CN103884816B - 产生线性pH梯度的缓冲液试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
在此披露了一种缓冲液试剂盒,包含一种第一洗脱液和第二洗脱液。该第一洗脱溶液包含至少四种缓冲盐,其中该四种缓冲盐中的至少三种是一种单价缓冲盐、具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷、并且包含一个磺酸基和一个胺。该第二洗脱溶液包含至少四种缓冲盐,其中该四种缓冲盐中的至少三种是一种单价缓冲盐、具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷、并且包含一个磺酸基和一个胺。该第一洗脱溶液具有一个第一pH并且该第二洗脱溶液具有一个第二pH,其中该第一pH与第二pH是不同的值。该缓冲液试剂盒提供了形成从至少该第一pH至该第二pH的一条近似直线的一个线性pH梯度。
Description
背景
离子交换色谱法(IEC)是用于带电分子的化学分析和分离的一种广泛使用的分析技术。IEC涉及从存在于一种样品中的其他基质组分中分离一种或多种分析物物质。这些分析物典型地是离子的以使得它们可以具有一种与固定相的离子相互作用。在IEC中,该固定相是使用将以不同亲和力水平理想地结合这些分析物和基质组分的离子部分进行衍生化的。将一种洗脱液渗透穿过该固定相并且与这些分析物和基质组分竞争结合离子部分。该洗脱液是用于描述被泵入到一个色谱柱入口中的一种液体溶液或缓冲溶液的一个术语。在此竞争过程中,这些分析物和基质组分将随着时间变化而从该固定相上洗脱出来并且随后在一个检测器上进行检测。一些典型检测器的实例是一台电导率检测器、一台UV-VIS分光光度计以及一台质谱仪。多年以来,IEC已经发展成适用于为如水质、环境监测、食品分析、药学以及生物技术的各种行业建立一个更健康、更干净以及更安全的环境的一种强大的分析工具,在该环境下可以分离和分析复杂样品混合物。
在生物技术产业中,在开发基于蛋白质的治疗药物方面已存在众多突破性发现。单克隆抗体(MAb)代表已成功治疗多种疾病如克罗恩氏病(Crohn’sdisease)、风湿性关节炎、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)以及转移性乳腺癌的一种特定类型的蛋白质治疗剂。考虑到过去在MAb技术方面的成功,在开发MAb技术的新治疗性应用方面并且更具体地说在加速发现、开发和筛选工序方面存在持续的兴趣,这迄今为止一直是昂贵且耗费时间的。
由于如C-端赖氨酸截断、N-端焦谷氨酸形成、脱酰胺基作用、唾液酸化作用、糖化作用、以及糖基化作用的修饰,所以重组MAb是高度异质的。这些修饰中的一些可以引起MAb的电荷的一种变化。例如,脱酰胺基作用和唾液酸化作用将在MAb上引入带负电荷的酸性部分。通过一个C-端赖氨酸截断可以形成一组带正电荷的MAb变体。传统上,用于阳离子交换色谱的一个洗脱液盐梯度已经用于表征MAb电荷变体。然而,每当一个新MAb候选物需要表征时,方法开发常常需要配置盐梯度和分离参数。例如,此类参数可包括缓冲盐类型、缓冲盐浓度、非缓冲盐类型、非缓冲盐浓度、流速、建立与多种洗脱溶液组分成比例的变化的时间特征曲线、以及每单位时间的pH变化率。申请人们相信,存在开发一种缓冲液试剂盒和系统的需要,该缓冲液试剂盒和系统可以在一个广泛pH范围上提供一个线性pH梯度并且可以用于表征广泛多种蛋白质(例如,MAb)而几乎没有为每种新候选物修改这些分离参数。
发明内容
一种缓冲液试剂盒包含一种第一洗脱溶液和一种第二洗脱溶液。该第一洗脱溶液包含至少四种缓冲盐,其中这四种缓冲盐中的至少三种是一种单价缓冲盐、在6至10的pH范围上具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷、并且包含一个磺酸基和一个胺,其中该第一洗脱溶液具有6的一个第一pH和大于25毫摩尔的一个总缓冲盐浓度。该第二洗脱溶液包含至少四种缓冲盐,其中这四种缓冲盐中的至少三种是一种单价缓冲盐、在6至10的pH范围上具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷、并且包含一个磺酸基和一个胺,其中该第二洗脱溶液具有10的一个第二pH和大于25毫摩尔的一个总缓冲盐浓度。该缓冲液试剂盒基于时间和pH值的函数提供了一个线性pH梯度,该线性pH梯度针对至少pH6至pH10的pH范围形成一条近似直线。
关于上述缓冲液试剂盒,该第一洗脱溶液和该第二洗脱溶液可各自进一步包含一种单价非缓冲离子盐。该单价非缓冲离子盐可以是氯化钠、甲磺酸钠、氯化钾或其组合并且具有15毫摩尔或更大的一个浓度。
关于上述缓冲液试剂盒的该第一洗脱溶液,该至少四种缓冲盐中的最高缓冲液浓度不大于该至少四种缓冲盐中的最低缓冲液浓度的60%以上。类似地,对于该第二洗脱溶液,该至少四种缓冲盐中的最高缓冲液浓度不大于该至少四种缓冲盐中的最低缓冲液浓度的60%以上。
关于上述缓冲液试剂盒,该第一洗脱溶液或该第二洗脱溶液的该四种缓冲盐可包含一种第一缓冲盐、一种第二缓冲盐、一种第三缓冲盐、以及一种第四缓冲盐。该第一、第二、第三以及第四缓冲盐可分别为2-(N-吗啉代)乙磺酸盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸盐(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸盐(TAPS)以及3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)。可替代地,该第一、第二、第三以及第四缓冲盐可分别为2-(N-吗啉代)乙磺酸盐(MES)、2-[双(2-羟乙基)氨基]乙磺酸盐(BES)、(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷-1-磺酸盐(TAPS)以及3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)。
