CN1761508A - pH响应性聚合物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从液体分离目标化合物的方法，该方法包括在第一pH下使液体与显示表面定位pH响应性聚合物的分离介质接触，以通过疏水性相互作用吸附目标化合物；和加入洗脱剂，它具有第二pH并提供所述pH响应性聚合物的构象变化以释放所述化合物。洗脱有利地通过pH梯度和/或通过盐梯度进行。

Description

pH响应性聚合物的用途
技术领域
本发明涉及从液体分离至少一种目标化合物的方法，其中通过将所述目标化合物吸附到分离介质中并随后从该介质中洗脱目标化合物进行分离。用于本发明方法的介质包括定位到它表面的pH响应性聚合物。本发明还包括pH响应性聚合物在分离介质制备中的用途。
背景
在许多应用中，如在从污染物种中纯化液体，和从溶液中分离所需化合物如蛋白质或另一种生物分子中，将目标化合物与溶液中的其它组分分离。随着生物技术近来的发展和重组生产的产物用途的增加，更多地需要有效的纯化方案。在许多情况下，要求所生产化合物的高纯度以保证使用中的安全，而不管所生产化合物是生物分子还是一些其它有机或甚至无机化合物。
由于其多样性和灵敏性，色谱通常是生物分子和医疗产品的优选纯化方法。术语色谱包括一类紧密相关的分离方法，它们都基于使两个不相互混溶的相接触的原理。更具体地，将目标化合物引入到流动相中，该流动相与固定相接触，该固定相典型地是固体基质。然后当目标化合物由流动相携带通过系统时，它经历一系列在固定相和流动相之间的相互作用。这些相互作用利用样品中组分的物理或化学性能的差异。这些相互作用可以根据一个或多个不同的原理，如电荷、疏水性、亲合力等。
疏水性和相关相互作用用于从液体中分离目标化合物的各种应用，如过滤和色谱。在疏水性相互作用色谱(HIC)中，流动相典型地是含水的并且基质由偶合到亲水性基质的疏水性基团组成，而在反相色谱(RPC)中，典型地使用有机流动相和极性较低，即更亲水的基质。通常通过盐或其它易溶剂的加入促进在介质和溶质表面之间的相互作用。因此，HIC典型地涉及比RPC更不疏水和更含水的环境，并且在许多应用中，HIC更适于较大MW蛋白质和其它易脆性物质。然而，在一些应用中，在RPC和HIC基质之间没有清楚的界线，但在流动相选择中存在。因此，在这样的情况下，用于HIC的介质对于RPC也起作用，且反之亦然。
在目标分子和固定相之间的HIC相互作用主要由流动相水合目标分子的能力控制，如由盐和其它添加剂影响，偶合到稳定目标和介质之间相互作用的疏水性相互作用。其它相互作用，如范德华相互作用、电荷-电荷相互作用等可在关于蛋白质截留、结构稳定和与不同目标分子的拆分中起次要但显著的作用。典型地目标分子对HIC介质的吸附在较高的流动相盐浓度下进行，而洗脱在较低的盐浓度下进行。盐梯度通常用于提高在几种溶质中的选择性。当运行这样的梯度时，最疏水的化合物理想地最后洗脱。在蛋白质的情况下，尚未完全理解在蛋白质疏水性和HIC洗脱之间的关系。高度带电和可溶蛋白质具有疏水性表面区域，可在HIC中较后洗脱。在蛋白质纯化中，由于HIC是其它色谱方法，如凝胶过滤、亲合力色谱和离子交换色谱的补充，所以对其兴趣日益增长。更具体地，HIC成功地在如下两个阶段使用：下游加工的初始阶段，如在盐沉淀之后和在离子交换之前，和后继阶段，如除去在先前加工期间已经变性的目标蛋白质。然而，在某些情况下它可能仍然存在缺点。
HIC的一个最显著缺点在于一些目标蛋白质可在加工期间变性，这也适用于RPC。例如，HIC要求的高盐浓度缓冲剂可能对敏感性目标化合物，如蛋白质是有害的，在该情况下可促进变性。离液序列高的或蛋白质稳定添加剂可用于减轻此缺点，然而它要求脱除它们的另外下游步骤，因此增加工艺的总成本。蛋白质变性也可以由与介质的疏水性相互作用引起和由随后在洗脱条件下从介质中脱除引起。涉及的机理目前还不清楚，但最简单地涉及如下事实：蛋白质改变构象以适应在流动相和介质之间的界面自由能差异，以及通过与表面基团的疏水性或其它相互作用增强它自身界面自由能的降低。这种变性的问题在于当蛋白质从介质洗脱时，它保留此新的构象。
给定以上内容，在色谱和其它分离表面的开发中存在极大的兴趣，该分离表面根据它们的疏水性在显示较少变性蛋白质的条件下在蛋白质和其它分子中区分。
作为包括不带电疏水性配体的传统HIC介质的替代选择，Boschetti等人(Genetic Engineering，vol.20，No.13，7月，2000)提出的方法指出疏水性电荷感应色谱(CIC)用于敏感性生物大分子特别是抗体的分离。市售产品BioSepra MEP HyperCel(LifeTechnologies，Inc.)基于此类相互作用并且包括4-巯基乙基吡啶作为配体。理论上，配体在中性pH下是不带电的并且通过中等疏水性相互作用结合分子。当pH降低时，配体带正电荷并且认为疏水性结合由配体电荷基团和蛋白质之间的静电排斥抗衡。然而，采用该方法可预见到几个问题。首先，它要求合适pI的目标蛋白质在洗脱pH下是净正电的。其次，蛋白质在洗脱pH下需要具有显著的净正电荷。第三，存在的危险是由于使用的吡啶基团接近7中性pKa，它促进其它稳定化相互作用，如π-键重叠、螯合、离子交换、阳离子-π，它们会危害它的作用。
作为通常使用的小配体的替代选择，已经提出更大的分子，且更具体而言聚合物作为分离应用中的固定相。
例如，WO 02/30564(Amersham Pharmacia K.K.)公开了用于亲合色谱的刺激响应性聚合物。更具体地，这种刺激响应性聚合物，也称为″智能或响应性聚合物″，当曝露于适当的刺激时经历它们物化性能的结构和可逆变化。此变化可以是显著疏水性，如由它们在溶液中的自缔合所示，到显著亲水性，即水合的转化，或反之亦然。最通常和所研究的刺激是温度变化，而在WO 02/30564中提出的替代刺激是光、磁场、电场和振动。尽管可以带有一定技术难度地在涉及小总面积的涂覆表面的应用，如用于分析色谱的微柱中使用这后四种刺激，但是难以看到它们可如何成功地用于涉及更大柱和表面的应用。促进目标从分离介质中洗脱所要求的温度的仔细控制也要求介质周围的恒定条件，并因此对使用的设备有更高的需求。提出的替代刺激的使用涉及相似的缺点。令人感兴趣的是，在WO02/30564中提及通过改变洗脱剂如盐的组成、无机溶剂、pH等而洗脱可能是不需要的，因为这可能由于加入的化学物质，如盐、有机溶剂、酸和碱而引起诸如失活、回收率降低等问题。
亲合色谱的另一个例子公开于US 5,998,588(华盛顿大学)，它涉及相互作用性分子缀合物，和更具体地涉及可用于调制或″接通或切断″分子间的亲合力或识别相互作用，如受体-配体相互作用和酶-底物相互作用的材料。因此，公开的缀合物是刺激响应性聚合物组分和相互作用性分子的组合。聚合物可以由pH、光或其它刺激的变化调节。刺激响应性组分在特定的部位偶合到相互作用性分子上以允许其调制，以在相邻的配体结合部位，例如抗体的抗原-结合部位或酶的活化部位改变配体结合。
聚合物涂料作为固定相的另一个例子发现于EP 1 081 492(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)，其中公开了由带电共聚物组成的色谱填料。更具体地，公开的填料具有离子交换功能，可以例如通过共聚聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PIPAAm)与带正电二甲氨基丙基丙烯酰胺(DMAPAAm)而制备。获得的填料可用于反相色谱和离子交换色谱两者。通过改变温度而改变在固定相表面上亲水性/疏水性平衡获得吸附到这些填料上的物质的洗脱。然而，如上所述，温度控制涉及某些缺点。例如，温度的控制典型地要求特殊的设备，如加热器、浴、温度计、对于甚至小塔的塔夹套和泵。当这种方法应用于更大的塔时，由于会出现包括在塔夹套之间的流体密封泄漏和相对于塔的长轴及直径的不均匀温度分布的相关问题，更加涉及这种设备。在更大的塔中，温度梯度可导致与凝胶床上传质和性能相关的混合流和物理性能如粘度的差异。
