CN1059355C - 一种用于生物大分子纯化的微孔亲和膜分离器膜堆介质 - Google Patents

一种用于生物大分子纯化的微孔亲和膜分离器膜堆介质 Download PDF

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Abstract

一种用于生物大分子纯化的微孔亲和膜分离器，所用膜堆介质是由滤纸为原料，采用碱处理及化学交联手段大孔纤维素膜，所用膜堆壳体接触膜的两块压板或分流板之间距离可调，适用于各种厚度的介质，构成的膜分离器具有机械强度好，寿命长且分离效率高。

Description

一种用于生物大分子纯化的微孔亲和膜分离器膜堆介质
本发明涉及膜分离器，特别提供了一种用于生物大分子纯化分离的微孔纤维素亲和膜分离器膜堆介质及膜堆壳体。
随着生命科学的快速发展，生物工程中分离纯化阶段的任务越来越重，而效率最高的柱亲和色谱法，由于进样量少，分离时间长，且不能进行连续分离，因而不能适应大批量自动化生产的要求。而且由于亲和色谱往往采用多糖类软胶为分离介质，寿命短，要求使用条件苛刻，所以成本也很高。为解决这一困难，人们又提出了膜亲和色谱法。膜亲和色谱的最大优势在于采用了容量大，渗透性好的膜做为配基的载体，大大缩短了样品分离时间，这就可以避免由于分离时间太长而引起的样品活性损失。同时，由于膜结构的特殊性，更有利于样品的传质扩散，提高分离效率。Stimpson最先从反应动力学角度阐明了以膜代替颗粒做为亲和介质的优越性，采用颗粒状介质时，溶质样品扩散传质距离在25～300微米之间，而以膜为色谱介质时，这一距离缩短至0.2～1.5微米，样品的传质时间大为缩短，即膜介质的分离效率要大大高于柱介质。为更好地反映膜介质在色谱过程中的形为，Suen等提出了轴向扩散模型，较为直观地给出了分离效率与膜堆厚度，样品扩散系数及流动相流速之间的关系，其结论指出，在保证亲和效率的前提下，随配基亲和力的减弱，膜分离介质厚度应相对增加。参考目前常用的各种亲和配基的性质，亲和膜介质的厚度应在1～15毫米之间。膜色谱中，做为载体的膜可以采用平板式和中空纤维式两种方式，其中中空纤维式可以实现较高的流速和较大的处理量，多用于样品预处理过程中。目前实际被用来进行样品分离纯化的膜色谱大都采用平板膜为基质，应用范围大多是离子交换、疏水色谱等。真正可用于实际分离纯化的膜亲和色谱实例很少。文献中见到的比较成功的例子是Josic在1992年发表的工作，采用单张聚丙烯酸缩水甘油酯厚膜为介质，制备了完整的膜堆，成功地对增水蛋白等进行了亲和分离。这种膜堆以单张膜为分离介质，便于解决密封问题，但所采用的材料仍属于软胶类基质，寿命短，机械强度差，膜堆通透性受到极大限制。
本发明的目的在于提供一种机械强度好，寿命长且分离效率高的膜分离器的膜堆介质及膜堆壳体。
本发明提供了一种用于生物大分子纯化的微孔亲和膜分离器膜堆介质，其特征在于：该膜堆介质系由滤纸为原料，采用碱处理及化学交联手段制备的大孔纤维素膜，其过程是：
——滤纸首先在含5～10克氢氧化钠、90毫升水及30～60毫升二甲基亚砜溶液中，在加温35～45℃条件下，处理5～45分钟；
——浸入含5～10克氢氧化钠，50毫升水，100～160毫升二甲基亚砜和90～110毫升环氧氯丙烷溶液中，45～55℃下，交联100～150分钟。
在膜亲和色谱中，膜介质主要是起载体的作用，因此，对膜材料的要求应有两个方面的内容，即有较好的生物兼容性，同时加上可以制膜这一条件，所以选择了纤维素做为膜亲和色谱的载体，由于亲和色谱主要应用于生物大分子分离纯化领域，故此要求做为载体的膜应具有较大的孔径及较高的孔率，一般要求孔径在微米数量级，而纤维素制成如此大孔径的通常意义上的均质膜有相当的难度。为此，采用滤纸做为制膜的原料。
首先，对滤纸进行碱处理，除去纤维中不均匀的短链部分，并使其结构变得致密和均匀，同时增加其羟基活性。然后，用环氧氯丙烷对其进行交联，进一步提高其机械强度及化学稳定性，控制适当的反应条件，可以在纤维结构上保存一定数量的环氧基团，以做为活性官能团进行进一步衍生化或直接偶联亲和配基。通过这种方法制备的膜由粗大的纤维交联而成，孔径较大，适合应用于生物大分子体系，其机械强度和化学稳定性均优于普通的纤维素及其衍生生物膜。
膜堆的制备，其中一个关键的技术问题是如何防止膜堆的泄漏。在膜亲和色谱中，要求作为分离介质的膜具有微孔结构，其内部呈网络状，而不是像超滤或反渗透膜那样的指状孔结构，即在膜的内部同时存在轴向和径向的传质和扩散。尤其使用多张膜构成膜堆时，泄漏问题就更加严重，导致一部分流动相和溶质样品不经过膜分离介质，而是从膜的边缘与膜堆边壁之间的空隙中流过，影响分离效果。在本工作中，采用了一种简便实用的胶粘方法来解决这一问题。具体方法是在每张膜周围宽度为0.5～2mm的圆环区域内，涂渍一层不收缩且有弹性的硅酮胶液，使其均匀地渗透于膜片结构内部，并形成一密封环，多张胶粘结在一起后，稍加压力即可完全消除泄漏问题。这种方法优点在于节约成本的同时，能使膜堆实现更好的通透性，因为膜堆所承受压力由涂胶的圆周区域承受，中间起分离作用的区域不承受压力，流动相不受阻碍。