关于上述缓冲液试剂盒,该至少四种缓冲盐在6至10的pH范围上各自具有一个净负电荷或一个净中性电荷。
关于上述缓冲液试剂盒,该至少四种缓冲盐中的一种是选自由TRIS和磷酸盐组成的组。
关于上述缓冲液试剂盒,该第一洗脱溶液和第二洗脱溶液的该至少四种缓冲盐各自包含具有一个第一pKa的一种第一缓冲盐、具有一个第二pKa的一种第二缓冲盐、具有一个第三pKa的一种第三缓冲盐、以及具有一个第四pKa的一种第四缓冲盐。该第一pKa是这四个pKa值中最小的并且该第四pKa是这四个pKa值中最大的,其中该第一pKa与该第一pH值相同并且该第四pKa与该第二pH值相同。在该第二pKa与该第一pKa之间的第一差异小于1.5。在该第三pKa与该第二pKa之间的第二差异小于1.5。在该第三pKa与该第四pKa之间的第三差异小于1.5。
关于上述缓冲液试剂盒,针对pH6至pH10的pH范围的直线具有大于0.97的一个相关系数。使用一种不同的度量标准,针对pH6至pH10的pH范围的直线可以具有小于1.4%的一个平均绝对百分比误差。
关于上述缓冲液试剂盒,该胺可处于质子化铵形式。
描述了一种采用一种色谱分离装置使用具有随着时间变化从一个第一pH值至一个第二pH值的线性pH梯度的一种梯度洗脱液流来从一种样品的基质组分中分离至少一种分析物的方法。该方法包括将样品注入到一个进样阀中,其中该进样阀与该色谱分离装置处于流体联通。可以将具有该第一pH值的一种第一洗脱溶液泵入到该色谱分离装置中。该第一洗脱溶液包含一种第一缓冲盐、一种第二缓冲盐、一种第三缓冲盐、以及一种第四缓冲盐。可以将具有该第二pH值的一种第二洗脱溶液泵入到该色谱分离装置中。该第二洗脱溶液包含一种第一缓冲盐、一种第二缓冲盐、一种第三缓冲盐以及一种第四缓冲盐。对于该第一和第二洗脱溶液二者,该第一缓冲盐具有一个第一pKa,该第二缓冲盐具有一个第二pKa,该第三缓冲盐具有一个第三pKa,并且该第四缓冲盐具有一个第四pKa。该第一pKa是这四个pKa值中最小的并且该第四pKa是这四个pKa值中最大的。该第一pKa与该第一pH值相同并且该第四pKa与该第二pH值相同。可以选择这些缓冲盐以使得这些pKa值近似且均匀地跨越在该第一pH值与第二pH值之间。在该第二pKa与该第一pKa之间的一个第一差异是小于1.5,在该第三pKa与该第二pKa之间的一个第二差异是小于1.5,并且在该第三pKa与该第四pKa之间的一个第三差异是小于1.5。泵入的第一洗脱溶液与泵入的第二洗脱溶液的比例可以随着时间变化而变化。基于时间和pH值的函数可以产生一个线性pH梯度,该线性pH梯度形成从该第一pH值至该第二pH值的一条近似直线。通过该色谱分离装置可以洗脱该样品。该分析物可以从该样品的多种基质组分中分离。随后可以在一个检测器中检测该分析物。
关于上述方法,该线性pH梯度是具有大于0.97的一个相关系数的一条近似直线,其中该第一pH值是6并且该第二pH值是10。使用一种不同的度量标准,该线性pH梯度是具有小于1.4%的一个平均绝对百分比误差的一条近似直线,其中该第一pH值是6并且该第二pH值10。
关于上述方法,在产生该线性pH梯度的步骤的同时产生一个线性电导率梯度。产生的线性pH梯度具有随着时间变化而增加的pH值并且产生的线性电导率梯度具有随着时间变化而增加的电导率值。
关于上述方法,该色谱分离装置包含一种阳离子交换树脂,其中用于该第一和第二洗脱溶液的这些缓冲盐中的每一种都不结合该阳离子交换树脂。
关于上述方法,该分析物包含一种抗体。
关于上述方法,在该色谱分离装置中形成所产生的线性pH梯度。
关于上述方法,该第一缓冲盐包括2-(N-吗啉代)乙磺酸盐。该第二缓冲盐可以选自2-[双(2-羟乙基)氨基]乙磺酸盐、MOPS、或磷酸盐。该第三缓冲盐可以选自N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸盐或TRIS。该第四缓冲盐可以是3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐。
关于上述方法,该第一洗脱溶液和第二洗脱溶液进一步包含一种单价非缓冲离子盐。该单价非缓冲离子盐可以选自氯化钠、氯化钾、甲磺酸钠、或其组合。
关于上述方法,该第一pH值是6并且该第二pH值是10。该第一和第二洗脱溶液可各自具有大于25毫摩尔的一个总缓冲盐浓度。该单价非缓冲离子盐可具有15毫摩尔或更大的一个浓度。
关于上述方法,对于该第一洗脱溶液,该四种缓冲盐的最高缓冲液浓度不大于该四种缓冲盐的最低缓冲液浓度的60%以上。类似地,对于该第二洗脱溶液,该四种缓冲盐的最高缓冲液浓度不大于该四种缓冲盐的最低缓冲液浓度的60%以上。
关于上述方法,在将该第一洗脱溶液和该第二洗脱溶液泵入到该色谱分离装置中之前,可以将该第一洗脱溶液与该第二洗脱溶液混合在一起。
关于上述方法,可以将两种或更多种溶液源输入到一个泵中。两种或更多种溶液源一起的一个组合包含该第一洗脱溶液的该第一缓冲盐、该第二缓冲盐、该第三缓冲盐、以及该第四缓冲盐。另外,该第一洗脱溶液可以由两种或更多种溶液源形成。类似地,该第二洗脱溶液可以由两种或更多种溶液源形成。