EP 0 851 768(华盛顿西雅图大学)建议使用刺激响应性聚合物和相互作用性分子以形成用于测定、亲合分离、加工等的部位特异性缀合物。聚合物可以通过pH、温度、光或其它刺激的变化调节。相互作用性分子可以是生物分子，如肽、蛋白质、抗体、受体或酶。刺激响应性化合物在特定部位偶合到相互作用性分子上，使得可以调节刺激响应性组分以在相邻的结合部位改变配体结合。如上所示，偶合借助亲合基团，并且所提供的材料可因此″接通或切断″亲合识别相互作用。更具体地，聚合物对目标化合物亲合部位的物理关系由上述改变控制。此外，公开了配体或其它亲合物质，采用需要的方式通过将响应性聚合物接枝到这些物质上而改进其基本相互作用。
Tuncel等人(Ali Tuncel，Ender Unsal，Hüseyin Cicek：用于DNA吸附的pH敏感性均匀凝胶珠，Journal of Applied PolymerScience，Vol.77，3154-3161，2000)描述了由胺官能化单体N-3-(二甲氨基)丙基甲基丙烯酰胺(DMAPM)的悬浮聚合制造均匀凝胶珠。公开的交联凝胶珠显示pH敏感性，可逆溶胀和去溶胀行为，并建议用于DNA吸附。然而，公开的珠的应用领域受其刚性限制，该刚性对于某些应用，如药物输送是足够的，而对于要求更高流速的应用是较不令人满意的。例如，通过填充色谱床的液体流动将不可避免地使这些珠倒塌，并因此损害它们的吸附性能。
最后，WO 96/00735(Massey大学)公开了用于纯化目标蛋白质或肽的色谱树脂。更具体地，公开了树脂-目标络合物，其中树脂包括选择的可离子化配体共价连接到其上的载体基质。配体使树脂在肽被吸附到树脂上的pH下是不带静电荷的而在肽被解吸的pH下是带静电荷的。对不带电树脂的吸附由疏水性相互作用获得，而解吸由电荷排斥获得。配体可包括胺基团、羧基、组氨酸基、吡啶基、苯胺基团、吗啉代基团或咪唑基。此外，配体可以通过间隔臂连接到载体上，该间隔臂对于本发明不是关键的，并可以例如衍生自β-丙氨酸、氨基丁酸、氨基己酸等。如果存在间隔物的话，由于其不包含任何可离子化基团，所以它们不能对公开的树脂的解吸性能有贡献。因此，在WO 96/00735中公开的配体都是较小的分子，其中每个配体通常表示一个官能团。所以，此树脂的配体相当不同于以上讨论的刺激响应性聚合物。
发明概述
本发明的第一个目的是提供与常规HIC介质相比，具有改进的选择性和/或分辨率的疏水性相互作用(HIC)分离介质。具体的目的是提供具有这种改进选择性和/或分辩率同时回收率至少与常规HIC介质一样好的这种介质。
本发明的另一个目的是提供从液体识别或分离至少一种目标化合物的方法，其中通常用于疏水性相互作用色谱(HIC)的相互作用用于将目标化合物吸附到介质，该介质的相对疏水性可以通过流动相pH和/或盐浓度改变。在此情况下，由涉及通常用作HIC介质的烷烃或苯基配体基表面涂料的蛋白质吸附判断疏水性。
具体的目的是提供这样的方法，其中pH控制用于改变相对相互作用，不仅仅用于在引起配体带电或不带电的基础上促进或降低吸附。因此，使用本发明用于分离的目的，操作者具有另一个变量，即pH，它可用于调节方法的分辨率。
本发明的另一个目的是提供色谱方法，该方法与现有技术方法相比在吸附和洗脱条件下在目标化合物的天然结构和活性方面更可能保存整体性。具体的目的是提供用于大分子如蛋白质分离的这种方法。这可根据本发明由从液体识别或分离至少一种目标化合物的方法达到，其中疏水性相互作用用于将目标化合物吸附到介质。更具体地，该介质由具有柔性聚合物表面涂层的基质组成，它在吸附和洗脱工艺期间改变相对于目标化合物的构象。这样的改变受pH以及先前用于HIC的其它刺激，如盐浓度影响。因此，本方法使得操作者更能控制操作变量，该变量影响非变性或另外改变的目标材料的回收率。
本发明的具体目的是提供色谱方法，其中疏水性相互作用是用于将目标化合物吸附到介质的主要相互作用，该介质相对于目标化合物的表面疏水性可以例如由pH变化而改变。在此情况下，pH变化不依赖于流动相盐浓度的显著变化或流动相改进剂，如改进极性的有机溶剂或聚合物添加剂的使用。本方法可以在流动相关于例如盐浓度、有机溶剂和聚合物流动相改进剂等的宽范围内应用。
本发明的具体目的是提供以上讨论的HIC方法，该方法与现有技术相比扩展可能的操作条件同时降低操作成本，并提供与现有技术HIC方法相比对操作设备具有更少负面影响的方法。
本发明另外的目的是提供色谱方法，其中疏水性相互作用用于将目标化合物吸附到介质，该方法允许在HIC通常采用的中性pH范围内对具有低极限溶解度的蛋白质和多肽使用HIC。这通过下述方法达到，其中疏水性相互作用涉及在基质表面定位的聚合物的构象以及涉及与pH有关的蛋白质-聚合物相互作用。
本发明另外的目的是提供色谱方法，其中将蛋白质采用与传统HIC介质相同的顺序洗脱，但其中选择的蛋白质与介质的相对相互作用，即与其它蛋白质有关的其峰洗脱位置由pH的变化改进。因此，本方法可改进从HIC方法得到的分辨率。
本发明的另一个目的是提供色谱方法，其中使用生产友好的色谱材料。这可以通过使用显示表面定位聚合物的基质，而不是特殊的疏水性配体，如通常使用的烷烃或苯基而达到。后者通常需要与使用亲水性涂料以改进天然表面亲水性有关的生产成本，与配体连接到其上的约束基团有关的生产成本等，它们可以由本方法的使用避免。
本发明最后的目的是减小影响各种目标化合物如蛋白质的所需分离所需要的介质的范围。这可以根据本发明由分离介质的使用达到，该分离介质的固有表面疏水性可以由pH控制而改变。由于传统HIC介质的疏水性的固有范围通常在多于一个表面密度下由带有不同烷烃基团的介质范围提供，所以如果降低关于每个应用必须生产和测试的介质范围，则对于生产者和使用者两方面均是有利的。
从以下详细描述显现本发明的其它目的和优点。
附图简述
图1显示涉及四种蛋白质和几种商业介质的混合物的典型pH 7盐梯度疏水性相互作用色谱(HIC)。
图2显示如图1的色谱，但展示几种其它商业介质。
图3a和b分别显示图1在pH7和4的色谱，但证明在从pH7到4时pH对商业介质HIC缺乏有用作用。
图4a和b说明用于根据本发明方法的pH响应性HIC(pHIC)聚合物涂料的典型结构。
图5显示在pH4下使用相似于图1和2的方法获得的典型盐梯度HIC结果，但各种pHIC聚合物涂料的组分摩尔比改变。
图6说明当pH从pH7变化到4时，典型的pHIC聚合物涂覆介质的结果，显示与常规HIC介质相比在pH7下改进的分辨率和该分辨率的提高，以及当改变pH时不寻常的选择性控制。
图7显示如图6的色谱，但色谱涉及单个蛋白质，以显示与图3相比提高的分辨率。
图8支持图6和7中结果的再现性。
定义
术语″表面定位的″表示分子或其它物质在靠近表面的定位。这可以由任何常规的相互作用，如吸附、共价键合等达到。
术语″表面″表示外部，和在多孔材料的情况下基质的内部或孔表面。
术语″基质″在此用于任何一种常规种类的固体载体，该载体用于识别和分离领域，如用于色谱和过滤。
″分离介质″由以上定义的基质组成，键合基团如配体或聚合物连接到该基质上。
术语″疏水性″在此以色谱领域中通常使用的意义使用。在此领域中存在许多公知的定义术语″疏水性″的常用方法，如按照溶解度。
术语″解吸″和″释放″在此可互换使用。
发明详述
