b1) aislando el producto de la etapa (a1) del reactivo, (c1) opcionalmente tratando el producto de la etapa (b1) con alcali acuoso, y (d1) opcionalmente lavando el producto de la etapa (b1)/(c1) con agua,
(2) (a2) poniendo en contacto el producto de la etapa (b1)/(c1)/(d1) con el reactivo, (b2) aislando el producto de la etapa (a2) del reactivo, (c2) opcionalmente tratando el producto de la etapa (b2) con alcali acuoso, y (d2) opcionalmente lavando el producto de la etapa (b2)/(c2) con agua, y
(3) (a3) poniendo en contacto el producto de la etapa (b2)/(c2)/(d2) con el reactivo, (b3) aislando el producto de la etapa (a3) del reactivo, (c3) opcionalmente tratando el producto de la etapa (b3) con alcali acuoso, y (d3) opcionalmente lavando el producto de la etapa (b3)/(c3) con agua; o
- (1) (a1) poniendo en contacto con el reactivo, (b1) aislando el producto de la etapa (a1) del reactivo, (c1) opcionalmente tratando el producto de la etapa (b1) con alcali acuoso, y (d1) opcionalmente lavando el producto de la etapa (b1)/(c1) con agua,
(2) (a2) poniendo en contacto el producto de la etapa (b1)/(c1)/(d1) con el reactivo, (b2) aislando el producto de la etapa (a2) del reactivo, (c2) opcionalmente tratando el producto de la etapa (b2) con alcali acuoso, y (d2) opcionalmente lavando el producto de la etapa (b2)/(c2) con agua,
(3) (a3) poniendo en contacto el producto de la etapa (b2)/(c2)/(d2) con el reactivo, (b3) aislando el producto de la etapa (a3) del reactivo, (c3) opcionalmente tratando el producto de la etapa (b3) con alcali acuoso, y (d3) opcionalmente lavando el producto de la etapa (b3)/(c3) con agua, y
(4) (a4) poniendo en contacto el producto de la etapa (b3)/(c3)/0(d3) con el reactivo, (b4) aislando el producto de la etapa (a4) del reactivo, (c4) opcionalmente tratando el producto de la etapa (b4) con alcali acuoso, y (d4) opcionalmente lavando el producto de la etapa (b4)/(c4) con agua.
Normalmente, cada etapa de poner en contacto con un reactivo en un modo discontinuo comprende tratar con el reactivo durante entre 1 y 20 minutos.
En ciertas circunstancias, poner en contacto con un reactivo puede comprender colocar dos o mas hojas no tejidas, comprendiendo cada una una o mas nanofibras de polfmero, que han sido comprimidas, calentadas, y opcionalmente desprotegidas y/o activadas (es decir, el material de polfmero) en un recipiente, y provocar que un reactivo circule a traves del recipiente de manera que el reactivo circule en contacto con el material de polfmero que funcionaliza el material de polfmero como medio de cromatograffa. El funcionalizar el material de polfmero de este modo puede en ciertas circunstancias ser mas eficiente que simplemente poner en contacto el material de polfmero con el reactivo, en, por ejemplo, un matraz o vaso de precipitados.
Normalmente, el recipiente es un portafiltros adaptado para contener el material de polfmero. Normalmente, el portafiltros contiene el material de polfmero de forma que una sustancia acuosa o lfquida que se pasa a traves del portafiltros circule en contacto con el material de polfmero. Asf, en el contexto de la presente invencion, el portafiltros contiene preferentemente el material de polfmero de forma que se provoque que un reactivo que circula a traves del portafiltros circule en contacto con el material de polfmero.
Normalmente, se provoca que el reactivo circule a traves del recipiente a presion.
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Normalmente, se provoca que el reactivo circule a traves del recipiente usando una bomba, preferentemente una bomba de HPLC.
Normalmente, se provoca que el reactivo circule a traves del recipiente en una manera cfclica. Asf, cualquier reactivo que sale del recipiente se recircula y pasa a traves del recipiente una o mas veces adicionales.
Normalmente, se provoca que el reactivo circule a traves del recipiente durante un periodo de tiempo de 1 a 20 minutos.
Normalmente, se provoca que el reactivo circule a traves del recipiente a una tasa de 10 a 100 ml/min.
Normalmente, despues de que se ha provocado que el reactivo circule a traves del recipiente, el producto resultante se trata con alcali acuoso, y opcionalmente se lava con agua. Preferentemente, despues de haberse provocado que el reactivo circulara a traves del recipiente, el producto resultante se trata con alcali acuoso, y se lava con agua. El tratamiento con alcali acuoso es preferentemente tratamiento con alcali acuoso caliente, como se ha definido anteriormente. Normalmente, despues de haberse provocado que el reactivo circulara a traves del recipiente, el producto resultante se saca el recipiente antes de cualquier etapa de tratamiento adicional. Asf, preferentemente, despues de que se ha provocado que el reactivo circulara a traves del recipiente, el producto resultante se saca del recipiente, se trata con alcali acuoso, y opcionalmente se lava con agua. Mas preferentemente, despues de que se ha provocado que el reactivo circulara a traves del recipiente, el producto resultante se saca del recipiente, se trata con alcali acuoso y se lava con agua.
El reactivo funcionaliza el producto de las etapas de procesamiento ffsico y qufmicos precedentes para dar un medio de cromatograffa, especfficamente un medio de cromatograffa funcionalizado. Normalmente, el reactivo funcionaliza el producto de las etapas precedentes de manera que sea adecuado para su uso en un metodo de cromatograffa de intercambio ionico, de captura por afinidad o hidrofoba. Asf, poniendo en contacto con el reactivo normalmente da un medio de cromatograffa que esta funcionalizado con uno o mas restos que estan negativamente cargados, uno o mas restos que estan positivamente cargados, una o mas protefnas, ligandos mimeticos o sinteticos que imitan la accion de los ligandos de protefna, peptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, colorantes, histidina, grupos que contienen un cation metalico, o grupos hidrofobo. Ejemplos de tales grupos se definen adicionalmente mas adelante. Reactivos adecuados para introducir tales grupos seran evidentes para el experto. Se prefieren clorhidrato de 2-cloro-N,N-dietilamina (DEACH) y glicidiltrimetilamonio como reactivo, particularmente cuando el medio de cromatograffa funcionalizado sea para uso en un metodo de cromatograffa de intercambio anionico. Otros reactivos preferidos son TEMPO, seguido de perclorato de sodio, o alil glicidil eter, seguido de disulfito de sodio, particularmente cuando el medio de cromatograffa funcionalizado es para uso en un metodo de cromatograffa de intercambio cationico. Otro reactivo preferido es NaIO4, seguido de Protefna A, particularmente cuando el medio de cromatograffa funcionalizado es para uso en un metodo de cromatograffa de afinidad. Otro reactivo preferido es oxido de estireno, particularmente cuando el medio de cromatograffa funcionalizado es para uso en un metodo de cromatograffa hidrofoba.
Medios y metodos de cromatograffa
Los productos del proceso de la presente invencion son medios de cromatograffa funcionalizados, es decir, medios de cromatograffa que han sido modificados qufmicamente para convertirlos en adecuados para su uso en uno o mas metodos de cromatograffa. Modificaciones qufmicas especfficas se tratan mas abajo en mas detalle. En terminos generales, tal modificacion qufmica cambia las propiedades qufmicas y/o ffsicas del medio de cromatograffa. Esto afecta a su vez como el medio de cromatograffa se comporta cuando se usa en un metodo de cromatograffa. Las modificaciones pueden, por ejemplo, cambiar la polaridad, hidrofobia o propiedades de union biologica del medio de cromatograffa funcionalizado en comparacion con su forma sin funcionalizar. Las modificaciones pueden, en ciertas circunstancias, cambiar mas de una de la polaridad, hidrofobia o propiedades de union biologica del medio de cromatograffa funcionalizado en comparacion con su forma sin funcionalizar. En una realizacion, la modificacion cambia la polaridad e hidrofobia del medio de cromatograffa funcionalizado en comparacion con su forma sin funcionalizar.
Los medios de cromatograffa normalmente estan en forma de membranas. Tales membranas son adecuadas para su uso en metodos de cromatograffa de membrana. Los metodos de cromatograffa de membrana son muy conocidos para el experto en la materia y se tratan en "Membrane Processes in Biotechnologies and Pharmaceutics" ed. Catherine Charcosset, Elsevier, 2012.
Normalmente, los medios de cromatograffa de polfmero funcionalizados son adecuados para su uso en metodos de cromatograffa elegidos de cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de captura por afinidad, cromatograffa hidrofoba y cromatograffa de modo mixto. En ciertas circunstancias, el metodo de cromatograffa opera en "modo mixto", es decir, utilizando mas de una forma de interaccion, es decir, intercambio ionico, captura por afinidad e interaccion hidrofoba. Normalmente, tal cromatograffa de "modo mixto" implica intercambio de iones (ionico) e interacciones hidrofobas. Preferentemente, los medios de cromatograffa de polfmero funcionalizados son adecuados para su uso en metodos de cromatograffa elegidos de cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de captura
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por afinidad y cromatograffa hidrofoba. En operacion, tales metodos de cromatograffa implican pasar una fase movil que contiene molecula deseada sobre una fase de adsorbente, aquf los medios de cromatograffa funcionalizados. La fase de adsorbente se elige normalmente de forma que la molecula deseada sea retenida encima en preferencia a otros componentes tambien presentes en la fase movil.