关于上述方法,这些缓冲盐中的每一种都是一种单价缓冲盐、在从第一pH值至第二pH值的pH范围上具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷、并且包含一个磺酸基和一个胺。
关于上述方法,该胺可处于质子化铵形式。
在一种缓冲液试剂盒的一个第二实施例中,它包含一种第一洗脱溶液和一种第二洗脱溶液。该第一洗脱溶液由一种第一缓冲盐、一种第二缓冲盐、一种第三缓冲盐、一种第四缓冲盐以及一种单价非缓冲离子盐组成。该第一洗脱溶液具有6的一个第一pH和大于25毫摩尔的一个总缓冲盐浓度。该第二洗脱溶液由一种第一缓冲盐、一种第二缓冲盐、一种第三缓冲盐、一种第四缓冲盐以及一种单价非缓冲离子盐组成。该第二洗脱溶液具有10的一个第二pH和大于25毫摩尔的一个总缓冲盐浓度。这些缓冲盐中的每一种都是一种单价缓冲盐、具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷、并且包含一个磺酸基和一个胺。
关于该缓冲液试剂盒的第二实施例,该第一洗脱溶液和第二洗脱溶液的四种缓冲盐各自包含具有一个第一pKa的一种第一缓冲盐、具有一个第二pKa的一种第二缓冲盐、具有一个第三pKa的一种第三缓冲盐以及具有一个第四pKa的一种第四缓冲盐。该第一pKa是这四个pKa值中最小的并且该第四pKa是这四个pKa值中最大的。该第一pKa与该第一pH值相同并且该第四pKa与该第二pH值相同。该至少四种缓冲盐在该第二pKa与该第一pKa之间具有小于1.5的一个第一差异、在该第三pKa与该第二pKa之间具有小于1.5的一个第二差异、并且在该第三pKa与该第四pKa之间具有小于1.5的一个第三差异。
关于该缓冲液试剂盒的第二实施例,对于该第一洗脱溶液,该四种缓冲盐的最高缓冲液浓度不大于该四种缓冲盐的最低缓冲液浓度的60%以上。类似地,对于该第二洗脱溶液,该四种缓冲盐的最高缓冲液浓度不大于该四种缓冲盐的最低缓冲液浓度的60%以上。
附图简要说明
结合在此并构成本说明书的一部分的附图说明了本发明目前优选的实施例,并且与上文给出的一般说明和下文给出的详细说明一起用于解释本发明的特征(其中相似数字代表相似元件)。
图1是示出了使用包含MES、BES、TAPS以及CAPSO的缓冲盐的一种缓冲液试剂盒的测量的pH值随着时间变化的图。
图2是使用图1的缓冲液试剂盒并示出一种蛋白质样品中的多个峰的保留时间和相应pH值的色谱图。
图3是示出了使用包含MES、MOPS、TAPS以及CAPSO的缓冲盐的一种缓冲液试剂盒的测量的pH值随着时间变化的图。
图4是示出了使用包含MES、BES、TRIS以及CAPSO的缓冲盐的一种缓冲液试剂盒的测量的pH值随着时间变化的图。
图5是示出了使用包含MES、磷酸盐、TAPS以及CAPSO的缓冲盐的一种缓冲液试剂盒的测量的pH值随着时间变化的图。
图6是比较当使用包含图1的MES、BES、TAPS以及CAPSO的缓冲液试剂盒(箭头602)和包含图4的MES、BES、TRIS以及CAPSO的缓冲液试剂盒(箭头604)时pH轨迹的线性度的图。
图7是比较当使用包含图1的MES、BES、TAPS以及CAPSO的缓冲液试剂盒时六种蛋白质组分峰的测量的pH值随着相应pI值变化的图。
图8是示出使用包含图1的MES、BES、TAPS以及CAPSO的缓冲液试剂盒(箭头802)和包含图4的MES、BES、TRIS以及CAPSO的缓冲液试剂盒(箭头804)的电导率值随着时间变化的图。
图9是在30分钟时间段上使用范围从约pH5.6至10.2的一个线性pH梯度来表征一种异质MAb样品的不同电荷变体的一个示例性色谱图(902)。轨迹904示出了随着时间变化的测量的pH。
图10是在30分钟时间段上使用范围从约pH6.7至7.9的一个线性pH梯度来表征该异质MAb样品的不同电荷变体的一个示例性色谱图(1002),其中每单位时间的pH变化率小于图9的变化率。轨迹1004示出了随着时间变化的测量的pH。
图11是适用于与在此所述的缓冲液试剂盒一起使用的一个示例性离子色谱系统。
实施方式的详细说明
以下详细说明应该参考附图来阅读,其中在不同附图中的相似元件采用相同编号。不必依比例绘制的这些附图描绘了选择的实施例并且不旨在限制本发明的范围。详细说明通过举例的方式而不是限制的方式来说明本发明的原理。本说明将清楚地使得本领域技术人员能够制备并使用本发明,并且描述本发明的若干实施例、改编、变化、替代方案以及用途,包括目前被认为是执行本发明的最好模式。如在此使用的用于任何数值或范围的术语“约”或“近似”是指出于其在此所述的预期目的允许组分的部分或集合起作用的一个适合的尺寸公差。
MAb分子的净电荷可以用作表征和分离一种MAb候选物的一个基础。在开发过程中,一种MAb样品将典型地包含具有稍微不同的化学结构的多种MAb变体。由于可归结于酸/碱基团的不同净电荷水平,所以这些MAb变体典型地被称为电荷变体。在一种典型的样品中,很多MAb变体将具有一个单独不同的pI值。该pI值代表一个pH值,在该pH值下特定MAb变体将具有一个净中性电荷。该pI值还可以被称为一个等电点。与一种特定MAb样品相关的一组pI值可提供适用于表征该样品的一个指纹。例如,此类指纹图谱可用于如鉴别、纯化、批再现性以及研究特定电荷变体的效力的方法中。应注意,在此所述的缓冲液试剂盒不应该被限制为仅分析MAb样品并且他们还可以用于分析各种各样的蛋白质和具有酸/碱部分的其他分子。