在第一方面，本发明涉及从液体分离至少一种目标化合物的方法，该方法包括如下步骤：
(a)在第一pH下使液体与显示表面定位pH响应性聚合物的分离介质接触以吸附目标化合物；和
(b)加入第二pH值的洗脱剂，它提供所述pH响应性聚合物的构象变化，以从分离介质释放所述化合物。
在本方法的一个实施方案中，第二pH值低于第一pH值。在最有利的实施方案中，洗脱剂包括降低pH梯度。由于吸附的强度依赖于聚合物和目标化合物之间的相互作用，所以不同的目标化合物可以从介质由pH梯度，如逐步或线性pH梯度有差别地洗脱。因此，在有利的实施方案中，步骤(b)是至少两种目标化合物的差别洗脱。在本方法中，每种目标化合物可以洗脱为纯或基本纯的级分。通常使用的添加剂，如醇、洗涤剂、离液序列高的盐等可用于洗脱缓冲剂以影响步骤(b)中解吸期间的选择性，但应当仔细以便不因曝露于高浓度的这种添加剂而使目标化合物变性或失活。
梯度洗脱是色谱领域中的公知技术，并且本领域技术人员可容易地使用常规酸/碱体系决定合适的梯度。
因此，在此实施方案中，聚合物的物理状态由pH变化而改变。依赖于聚合物的性质，其自缔合倾向，以及与其疏水性有关的表面对材料更具吸附性的倾向，可以由pH的变化增加或降低。在图5-8所示的实施例中，当pH降低时它增加。结果是，蛋白质通常从表面洗脱的盐浓度变得更低，这与当传统HIC介质表面变得更为疏水性时看到的机理相同，如图1和2所示。
显然相反的应当是真实的，即当有利于较少吸附而改变pH时，在介质和蛋白质或其它吸附剂之间存在较不强的相互作用。在此上下文中，应理解的是，由于与pH有关，聚合物的构象倾向影响在吸附和解吸中的pH控制。然而，如本领域技术人员认识到的那样，在本方法中，目标化合物也可很少程度地经历构象变化，尽管如图3所示不以足以促进它从基质表面释放的方式。因此，这种情况也包括在本发明的范围内。因此，在本方法中化合物的吸附和释放主要和优选显著地由pH响应性聚合物的构象变化促进。
如上所述本方法可用于由其吸附分离目标化合物。因此，在本方法的一个实施方案中，吸附的化合物是目标化合物。在另外的实施方案中，本发明用于从液体中通过其吸附除去不需要的化合物同时允许目标化合物通过。在具体的实施方案中，以上讨论的吸附实际上是对能够令人满意地分离和/或识别目标化合物的阻滞。
在本方法的另外实施方案中，洗脱剂的电导率不同于步骤(a)的液体的电导率，而第二pH值保持等于或至少基本等于第一pH值。在用于蛋白质分离的最有利实施方案中，洗脱在中性或碱性pH下进行。电导率的变化通常由合适盐，如通常用于疏水性相互作用色谱的任何一种的加入提供。在有利的实施方案中，洗脱剂包括盐梯度。由于吸附的强度依赖于聚合物和目标化合物之间的相互作用，不同的目标化合物可以从介质由盐梯度，如逐步或线性盐梯度有差别地洗脱。在有利的实施方案中，步骤(b)是至少两种目标化合物的差别洗脱。在本方法中，每种目标化合物可以洗脱为纯或基本纯的级分。通常使用的添加剂，如醇、洗涤剂、离液序列高的盐等可用于洗脱缓冲剂以影响步骤(b)中解吸期间的选择性，但应当仔细以便不因曝露于高浓度的这种添加剂而使目标化合物变性或失活。梯度洗脱是色谱领域中的公知方法，并且本领域技术人员可容易地决定合适的梯度。
在具体的实施方案中，结合以上讨论的pH和盐梯度洗脱并且两个原理均用于吸附化合物的洗脱。
总之，在本方法的步骤(a)中，依赖于pH响应性聚合物的性质，本领域技术人员可容易地改变吸附的条件。例如，如公知的那样，更高的表面张力为将蛋白质吸附到疏水性表面上提供疏溶剂的更优选环境。因此，具有更大摩尔表面张力的盐的使用会导致诸如蛋白的目标化合物在介质中的保留增加。在HIC中最通常使用的盐是硫酸铵，然后它不能用于非常碱性的环境。其它有用的盐是例如谷氨酸单钠、胍、硫酸钠和天冬氨酸钠，它们有利地以约9.5的pH使用。本方法最有利地在室温下进行。
在一个实施方案中，目标化合物的吸附由pH响应性聚合物和目标化合物之间的疏水性相互作用提供。因此，形成本施方案基础的原理在此有时称为″pH响应性HIC(pHIC)″。在具体的实施方案中，目标化合物的吸附通过由相关种类相互作用补充的疏水性相互作用提供。这种相关相互作用合适地选自电荷-电荷相互作用、范德华相互作用和基于共溶解/共水合的相互作用。在涉及某些情况，例如在某些pH和盐浓度下的特殊蛋白质的另外实施方案中，相关种类的相互作用占优势。然而，通常，这种其它相互作用与疏水性相互作用相比是次要的。
更具体地，在使用盐梯度协助的疏水性相互作用的实施方案中，目标化合物如蛋白质将在步骤(a)中与表面的疏水性、目标化合物的疏水性和洗脱剂的性质相关地被吸附。因此，相互作用主要是疏水性的，因为它们模拟对传统HIC介质而言常见的相互作用类型，传统HIC介质通常包括例如由烷烃或芳族疏水性配体涂覆的载体或基质。
因此，其中使用pH响应性聚合物的基于疏水性相互作用色谱(HIC)的本发明不同于由Boschetti等人建议的以上讨论的电荷感应色谱(CIC)，其中(1)涉及的配体是低分子量分子，不是如在本发明中的聚合物，(2)改变流动相pH以引起配体当结合时是中性的或当不结合时是阳离子的，(3)提供响应pH变化的配体变化构象的不是由Boschetti等人建议的，(4)可感应电荷基团偶合到疏水性配体上使得它实际上表示传统HIC配体的改进。通过本发明将避免可以采用CIC方法预见到的一些问题，如由如下因素引起的问题：(i)蛋白质电荷基团对于带电形式的CIC配体的亲合力，(ii)电荷-电荷相互作用被与一些HIC缓冲剂有关的较高盐浓度屏蔽以及(iii)配体密度和介质性能之间的关系。
在本方法的一个实施方案中，改变所述pH响应性聚合物的构象变化到由pH降低引起的较不疏水的构象。在另一个实施方案中，聚合物的构象变化基于聚合物自缔合和/或与基质的缔合。
本领域技术人员可生产合适的pH响应性聚合物，当pH降低或升高时它会通过在水溶液或其它溶液中较多到较少的疏水性构象。这通常伴随着自缔合，当聚合物在溶液中游离时由它们从溶液出来检测到自缔合。对于在水溶液体系中的温度响应性聚合物，存在下临界溶液温度(LCST)或上临界溶液温度(UCST)。pH响应性聚合物的LCST随pH变化，并且也可以受其它因素，例如离子的离子强度和类型或溶液中其它添加剂的影响。当这种聚合物连接到表面时，它们仍然可显示这样的构象改变使得表面相对疏水性像聚合物的那样变化。因此表面缔合聚合物可自缔合并响应pH改变构象。
显示pH响应性聚合物的基质可以是允许pH响应性聚合物偶合的任何有机或无机多孔材料，只要它不显示可干扰分离工艺的任何电荷。因此，在一个实施方案中，基质由亲水性碳水化合物，如交联的琼脂糖组成。在将在以下的试验部分详细描述的此情况下，首先将基质材料烯丙基化，优选在碱如NaOH存在下，根据公知方法到合适的程度，并随后将它胺化以允许聚合物的随后偶合。在另外的实施方案中，将基质首先烯丙基化并随后通过将单体接枝到表面上而提供pH响应性聚合物涂层。在此实施方案中，单体直接共聚到表面上。对单体进行选择能够制备所需响应性的聚合物。例如，本领域技术人员可容易地使用标准方法制备所需LCST的聚合物涂料。在具体的实施方案中，pH响应性聚合物可以与温度响应性聚合物结合以提供具体的特性。在进一步的实施方案中，基质自身由接枝技术制备。
在另外的实施方案中，基质是二氧化硅或合成共聚物材料。如要求，将基质如上所述烯丙基化，并随后胺化。在色谱的上下文中，由于这种基团可另外导致化合物的分离降低，所以最优选在使用之前将基质的任何剩余胺基团烷基化。