Normalmente, el medio de cromatograffa de polfmero esta funcionalizado con DEAE, Q, SP, CM, Protefna A, fenilo, o grupos MEP, por ejemplo grupos DEAE o CM. Generalmente, el polfmero es celulosa y el medio de cromatograffa esta funcionalizado con DEAE, Q, SP, CM, Protefna A, fenilo, o grupos MEP, por ejemplo grupos DEAE o CM. Asf, el medio de cromatograffa funcionalizado puede ser celulosa derivatizada con DEAE, Q, SP, CM, Protefna A, fenilo, o grupos MEP, por ejemplo grupos DEAE o CM.
La cromatograffa de intercambio ionico es una tecnica para separar moleculas, normalmente iones o moleculas polares, basandose en su carga ionica. Medios de cromatograffa funcionalizados para su uso en tales metodos, por tanto, contienen uno o mas restos que estan positiva o negativamente cargados. Las cargas positivas y/o negativas en los medios de cromatograffa funcionalizados estan normalmente equilibradas con uno o mas contraiones. La cromatograffa de intercambio ionico implica una o mas de cromatograffa de intercambio cationico y cromatograffa de intercambio anionico.
Medios de cromatograffa funcionalizados para su uso en la cromatograffa de intercambio cationico contienen uno o mas restos que estan negativamente cargados. Restos negativamente cargados tfpicos incluyen uno o mas grupos carboxilato, sulfonato o fosfonato, o mezclas de los mismos, es decir, los restos normalmente contienen uno o mas grupos -COO', -SO3' o -P(OH)2O', o mezclas de los mismos. Medios de cromatograffa funcionalizados tfpicos para su uso en cromatograffa de intercambio cationico contienen uno o mas restos -O-CH2COO', -CH2COO', -SO3', - CH2CH2CH2SO3', -CH2CH2SO3- o -P(OH)2O-.
Medios de cromatograffa funcionalizados para su uso en cromatograffa de intercambio anionico contienen uno o mas restos que estan positivamente cargados. Restos positivamente cargados tfpicos incluyen uno o mas grupos amina cuaternaria. Medios de cromatograffa funcionalizados tfpicos para su uso en cromatograffa de intercambio anionico contienen uno o mas restos -N+(CH3)3, -N+(C2Hs)H, -CH2CH2N+(C2Hs)H, -
CH2CH2N+(C2H5)2(CH2CH(OH)CH3), -O-CH2CH2-N+(CH3)3, -CH2CH2N+(CH3)3 o -CH2CH2N+(CH3)2H.
La cromatograffa de captura por afinidad es una tecnica para separar moleculas basandose en su afinidad por ligandos particulares, normalmente pero no siempre ligandos biologicos. Este metodo puede, por ejemplo, basarse en las fuerzas atractivas entre anticuerpos y antfgenos o enzimas y sustratos. Medios de cromatograffa funcionalizados para su uso en cromatograffa de captura por afinidad normalmente contienen uno o mas restos elegidos de una o mas protefnas, peptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, colorantes, histidina, o grupos que contienen un cation metalico. Alternativamente, los medios de cromatograffa funcionalizados para su uso en la cromatograffa de captura por afinidad pueden contener ligandos mimeticos o sinteticos que imitan la accion de ligandos de protefna.
Protefnas tfpicas para su uso en la cromatograffa de captura por afinidad son muy conocidas para el experto en la materia e incluyen Protefna A, Protefna G y Protefna L.
Anticuerpos tfpicos y fragmentos de los mismos para su uso en cromatograffa de captura por afinidad son muy conocidos para el experto en la materia e incluyen IgG.
Colorantes tfpicos para su uso en cromatograffa de captura por afinidad son muy conocidos para el experto en la materia e incluyen Yellow HE-4R, Red HE-3B y Cibacron Blue F3G.
Grupos tfpicos que contienen cationes metalicos para su uso en cromatograffa de captura por afinidad son muy conocidos para el experto en la materia. Tales grupos normalmente contienen un agente quelante para inmovilizar cationes metalicos. El cation metalico normalmente se elige de cationes cobre, nfquel, cinc y cobalto, preferentemente Cu2+, Ni2+, Zn2+ y Co2+.
La cromatograffa de interaccion hidrofoba es una tecnica para separar moleculas basandose en su hidrofobia. Medios de cromatograffa funcionalizados para su uso en tales metodos, por tanto, contienen uno o mas restos que contienen uno o mas grupos hidrofobos. Grupos hidrofobos tfpicos incluyen grupos propilo, butilo, fenilo y octilo.
La cromatograffa de modo mixto (o multimodal) es una tecnica para separar moleculas basandose en dos o mas caracterfsticas, normalmente hidrofobia y carga ionica. Esto puede implicar una combinacion de hidrofobia y propiedades anionicas, o una combinacion de hidrofobia y propiedades cationicas. Medios de cromatograffa funcionalizados para su uso en tales metodos, por tanto, normalmente contienen uno o mas restos que estan positivamente o negativamente cargados, normalmente como se ha definido anteriormente, y que contienen uno o mas grupos hidrofobos, normalmente como se ha definido anteriormente. Las cargas positivas y/o negativas en los medios de cromatograffa funcionalizados estan normalmente equilibradas con uno o mas contraiones. Medios de cromatograffa funcionalizados para su uso en tales metodos tambien pueden contener uno o mas grupos hidrofobos
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que son ionizables, para su uso en la llamada cromatograffa de induccion de carga hidrofoba (HCIC). Asf, en una realizacion, la cromatograffa de modo mixto es cromatograffa de induccion de carga hidrofoba. Grupos adecuados para su uso en tales metodos son grupos 4-mercapto-etil-piridina (MEP) y grupos octilamina.
Los medios de cromatograffa funcionalizados para su uso en metodos de cromatograffa de modo mixto que implican una combinacion de interacciones hidrofobas y anionicas contienen uno o mas restos que estan positivamente cargados, normalmente como se ha definido anteriormente, y uno o mas grupos hidrofobos, normalmente como se ha definido anteriormente. Grupos adecuados para su uso en tales metodos son grupos N-bencilmetiletanolamina y grupos N-benzoil-homocistefna. Los medios de cromatograffa funcionalizados para su uso en metodos de cromatograffa de modo mixto que implican una combinacion de interacciones hidrofobas y cationicas contienen uno o mas restos que estan negativamente cargados, normalmente como se ha definido anteriormente, y uno o mas grupos hidrofobos, normalmente como se ha definido anteriormente. Grupos adecuados para su uso en tales metodos son grupos N-benzoil-homocistefna.
Los procesos reivindicados en la presente invencion para preparar medios de cromatograffa funcionalizados normalmente implican introducir uno o mas restos en un medio de cromatograffa de forma que el producto funcionalizado resultante que comprende el uno o mas restos sea adecuado para su uso como un medio de cromatograffa en un metodo de cromatograffa. Restos tfpicos, medios, reactivos y metodos son como se han definido anteriormente. El uno o mas restos se introducen haciendo reaccionar un reactivo con uno o mas grupos funcionales contenidos en las dos o mas hojas no tejidas, que comprende cada una una o mas nanofibras de polfmero, que han sido comprimidas, calentadas y opcionalmente desprotegidas y/o activadas. Grupos funcionales tfpicos incluyen grupos hidroxilo, amino y carboxilo.
El uno o mas grupos funcionales pueden activarse antes de la reaccion con un reactivo. Pueden emplearse metodos de activacion convencionales conocidos en la tecnica. Asf, en el caso en el que el grupo funcional sea un grupo hidroxilo, un grupo tal puede activarse tratando con carbonildiimidazol (CDI), bisoxiranos, acido cianurico, esteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) o tolueno-4-sulfonato de 2-fluoro-1 -metilpiridinio (FMP). En el caso en el que el grupo funcional sea un grupo amino, un grupo tal puede activarse tratando con epiclorhidrina, glutaraldehfdo como epoxido. En el caso en el que el grupo funcional sea un grupo carboxilo, un grupo tal puede activarse tratando con CDI o 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC).
Un experto puede elegir reactivos adecuados para introducir restos particulares en polfmeros particulares, por ejemplo basandose en los grupos funcionales contenidos en aquellos polfmeros. Reactivos tfpicos incluyen clorhidrato de 2-cloro-N,N-dietilamina (DEACH).
Normalmente,
- el metodo de cromatograffa es un metodo de intercambio cationico, y el reactivo funcionaliza el medio de cromatograffa con un grupo carboxilato, sulfonato o fosfonato;
- el metodo de cromatograffa es un metodo de intercambio anionico, y el reactivo funcionaliza el medio de cromatograffa con un grupo amino cuaternario o dietilamina;
- el metodo de cromatograffa es un metodo de cromatograffa de captura por afinidad, y el reactivo funcionaliza el medio de cromatograffa con una protefna, peptido, anticuerpo o fragmento del mismo, colorante, histidina, o grupo que contiene un cation metalico;
- el metodo de cromatograffa es un metodo de cromatograffa de interaccion hidrofoba, y el reactivo funcionaliza el medio de cromatograffa con un grupo propilo, butilo, fenilo u octilo; o
- el metodo de cromatograffa es un metodo de cromatograffa de modo mixto, y el reactivo funcionaliza el medio de cromatograffa con un grupo MEP, octilamina, N-bencilmetiletanolamina o N-benzoil-homocistefna.