在从pH6至10的pH值范围上,多种MAb将针对此范围的至少一个部分典型地具有一个净正电荷。出于这个原因,阳离子交换色谱非常适用于分离和表征多种MAb样品。在一个实施例中,可以将一种MAb样品注入到一个阳离子交换柱中,在该柱中洗脱液最初处于一个相对低pH下。这确保大多数MAb变体是带正电荷的,并且因此将结合该阳离子交换固定相。可将一个线性pH梯度施加于该柱以引起pH随着时间变化而线性地增加。增加的pH将滴定该MAb上的酸基团并引起净正电荷减少。例如,质子化胺基将从正电荷转变为中性并且羧酸基团将从中性转变为负电荷。在线性pH梯度中的某一pH下,该净电荷最后将变为中性(即等电点)。当该MAb变体具有一个净中性电荷时,该MAb变体对该阳离子交换柱的亲和力将显著减小,并因此将导致它从该柱中洗脱出来。
以下将描述提供一个线性pH梯度的一种缓冲液试剂盒。该线性pH梯度代表基于时间变化而变化的pH值,其中在一个时间范围上该pH值针对至少约pH6至约pH10的pH范围形成一条近似直线。申请人相信,用于离子交换色谱的一个线性pH梯度将提供一种用于表征一种MAb样品的平台方法,其中在表征过程中将需要最少的变化至没有变化。申请人还相信,线性pH梯度的直线度对于当使用一个更窄的pH范围和每单位时间减小的pH变化率时表征这些MAb样品并且增大分离的分辨率是关键的。
在一个实施例中,该缓冲液试剂盒可包含一种第一洗脱溶液和一种第二洗脱溶液。注意,一种洗脱溶液可以是用于将一种样品从一个离子交换固定相中洗脱出来的一种溶液。这些洗脱溶液可以装入到一个相应的液体容器或小瓶中。为了减小运输重量,可按10x浓度来包装这些洗脱溶液,其中使用者可在测试点将其稀释至适当的浓度范围如约1x范围。应注意,在此描述的缓冲液试剂盒不应被限制为仅两种洗脱溶液并且缓冲液试剂盒可以使用两种以上的洗脱溶液来实施。
关于该第一洗脱溶液,它可以包含至少四种缓冲盐,其中该四种缓冲盐中的至少三种具有多种具体的特性,这些特性是a)这些缓冲盐是单价缓冲盐,b)在约6至约10的pH范围上具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷,并且c)包含一个磺酸基和一个胺。以下将更详细地描述具体的特性a)至c)。
一种单价缓冲盐是仅具有一个酸/碱部分的一种缓冲液。对于在此描述的这些缓冲液试剂盒,该酸/碱部分应该具有在相关pH范围之间内的一个pKa值,在此情况下该pH范围是从约pH6至pH10。此外,该单价缓冲盐可具有三种电荷状态中的仅一种,该三种电荷状态是单一正电荷、无净电荷(即中性或两性离子电荷)、或单一负电荷。申请人相信在四种缓冲盐中的至少三种是多价的情况下,该缓冲液试剂盒将提供在不同pH值下变化的缓冲能力,并且反过来导致更少的线性pH梯度和一种更难实施的分离方法。
该至少三种缓冲盐在约6至约10的pH范围上应该各自都包含一个净负电荷抑或净中性两性离子电荷以使得该缓冲盐将不会与该阳离子交换柱牢固缔合或者牢固结合该阳离子交换柱。阳离子交换材料通常具有用于结合带正电荷阳离子的一个负电荷。因此,由于离子排斥,所以一种带净负电荷的缓冲盐不会结合这些带负电荷的阳离子交换部分。由于缺乏中性物质与带负电荷物质之间的净离子吸引,所以一种净中性带两性离子的缓冲盐不会结合带负电荷的阳离子交换材料。与此相反,由于离子吸引,所以一种带正电荷的缓冲盐会结合该带负电荷的阳离子交换材料。一种带正电荷的缓冲盐与该阳离子交换材料的离子结合可影响该缓冲盐的缓冲能力并且妨碍该pH梯度的线性度。在一个实施例中,通过以允许这些缓冲盐有效缓冲流动相和固定相二者的方式不完全从该固定相中排除而未保留这些缓冲盐。注意,如果一种缓冲盐物质从该固定相中排除,那么它不能以与未从固定相中排除的其他缓冲盐相似的方式缓冲该固定相并且帮助洗脱该分析物。另外,由固定相保留的一种缓冲盐可引起在流动相pH与固定相pH之间的一个偏差,该偏差取决于该缓冲液在该固定相上的保留特征。
该至少三种缓冲盐应各自进一步包含一个磺酸基和一个胺。在一个实施例中,该胺基可以是伯胺、仲胺、或叔胺。该缓冲盐可处于其中来自该磺酸基的氢使该胺基质子化以形成一个带正电荷部分和一个带负电荷磺酸基(两者一起形成一个两性离子)的形式。该缓冲盐还可以处于其中质子化胺基具有一个负反离子如氯并且该磺酸基具有正反离子如钠的形式。应注意包含一个磺酸基和一个胺基的很多缓冲盐可被称为“古德缓冲液(Good’s buffer)”。
尽管没有以一个具体缓冲盐的名称明确地进行描述,但是本领域普通技术人员将理解,作为该缓冲盐名称的一部分的术语“磺酸盐”的指定不应将该缓冲盐限制为仅带负电荷的磺酸盐状态并且它在低pH条件下还可以处于磺酸形式。此外,本领域普通技术人员将理解,作为一种缓冲盐名称的一部分的术语“胺基”的指定不应将该缓冲盐限制为仅中性电荷的游离胺状态并且当该缓冲液是轻微酸性时它还可以处于具有一个反离子的质子化铵形式。
在一个实施例中,该第一洗脱溶液可具有约6的一个第一pH和大于约25毫摩尔的总缓冲盐浓度。当分离MAb带电变体时选择该第一pH6,因为在该样品中的大部分MAb变体具有引起结合该阳离子交换柱的一个净正电荷。可以选择该第一洗脱溶液的缓冲盐浓度以使得缓冲能力大于MAb样品和该阳离子交换材料二者。
该缓冲液试剂盒包含可与该第一洗脱溶液混合以形成一个线性增加的pH梯度的一种第二洗脱溶液。该第二洗脱溶液可具有大于该第一洗脱溶液的第一pH的一个第二pH。与该第一洗脱溶液类似,该第二洗脱溶液可包含至少四种缓冲盐,其中该四种缓冲盐中的至少三种具有多种具体的特性,这些特性是a)这些缓冲盐是单价缓冲盐,b)在约6至约10的pH范围上具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷,并且c)包含一个磺酸基和一个胺。