用于本方法的pH响应性聚合物可以是对pH敏感的任何物质，其中周围pH的变化引起聚合物线团中的显著构象变化。对于此类聚合物的一般性综述，参见例如Chen，G.H.和A.S.Hoffman，″可能用于蛋白质缀合的新温度响应性和pH响应性共聚物(A new temperature-and pH-responsive copolymer for possible use in proteinconjugation)″，Macromol.Chem.Phys.，196，1251-1259(1995)。在具体的实施方案中，本pH响应性聚合物在pH2-13，如2-12，3-12，4-7或7-10的范围内是pH响应性的。
简言之，在此使用的合成pH响应性聚合物典型地基于pH敏感性乙烯基单体，如丙烯酸(AAc)、甲基丙烯酸(MAAc)、马来酸酐(MAnh)、马来酸(MAc)、AMPS(2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸)、N-乙烯基甲酰胺(NVA)、N-乙烯基乙酰胺(NVA)(最后两者可以在聚合之后水解成聚乙烯基胺)、甲基丙烯酸氨基乙酯(AEMA)、磷酰基乙基丙烯酸酯(PEA)或甲基丙烯酸酯(PEMA)。这样的pH敏感性聚合物也可以从氨基酸合成为多肽(如聚赖氨酸或聚谷氨酸)或衍生自天然聚合物如蛋白质(如溶菌酶、白蛋白、酪蛋白等)、或多糖(如藻酸、透明质酸、角叉菜胶、壳聚糖、羧甲基纤维素等)或核酸，如DNA。
在一个实施方案中，pH响应性聚合物是共聚单体。在另一个实施方案中，每种pH响应性聚合物由疏水性部分、亲水性部分和pH响应性部分组成。pH响应性部分优选包括胺，如伯胺、仲胺或叔胺，和/或丙烯酸，它们在某些pKa值下质子化。
在具体的实施方案中，所述pH响应性聚合物包括选自如下基团的pH响应性基团：-COOH基团、-OPO(OH)2基团、-SO3 -基团、-SO2NH2基团、-RNH2基团、-R2NH基团、和-R3N基团，其中R是C。
在具体的实施方案中，可以设计本pH响应性聚合物以包含一个或多个官能团，它们提供或执行聚合物的疏水性特征。本方法中的最优选官能团是诸如发现于不饱和体系，例如发现于烯烃或芳族体系中的碳碳双键(C＝C)。
用于本方法的pH响应性表面可以由本领域技术人员使用合成有机聚合物化学设计为官能团的单层或多层。通常，在此使用的本pH响应性聚合物可以根据标准方法合成到约1,000-约250,000道尔顿，如约2,000-约30,000道尔顿的分子量。如技术人员理解的那样，下限由诸如表面覆盖和它们如何可以是疏水性的因素确定，而上限由诸如聚合物/扩散效应的因素确定。
如上所示，一种说明性类型的pH响应性聚合物可以从具有一个氨基和一个羧基的氨基酸制备并偶合到多糖基质。此单体容易由自由基聚合而聚合以得到在pH4-8区域中具有恒定溶胀和在酸性和碱性区域中具有增加溶胀的基质。偶合聚合物到基质表面的另一种方式是通过表面接枝方法，其中首先合成明确尺寸的pH响应性聚合物并随后接枝到载体上。生产可逆pH响应性表面的另一种已知方法是″包埋官能化″，它产生复杂的标记聚乙烯低聚物。然后这些低聚物可以与没有添加剂的HDPE混合。聚合物和官能化低聚物的共溶解产生均相溶液，该溶液可用于生产官能化PE-膜。
在另外的实施方案中，本方法采用诸如下列聚合物：聚(N-丙烯酰基-N′-丙基哌嗪)(PAcrNPP)、聚(N-丙烯酰基-N′-甲基哌嗪)(PAcrNMP)和聚(N-丙烯酰基-N′-乙基哌嗪)(PAcrNEP)，它们是对pH和温度两者均敏感的水凝胶。N，N-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯[DMEEMA]类聚合物是另一组温度和pH响应性水凝胶。
在本方法的一个实施方案中，至少一种目标化合物是生物分子，如蛋白质或肽。在此上下文中特别合适的蛋白质的一些具体例子是抗原、纤维素酶、糖蛋白、激素、免疫球蛋白、脂酶、膜蛋白质、核蛋白质、胎盘蛋白质、核糖体蛋白质和血清蛋白质。目标化合物可以在任何液体，通常水溶液中存在，条件是它与吸附工艺相容并且它不以任何方式对pH响应性聚合物或目标化合物有害。在一个实施方案中，液体是发酵液而目标化合物是其中产生的蛋白质或肽。依赖于pH响应性聚合物的性质，这种发酵液可以是稀释或未稀释的，如粗提取物。
在目前最好的实施方案中，根据本发明的方法是色谱方法。这种色谱可以是制备性的，可以是任何规模，直到大生产规模，或分析规模。因此，在具体的实施方案中，本方法是分析方法。在说明性实施方案中，分离基质是微量滴定板、生物传感器、生物芯片等。在另外的实施方案中，本发明用于细胞培养。本方法同样用于小和大规模设备。
在另外的实施方案中，本方法是过滤方法。在此情况下，基质可以是任何公知的材料，根据标准方法以上讨论的pH响应性聚合物偶合到该材料上。过滤的一般性原理是技术人员公知的。
在另一方面，本发明涉及以上定义的pH响应性聚合物在色谱介质制备中的用途。因此，本发明也包括将合适的共聚物接枝到基质如琼脂糖上的方法，其中设计共聚物的性能使其在需要的状况下是pH响应性的。
最后，本发明也包括pH响应性聚合物通过改变pH以增加或降低表面吸附的用途。一般现象是在溶液中或在表面上的聚合物可以与溶液中或在该表面上定位的蛋白质或其它分子，如大分子或胶体相互作用。这种相互作用可导致聚合物-蛋白质相互作用，如涂覆表面-蛋白质相互作用并且非常依赖于聚合物和其它材料的化学基团。因此希望它们与一系列化学相互作用，例如共水合、疏水性、范德华和氢键相互作用有关，并反映其它材料的独特补充。相互作用可用于差别地控制表面与材料的相互作用。注意这样的相互作用可促进和稳定聚合物的自缔合倾向。
更具体地，显示表面定位pH响应性聚合物的分离基质的本用途从液体的其它组分中分离出一种或多种目标化合物。在最有利的实施方案中，该pH响应性聚合物包括选自如下基团的侧挂pH敏感性基团：-COOH基团、-OPO(OH)2基团、-SO3 -基团、-SO2NH2基团、-RNH2基团、-R2NH基团、和-R3N基团，其中R是C。在具体的实施方案中，该聚合物原位聚合到基质表面上。
因此，本发明包括下述方法，其中显示表面定位pH响应性聚合物的分离介质用于从液体的其它组分中分离生物分子。如以上讨论的那样，这种分离可以是色谱方法或过滤方法。本用途是对常规疏水性相互作用色谱(HIC)或反相色谱(RPC)的有利替代选择。关于pH响应性聚合物的进一步细节可以如以上涉及本发明方法的讨论那样。
最后，本发明也涉及疏水性相互作用色谱(HIC)介质，该介质由表面定位pH响应性聚合物连接到其上的基质组成，该聚合物显示HIC配体。在具体的实施方案中，聚合物的pH响应性基团选自-COOH基团、-OPO(OH)2基团、-SO3 -基团、SO2NH2基团、-CNH2基团、-C2NH基团、和-C3N基团。关于本介质及其用途的进一步细节可以如以上涉及本发明方法所述。
此外，本发明也包括一种用于分离目标化合物的试剂盒，该试剂盒包括在单独的隔室中由介质填充的色谱柱，该介质由表面定位pH响应性聚合物连接到其上的基质组成，该聚合物显示HIC配体；具有第一pH的吸附缓冲剂；具有第二pH的洗脱剂，第二pH低于所述第一pH；及其使用的书面说明书。该说明书可包括如何实施本发明方法的说明。
附图详述