本发明还提供了一种用于生物大分子纯化的微孔亲和膜分离器膜堆壳体，其特征在于：其接触的两块压板或分流板(4)(5)之间的距离在2～16mm之间可调，可以装载厚度不同的膜介质。
膜亲和色谱实现快速特别是高效分离的技术关键之一是样品及流动相在膜分离介质上的分配问题。由于膜分离介质的直径与厚度之比远大于1，一般在3～20之间，所以在上样时，样品能否在膜介质表面实现均匀分布往往会在很大程度上影响整个分离过程的效果。因此，为了避免样品径向扩散时间过长而引起的分离效率降低和分析时间加长问题，提高样品负荷量，要求样品在上样时能尽可能快速均匀地分布于整个膜面积上，为此设计制做了具有同心圆及径向沟槽形式的分流板。这样就可以使样品上样时沿径向槽迅速向周围扩散，大大减少了样品径向扩散时间，同时也保证了流动相流速在膜介质不同区域内的均匀分布，提高了分离效率，增加了样品处理量。
总之，本发明设计制备了一种通用型膜堆壳体，通过调节可以适用于不同厚度的膜介质，使用特制的分流板后，解决了流动相分配问题，简化了膜堆制备过程，降低了膜色谱成本。首次利用碱处理及化学交联法，从滤纸制备大孔纤维素膜，这种新型的纤维素膜具有较大的孔径和较高的孔率，同时具备较好的机械强度及化学稳定性，适合用做膜色谱，尤其是膜亲和色谱的载体。首次采用胶粘法解决了膜堆的泄漏问题，这种方法的特点是成本低，效果好，除膜介质本身外不需要其他的密封圈，同时膜中央分离区域不承受密封压力，使通透性得以有较大提高。
下面结合附图通过实施例详述本发明。
附图1为膜堆壳体结构示意图；
附图2为膜堆壳体分解图；
附图3为分流板结构示意图。
实施例1
膜堆壳体由能耐高温消毒的聚碳酸酯材料制成，各部分结构见图1，2，该膜堆壳体由压盖(1)、压环(2)、上盖(3)、上下两块分流板(4)(5)、底壳(6)组成；压盖(1)与底壳(6)外径螺合；压环(2)、上盖(3)、上、下两块分流板(4)(5)由上至下顺序设于底壳(6)内部，且其外径大小刚好与底壳(6)内径大小相适应；膜介质(8)置于上下分流板(4)(5)之间。分流板(4)(5)具有同心圆及径向沟槽，调节压盖和底壳之间的螺扣，可控制两块分流板间的距离在2～16mm之间，从而可以使膜堆壳体适用于各种厚度的膜介质，进一步旋紧压盖后可以产生适当的压力，使整个膜堆形成良好的密封。
实施例2
1.将80张Φ50mm的滤纸浸于含5克NaOH，90ml水和60ml二甲基亚砜溶液中，加热至40℃，搅拌下反应15分钟。滤纸取出后沥干，重新加入含10克NaOH，50ml水，150ml二甲基亚砜和100ml环氧氯丙烷溶液中，升温至50℃，搅拌下反应120min产物用50℃的蒸馏水洗至中性。
2.上述产物，即交联活化好的纤维素膜沥干后，浸于5％的氨水溶液中，室温下反应过夜，产物沥干后浸于含有2克红色活性三嗪染料Active Red K2BP，10克Na2CO3·10H2O和40ml水的溶液中，升温至50℃，反应20小时。
3.按上述方法制备的80张红色亲和膜切成Φ47mm的圆片，周围分别涂胶后粘结，放置分流板后装入膜堆壳体，拧紧后，用0.1MNaCl溶液充分冲洗。
4.冲洗完全的膜堆首先用0.1MNaCl，0.1MNaAc-HAc，PH7.5缓冲液平衡。取粗制碱性磷酸酶溶于2.0ml，0.1MNaCl，0.1MNaAc-HAc PH7.5缓冲溶液中，于1.0ml/min速度上样至膜堆。
5.上样后的膜堆于室温下分别用0.1MNaCl，0.1MNaAc-HAc，PH7.5缓冲溶液，1.0M NaCl溶液，1.0MNaCl 60％乙二醇溶液冲洗，色谱图见附图3，收集各洗脱峰，用磷酸对硝基酚为底物测定其中碱性磷酸酯酶活力，用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，计算纯化效率，结果列于表1。
表1样品      体积  总蛋白(mg)  总活力(U)  样活性   产率原始样品  2.0     10.3       10800      1050纯化产物  8.0     0.15       6480      4.2×104  60％

Claims (2)

1.一种用于生物大分子纯化的微孔亲和膜分离器膜堆介质，其特征在于：该膜堆介质系由滤纸为原料，采用碱处理及化学交联手段制备的大孔纤维素膜，其过程是：
——滤纸首先在含5～10克氢氧化钠、90毫升水及30～60毫升二甲基亚砜溶液中，在加温35～45℃条件下处理5～45分钟；
——浸入含5～10克氢氧化钠，50毫升水，100～160毫升二甲基亚砜和90～110毫升环氧氯丙烷溶液中45～55℃下交联100～150分钟。
2.按权利要求1所述用于生物大分子纯化的微孔亲和膜分离器膜堆介质，其特征在于：在制作膜堆介质时分别在组成膜介质的各单张膜边缘0.5～2.0mm区域涂渍一层不收缩且有弹性的胶液(7)，然后将各张膜片粘结在一起构成膜堆介质。
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