该第二洗脱溶液可具有约10的一个第二pH和大于约25毫摩尔的总缓冲盐浓度。当分离MAb的带电变体时选择该第二pH10,因为大多数MAb变体将不具有大于10的pI。因此,在从pH6至pH10的一个线性梯度过程中,基本上全部的MAb带电变体将转变为一个净中性值,以引起它们从该阳离子交换柱中洗脱出来。与该第一洗脱液相似,可以选择该第二洗脱溶液的缓冲盐浓度以使得缓冲能力大于MAb样品和该阳离子交换材料二者。
在一个实施例中,对于该第一洗脱溶液和该第二洗脱溶液二者,该至少四种缓冲盐可以是相同的化学物质。例如,该第一洗脱溶液和该第二洗脱溶液二者都包含以下四种缓冲盐,它们是:2-(N-吗啉代)乙磺酸盐(MES)、2-[双(2-羟乙基)氨基]乙磺酸盐(BES)、N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸盐(TAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)。
该第一洗脱溶液和第二洗脱溶液的该至少四种缓冲盐可各自包含具有一个第一pKa的一种第一缓冲盐、具有一个第二pKa的一种第二缓冲盐、具有一个第三pKa的一种第三缓冲盐、以及具有一个第四pKa的一种第四缓冲盐。该第一pKa可以是这四个pKa值中最小的并且该第四pKa可以是这四个pKa值中最大的。可以选择这些缓冲盐以使得该第一pKa与该第一pH值大致相同并且该第四pKa与该第二pH值大致相同。更具体地说,可以选择这些缓冲盐以使得该第一pKa处于该第一pH值的0.5pH单位内并且该第四pKa处于该第二pH值的0.5pH单位内。
还可以选择这些缓冲盐以使得这些pKa值近似且均匀地跨越在该第一pH值与第二pH值之间。在一个实施例中,在该第二pKa与该第一pKa之间存在小于约1.5的一个第一差异,在该第三pKa与该第二pKa之间存在小于约1.5的一个第二差异,并且在该第三pKa与该第四pKa之间存在小于约1.5的一个第三差异。可以在从约0.5至约1.5pH单位的范围内选择这四种pKa值的差异以使得存在从该第一pH至该第二pH的一个相对一致的缓冲能力。申请人相信,通过选择具有提供大致相等的第一、第二、第三差异值的pKa的缓冲盐将获得提供线性pH梯度的缓冲液试剂盒。在一个实施例中,该第一、第二、第三以及第四pKa值在25℃下可以是约6.1、7.1、8.4以及9.6。应注意,在此所说明的所有pKa值是相对于25℃下来说明的,除非特别说明在一个不同的温度下。
在一个可替代的实施例中,该第一洗脱溶液的缓冲盐中的一种或多种可以是一种与该第二洗脱溶液的缓冲盐不同的化学物质。例如,该第一洗脱溶液可包含MES、BES、TAPS以及CAPSO并且该第二洗脱溶液可包含MES、MOPS、TAPS以及CAPSO。即使该第二洗脱溶液的第二缓冲盐是一种不同的化学物质,这种缓冲液试剂盒仍将提供一个线性pH梯度。
在一个实施例中,可选择具有边界条件的该第一洗脱溶液和第二洗脱溶液的缓冲盐浓度值。例如,这些洗脱溶液可各自具有该至少四种缓冲盐中的最低缓冲液浓度和最高缓冲液浓度。可以选择这些缓冲盐浓度值以使得最高缓冲液浓度不大于最低缓冲液浓度的约60%以上。
为该第一洗脱溶液选择的缓冲盐浓度值的一个实例可包括16mMMES、10mM BES、12mM TAPS以及10mM CAPSO。此时,最低缓冲盐浓度是10mM的BES和10mM的CAPSO,并且最高缓冲盐浓度是16mM的MES。因此,16mM MES不大于10mM BES或CAPSO的60%以上。
为该第二洗脱溶液选择的缓冲盐浓度值的一个实例可包括10mMMES、12mM BES、14mM TAPS、以及16mM CAPSO。此时,最低缓冲盐浓度是10mM的MES,并且最高缓冲盐浓度是16mM的CAPSO。因此,16mM CAPSO不大于10mMMES的60%以上。
应注意,申请人凭经验确定了提供一个线性pH梯度的缓冲液浓度组并且在此所述的多个缓冲液试剂盒实施例不应限于缓冲液浓度的这些特定组。可替代地,使用弱酸和弱碱解离常数以及标准分析方程来计算提供一个线性pH梯度的一组缓冲液浓度也是可能的。然而,此类分析是计算密集型的,并且因此一种软件程序可适用于模拟该pH特征曲线或一组特定的缓冲液浓度,例如像在美国授权前公开号2012/0239360中描述的软件程序,该公开号通过引用结合在此。
在一个实施例中,该第一洗脱溶液和该第二洗脱溶液可各自进一步包含一种单价非缓冲离子盐,例如像氯化钠、氯化钾或甲磺酸钠。该单价非缓冲离子盐仅包含具有一种单一电荷的阴离子和阳离子,该电荷是正的或负的。另外,该单价非缓冲离子盐不具有提供任何可感知的缓冲能力的弱酸或弱碱功能。例如,该第一洗脱溶液和该第二洗脱溶液可各自包含约15毫摩尔或更大的一个氯化钠浓度。申请人相信,单价非缓冲离子盐的存在促进了离子交换柱上的分离并且还允许使用更低浓度的这些缓冲盐。作为结果,可以减小这些缓冲液试剂盒中的缓冲液浓度,这提供了关于试剂成本的一个更低成本的系统并且同时提供了适用于分离蛋白质样品的线性pH梯度。此外,申请人已发现,单价非缓冲离子盐的使用倾向于增加分离柱的操作寿命,从而提供进一步的成本节约。