图1显示涉及各种常规HIC介质的色谱，从顶部到底部为：醚650STM，醚5PWTM，苯基650STM和苯基5PWTM(Tosoh)和苯基HP琼脂糖TM(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)。介质由它们的配体(苯基或醚基团)指示。在此实施例中，将四种蛋白质(肌红蛋白、核糖核酸酶A、α-乳清蛋白和α-胰凝乳蛋白酶原A，它们的一些性能在试验部分列表)加入到0.1M磷酸钠pH7的缓冲剂中，该缓冲剂包含2M(NH4)2SO4，然后它以梯度运行到0.1M磷酸钠和0M(NH4)2SO4。采用单一蛋白质的试验表明它们采用以上给出的典型的″传统″HIC顺序洗脱。似乎(a)蛋白质在柱-峰上均以相同顺序洗脱，分辩率变化但相对位置不变，(b)一些介质在四种蛋白质的拆分峰下比其它更好，(c)介质显现为在不同盐浓度下洗脱不同的蛋白质，例如当从醚变化到苯基配体涂覆的介质时，顶部到底部肌红蛋白峰显现在2M(NH4)2SO4下和然后在大约1M下洗脱。这表明，在保持苯基与乙基的疏水性一致时，苯基涂覆介质具有更强的蛋白质相互作用。
图2显示使用相同的蛋白质和条件如图1进行的″传统″梯度HIC的色谱，各种琼脂糖TM介质(都来自Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)从底部向上为：1.苯基琼脂糖TM6FF(低sub)；2.苯基琼脂糖TM6FF(高sub)；3.丁基琼脂糖TM6FF；和辛基琼脂糖TM6FF，其中″sub″表示相对配体密度，它随介质疏水性增加。市售介质由它们的配体和配体密度表示。单个蛋白质试验(未显示)表明四种蛋白质以图1所示的顺序洗脱但(a)蛋白质仅拆分成两个峰(肌红蛋白和核糖核酸酶，随后为α-乳清蛋白和α-胰凝乳蛋白酶原A)，(b)当从在低密度到更高密度的带有苯基的介质中走过时，峰在较低盐浓度下洗脱(表明与更疏水性介质表面的更强相互作用)和(c)介质疏水性不仅由配体疏水性也由密度决定。因此，具有最疏水性配体但最低配体密度的辛基介质(8umol/ml凝胶，参见Amersham Biosciences目录)与蛋白质峰缔合，它在丁基(50umol/ml)或苯基低sub(20umol/ml)或高sub(40umol/ml)介质之前洗脱。注意图1中的苯基-HP介质的配体密度为25u摩尔/ml凝胶。
图3a显示相似的pH7梯度HIC研究，该研究涉及与图1和2中四种蛋白质相同的混合物。各曲线从顶部到底部为：rb，myo，a-lac，a-ch和混合物。也单独显示了单个蛋白质样品试验的结果。图3b显示在pH4下的相同蛋白质。注意(a)蛋白质混合物结果在两个pH下看起来相似，(b)也仅拆分了两个峰，(c)当从pH7到4时肌红蛋白和α-乳清蛋白倾向于保留在柱上(例如甚至在更低盐浓度下显示更强的相互作用)。
图4a显示了研制用于在酸性pH范围(如4-7)内具有pH HIC(pHIC)响应性的响应性聚合物涂料的通式：PNIPAAm-共-PAA-共-PBMA。它由如下基团组成：带有一些电荷以及疏水性特征的自缔合基团″m″，加入以控制pH响应性的基团″n″-在此情况下为用于酸性pH响应性的酸基团，和用于改进HIC(自缔合)官能度的另一种″o″。如图中所示可以改变许多变量以对于任何特定的应用优化聚合物，并且除其中直接展示的那些以外许多其它的应用是可能的。一些更显然的变化是改变基础基质，改变三种官能团m、n和o的摩尔比，改变基团的类型(例如使n为吡啶基团和o为苯基，利用四种官能团以由两个可彼此缓冲的基团替代基团n)，改变基团的相对排列。图4b显示设计在碱性pH范围起作用的不同类型的pH响应性聚合物。图5显示采用以上图中所实施的四种蛋白质混合物涉及的″传统″梯度HIC的色谱，但在pH4下的除外，使用通过用图4a中的聚合物接枝琼脂糖TM介质制备的介质(UB878029，U878032：1-3)。显示了采用显示三种聚合物组分的四个不同摩尔比的介质的结果。注意(a)可以控制摩尔比，(b)色谱行为倾向于随摩尔比变化并可因此被控制，(c)具有相似摩尔比的聚合物得到相似的HIC色谱。
图6显示涉及采用如以上图中实施的四种蛋白质混合物的″传统″梯度HIC的色谱，区别在于根据本发明的一个方面在吸附和洗脱两个步骤中pH从4变化到7，使用一种图4a中用聚合物涂覆的pH敏感性HIC(pHIC)原型介质(U878032：3)。注意(a)在pH7下″pHIC″介质显示由单个试验(未显示)证实的蛋白质正常洗脱顺序的典型HIC色谱，(b)四个峰的拆分优异或等于图1和2中显示的商业介质结果，(c)当pH从4降低到7时，肌红蛋白(pI 6.3)峰从最先洗脱移动到最后洗脱并且α-乳清蛋白(pI 5)也移动(见下)，(d)而其它峰，如核糖核酸酶(pI 9.4)和α-胰凝乳蛋白酶原A(pI 9.6)保持相对位置但倾向于在更低盐浓度下洗脱。观察″c″说明通过改变pH，操作者可进行单独的分离(如纯化在传统HIC中倾向于一起洗脱的核糖核酸酶和肌红蛋白)。观察″d″说明，类似于图1和2，峰的右移与增加介质疏水性有关。结果是可以通过降低pH降低介质的有效盐梯度范围。故在不同pH值下操作的一种介质也能再现类似于图1和2中许多不同介质范围的色谱分离。
图7显示与图6中pH4梯度试验相关的单个蛋白质色谱(U878032：3)。比较四种单个蛋白质的拆分峰与图3中商业苯基琼脂糖TM介质的拆分峰。注意到得到很大改进的峰形状，和肌红蛋白和α-乳清蛋白的回收。
图8显示采用图6中显示的pHIC介质的三个单独试验表明了色谱的再现性。采用相似摩尔比(未显示)的介质的试验也相似地表明了生产这种介质的再现性(稳健性)。
试验部分
提供如下实施例仅用于说明性的目的而不应当解释为限制由所附权利要求限定的本发明范围。因此以下和另外在本说明书中给出的所有参考包括于此作为参考。
材料
分离的化合物
肌红蛋白                     (SIGMAM-1882)
核糖核酸酶A                  (SIGMA R-5000)
α-乳清蛋白                  (SIGMA-L-5385)
α-胰凝乳蛋白酶原A           (SIGMAC-4879)
硫酸铵                       (Merck 1.01217.1000)
硫酸钠                       (Merck 1.06649.1000)
O-磷酸                       (Merck 1.00573.2500)
氢氧化钾                     (Merck 1.05033.1000)
洗脱剂
硫酸铵                       (Merck 1.01217.1000)
O-磷酸                       (Merck 1.00573.2500)
氢氧化钾                     (Merck 1.05033.1000)
甘氨酸                       (Merck 1.04201.1000)
氢氧化钠                     (Merck 1.06469.1000)
硫酸钠                  (Merck 1.06649.1000)
合成
琼脂糖TMHP             (Amersham Biosciences AB，瑞典)
氢氧化钠                (Merck 1.06469.1000)
NaBH4                  (Int.30011700)
Na2SO4                (Merck 1.06649.1000)
AGE                     (Fatgrden 236093-01)
乙醇                    (Kemetyl 201035488)
Hac                     (Merck 1.00063.1000)
NaAc                    (Prolabo 27650.292)
Br2(aq)                (Int.)