Preferentemente,
- el metodo de cromatograffa es un metodo de intercambio cationico, y el reactivo funcionaliza el medio de cromatograffa con un grupo carboxilato, sulfonato o fosfonato;
- el metodo de cromatograffa es un metodo de intercambio anionico, y el reactivo funcionaliza el medio de cromatograffa con un grupo amino cuaternario o dietilamina;
- el metodo de cromatograffa es metodo de cromatograffa de captura por afinidad, y el reactivo funcionaliza el medio de cromatograffa con una protefna, peptido, anticuerpo o fragmento del mismo, colorante, histidina, o grupo que contiene un cation metalico; o
- el metodo de cromatograffa es un metodo de cromatograffa de interaccion hidrofoba, y el reactivo funcionaliza el medio de cromatograffa con un grupo propilo, butilo, fenilo u octilo; o
Realizaciones particulares del proceso de la invencion
La presente invencion normalmente proporciona un proceso para preparar un medio de cromatograffa polimerico funcionalizado, proceso que comprende (I) proporcionar dos o mas hojas no tejidas como se define en el presente documento, apiladas una encima de la otra y comprendiendo cada una una o mas nanofibras de polfmero como se
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define en el presente documento, (II) calentar y comprimir simultaneamente la pila de hojas para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras de hojas adyacentes como se define en el presente documento, y (III) poner en contacto el producto comprimido y calentado con un reactivo como se define en el presente documento que funcionaliza el producto de la etapa (II) como medio de cromatograffa como se define en el presente documento.
En una realizacion preferida de la invencion, la etapa de funcionalizar con un reactivo se lleva a cabo en un modo discontinuo. Esto aumenta la capacidad de union del medio de cromatograffa polimerico funcionalizado resultante. Asf, en esta realizacion preferida, la presente invencion proporciona un proceso para preparar un medio de cromatograffa polimerico funcionalizado, proceso que comprende (I) proporcionar dos o mas hojas no tejidas como
se define en el presente documento, apiladas una encima de la otra y comprendiendo cada una una o mas
nanofibras de polfmero como se define en el presente documento, (II) calentar y comprimir simultaneamente la pila de hojas para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras de hojas adyacentes como se define en el presente documento, y (III) poner en contacto el producto de la etapa (II) en un modo discontinuo al menos dos veces con un reactivo como se define en el presente documento que funcionaliza el producto de la etapa (II) como medio de cromatograffa como se define en el presente documento.
En otra realizacion preferida de la invencion, la etapa de funcionalizar con un reactivo se lleva a cabo por flujo convectivo. Un proceso tal normalmente es mas eficiente que un proceso difusivo convencional. Asf, en esta realizacion preferida adicional, la presente invencion proporciona un proceso para preparar un medio de cromatograffa polimerico funcionalizado, proceso que comprende (I) proporcionar dos o mas hojas no tejidas como
se define en el presente documento, apiladas una encima de la otra y comprendiendo cada una una o mas
nanofibras de polfmero como se define en el presente documento, (II) calentar y comprimir simultaneamente la pila de hojas para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras de hojas adyacentes como se define en el presente documento, y (III) poner el producto de la etapa (II) en un recipiente como se define en el presente documento, y (IV) provocar que un reactivo como se define en el presente documento circule a traves del recipiente de manera que el reactivo circule en contacto con el producto de la etapa (II) que funcionaliza el producto de la etapa (II) como medio de cromatograffa como se define en el presente documento.
Se prefiere que el medio de cromatograffa de polfmero funcionalizado sea un medio de cromatograffa de celulosa funcionalizado.
En una realizacion mas preferida de la invencion, la presente invencion proporciona un proceso para preparar un medio de cromatograffa de celulosa funcionalizado, proceso que comprende (i) proporcionar dos o mas hojas no tejidas como se define en el presente documento, apiladas una encima de la otra y comprendiendo cada una una o mas nanofibras de acetato de celulosa como se define en el presente documento, (ii) calentar y comprimir simultaneamente la pila de hojas para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras de acetato de celulosa de hojas adyacentes como se define en el presente documento, (iii) tratar el producto comprimido y calentado para convertir el acetato de celulosa en celulosa como se define en el presente documento, y (iv) poner en contacto el producto asf obtenido con un reactivo como se define en el presente documento que funcionaliza el producto de la etapa (iii) como medio de cromatograffa como se define en el presente documento.
En una realizacion mas preferida de la invencion, la presente invencion proporciona un proceso para preparar un medio de cromatograffa de celulosa funcionalizado, proceso que comprende (i) proporcionar dos o mas hojas no tejidas como se define en el presente documento, apiladas una encima de la otra y comprendiendo cada una una o
mas nanofibras de acetato de celulosa como se define en el presente documento, (ii) calentar y comprimir
simultaneamente la pila de hojas para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras de acetato de celulosa de capas adyacentes como se define en el presente documento, (iii) tratar el producto comprimido y calentado para convertir el acetato de celulosa en celulosa como se define en el presente documento, y (iv) poner en contacto el producto asf obtenido en un modo discontinuo entre dos y cuatro veces con un reactivo como se define en el presente documento que funcionaliza el producto de la etapa (iii) como medio de cromatograffa como se define en el presente documento.
En otra realizacion mas preferida de la invencion, la presente invencion proporciona un proceso para preparar un medio de cromatograffa de celulosa funcionalizado, proceso que comprende (i) proporcionar dos o mas hojas no tejidas como se define en el presente documento, apiladas una encima de la otra y comprendiendo cada una una o
mas nanofibras de acetato de celulosa como se define en el presente documento, (ii) calentar y comprimir
simultaneamente la pila de hojas para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras de acetato de celulosa de hojas adyacentes como se define en el presente documento, (iii) tratar el producto comprimido y calentado para convertir el acetato de celulosa en celulosa como se define en el presente documento, (iv) poner el producto asf obtenido en un recipiente como se define en el presente documento, y (v) provocar que un reactivo como se define en el presente documento circule a traves del recipiente de manera que el reactivo circule en contacto con el producto obtenido en la etapa (iii) que funcionaliza el producto de la etapa (iii) como medio de cromatograffa como se define en el presente documento.
Se prefiere que entre dos y treinta, mas preferentemente entre cinco y veinticinco de dichas hojas, se apilen una encima de la otra en la etapa (I), comprendiendo cada hoja 1, 2 o 3 nanofibras de polfmero y teniendo cada hoja un
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espesor de 5 a 40 pm
Tambien se prefiere en la etapa (II) que la pila de hojas se caliente simultaneamente a una temperatura por debajo del punto de fusion del polfmero y se comprima bajo una presion de 0,01 a 5 MPa durante 1 a 120 minutos para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras de hojas adyacentes, teniendo el producto comprimido y calentado resultante una densidad promedio de 250 a 750 kg/m3 y un espesor de 0,05 a 10 mm.
Es mas preferido que:
- entre dos y treinta, mas preferentemente entre cinco y veinticinco de dichas hojas, se apilen una encima de la otra en la etapa (I), comprendiendo cada hoja 1, 2 o 3 nanofibras de polfmero y teniendo cada hoja un espesor de 5 a 40 pm; y
- en la etapa (II) que la pila de hojas se caliente simultaneamente a una temperatura por debajo del punto de fusion del polfmero y se comprima bajo una presion de 0,01 a 5 MPa durante 1 a 120 minutos para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras de hojas adyacentes, teniendo el producto comprimido y calentado resultante una densidad promedio de 250 a 750 kg/m3 y un espesor de 0,05 a 10 mm.
Se prefiere que entre dos y treinta, mas preferentemente entre cinco y veinticinco de dichas hojas, se apilen una encima de la otra en la etapa (I), consistiendo cada hoja en una nanofibra de polfmero unica, y teniendo cada hoja un espesor de 5 a 120 pm y una densidad del area de 1 a 40 g/m2.
Tambien se prefiere en la etapa (II) que la pila de hojas se caliente simultaneamente a una temperatura por debajo del punto de fusion del polfmero y se comprima bajo una presion de 1 a 500 kPa durante 1 a 30 minutos para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras de hojas adyacentes, teniendo el producto comprimido y calentado resultante una densidad promedio de 200 a 1000 kg/m3 y un espesor de 0,05 a 10 mm.
Es mas preferido que:
- entre dos y treinta, mas preferentemente entre cinco y veinticinco de dichas hojas, se apilen una encima de la otra en la etapa (I), consistiendo cada hoja en una nanofibra de polfmero unica, y teniendo cada hoja un espesor de 5 a 120 pm y una densidad del area de 1 a 40 g/m2; y
- en la etapa (II) que la pila de hojas se caliente simultaneamente a una temperatura por debajo del punto de fusion del polfmero y se comprima bajo una presion de 1 a 500 kPa durante 1 a 30 minutos para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras de hojas adyacentes, teniendo el producto comprimido y calentado resultante una densidad promedio de 200 a 1000 kg/m3 y un espesor de 0,05 a 10 mm
Medio de cromatograffa funcionalizado de la invencion
La presente invencion tambien proporciona un medio de cromatograffa funcionalizado que es obtenible por el proceso de la presente invencion.
Tambien se proporciona un medio de cromatograffa funcionalizado que se obtiene por el proceso de la presente invencion.
El medio de cromatograffa funcionalizado de la presente invencion normalmente tiene una porosidad de 0,1 a 1,0 pm, preferentemente de 0,3 a 0,9 pm, mas preferentemente de 0,4 a 0,8 pm, incluso mas preferentemente de 0,5 a 0,7 pm, todavfa mas preferentemente de 0,6 a 0,7 pm, por ejemplo de 0,6 a 0,65 pm.
El medio de cromatograffa funcionalizado de la presente invencion tiene una densidad de 200 a 1000 kg/m3, preferentemente 250 a 750 kg/m3, mas preferentemente de 350 a 650 kg/m3, en algunas circunstancias de 450 a 550 kg/m3. Otras densidades preferibles incluyen de 200 a 750 kg/m3, 200 a 650 kg/m3, 200 a 550 kg/m3, 250 a 750 kg/m3, 250 a 650 kg/m3 y 250 a 550 kg/m3.