该第一和第二洗脱溶液可各自包含至少四种缓冲盐,其中四种缓冲盐中的至少三种是选自一种第一缓冲盐、一种第二缓冲盐、一种第三缓冲盐以及一种第四缓冲盐。该第一缓冲盐可包括2-(N-吗啉代)乙磺酸盐(MES)。该第二缓冲盐可包括N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐(BES)或者3-(N-吗啉代)丙磺酸盐(MOPS)。该第三缓冲盐可包括N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸盐(TAPS)或者N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(4-丁烷磺酸盐)(HEPBS)。该第四缓冲盐可包括3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)或2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)。应注意,使用上文所述的第一、第二、第三或第四缓冲盐的至少三种的任何组合可提供适用于产生从约pH6至约pH10的一个线性pH梯度的一种缓冲液试剂盒。此外,可以修饰上述缓冲盐,其中磺酸部分可具有各种烷基链长度,例如像乙基磺酸盐、丙基磺酸盐、丁基磺酸盐以及羟丙基磺酸盐。应注意,上述缓冲盐是示例性的并且在此所述的用于产生线性pH梯度的这些缓冲液试剂盒不应被限制为以上示例性缓冲盐。
在一个实施例中,对于该第一洗脱溶液和该第二洗脱溶液二者,可以选择该至少四种缓冲盐以使得这些缓冲盐中的一种或多种不具有上文所述的全部具体特性a)至c)。例如,每种缓冲盐在约6至约10的pH范围上可具有一个净负电荷或一个净中性电荷(特征b),但是不需要具有特征a)和c))。这些缓冲盐中的一种或多种可包括一种或多种以下特征,它们是:是一种多价缓冲液并且不包含一个磺酸基和一个胺二者。例如,这些缓冲盐之一可以是磷酸盐。磷酸盐在约6至约10的pH范围上仅带负电荷、是一种多价缓冲液、并且不具有一个胺基或一个磺酸基。与在此所述的这些缓冲液试剂盒一起使用的磷酸盐可处于一元碱、二元碱和/或三元碱的形式,其中反离子是钠和/或钾。适用于在此所述的缓冲液试剂盒中使用的含有磷酸盐官能团的其他缓冲盐是焦磷酸盐和三聚磷酸盐。
在另一个实施例中,对于该第一洗脱溶液和该第二洗脱溶液二者,这些缓冲盐中的一种或多种可包括一种或多种以下特征,它们是:在约6至约10的pH范围上具有一个净正电荷或一个净中性电荷并且不包含磺酸基。例如,这些缓冲盐之一可以是三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。TRIS在约6至约10的pH范围上可带中性电荷抑或正电荷并且不具有一个磺酸基。出人意料的是,申请人发现,包含具有一种或多种以下特征(例如是一种多价缓冲盐、在约6至10的pH范围上带正电荷、不具有一个磺酸基或者不具有一个胺)的缓冲盐不会显著干扰该缓冲液试剂盒在该pH范围上的pH线性度,只要包含各自具有以下特性的至少三种缓冲盐即可,这些特性是:a)这些缓冲盐是单价缓冲盐,b)在约6至约10的pH范围上具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷,以及c)包含一个磺酸基和一个胺。因此,将TRIS或磷酸盐用作在此所述的缓冲液试剂盒中的缓冲盐之一仍可提供一个足够线性的pH梯度。
以下将描述一个与上文所述的实施例稍微不同的缓冲液试剂盒实施例。这个实施例的不同之处在于,它由四种缓冲盐和一种单价非缓冲离子盐组成并且基本上不具有任何其他添加的缓冲盐或单价非缓冲离子盐。这个缓冲液试剂盒包含一种第一洗脱溶液和一种第二洗脱溶液。该第一洗脱溶液由一种第一缓冲盐、一种第二缓冲盐、一种第三缓冲盐、一种第四缓冲盐以及氯化钠组成,其中该第一洗脱溶液具有约6的一个第一pH和大于约25毫摩尔的总缓冲盐浓度。该第二洗脱溶液由一种第一缓冲盐、一种第二缓冲盐、一种第三缓冲盐、一种第四缓冲盐以及氯化钠组成,其中该第二洗脱溶液具有约10的一个第二pH和大于约25毫摩尔的总缓冲盐浓度。对于该第一和第二洗脱溶液二者,这些缓冲盐中的每一种都是一种单价缓冲盐、具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷、并且包含一个磺酸基和一个胺。
在一种缓冲液试剂盒的另一个实施例中,可以使用三种而不是四种缓冲盐,其中线性pH范围跨越三个而不是四个pH单位。例如,该第一和第二洗脱溶液可各自包含BES、TAPS以及CAPSO,其中该线性pH梯度从约pH7跨越至约pH10。
在一种缓冲液试剂盒的又一个实施例中,可以使用至少五种而不是四种缓冲盐,其中线性pH范围跨越五个而不是四个pH单位。例如,该第一和第二洗脱溶液可各自包含一种第五缓冲盐,其中该线性pH梯度从约pH6跨越至约pH11。该第五缓冲盐可以是具有10.4的一个pKa的3-(环己基氨基)-1-丙磺酸盐(CAPS)或者具有10.7的一个pKa的4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸盐(CABS)。
现在已经描述了该缓冲液试剂盒,以下将描述用于与产生一个线性pH梯度的缓冲液试剂盒一起使用的一个色谱系统。图11示出了被配置以产生包含两种或更多种洗脱溶液的一个梯度缓冲液的一个色谱系统100的一个实施例。色谱系统100可包括一个泵102、一个进样阀112、一个色谱分离装置114、一个检测器116以及一个微处理器118。