甲酸钠                  (Merck 1.06443.0500)
二胺己烷                (Fluka 204676)
采用p-NPA的PVCL gr.     (Int.Lund)
DMF                     (Merck 17134-1)
乙酸酐                  (M & B A12/64/107-1)
滴定
HCl                     (Merck 1.00317.1000)
Hac                     (Merck 1.00063.1000)
HNO3
AgNO3
FTIR
乙醇                    (Kemetyl 201035488)
KBr                     (Aldrich 22.184-4)
NMR
DMSO(d6)               (CIL 2206-27-1)
丙酮(d6)               (CIL 666-52-4)
甲醇(d4)               (CIL 811-98-3)
氯仿(d)                 (CIL 865-49-6)
DMF                     (安瓿)
UV-VIS
缓冲剂pH7               (Merck 1.09439.1000)
缓冲剂10                  (Merck 1.09438.1000)
缓冲剂pH4                 (Merck 1.09435.1000)
GPC
THF                       (Merck 1.09731.1000)
PS标准物                  (PL LTD)
方法
仪器
疏水性相互作用色谱在装配UV检测器的KTATMExplorer 10S(ID 119)(Amersham Biosciences AB，Uppsala，瑞典)上进行。柱子是玻璃的且为HR5/5(18-0383-1)型。
对于凝胶的滴定，使用ABU 93TRIBURETTE(ID 672)(RadiometerCopenhagen)。对于胺基团的滴定，使用5-ml特氟隆管(ID 85)而对于烯丙基类基团的滴定使用1-ml特氟隆管(ID 600)。Perkin-Elmer16PC(系列号145689)用于凝胶的FTIR分析。将由NMR分析的凝胶采用50μl氟隆管测量并采用av500分析。将纯聚合物溶解并通过NMR采用av300分析。
重量的所有测量对于≤1g的重量在Metler Toledo(ID 526)上测量，而对于≥1g的重量在Metler PM480(ID 635)上测量(当没有给出其它信息时)。
作为温度函数的聚合物吸光度采用Ultraspec 3000(ID 134)测量。对于GPC在THF中使用Waters712 WISP(ID 648)、Water 410(差示折射计)和PL-ELS 1000(检测器)。
实施例1：胺化烯丙基琼脂糖 TM HP的制备
烯丙基-HP的制备：将100ml排水的琼脂糖TMHP放入250ml容器，加入25ml水并启动搅拌。在50℃下60分钟之后，加入各种数量的NaOH、0.2g的NaBH4和6g的Na2SO4并在50℃下连续搅拌让这些物质反应16-20小时。
烯丙基-HP的胺化：将排水的烯丙基-HP凝胶放入含有50-100ml水的容器中并启动搅拌。加5g NaAc并加入Br2(aq)直到看出剩余的黄颜色，然后加入NaCOOH直到颜色消失，并用水洗涤凝胶。
制备17g 1，6-二胺己烷、8.8g NaCl，50ml水的溶液并将其加入到冷却凝胶中。允许反应在50℃下进行16-20小时。
实施例2：改性琼脂糖TMHP-凝胶的分析
滴定结果
滴定的结果是所期望的。凝胶的烯丙基类浓度与凝胶的氯离子容量一样随氢氧化钠的重量百分比增加而增加(表1)。
表1：加入不同数量NaOH的凝胶的滴定结果
  加入到凝胶中的NaOH数量[g/100ml凝胶]   烯丙基类浓度[μmol/ml]   没有聚合物的胺化凝胶的Cl-容量[μmol/ml]
  4   53.8   52
  6   58.0   112
  10   73.7   121
实施例3：PVCL-NPA共聚物与胺化凝胶的偶合
10ml凝胶的制备：
用DMF洗涤10ml胺改性琼脂糖颗粒。将96mg的PVCL-NPA溶于10ml的DMF中并随后将溶液加入到琼脂糖颗粒中。让混合物摇动过夜。向混合物中加入50μl乙酸酐(以乙酰化载体的残余氨基烷基)，随后在玻璃过滤器(孔度4)上过滤并用200ml DMF洗涤以除去过量聚合物。
凝胶的评价显示氨基烷基的乙酰化还不够，所以加入的乙酸酐体积增加到10ml。
实施例4：将PNIPAAm-PAA-共-BMA聚合物接枝到烯丙基化凝胶上
根据表2称量单体和AIBN并将其溶于15ml管形瓶中的二噁烷中。将排水的烯丙基琼脂糖TMHP加入到管形瓶中并用橡胶隔膜密封容器。Ar(g)鼓泡通过管形瓶五分钟。然后将管形瓶放入设定到70℃的摇动加热块中并使其反应过夜。
表2：单体和AIBN的数量
  样品#   NIPAAm(g)   AA(ml)   BMA(ml)   AIBN(mg)   HP100(g)   二噁烷(ml)   进料比N∶A∶B   引发剂(mol％)
  U878029   4.04   0.307   0.714   147   5   8   8∶1∶1   2
  U878032：1   3.54   0.307   1.427   147   5   8   7∶1∶2   2
  U878032：2   4.55   0.307   0   147   5   8   9∶1∶0   2
  U878032：2   4.30   0.307   0.357   147   5   8   8.5∶1∶0.5   2
采用玻璃过滤器过滤凝胶并在圆底烧瓶中回收洗脱的溶液。采用二噁烷洗涤凝胶随后后乙醇和水洗涤。
将聚合物溶液在乙醚中沉淀并在真空烘箱中干燥。然后将干燥的聚合物溶于THF中并再次沉淀。继续此过程直到剩下干燥和绒毛状的聚合物粉末。
实施例5：分析
胺基团的滴定
改性琼脂糖的精确胺浓度是未知的，必须由滴定测定。使用的方法(NR 08)涉及：
·用水、100ml的0.5M HCl并最后用200ml 1mM的HCl洗涤15-20ml凝胶。
·在(5ml)特氟隆管的底部放上滤纸并采用在1mM HCl中的凝胶淤浆填充它。
·将管子连接到水抽吸直到干燥凝胶表面是可见的并随后再进行约另外30秒。
·除去管子并通过加入水将凝胶转移到滴定杯中。
·加入2-3滴浓硝酸并开始滴定。
烯丙基的滴定
方法(NR 08)涉及：
·用水-乙醇-水-HAc-水洗涤凝胶。
·采用以上的特氟隆管(ID 600)测量1ml凝胶，通过加入蒸馏水将其转移到瓶子中并稀释到10ml的总体积。
·在搅拌下加入Br2(aq)直到颜色一致。
·将烧瓶置于抽吸下直到溶液是无色的。
·用水将烧瓶内的物料转移到滴定容器中，稀释到30ml，加入1-2滴浓硝酸并开始用AgNO3滴定。
羧基的滴定