Normalmente, el medio de cromatograffa funcionalizado de la presente invencion tiene un espesor de 0,05 a 10 mm, por ejemplo 0,1 a 5 mm.
Preferentemente, el medio de cromatograffa funcionalizado de la presente invencion esta funcionalizado de manera que sea adecuado para su uso en un metodo de cromatograffa como se define en el presente documento, por ejemplo cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de captura por afinidad y cromatograffa hidrofoba.
El medio de cromatograffa funcionalizado de la presente invencion normalmente esta en forma de una membrana.
Cartucho de cromatograffa de la invencion
La presente invencion tambien proporciona un cartucho de cromatograffa. El cartucho de cromatograffa de la presente invencion comprende uno o mas medios de cromatograffa funcionalizados de la presente invencion.
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Alternativamente, el cartucho de cromatograffa de la presente invencion es obtenible llevando a cabo el proceso de la presente invencion e incorporando el producto asf obtenido en un cartucho.
Tambien se proporciona un proceso para preparar un cartucho de cromatograffa que comprende llevar a cabo el proceso de la presente invencion e incorporar el producto asf obtenido en un cartucho.
El cartucho de cromatograffa normalmente es adecuado para su uso en cromatograffa, preferentemente un metodo de cromatograffa como se define en el presente documento.
Un cartucho de cromatograffa de la presente invencion comprende normalmente uno o mas medios de cromatograffa funcionalizados de la presente invencion dentro de un recipiente, por ejemplo un recipiente como se ha definido anteriormente. El soporte normalmente es cilfndrico.
Normalmente, el cartucho de cromatograffa comprende uno o mas medios de cromatograffa funcionalizados de la presente invencion apilados dentro de un recipiente cilfndrico.
Normalmente, el cartucho de cromatograffa comprende dos o mas medios de cromatograffa funcionalizados de la presente invencion. Normalmente, el cartucho de cromatograffa comprende hasta veinte medios de cromatograffa funcionalizados de la presente invencion.
Normalmente, el cartucho de cromatograffa tambien comprende una o mas fritas dentro del recipiente normalmente cilfndrico. Las fritas son muy conocidas para el experto en la materia y se refieren a estructuras porosas rfgidas, normalmente estructuras porosas de metal rfgido, polimericas o ceramicas, preferentemente de metal rfgido o ceramicas. Las fritas normalmente estan incluidas en un cartucho de cromatograffa para mejorar la distribucion de flujo a traves del cartucho y/o para soportar el uno o mas medios de cromatograffa funcionalizados de la presente invencion. Los poros en las fritas tfpicas tienen diametros de 1 a 1000 pm, preferentemente de 5 a 500 pm, mas preferentemente de 10 a 150 pm. Otros diametros de poro de frita adecuados incluyen de 1 a 20 pm, preferentemente de 5 a 10 pm, mas preferentemente de 3 a 7 pm
Normalmente, el cartucho de cromatograffa tambien comprende uno o mas medios de distribucion de fluido de entrada y/o medios de recogida de fluido de salida. Tales medios son muy conocidos para el experto en la materia.
Metodo de cromatograffa de la invencion
La presente invencion tambien proporciona el uso de un medio de cromatograffa funcionalizado de la invencion o un cartucho de cromatograffa de la invencion en cromatograffa, particularmente en un metodo de cromatograffa como se define en el presente documento.
La presente invencion tambien proporciona un proceso para aislar una o mas moleculas biologicas de una fase movil, proceso que comprende poner en contacto una o mas moleculas biologicas en una fase movil con un medio de cromatograffa funcionalizado de la invencion o un cartucho de cromatograffa de la invencion. El medio de cromatograffa o cartucho de cromatograffa se une preferencialmente a la una o mas moleculas biologicas en la fase movil, normalmente en preferencia a otros componentes (por ejemplo, otras moleculas biologicas) tambien presentes en la fase movil. Esto puede llevarse a cabo segun metodos convencionales conocidos para la fase de union de tales metodos cromatograficos.
Asf, normalmente, este proceso cromatografico es un proceso de cromatograffa de intercambio ionico (anionico o cationico), captura por afinidad, interaccion hidrofoba o de modo mixto.
Preferentemente, el proceso cromatografico es un proceso de cromatograffa de intercambio anionico y el medio de cromatograffa esta funcionalizado con DEAE o Q; el proceso cromatografico es un proceso de cromatograffa de intercambio cationico y el medio de cromatograffa esta funcionalizado con SP o CM; el proceso cromatografico es una proceso de cromatograffa de captura por afinidad y el medio de cromatograffa esta funcionalizado con Protefna A; o el proceso cromatografico es un proceso de cromatograffa de interaccion hidrofoba y el medio de cromatograffa esta funcionalizado con grupos fenilo.
Asf, la presente invencion proporciona un proceso de cromatograffa que comprende la etapa anterior. Normalmente, el proceso de cromatograffa se lleva a cabo segun un metodo de cromatograffa como se ha definido anteriormente.
El proceso de cromatograffa normalmente comprende otra etapa de recuperar la una o mas moleculas biologicas del medio de cromatograffa funcionalizado o cartucho de cromatograffa. Esta etapa puede normalmente efectuarse poniendo en contacto el medio de cromatograffa funcionalizado o cartucho de cromatograffa al que se adsorbe la una o mas moleculas biologicas con un tampon de elucion. Esto puede llevarse a cabo segun metodos convencionales conocidos para la fase de eluir de tales metodos cromatograficos. Asf, el proceso normalmente es un metodo cromatografico de unir-eluir.
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Entre las etapas de unir y eluir, el proceso puede comprender ademas una etapa de lavar el medio de cromatograffa funcionalizado o cartucho de cromatograffa de la invencion al que se adsorbe la una o mas moleculas biologicas. Esta etapa de lavado se lleva a cabo para eliminar cualquier componente que no se una al medio de cromatograffa funcionalizado o cartucho de cromatograffa. Esto puede llevarse a cabo segun metodos convencionales conocidos para la fase de lavado de tales metodos cromatograficos.
Despues de la etapa de eluir, el proceso puede comprender ademas una etapa de regenerar el medio de cromatograffa funcionalizado o cartucho de cromatograffa de la invencion. Normalmente, esto se efectua poniendo en contacto el medio de cromatograffa funcionalizado o cartucho de cromatograffa del que se han eluido la una o mas moleculas biologicas con un tampon. Esto puede llevarse a cabo segun metodos convencionales conocidos para la fase de regeneracion de tales metodos cromatograficos.
Normalmente, la una o mas moleculas biologicas se eligen de protefnas, polipeptidos, anticuerpos, aminoacidos, virus y acidos nucleicos, que incluyen, por ejemplo, protefnas recombinantes, anticuerpos monoclonales, vacunas virales y ADN de plasmido.
El anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo multiespecffico (por ejemplo, un anticuerpo biespecffico) o un anticuerpo de dominio delecionado. Preferentemente, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. Pueden usarse fragmentos de union al antfgeno de los anticuerpos monoclonales. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diacuerpos y anticuerpos monocatenarios.
Normalmente, el proceso cromatografico emplea un sistema de lecho en movimiento simulado o real. Asf normalmente, el proceso comprende introducir la una o mas moleculas biologicas en una fase movil en uno o mas aparatos de cromatograffa de lecho en movimiento simulado o real que tienen una pluralidad de columnas de cromatograffa conectadas, columnas de cromatograffa que contienen como adsorbente el medio de cromatograffa funcionalizado de la presente invencion.
Puede usarse cualquier aparato de lecho en movimiento simulado o real conocido para llevar a cabo el proceso cromatografico, a condicion de que comprenda, como adsorbente, el medio de cromatograffa funcionalizado de la presente invencion.
La cromatograffa en lecho en movimiento simulado y real son tecnicas conocidas, familiares para aquellos expertos en la materia. El principio de operacion implica movimiento en contracorriente de una fase de eluyente lfquido y una fase de adsorbente solido. Esta operacion permite uso mfnimo de disolvente haciendo el proceso economicamente viable. Tal tecnologfa de separacion ha encontrado aplicaciones en diversas areas que incluyen purificacion de moleculas biologicas usando adsorbentes de membrana.
Un sistema de lecho en movimiento simulado consiste en varias columnas individuales que contienen adsorbente que estan conectadas juntas en serie. El eluyente pasa a traves de las columnas en una primera direccion. Los puntos de inyeccion de la materia prima y el eluyente, y los puntos de recogida de componentes separados en el sistema, son periodicamente desplazados por medio de una serie de valvulas. El efecto global es simular la operacion de una unica columna que contiene un lecho en movimiento del adsorbente solido. Asf, un sistema de lecho en movimiento simulado consiste en columnas que, como en un sistema de lecho estacionario convencional, contienen lechos estacionarios de adsorbente solido a traves del que pasa el eluyente, pero en un sistema de lecho en movimiento simulado la operacion es tal como simular un lecho en movimiento en contracorriente continuo.
Un lecho en movimiento simulado real es similar en operacion a un sistema de lecho en movimiento simulado. Sin embargo, en vez de desplazar los puntos de inyeccion de la mezcla de alimentacion y el eluyente, y los puntos de recogida de componentes separados por medio de un sistema de valvulas, en su lugar una serie de unidades de adsorcion (es decir, columnas) son ffsicamente movidas con respecto a los puntos de alimentacion y de extraccion. Otra vez, la operacion es tal como simular un lecho en movimiento en contracorriente continuo.
Los siguientes ejemplos ilustran la invencion.
Materiales y equipo
Se emplearon los siguientes materiales, equipo y tecnicas, a menos que se establezca de otro modo
Se compraron protefna BSA Bovine Albumin Serum Fraction V, >96 % con peso molecular de ~66 kDa y todos los otros productos qufmicos de Sigma-Aldrich Co. (Sigma-Aldrich Company Ltd. Dorset, RU) de la mayor pureza disponible y se usaron sin mas purificacion, a menos que se establezca de otro modo.