泵102可被配置以将一种液体从一个液体源泵出并且流体连接至进样阀112。该液体可以是具有多种缓冲盐的一种洗脱溶液。该液体源可以处于含有该液体的一个容器的形式并且可以流体附接至泵102的一个输入端。泵102可被配置以在从约20PSI至约15,000PSI的压力范围下运输该液体。应注意,在此表示的压力是相对于周围压力(13.7PSI至15.2PSI)而列出的。泵102可处于高压液相色谱(HPLC)泵的形式。此外,还可以配置泵102以使得液体仅接触泵102的一个惰性部分,以防止滤去显著量的杂质。在此背景下,显著意指会干扰预期测量的杂质的量。例如,该惰性部分可由聚醚醚酮(PEEK)制成或者至少涂覆有一个PEEK衬里,该PEEK在暴露于一种液体时不会滤去显著量的离子。
此外,泵102可被配置以摄入多于一种类型的洗脱溶液。如图11所示,字母A和字母B表明两种不同类型的洗脱溶液可输入到泵102之中。泵102可包括控制输出的A(例如,第一洗脱溶液)与B(例如,第二洗脱溶液)的比例的一个比例阀。在一个实施例中,泵入的A与B的比例可都独立地随着时间变化而变化。
应注意,可以使用两种以上的溶液源来形成在此描述的线性缓冲液梯度。例如,泵102可以是具有四个摄入口的一个四元泵,该四个摄入口附接至四个分开的溶液源容器A、B、C以及D。通过将洗脱溶液的这些组分(多种缓冲盐和多种单价非缓冲离子盐)分配到两种或更多种摄入源容器中可在泵102内原位形成该第一洗脱溶液。例如,容器A可具有在pH5.6下的32mM MES、20mM BES以及30mM NaCl并且容器B可具有在pH5.6下的24mM TAPS、20mM CAPSO以及30mMNaCl。像这样,泵102可等比例混合容器A和B二者以使得该组合基本上形成具有与先前实施例一致的缓冲盐浓度的一种第一洗脱溶液。以一种相似的方式,该第二洗脱溶液也可以具有分配到两个或更多个容器中的多种缓冲盐和单价非缓冲离子盐。
以下将描述将第一和第二洗脱溶液的多个部分分配到四个容器中的另一个实施例,这四个容器各自输入该四元泵的一个摄入部分中。这个实施例提供了一个平台以使得可以快速且容易地调整这些参数以便产生所希望的线性pH梯度。例如,容器A可具有在pH5.6下的四种缓冲盐:32mM MES、20mM MOPS、24mM TAPS以及20mM CAPSO。容器B可具有在pH10.2下的20mM MES、24mM MOPS、28mM TAPS、32mM CAPSO。容器C可具有60mM NaCl。容器D可具有去离子水。在此实施例中,如果需要,那么通过容器C的比例阀可轻易地调整单价非缓冲离子盐的浓度。类似地,如果需要,那么通过容器A、B以及C的比例阀也可轻易地调整这些缓冲盐的浓度。
可使用进样阀112来将一团液体样品注入到一个洗脱液流中。该液体样品可包含多种化学成分(即,多种基质组分)和一种或多种目的分析物。样品进样阀112将典型地具有两个位置。在第一个位置中,洗脱液将简单通过进样阀112流动到色谱分离装置114中。使用者可将一种液体样品装入到在进样阀112中具有一个预定体积的一个样品环中。一旦将进样阀112切换到第二位置中,洗脱液便将流动穿过该样品环并随后将该液体样品引入到色谱分离装置114中。在一个实施例中,进样阀112可处于一个六通阀的形式。
色谱分离装置114可用于从存在于液体样品中的各种基质组分中分离一种或多种感兴趣的分析物。典型地,色谱分离装置114可处于含有一种包装的固定相的一个空心圆柱体形式。在液体样品流动穿过色谱分离装置114时,这些基质组分和目标分析物可具有用于洗脱出色谱分离装置114的一个保留时间范围。根据多种目标分析物和基质组分的特征,它们对色谱分离装置114中的固定相可具有不同的亲和力。色谱分离装置114的输出端可流体连接至检测器116,以测量液体样品的分离的化学成分的存在。适合与在此所述的这些缓冲液试剂盒一起使用的色谱分离装置114的多个实例可以是处于一种阳离子交换分离装置并且优选一种强阳离子交换分离装置的形式。在某些情形下,一种弱阳离子交换分离装置可与在此所述的这些缓冲液试剂盒一起使用。适合与在此所述的这些缓冲液试剂盒一起使用的可商购的强阳离子交换分离装置是MAbPac SCX-10(赛尔飞世尔科技公司(Thermo Scientific Dionex),美国加利福尼亚州桑尼维尔市(Sunnyvale,California,U.S.A.))、Bio Mab(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))、Protein–Pak Hi Res CM(沃特世公司(Waters Corp.),马萨诸塞州米尔德福(Milford,Massachusetts))、TSKgel CM-STAT(东曹生物科技有限公司(TosohBioscience))。
检测器116可处于以下形式:紫外可见光光谱仪、荧光光谱仪、电化学检测器、测量导热率检测器、电荷检测器、质谱仪、带电气溶胶检测器、蒸发光散射检测器、pH计、或其一个组合。一个组合检测器的一个实例可以是可从赛尔飞世尔科技公司商购的(PCM-3000,美国加利福尼亚州桑尼维尔市)具有一个下游pH计的一个紫外可见光光谱仪。关于基于一个带电障壁和两个电极的电荷检测器的详情可在美国授权前公开号20090218238中找到,该公开通过引用全部结合在此。带电气溶胶检测器使流出液流成雾状并形成可作为与分析物浓度成比例的电流而测量的带电粒子。关于带电气溶胶检测器的详情可在美国专利号6,544,484;和6,568,245中找到,这些专利通过引用全部结合在此。关于蒸发光散射检测器的详情可在美国专利号7,847,936;和7,911,609;8,089,627;以及国际专利公开号WO2010068272A1中找到,这些专利通过引用全部结合在此。