在特氟隆管中测量1ml凝胶。将凝胶转移到含有15ml 1M KCl的滴定烧杯中。在开始滴定之前将pH降低到3以下。用0.1M NaOH进行滴定直到pH为11.5。
由NMR(HR-MAS)分析凝胶
采用HR-MAS(磁角旋转)分析聚合物涂覆的凝胶，此方法能够利用来自凝胶基质的最小扰动分析所连接的聚合物。
在特氟隆管中测量50μl凝胶并用1ml水洗涤随后用2×500μlDMSO洗涤。在加入凝胶之前将10μl的TMB放入探针底部。TMB用作内标，它使对比峰积分以进行定量计算成为可能。
由NMR分析纯聚合物和单体
当1H-NMR以单体或纯聚合物(未连接到凝胶上的聚合物)运行时，将10mg样品溶于0.70ml氘化溶剂中。
UV-VIS
采用UV-分光光度计分析较低临界溶液温度LCST。制备聚合物在缓冲剂中的1％溶液。使用的缓冲剂溶液是pH为4-7的0.1M磷酸钾(相同的缓冲剂用于HIC)。将溶液放入1cm样品池。水用作参比物。采用500nm的光学透射比观察浊点。测量的温度间隔是20-75℃并且加热速率为0.5℃/min。LCST定义为在吸光度对温度曲线中拐点处的温度。
GPC
将聚合物溶于THF(0.5mg聚合物/ml THF)并在将它们加入到管形瓶中之前过滤溶液。还制备了两种不同的标准物，将其过滤并加入到管形瓶中，每种标准物包含具有三种不同分子量的PS。然后将管形瓶放入自动旋转的管形瓶夹具中，设备从该夹具取样并将它们注入分析系统。
实施例6：色谱评价
柱的填充
采用巴斯德吸移管用聚合物偶合的琼脂糖TMHP(AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)和乙醇(20％b.v.)的淤浆仔细填充柱子直到在柱的顶部仅留下几毫米空间。加入几滴乙醇并将柱子密封和连接到HIC设备上。
分离材料
蛋白质混合物由四种蛋白质：肌红蛋白1.0mg/ml、核糖核酸酶A 2.0mg/ml、α-乳清蛋白0.8mg/ml和α-胰凝乳蛋白酶原A 0.8mg/ml组成。将蛋白质溶于pH7的2.0M硫酸铵/0.1M磷酸钾缓冲剂。在冰箱中贮存蛋白质溶液样品。同样采用肌红蛋白1.0mg/ml、核糖核酸酶A 2.0mg/ml、α-乳清蛋白0.8mg/ml和α-胰凝乳蛋白酶原A 0.8对蛋白质进行色谱分析。将蛋白质溶于pH7的2.0M硫酸铵/0.1M磷酸钾缓冲剂。在冰箱中贮存蛋白质溶液样品。
依赖于pH范围使用两种不同的缓冲剂体系(见表3)。A-缓冲剂具有″盐析″效应并促进蛋白质-HIC介质相互作用，而B-缓冲剂的较低离子强度促进洗脱。
表3：用于HIC研究的缓冲剂
  A-缓冲剂   B-缓冲剂
  pH4-7   2.0M硫酸铵/0.1M磷酸钾   0.1M磷酸钾
  pH8-10   1.0M硫酸钠/0.1M甘氨酸/NaOH   0.1M甘氨酸/NaOH
采用从100％A-缓冲剂到100％B-缓冲剂的盐梯度运行HIC，流量是1ml/min。UV检测器在215、254和280nm下运行。注射体积是50μl。pH和温度在每个试验期间保持恒定。
测试蛋白质的性能
用于测试混合物的蛋白质的一些性能(表4)。注意在pH从7到4时，两种蛋白质(肌红蛋白和核糖核酸酶)通过它们的等电位pH并改变净电荷从负到正而其它两种蛋白质保持它们的净正电荷。来源蛋白质数据银行(www.rcsb.org/pdb/)。
表4：四种不同蛋白质的描述
  蛋白质和来源   PDB编码   pl   MW   残余物   表面阳离子残余物   表面阴离子残余物   表面疏水性残余物   净电荷pH7
  α-胰凝乳蛋白酶原A(牛)   1gcd   9.4   24861   237   17   9   14   6.8
  α-乳清蛋白(牛)   1f6r   5.0   14168   123   13   16   4   -4.3
  核糖核酸酶A(牛)   1afk   9.6   13672   124   12   6   12   5.8
  肌红蛋白(equian)   1azi   6.3   16933   153   18   22   17   -2.5
实施例7：聚合物分析的结果
NMR结果
采用NMR分析测定的数值(表5)不应当被认为是精确的数值。峰未被清晰地分开，导致结果的某些不可靠性。通过比较峰组而不是单个峰测定结果，这是优选的方式。分离较差的峰可能是由于难以找到使聚合物自由旋转的良好溶剂。
表5：供应商的m∶n值和由NMR测定的值之间的比较
  用p-NPA接枝的PVCL数目   根据供应商的m∶n值  由NMR分析测定的m∶n值
  1   7∶93   6∶94
  2   16∶84   15∶83
  3   12∶88   14∶86
  4   8∶92   26∶94
UV-VIS结果
根据理论推测当加入亲水性组分时LCST值增加而当共聚单体是疏水性的时LCST值降低。在此情况下与N-异丙基丙烯酰胺相比，丙烯酸更亲水而甲基丙烯酸丁酯(BMA)较不亲水。
对于此研究LCST定义为由吸光度对温度曲线中拐点处的温度表示。
在低pH下LCST值低于32℃，但对于其中不加入BMA的聚合物此数值也如此。此聚合物事实上具有它们所有的最低LCST值。聚合物的水溶解度不太好，难以得到1％溶液。
另一方面聚合物的浊点是非常pH依赖性的。在pH4和5下LCST值为约25-30℃，但当pH增加到5以上时，观察LCST在约70℃。在pH7下在所观察的温度范围(20-75℃)中没有看到LCST。AA中的羧基在pH6和7下带电荷，增加亲水性并因此增加LCST。
可以得出的结论是对于所有研究的PNIPAAm-共-PAA-共-PBMA组合物，在环境温度下从7到4改变pH应当导致聚合物结构中的构象变化。聚合物的亲水性在大于5的pH下更大并且在pH7下没有观察到聚合物溶液的混浊。
GPC结果
来自NIPAAM、AA和BMA三元聚合物的GPC的色谱显示出宽峰并有时为多重峰。这可能意味着在样品中存在均聚物和共聚物。
表6：多分散性
  样品名   描述   Mn   多分散性
  U878019   PNIPAAm-共-PAA 9∶1(TA)   2343   1.32
  U878021   PNIPAAm-共-PAA 9∶1(TA)   2146   1.6
  U878029   PNIPAAm-共-PAA-共-PBMA 8∶1∶1   *   ------
  U878032：1   PNIPAAm-共-PAA-共-PBMA 7∶1∶2   15484   3.6
  U878032：2   PNIPAAm-共-PAA-共-PBMA 9∶1   26550   3.8
  U878032：3   PNIPAAm-共-PAA-共-PBMA 8.5∶1∶0.5   *   ------
*没有拆分的多重峰
没有转移剂的合成聚合物的多分散性高且分子量在不同体系之间非常不同，尽管除单体的进料比以外反应条件相同(表6)。
实施例8：HIC评价
使用苯基琼脂糖 TM HP介质的对照HCI
采用苯基-琼脂糖TMHP(Phe-HP)介质进行对照研究。对所有的柱使用相同的柱制备方法和色谱方法。