Se compro citocromo c, de corazon equino, >90 % con peso molecular de ~12 kDA de Merck Chemical (Merck Serono Ltd. Middlesex, RU).
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Ejemplo 1 preparativo
Preparation de membrana de nanofibra
Se disolvio una solucion de 0,20 g/ml de acetato de celulosa, con una masa molecular relativa de 29.000 g/mol, en acetona/dimetilformamida/etanol (2:2:1). Se llevo a cabo electrohilado en una vitrina de control climatico Climate Zone (alsafetech Luton, RU) para permitir el control de temperatura y la humedad de las condiciones ambientales. Se usaron condiciones optimizadas de O. Hardick, et al, J. Mater. Sci. 46 (2011) 3890 para producir hojas no tejidas de nanofibras de acetato de celulosa electrohiladas con baja distribucion de diametros de fibra, espesores promedio de 20 micrometros y densidades de area promedio de 10 g/m2.
Una vez electrohiladas, quince hojas no tejidas de nanofibras con un area superficial de la cara de 100 cm2 se apilaron las unas encima de las otras y se comprimieron en una prensa hidraulica manual a una presion de 1 MPa durante dos minutos. Despues de la compresion, la hoja de material se puso inmediatamente en un horno precalentado a 213 °C durante 5 minutos entre hojas metalicas. La presion entre las hojas metalicas se determino como 20 kPa. Entonces, el material comprimido y calentado se corto en multiples discos de 25 mm de diametro.
Ejemplo 1
Modification qufmica por convection
Se preparo un disco de nanofibra de acetato de celulosa como antes y se modifico qufmicamente para dar funcionalidad de superficie de intercambio anionico. Se modifico un disco que tenia un espesor de 0,188 mm y volumen total 0,1 ml como se explica a continuacion.
El disco de nanofibra se empaqueto en un portafiltros antes de la derivatizacion. Se llevo a cabo desacetilacion usando 30 ml de NaOH 0,1 M en agua DI:etanol (2:1), que se bombeo a traves del disco de una manera ciclica usando una bomba de HPLC P680 Dione a una tasa de 25 ml/min durante 24 horas. Entonces se aclaro el disco con 300 ml de H2O DI a una tasa de 25 ml/min. Entonces se confirio la funcionalidad de superficie de intercambio anionico por ciclos de 20 ml de solucion acuosa al 99 % de clorhidrato de 2-cloro-N,N-dietiletilamina al 15 % (DEACH) caliente (40 °C) a traves del disco a 40 ml/min durante 10 min. Entonces se saco el disco de la carcasa de portafiltros y se dejo durante 30 segundos que se secara goteando antes poner en 20 ml de NaOH 0,5 M caliente (80 °C) en un tubo de muestra de 50 ml en una mesa vibratoria con agitacion suave durante 10 min. Finalmente, el disco se aclaro en multiples volumenes de H2O DI y se dejo secar antes de uso.
Ejemplo 2
Se llevo a cabo un experimento como se explica en el Ejemplo 1 anterior, excepto que el disco de nanofibra de acetato de celulosa usado tuvo un espesor de 0,376 mm y volumen total 0,2 ml.
Ejemplo 3
Modification qufmica por difusion
Se preparo un disco de nanofibra de acetato de celulosa como antes. Se modifico un disco que tenia un espesor de 0,188 mm y volumen total 0,1 ml como se explica a continuacion.
El disco se puso en un tubo de muestra de 50 ml que contenfa 30 ml de NaOH 0,1 M en agua DI:etanol (2:1) durante 24 horas en una mesa vibratoria de laboratorio para desacetilar el acetato de celulosa para formar celulosa regenerada. Entonces, el disco se aclaro minuciosamente en volumenes de 10 x 30 ml de agua DI durante 5 minutos cada uno en la mesa vibratoria. Entonces se introdujo funcionalidad de superficie de intercambio anionico poniendo el disco aclarado en un tubo de muestra con 20 ml de solucion acuosa al 99 % de clorhidrato de 2-cloro-N,N- dietiletilamina al 15 % (DEACH) caliente (40 °C) durante 10 min. Se elimino el adsorbente y se dejo que se secara goteando durante 30 segundos antes ponerse en 20 ml de NaOH 0,5 M caliente (80 °C) en un nuevo tubo de muestra en la mesa vibratoria durante 10 min. Finalmente, el disco se aclaro en multiples volumenes de H2O DI y se dejo secar antes de uso.
Ejemplo 4
Se llevo a cabo un experimento como se explica en el Ejemplo 1 anterior, excepto que el disco de nanofibra de acetato de celulosa usado tuvo un espesor de 0,376 mm y volumen total 0,2 ml.
Ejemplo 5
Analisis del rendimiento de bioseparacion
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Se prepararon discos de nanofibra y modificados segun los Ejemplos 1 a 4 se analizaron para comparar el rendimiento de union a protefna de membranas de nanofibra de masa y volumen equivalentes derivatizada por los dos metodos diferentes. Esto fue para determinar el grado de modificacion del area superficial presentada por estos sistemas de nanofibra.
Se realizaron experimentos usando un AKTA Basic (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, RU) con medicion en lfnea de absorbancia UV (280 nm), pH y conductividad.
Se prepararon discos de nanofibra y modificados segun los Ejemplos 1 a 4 se equilibraron con 5 ml de bis-Tris 20 mM, tampon de lavado a pH 5,3 a una tasa de 480 cm/h y luego se cargaron con 1 ml de una solucion de protefna de dos componentes que contenfa 1 mg/ml de BSA y 0,25 mg/ml de citocromo C. Entonces se pasaron 5 ml de tampon de lavado a traves del adsorbente antes de introducir 5 ml de tampon de elucion de NaCl 0,4 M-bis-Tris 20 mM, pH 5,3. Entonces se analizo la capacidad de elucion usando el software Unicorn 5.0 como se mide por la integracion del area del pico.
Se uso una mezcla de BSA y citocromo C para aprovechar sus diferentes puntos isoelectricos y, por tanto, la idoneidad para la separacion por cromatograffa de intercambio ionico. El citocromo C tiene un pi de 10,0 mientras que BSA tiene un pi de 4,7 en agua a 25 °C. Esto significa que en una solucion de tampon bis-Tris a pH 5,3 el citocromo C tendra una carga neta positiva y no se unira a la superficie de intercambio anionica debil del adsorbente de DEAE. A diferencia, a este pH por encima del pi de BSA, BSA tendra una carga de superficie negativa neta y, por tanto, se unira al adsorbente de DEAE. Como la concentracion de sales aumenta durante la elucion, la interaccion entre la carga de superficie negativa de BSA y el intercambiador anionico esta fuera de competicion por los iones de sal y asf el BSA se elimina del adsorbente y se recoge.
El rendimiento del adsorbente se analizo durante varios ciclos de operacion para determinar la reproducibilidad con respecto a la vida de los adsorbentes. La tabla a continuacion expone las capacidades de union promedio para los discos probados.
Muestra
Espesor de adsorbente (mm) Volumen de adsorbente (ml) Capacidad de union (mg/ml)
Ejemplo 1
0,188 0,1 5,64 ± 0,10
Ejemplo 3
0,188 0,1 5,56 ± 0,40
Ejemplo 2
0,376 0,2 6,46 ± 0,44
Ejemplo 4
0,376 0,2 5,88 ± 0,56
Para ambos espesores de discos de nanofibra, el proceso de modificacion convectiva dio una capacidad de union mas alta que el proceso de modificacion difusiva. Este efecto fue mas pronunciado para el disco mas grueso.
Tambien se observo que la capacidad de reactivos qufmicos para alcanzar superficies funcionales del sistema de polfmero tambien dependfa del espesor de la membrana de nanofibra. Asf, para las membranas de nanofibra mas gruesas probadas hubo una capacidad de union significativamente mejorada observada para los adsorbentes de nanofibra de DEAE que se derivatizaron mediante flujo convectivo. Esto sugiere que para los protocolos investigados, la difusion es insuficiente para que los reactivos qufmicos alcancen todas las areas superficiales de union.
Ejemplo 6
Modificacion quimica difusiva repetida
Se llevo a cabo derivatizacion de superficie de intercambio anionico de los discos de nanofibra de celulosa como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 4, es decir, usando un disco de nanofibra de acetato de celulosa que tiene un espesor de 0,376 mm y volumen total 0,2 ml. La modificacion quimica se repitio entonces desde el punto de la introduccion de DEACH hasta el final del protocolo.
Asf, el disco obtenido en el Ejemplo 4 se puso en un tubo de muestra con 20 ml de solucion acuosa al 99 % de clorhidrato de 2-cloro-N,N-dietiletilamina al 15 % (DEACH) caliente (40 °C) durante 10 min. Se elimino el adsorbente y se dejo secar goteando durante 30 segundos antes de ponerse en 20 ml de NaOH 0,5 M caliente (80 °C) en un tubo de muestra nuevo en una mesa vibratoria durante 10 min, entonces se aclaro en multiples volumenes de H2O DI.
Ejemplo 7
Se llevo a cabo un experimento como en el Ejemplo 6, excepto que la modificacion quimica se repitio otra vez.
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Asf, el disco obtenido en el Ejemplo 6 se puso en un tubo de muestra con 20 ml de solucion acuosa al 99 % de clorhidrato de 2-cloro-N,N-dietiletilamina al 15 % (DEACH) caliente (40 °C) durante 10 min. Se elimino el adsorbente y se dejo secar goteando durante 30 segundos antes de ponerse en 20 ml de NaOH 0,5 M caliente (80 °C) en un tubo de muestra nuevo en una mesa vibratoria durante 10 min, entonces se aclaro en multiples volumenes de H2O DI.
Ejemplo 8
Se llevo a cabo un experimento como en el Ejemplo 7, excepto que la modificacion qufmica se repitio otra vez.
Asf, el disco obtenido en el Ejemplo 7 se puso en un tubo de muestra con 20 ml de solucion acuosa al 99 % de clorhidrato de 2-cloro-N,N-dietiletilamina al 15 % (DEACH) caliente (40 °C) durante 10 min. Se elimino el adsorbente y se dejo secar goteando durante 30 segundos antes de ponerse en 20 ml de NaOH 0,5 M caliente (80 °C) en un tubo de muestra nuevo en una mesa vibratoria durante 10 min, entonces se aclaro en multiples volumenes de H2O DI.
Ejemplo 9
Se analizaron los discos producidos en los Ejemplos 4 y 6 a 8 para la capacidad de union usando el protocolo explicado anteriormente en el Ejemplo 5. Tambien se determino la cafda de presion para cada disco.
La tabla a continuacion expone las capacidades de union promedio y cafdas de presion para los discos probados.
Muestra
Modificaciones qufmicas Cafda de presion (MPa) Capacidad de union (mg/ml)
Ejemplo 4
x1 0,210 5,88 ± 0,56
Ejemplo 6
x2 0,205 13,31 ± 3,11
Ejemplo 7
x3 0,245 14,88 ± 0,38
Ejemplo 8
x4 0,205 15,88 ± 0,73
Estos resultados muestran una clara mejora en la sustitucion de grupos funcionales con etapas del protocolo de derivatizacion repetidas. En general, se observo una mejora del 270 % en la capacidad de union para los adsorbentes probados usando etapas del protocolo repetidas durante la derivatizacion. La cafda de presion no estuvo afectada por la modificacion repetida.
No parecio afectarse la estabilidad estructural de los adsorbentes de nanofibra DEAE de derivatizacion repetida y esto se confirmo por estudios de reproducibilidad que mostraron rendimiento constante durante 50 ciclos de operacion tfpica.
La Figura 1 muestra el flujo a traves de citocromo C + BSA no unido como el primer pico durante la carga de una mezcla de 2 componentes y la elucion de BSA como el segundo pico. El resultado promedio durante 50 series de union equivalentes se representa ± 1 desviacion estandar de la poblacion de muestra (mostrada por las curvas discontinuas alrededor de la curva principal del mismo color). Estos resultados muestran la reproducibilidad con respecto a las 50 series de union equivalentes y muestran que para las condiciones elegidas los adsorbentes de nanofibra rindieron reproduciblemente, capturando y eluyendo el 99 % del BSA cargado. La desviacion estandar se calculo para mostrar que la nanofibra adsorbente operaba coherentemente.
La Figura 2 muestra el flujo a traves de citocromo C + BSA no unido como el primer pico durante la carga de una mezcla de 2 componentes y la elucion de BSA como el segundo pico. Se llevaron a cabo multiples series de union, y se representaron curvas para series registradas separadas 500 series. Las curvas registradas para las dos series casi se solapan completamente. Esto tambien demuestra la excelente reproducibilidad obtenida con membranas preparadas segun la presente invencion. Esto es a diferencia de la significativa disminucion en el rendimiento despues de multiples series informadas con membranas del estado de la tecnica.
Ejemplo 2 preparativo
Se disolvio una solucion de 0,20 g/ml de acetato de celulosa, con una masa molecular relativa de 29.000 g/mol, en disolventes comunes, por ejemplo acetona/dimetilformamida/etanol. Se usaron condiciones optimizadas de O. Hardick, et al, J. Mater. Sci. 46 (2011) 3890 para producir hojas no tejidas de nanofibras de acetato de celulosa electrohiladas con distribucion baja de diametros de fibra, espesores promedio de 20 micrometres y densidades de area promedio de 20 g/m2.
Una vez electrohiladas, se apilaron diez hojas no tejidas de nanofibras con un area superficial de la cara de 100 cm2 las unas encima de las otras y se pusieron en un horno precalentado a 208 °C durante 30 minutos entre hojas metalicas. La presion entre las hojas metalicas se determino como 20 kPa. Entonces, el material comprimido y
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calentado se corto en multiples discos de 25 mm de diametro.
Ejemplo 1 analitico - Efecto del calentamiento y la compresion
Se obtuvieron diez hojas de nanofibras de acetato de celulosa como se describe en el Ejemplo 2 preparativo. Las hojas se apilaron las unas encima de las otras y se sometieron a 20 kPa de presion en una prensa calentada mientras que se calentaban simultaneamente a 207 °C. Las hojas apiladas se comprimieron y se calentaron en la prensa durante 5 minutos. Despues de la compresion y el calentamiento, se corto un disco de la membrana resultante. Se desacetilaron las fibras de acetato de celulosa dando celulosa usando el metodo brevemente expuesto en el Ejemplo 3. Las muestras preparadas de esta forma se refieren mas adelante como las muestras de "prensa", que refleja el hecho de que el calentamiento se llevo a cabo en una prensa calentada.
Se puso un disco de "prensa" en una junta torica de caucho dentro de una jeringa de 50 ml, como recipiente para contener la junta torica en su sitio. Se coloco un peso en forma de una punta de pipeta de 10 ml (masa 5,81 g) en el centro del disco de nanofibra. Se anadio una solucion de NaOH 1 M al recipiente y se uso un cronometro para determinar el punto de fallo. El punto de fallo se determino como el momento en el que la punta de pipeta cayo a traves del disco. La longitud de tiempo necesaria para que la punta de pipeta caiga a traves del disco indica la resistividad qufmica del disco. Este experimento se repitio tres veces.
Este sistema experimental se muestra en la Figura 3.
Se produjeron discos de nanofibra adicionales como se ha descrito anteriormente, excepto que las diez hojas de nanofibra se comprimieron primero en una prensa (sin calentamiento) a una presion de 20 kPa durante una hora, seguido de calentamiento (sin compresion) en un horno durante cinco minutos a 207 °C. Las muestras preparadas de esta forma se refieren mas adelante como las muestras de "horno", que refleja el hecho de que el calentamiento se llevo a cabo en un horno.
Se puso un disco de "horno" en una junta torica de caucho y se sometio a la prueba de resistividad qufmica descrita anteriormente. Otra vez, esto se repitio tres veces.
Los resultados para los discos de "prensa" y de "horno" se exponen en la tabla a continuacion.
Disco 1 Disco 2 Disco 3
Horno
66 minutos 71 minutos 88 minutos
Prensa
>120 h >120 h >120 h
Puede observarse de estos resultados que los discos que son comprimidos y calentados simultaneamente tienen resistividad qufmica superior a aquellos que son comprimidos (sin calentar) y posteriormente calentados (sin comprimir).
El disco de "horno" mostro decoloracion y corrosion por picaduras en el plazo de 10 minutos desde la exposicion a NaOH 1 M. El disco de "prensa" mostro poca degradacion incluso despues de 120 horas de exposicion. Las fotograffas de los discos respectivos se muestran como Figura 4.
Se determino el espesor y la densidad de varios discos de "prensa" y de "horno". Los espesores y las densidades promedio de estos discos se muestran en la Figura 5. Se encontro que los discos de "prensa" eran tanto mas finos como mas densos que los discos de "horno".
Se analizaron las caracterfsticas de flujo de los discos de "prensa" y de "horno" determinando el delta de cafda de presion en la columna a caudales crecientes (2, 5, 10, 20, 30, 40, 60 ml/min) de tampon Tris-HCl (pH 8) a traves de los discos. Los datos obtenidos se muestran como la Figura 6. Puede observarse que los discos de "prensa" y de "horno" tienen caracterfsticas de flujo similares.
Ejemplo 2 analitico - Efecto de variar la presion
Se prepararon discos de celulosa regenerada usando el metodo descrito en el Ejemplo 1 analitico para los discos de "prensa". Los discos preparados de este modo se refieren mas adelante como los discos de "20 kPa".
Se prepararon discos adicionales usando el metodo descrito anteriormente para los discos de "20 kPa", excepto que se uso una presion de 200 kPa en lugar de 20 kPa. Los discos preparados de este modo se refieren mas adelante como los discos de "200 kPa".
Se determinaron el espesor y la densidad de varios discos de "20 kPa" y "200 kPa". Los espesores y densidades promedio de estos discos se muestran en la Figura 7. Se encontro que los discos de "200 kPa" eran tanto mas finos como mas densos que los discos de "20 kPa".
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Las caracterfsticas de flujo de los discos de "20 kPa" y "200 kPa" se analizaron usando el metodo descrito en el Ejemplo 1 analftico. Los datos obtenidos se muestran como la Figura 8. Puede observarse que la cafda de presion sobre los discos de "200 kPa" es superior a aquella sobre los discos de "20 kPa".
Los discos de celulosa regenerada de "20 kPa" y "200 kPa" se funcionalizaron con DEAE usando el metodo del Ejemplo 3. Se determinaron las capacidades de union dinamica (DBC) para estos discos usando el protocolo similar al explicado en el Ejemplo 5. Se determino la capacidad de union dinamica (DBC) a un flujo de 30 ml/min, usando diferentes masas de BSA (1 mg, 2 mg, 4 mg), usando tampon Tris-HCl a pH 8, con una etapa de elucion de NaCl 1 M. Los resultados del analisis de DBC se muestran en la Figura 9. La DBC de los discos de "20 kPa" es superior a la de los discos de "200 kPa".