图3a和b显示采用Phe-HP介质在pH7和4两者下对于本文的标准蛋白质混合物和对于单个蛋白质两者获得的结果。可以清楚地看到，在pH7下和在pH4下运行的蛋白质混合物色谱中存在非常小的差异。这种pH响应性的缺乏实际上被视为对传统HIC介质的正向贡献。然而在两种情况下均没有两个以上大峰的拆分。也可从单个蛋白质试验看出，在pH7下第一个峰由肌红蛋白和核糖核酸酶A组成，而第二个峰由胰凝乳蛋白酶原A(双峰)和乳清蛋白(非常宽的低″峰″)组成。
改变pH到4仍然留下两个大的蛋白质混合物峰。单个试验表明这些仍然分别受核糖核酸酶A、胰凝乳蛋白酶原A影响。肌红蛋白和乳清蛋白不显现为被洗脱或可能在非常宽的低″峰″中洗脱。
使用PNIPPAm-共-PAA-共-PBMA的对照HIC
用具有不同NIPAAm、AA和BMA进料比的四种凝胶填充柱子并采用蛋白质混合物在pH4-7下运行HIC(表7)。
表7：用于HIC评价的柱子
  柱名称   进料比N∶A∶B
  U878029   8∶1∶1
  U878032：1   7∶1∶2
  U878032：2   9∶1∶0
  U878032：3   8.5∶1∶0.5
与商业苯基-HP介质(图5)相比，所有四种凝胶显示有前途的HIC介质行为(图3a和b)。在pH4下，U878032：3具有在22min洗脱时间的大峰，此峰也可以在(尽管较小)柱U878029和U878032：1中看到，而采用U878032：2的色谱完全缺乏此峰。采用相似组成(表7)的两种介质(032：3和029)获得最好的结果。
可以采用轻稍不同的配方获得的相似的良好结果表明了结果的再现性。它还表明这种介质生产运行的轻微变化也会得到良好的介质。然而应当注意到，结果显现为依赖于AA对BMA的适当比例而这应当进一步研究。
选择柱U878032：3用于采用蛋白质混合物(图6)的进一步评价，使用单独的蛋白质证实位置。以下显示单独的蛋白质色谱(图7和8)，在表8中给出的平均峰位置按照相对洗脱盐浓度(硫酸铵)表示。
在U878032：3上在pH4-7下运行的HIC的所有色谱中，α-胰凝乳蛋白酶原A显示双峰行为，小峰之后为更大的峰。如在引言中所述，这是相当典型的。当降低pH时所有的蛋白质在更低盐浓度下洗脱(表8和图6)。这表明如下一些可能性：pH响应性聚合物介质可在较低盐条件下允许HIC。
表8：在不同pH下的柱U878032：3运行
  U878032：3              以硫酸铵盐浓度[M]表示的峰中心
  蛋白质   pH4   pH5   pH6   pH7
  肌红蛋白   0   0   1.46   1.51
  核糖核酸酶A   0.88   0.98   1.23   1.35
  α-乳清蛋白   0   0.24   0.79   0.90
  α-胰凝乳蛋白酶原A：1   0.30   0.37   0.51   0.53
  α-胰凝乳蛋白酶原A：2   0.12   0.21   0.30   0.39
注：以上表示平均峰位置；如正常的那样，胰凝乳蛋白酶原洗脱在两个峰中
在pH7下蛋白质以预期的顺序肌红蛋白、核糖核酸酶A、α-乳清蛋白和最后α-胰凝乳蛋白酶原A洗脱。在肌红蛋白和核糖核酸酶A之间的拆分不是令人满意的，但蛋白质峰拆分与许多商业介质一样好。
当pH变化到6时，洗脱时间在一定程度上更长但洗脱的相对顺序与pH7的相同。也许存在肌红蛋白和核糖核酸酶A峰的更多拆分，但α-乳清蛋白(pI 5)峰不如在pH7下尖锐。
在pH5下洗脱的顺序改变。在pH7和6下首先洗脱的肌红蛋白(pI 6.3)现在变为净电荷为约+8并且变成最后洗脱的蛋白质。α-胰凝乳蛋白酶原A和α-乳清蛋白在几乎相同的盐浓度下在肌红蛋白之前洗脱。核糖核酸酶、α-乳清蛋白和α-胰凝乳蛋白酶原A的相对位置仍然与它们的正常HIC行为(即相对疏水性)一致。
在pH4下肌红蛋白和α-乳清蛋白(具有酸性pI的两种蛋白质)在相同浓度(100％B-缓冲剂)下洗脱，在蛋白质混合物中得到一个单一峰。洗脱的顺序现在是核糖核酸酶A、α-胰凝乳蛋白酶原(具有碱性pI的两种蛋白质)然后是α-乳清蛋白和肌红蛋白(图7)。

Claims (22)

1.从液体分离至少一种目标化合物的方法，该方法包括如下步骤：
(a)在第一pH下使液体与显示表面定位pH响应性聚合物的分离介质接触，以通过疏水性相互作用吸附目标化合物；和
(b)加入第二pH值的洗脱剂，它提供所述pH响应性聚合物的构象变化，以从分离介质释放目标化合物。
2.根据权利要求1的方法，其中第二pH值低于第一pH值。
3.根据权利要求2的方法，其中洗脱剂包括降低pH梯度。
4.根据任何权利要求1的方法，其中洗脱剂的电导率不同于步骤(a)的液体的电导率，而第二pH值保持基本等于第一pH值。
5.根据前述权利要求任意一项的方法，其中洗脱剂包括盐梯度。
6.根据前述权利要求任意一项的方法，其中在步骤(a)中，分离介质是不带电的。
7.根据权利要求1-5任意一项的方法，其中在步骤(a)中，目标化合物也由pH响应性聚合物和目标化合物之间的另外相互作用吸附，该另外相互作用选自电荷-电荷相互作用、范德华相互作用和基于共溶解/共水合的相互作用。
8.根据前述权利要求任意一项的方法，其中在步骤(b)中，分离介质是不带电的。
9.根据前述权利要求任意一项的方法，其中在步骤(b)中，pH响应性聚合物的疏水性不如在步骤(a)中的。
10.根据前述权利要求任意一项的方法，其中聚合物的构象变化由聚合物自缔合和/或聚合物与介质的缔合提供。
11.根据前述权利要求任意一项的方法，其中pH响应性聚合物是共聚物。
12.根据前述权利要求任意一项的方法，其中每种pH响应性聚合物包括疏水性部分、亲水性部分和pH响应性部分。
13.根据前述权利要求任意一项的方法，其中pH响应性聚合物包括选自如下基团的侧挂pH敏感性基团：-COOH基团、-OPO(OH)2基团、-SO3 -基团、SO2NH2基团、-CNH2基团、-C2NH基团和-C3N基团。
14.根据前述权利要求任意一项的方法，其中目标化合物是生物分子，如蛋白质或肽。
15.根据前述权利要求任意一项的方法，它是色谱方法。
16.根据前述权利要求任意一项的方法，它是分析方法。
17.根据前述权利要求任意一项的方法，其中基质是生物传感器或生物芯片。
18.根据权利要求1-14任意一项的方法，它是过滤方法。
19.一种疏水性相互作用色谱(HIC)介质，它由表面定位pH响应性聚合物连接到其上的基质组成，该聚合物显示HIC配体。
20.根据权利要求19的介质，其中聚合物的pH响应性基团选自-COOH基团、-OPO(OH)2基团、-SO3 -基团、SO2NH2基团、-CNH2基团、-C2NH基团和-C3N基团。
21.一种用于分离目标化合物的试剂盒，该试剂盒包括在单独的隔室中由介质填充的色谱柱，该介质由表面定位pH响应性聚合物连接到其上的基质组成，该聚合物显示HIC配体；具有第一pH的吸附缓冲剂；具有第二pH的洗脱剂，第二pH低于所述第一pH；及其使用的书面说明书。
22.根据权利要求21的试剂盒，其中聚合物的pH响应性基团选自-COOH基团、-OPO(OH)2基团、-SO3 -基团、SO2NH2基团、-CNH2基团、-C2NH基团和-C3N基团。
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