Ejemplo 10
Se prepararon discos de nanofibra segun el metodo del Ejemplo 2 preparativo. Los discos se desacetilaron y se sumergieron en DEACH a temperatura ambiente, entonces se lavaron con NaOH 0,5 M a temperatura ambiente. La inmersion en DEACH y el lavado con NaOH 0,5 M se repitio hasta 5 veces y se refiere mas adelante como el numero de ciclos de funcionalizacion. Asf, los discos se funcionalizaron usando 1 ciclo, 2 ciclos, 3 ciclos, 4 ciclos y 5 ciclos.
Las caracterfsticas de flujo de los discos de 1, 2, 3, 4 y 5 ciclos se analizaron usando el metodo descrito en el Ejemplo 1 analftico usando caudales crecientes (2, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80 ml/min), usando tampon Tris-HCl a pH 8. Los datos obtenidos se muestran como la Figura 10. Puede observarse que la cafda de presion aumenta con el numero de ciclos.
Se analizaron las capacidades de union dinamica (DBC) para los discos de 1, 2, 3, 4 y 5 ciclos usando el metodo descrito en el Ejemplo 2 analftico. Los resultados del analisis de DBC se muestran en la Figura 11. La DBC aumenta de 1 a 4 ciclos, y entonces disminuye para el quinto ciclo.
Ejemplo 11 - Preparacion de discos funcionalizados con SP
Se prepararon discos de celulosa regenerada usando el metodo del Ejemplo 2 preparativo y Ejemplo 1.
A una solucion de 10 ml de DMSO y 5 ml de NaOH 1 M se anadieron 2 ml de alil glicidil eter, seguido de 10 discos de fibra de celulosa regenerada. Se ajusto una solucion de disulfito de sodio (3 g) en 30 ml de H2O a pH 6,5 mediante la adicion de NaOH (1 M). Los discos obtenidos en la primera etapa anterior se trataron entonces con esta mezcla. Los discos se lavaron entonces con HCl 0,1 M, seguido de agua.
Para determinar la capacidad de union dinamica, se analizaron discos funcionalizados con SP usando un metodo similar al brevemente expuesto anteriormente en el Ejemplo 5. Se equilibro un sistema de purificacion AKTA (GE Healthcare) con tampon acetato de Na 10 mM a pH 5. Se cargo una muestra de 1 mg/ml de lisozima sobre el sistema a 30 ml/min. Se uso una solucion de NaCl 1 M (tampon acetato de Na 10 mM a pH 5) para la elucion. La senal UV en lfnea a 280 nm produjo el cromatograma mostrado en la Figura 12.
Ejemplo 12 - Preparacion de discos funcionalizados con CM
Se prepararon discos de celulosa regenerada usando el metodo del Ejemplo 2 preparativo y Ejemplo 1.
Estos se anadieron a una solucion acuosa de NaBr (24,3 mmoles) y TEMPO (1,60 mmoles) y se ajusto usando NaOH a pH 10. A esta se anadio NaOCl (5,0 mmoles) hasta que no hubo cambio adicional en el pH. Entonces se lavaron discos con EtOH.
Para determinar la capacidad de union dinamica de los discos, se ejecuta un sistema AKTA a un caudal de 30 ml/min y la muestra usada es lisozima a una concentracion de 1 mg/ml con inyeccion de carga de 1 ml. Se uso tampon acetato sodico 10 mM a pH 5 para equilibrar y lavar el sistema. Se usa una solucion de NaCl 1 M (tampon acetato sodico 10 mM a pH 5) para la elucion. La senal UV en lfnea a 280 nm produjo el cromatograma mostrado en la Figura 13.
Ejemplo 13 - Preparacion de discos funcionalizados con Q
Se prepararon discos de celulosa regenerada usando el metodo del Ejemplo 2 preparativo y Ejemplo 1.
Estos se anadieron a una solucion de 2:1:0,1 de DMSO:NaOH 1 M:glicidiltrimetilamonio. Entonces, los discos se lavaron con HCl 0,1 M y agua.
Para determinar la capacidad de union dinamica se equilibro el sistema de purificacion AKTA (GE Healthcare) con tampon Tris-HCl 10 mM a pH 8. Se cargo una muestra de 1 mg/ml de BSA sobre el sistema a 20 ml/min. Se usa una
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solucion de NaCI 1 M (tampon Tris-HCl 10 mM a pH 8) para la elucion. La senal UV en linea a 280 nm produjo el cromatograma mostrado en la Figura 14.
Ejemplo 14 - Preparacion de discos funcionalizados con Proteina A
Se prepararon discos de celulosa regenerada usando el metodo del Ejemplo 2 preparativo y Ejemplo 1.
Estos se anadieron a 80 ml de solucion de tampon de acetato sodico (pH 5,5) que contenfa 6,5 g de NaIO4. Los discos se lavaron entonces con 50 ml de etilenglicol seguido de agua. Entonces, los discos se lavaron con 0,05 % de Triton X-100, carbonato/bicarbonato 100 mM a pH 9,0. El ligando de proteina A se dializo con 0,05 % de Triton X- 100, carbonato/bicarbonato 100 mM a pH 9,0 y luego se anadio a los discos. La solucion se decanto entonces y se anadio 0,05 % de Triton X-100, carbonato/bicarbonato 100 mM a pH 9,0. A esta se anadio solucion de borohidruro de sodio 100 mM para dar una concentracion de borohidruro final de 4 mM. Entonces esta solucion se decanto y se anadieron 20 % de etanol en tampon fosfato 50 mM-cloruro sodico 150 mM a pH 6,7. Las etapas de lavado anteriores se repitieron 9 veces.
Para determinar la capacidad de union dinamica se ejecuto el sistema AKTA a un caudal de 30 ml/min y la muestra usada fue IgG purificada en Proteina A a una concentracion de 1 mg/ml con inyeccion de carga de 1 ml. Se uso tampon PBS a pH 7,4 para equilibrar y lavar el sistema. Se usa una solucion de tampon citrato de sodio 0,1 M a pH 3,0 para la elucion. La senal UV en linea a 280 nm produjo el cromatograma mostrado en la Figura 15.
Ejemplo 15 - Preparacion de discos funcionalizados con fenilo
Se prepararon discos de celulosa regenerada usando el metodo del Ejemplo 2 preparativo y Ejemplo 1.
Estos se anadieron a 75 ml de una solucion de una mezcla 2:1 de DMSO:NaOH 1 M. Entonces se anadio oxido de estireno (7,5 ml) a la mezcla de reaccion que se agito a temperatura ambiente durante 4 h. Entonces, los discos se lavaron con metanol, y luego agua.
Para determinar la capacidad de union dinamica se ejecuto el sistema AKTA a un caudal de 10 ml/min y la muestra usada fue 0,1 mg/ml de lisozima (con sulfato de amonio 1,5 M), con una inyeccion de carga de 1 ml. Se uso sulfato de amonio 1,5 M con Tris 10 mM a pH 8 para equilibrar y lavar el sistema. Se usa Tris 10 mM a pH 8 para la elucion. La senal UV en linea a 280 nm produjo el cromatograma mostrado en la Figura 16.
Ejemplo 3 analitico - Efecto de apilar antes comprimir y calentar
Como se trata anteriormente en el Ejemplo 1 analitico, los discos de celulosa regenerada preparados segun la presente invencion (los discos de "prensa") aguantaron durante >120 horas en una prueba de resistividad qufmica (mostrada en la Figura 3). Los discos de "prensa" mostraron poca degradacion incluso despues de 120 horas de exposicion a NaOH (como se muestra en la Figura 4).
Se obtuvieron hojas de nanofibras de acetato de celulosa individuales como se describe en el Ejemplo 2 preparativo. Se intercalo una unica hoja de capa entre dos hojas de PTFE planas y se puso en un horno a 208 °C durante una hora, segun el metodo descrito en Ma, et al, Journal of Membrane Science 265 (2005) 115-123. La hoja obtenida se desacetilo usando el metodo brevemente expuesto en el Ejemplo 3. Se cortaron diez discos de la hoja de celulosa resultante y se apilaron juntos como se describe en Ma, et al. Las muestras preparadas de esta forma se refieren mas adelante como las muestras de "Ma, et al". Este proceso se repitio ocho veces para crear ocho pilas de diez discos.
Se coloco una pila de discos de "Ma, et al" en una junta torica de caucho y se sometio a la prueba de resistividad qufmica descrita anteriormente en el Ejemplo 1 analitico. Esto se repitio tres veces. Los tres discos de "Ma, et al" probados fallaron despues de diez minutos, diez minutos y dos minutos, respectivamente.
Puede observarse de estos resultados que los discos que se forman a partir de multiples hojas no tejidas de nanofibras que se apilaron primero y luego se comprimieron y calentaron simultaneamente tienen resistividad qufmica superior a aquellos formados calentando hojas de nanofibra individuales, seguido de apilamiento posterior.
Los discos de "Ma, et al" mostraron decoloracion y corrosion por picaduras en el plazo de 10 minutos de exposicion a NaOH 1 M como se muestra en la Figura 17. Los discos de "prensa caliente" mostraron poca degradacion, incluso despues de 120 horas de exposicion (Figura 4).
Se determino el espesor y la densidad de varios discos de "prensa termica" y de "Ma, et al". Los espesores y las densidades promedio de estos discos se muestran en la Figura 18. Se encontro que los discos de "prensa termica" eran tanto mas finos como mas densos que los discos de "Ma, et al".
Las caracterfsticas de flujo de los discos de "prensa termica" y de "Ma, et al" se analizaron determinando el delta de cafda de presion en la columna a caudales crecientes de tampon Tris-HCl (pH 8) a traves de los discos. Los datos obtenidos se muestran como la Figura 19. Puede observarse que los discos de "prensa termica" y de "Ma, et al" tienen caracterfsticas de flujo similares.
5
Se funcionalizaron los discos de "prensa termica" y de "Ma et al" con ligandos de DEAE usando el metodo descrito en el Ejemplo 3. La capacidad de union dinamica de estos discos se determino usando el protocolo similar al que se expone en el Ejemplo 5. La capacidad de union dinamica (DBC) se determino a un flujo de 30 ml/min, usando diferentes masas de BSA (1 mg, 2 mg, 4 mg), usando tampon Tris-HCl a pH 8, con una etapa de elucion de NaCl 1 10 M. Los resultados del analisis de DBC se muestran en la Figura 20. La DBC de los discos de "prensa termica" es superior a la de los discos de "Ma, et al".
Se determino la posibilidad de realizar funcionalizaciones repetidas de los discos de "prensa termica" y de "Ma, et al". El metodo para la funcionalizacion de DEAE repetida de los discos descrito en el Ejemplo 10 se llevo a cabo en 15 tanto los discos de celulosa regenerada de "prensa termica" como de "Ma, et al". La mala estabilidad qufmica del material de "Ma, et al" significo que no era posible aumentar DBC usando multiples ciclos de funcionalizacion. La maxima DBC que se encontro que era posibles para el material de "Ma, et al" era aproximadamente 7 mg/ml (como se muestra en la Figura 20). Usando multiples ciclos de funcionalizacion fue posible aumentar la DBC del material de "prensa termica" a aproximadamente 16 mg/ml (vease la Figura 11). El material de "Ma, et al" se degrado 20 significativamente despues de multiples ciclos de DEAE. Este problema no se observo con el material de "prensa termica". Se muestran fotograffas del material de "Ma, et al" y de "prensa termica" despues de multiples ciclos de funcionalizacion en la Figura 21. El material de "Ma, et al" se muestra como la fotograffa inferior y el material de "prensa termica" como la fotograffa superior en la Figura 21.

Claims (23)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
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    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un proceso para preparar un medio de cromatograffa polimerico funcionalizado, proceso que comprende
    (I) proporcionar dos o mas hojas no tejidas apiladas una encima de la otra, comprendiendo cada dicha hoja una o mas nanofibras de polfmero, donde las nanofibras de polfmero tienen diametros medios de 10 nm a 1000 nm,
    (II) calentar y comprimir simultaneamente la pila de hojas para fusionar puntos de contacto entre las nanofibras de hojas adyacentes, y
    (III) poner en contacto el producto comprimido y calentado con un reactivo que funcionaliza el producto de la etapa (II) como medio de cromatograffa.
  2. 2. El proceso segun la reivindicacion 1, en el que entre dos y treinta, preferentemente entre cinco y veinticinco, de dichas hojas se apilan las una encima de las otras en la etapa (I).
  3. 3. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que una presion de
    (i) de 0,01 a 5 MPa, (ii) superior a 1 kPa, o (iii) no superior a 500 kPa, se aplica a la pila de hojas en la etapa
  4. 4. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que cada hoja no tejida consiste en una unica nanofibra de polfmero, o comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nanofibras de polfmero.
  5. 5. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el polfmero esta seleccionado del grupo que consiste en celulosa, acetato de celulosa, polisulfonas, poliamidas, acido poliacrflico, acido polimetacrflico, poliacrilonitrilo, poliestireno, poli(oxido de etileno), y mezclas de los mismos.
  6. 6. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas nanofibras son nanofibras de acetato de celulosa, y el producto comprimido y calentado se trata entre las etapas (II) y (III) para convertir el acetato de celulosa en celulosa.
  7. 7. El proceso segun la reivindicacion 6, en el que la pila de hojas se calienta a una temperatura entre 190 y 220 °C en la etapa (II).
  8. 8. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo la etapa (III) poner en contacto el producto comprimido y calentado en un modo discontinuo al menos dos veces con un reactivo que funcionaliza el producto comprimido y calentado como medio de cromatograffa.
  9. 9. El proceso segun la reivindicacion 8, comprendiendo cada etapa de poner en contacto con un reactivo en un modo discontinuo (a) poner en contacto con el reactivo, (b) aislar el producto de la etapa (a) del reactivo, (c) opcionalmente tratar el producto de la etapa (b) con alcali acuoso, y (d) opcionalmente lavar el producto de la etapa (b) o el producto opcional de la etapa (c) con agua; y/o
    en el que la funcionalizacion discontinua se lleva a cabo entre dos y cuatro veces.
  10. 10. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo la etapa (III) poner el producto comprimido y calentado en un recipiente, y (IV) provocar que un reactivo circule a traves del recipiente de manera que el reactivo circule en contacto con el producto comprimido y calentado que funcionaliza el producto de la etapa (II) como medio de cromatograffa.
  11. 11. El proceso segun la reivindicacion 10, en el que la etapa (IV) comprende
    - provocar que un reactivo circule a traves del recipiente bajo presion; y/o
    - provocar que un reactivo circule a traves del recipiente usando una bomba; y/o
    - provocar que un reactivo circule a traves del recipiente en una manera cfclica; y/o
    - provocar que un reactivo circule a traves del recipiente durante un periodo de tiempo de 1 a 20 minutos.
  12. 12. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el reactivo funcionaliza el producto comprimido y calentado de manera que el medio de cromatograffa funcionalizado resultante sea adecuado para su uso en un metodo de cromatograffa elegido del grupo que consiste en metodos de intercambio ionico, captura por afinidad, interaccion hidrofoba y de modo mixto.
  13. 13. El proceso segun la reivindicacion 12, en el que
    - el metodo de cromatograffa es un metodo de intercambio cationico, y el reactivo funcionaliza el medio de cromatograffa con un grupo carboxilato, sulfonato o fosfonato;
    - el metodo de cromatograffa es un metodo de intercambio anionico, y el reactivo funcionaliza el medio de cromatograffa con un grupo amino cuaternario o dietilamina;
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    - el metodo de cromatograffa es un metodo de cromatograffa de captura por afinidad, y el reactivo funcionaliza el medio de cromatograffa con una protefna, Protefna A, Protefna G, Protefna L, peptido, anticuerpo o fragmento del mismo, colorante, histidina, grupo que contiene un cation metalico, o ligando mimetico o sintetico que imita la accion de un ligando de protefna;
    - el metodo de cromatograffa es un metodo de cromatograffa de interaccion hidrofoba, y el reactivo funcionaliza el medio de cromatograffa con un grupo propilo, butilo, fenilo u octilo; o
    - el metodo de cromatograffa es un metodo de cromatograffa de modo mixto, y el reactivo funcionaliza el medio de cromatograffa con un grupo MEP, octilamina, N-bencilmetiletanolamina o N-benzoil-homocistefna.
  14. 14. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el reactivo funcionaliza un grupo hidroxilo, amino o acido carboxflico en el medio de cromatograffa.
  15. 15. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el producto comprimido y calentado se trata para desproteger o activar cualquier grupo funcional sobre el polfmero antes de la etapa de poner en contacto con un reactivo.
  16. 16. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que (A):
    - entre cinco y veinticinco de dichas hojas se apilan las unas encima de las otras en la etapa (I), comprendiendo cada hoja 1, 2 o 3 nanofibras de polfmero, y teniendo cada hoja un espesor de 5 a 40 pm, y/o
    - en la etapa (II) se aplican una temperatura por debajo del punto de fusion del polfmero y una presion de 0,01 a 5 MPa durante 1 a 120 minutos para obtener un producto comprimido y calentado que tiene una densidad promedio de 250 a 750 kg/m3 y un espesor de 0,05 a 10 mm;
    o (B):
    - entre cinco y veinte de dichas hojas se apilan las unas encima de las otras en la etapa (I), consistiendo cada hoja en una unica nanofibra de polfmero, y teniendo cada hoja un espesor de 5 a 120 pm y una densidad del area de 1 a 40 g/m2, y/o
    - en la etapa (II) se aplican una temperatura por debajo del punto de fusion del polfmero y una presion de 1 a 500 kPa durante 1 a 30 minutos para obtener un producto comprimido y calentado que tiene una densidad promedio de 200 a 1000 kg/m3 y un espesor de 0,05 a 10 mm.
  17. 17. Un medio de cromatograffa funcionalizado obtenible por el proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
  18. 18. Un proceso para preparar un cartucho de cromatograffa, proceso que comprende llevar a cabo el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 e incorporar el producto asf obtenido en un cartucho.
  19. 19. Un cartucho de cromatograffa que (a) es obtenible por el proceso de la reivindicacion 18, o (b) que comprende uno o mas medios de cromatograffa funcionalizados segun la reivindicacion 17.
  20. 20. Uso de un medio de cromatograffa funcionalizado segun la reivindicacion 17 o un cartucho de cromatograffa segun la reivindicacion 19 en cromatograffa.
  21. 21. Un proceso para aislar una o mas moleculas biologicas de una fase movil, proceso que comprende poner en contacto una o mas moleculas biologicas en una fase movil con un medio de cromatograffa funcionalizado segun la reivindicacion 17 o un cartucho de cromatograffa segun la reivindicacion 19.
  22. 22. El proceso segun la reivindicacion 21 que es un proceso de cromatograffa de intercambio ionico, captura por afinidad o interaccion hidrofoba.
  23. 23. El proceso segun la reivindicacion 21, en el que la una o mas moleculas biologicas son una o mas protefnas, polipeptidos, anticuerpos, aminoacidos, virus, acidos nucleicos, protefnas recombinantes, anticuerpos monoclonales, vacunas virales o ADN de plasmido.
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