一个电子线路可包括微处理器118、一个计时器、以及一个存储器部分。微处理器118可用于控制色谱系统100的运行。微处理器118可以被整合到色谱系统100中或者可以是与色谱系统100相联通的一台个人计算机的一部分。微处理器118可被配置以与色谱系统的一个或多个组件如泵102、进样阀112以及检测器116相联通并控制它们。在一个实施例中,微处理器118可控制泵入的洗脱溶液的比例并随着时间变化来改变该比例。
应注意,使用在此所述的缓冲液试剂盒,不需要pH检测器与比例阀之间的一个反馈机构来确保在色谱图的测试时间上pH梯度是线性的。这是一个优点,其在于在不使用基于测量的pH值调整比例阀的定制软件的情况下简单地实现线性pH梯度。为了产生一个线性pH梯度,随着时间变化而改变第一洗脱液相对于第二洗脱液的比例。在一个实施例中,这种随着时间的比例变化是线性的并且仅具有一个斜率,这提供了一种使用简单的缓冲液试剂盒。还有一个优点是在于随着时间的比例变化是线性的并且不会根据一个高阶方程例如像一个多项式方程来变化。在其他情况下,当在pH检测器与比例阀之间实施一个反馈机构时,在具体时间间隔下可使用多个斜率以提供一个线性pH斜率,但是这使得缓冲液试剂盒系统变得更复杂。
现在已经描述了色谱系统,以下将描述采用一种色谱分离装置使用具有一个线性pH梯度的一种梯度洗脱液流从一种样品的多种基质组分中分离至少一种分析物的方法。该pH梯度随着时间变化的范围是从一个第一pH值至一个第二pH值。在一个实施例中,该第一pH可以是约6并且该第二pH可以是约10,其中在一个预定时间段上pH线性地变化。此预定时间段的范围可以是从约10分钟至约180分钟,范围优选是从约10分钟至约60分钟,并且范围更优选是从约10分钟至约30分钟。因此,由在此所述的缓冲液试剂盒提供的线性梯度的斜率的范围可以是从约0.04pH单位/分钟至约0.5pH单位/分钟。
该方法包括将样品注入到进样阀112中,其中该进样阀与该色谱分离装置114处于流体联通。将具有该第一pH值的该第一洗脱溶液泵入到该色谱分离装置中。该第一洗脱溶液包含一种第一缓冲盐、一种第二缓冲盐、一种第三缓冲盐以及一种第四缓冲盐。将具有该第二pH值的该第二洗脱溶液泵入到该色谱分离装置中。该第二洗脱溶液包含一种第一缓冲盐、一种第二缓冲盐、一种第三缓冲盐以及一种第四缓冲盐。对于该第一和第二洗脱溶液,该第一缓冲盐、该第二缓冲盐、该第三缓冲盐以及该第四缓冲盐可分别是MES、BES、TAPS以及CAPSO。在使用具有10微米粒径的一种柱的一个实施例中,在从约0.5mL/min至约1mL/min的流速范围下并在从约1000至约3000磅/平方英寸的压力范围下可以泵入该第一和第二洗脱溶液。
对于该第一和第二洗脱溶液,该第一缓冲盐、该第二缓冲盐、该第三缓冲盐以及该第四缓冲盐可分别是MES(pKa6.1)、BES(pKa7.1)、TAPS(pKa8.4)以及CAPSO(pKa9.6)。在多个替代实施例中,该第二缓冲盐BES可以用MOPS(pKa7.2)、磷酸盐(pKa2.15、7.2、12.38)、焦磷酸盐(pKa0.91、2.10、6.70、9.32)或者三聚磷酸盐(pKa约1、约2、2.8、6.5以及9.2)替代,并且该第三缓冲盐TAPS可以用TRIS(pKa8.1)替代。
该方法还包括随着时间变化改变所泵入的第一洗脱溶液与泵入的第二洗脱溶液的比例。在比例阀中时或者之后但是在输入到色谱分离装置中之前该泵可以将两种洗脱液混合在一起。例如,最初1分钟该比例可以是100%的该第一洗脱溶液和0%的该第二洗脱溶液。随后,接下来的30分钟该比例可以按其中该第一洗脱溶液从100%变为0%并且该第二洗脱溶液从0%变为100%的一种线性方式发生改变。可以引起一个线性pH梯度产生的一种线性的方式改变泵入的洗脱溶液的比例。随着时间变化测量并记录洗脱液的pH值,其中此数据集形成从约该第一pH值至该第二pH值的一条近似直线。在线性斜升之后,接下来的3分钟该第一洗脱溶液可维持在0%并且第二洗脱溶液可维持在100%。作为循环的最后部分,接下来的6分钟可将该第一洗脱溶液切换至100%并且可将第二洗脱溶液切换至0%以完成该循环。
在此方法的过程中,通过该色谱分离装置可以洗脱该样品。将分析物从样品中的多种基质组分中分离,并且随后在检测器处进行检测。
在此所述的这些缓冲液试剂盒被配置以提供随着时间变化的一个线性pH梯度。该线的直线度允许一种平台方法表征多种分析物并且对IEC过程几乎没有修改。在一个实施例中,在其中该第一pH值是约6并且该第二pH值是约10的一个范围上该近似直线具有大于0.97、优选大于0.98并且更优选大于0.99的一个相关系数。更接近整数的一个相关系数值代表具有一个整数值的一条完美直线的线的直线度。除了相关系数(例如,皮尔森(Pearson)相关系数并且被表示为R2)之外,还可以使用平均绝对百分比误差(MAPE)来评定该线的直线度或线性度,如方程式1所示。
(方程式1)
在线性梯度过程中,可以使用所有测量的pH值(pHmeas)和时间值(t)来产生一个线性方程式。注意,n代表在线性梯度斜升过程中进行的pH测量的次数。通过将一个时间值t输入到计算的线性方程式中可以确定计算的pH值pHcalc(t)。pHmeas与pHcalc之间的差异代表一个线性度偏差,其中这个差异可转换为一个百分比误差、一个绝对值并且随后计算为一个平均值。更接近于零的一个更低的MAPE值代表近似一条完美直线的直线度。在一个实施例中,平均绝对百分比误差可以是小于约1.5%、优选小于约1.0%并且更优选小于约0.5%,其中该第一pH值是约6并且该第二pH值是约10。
除MAPE之外,还可以计算一个平均绝对误差以评定一个线性度,如方程式2所示。
与MAPE类似,更接近于零的一个更低的MAE值代表近似一条完美直线的直线度。
还可以计算一个最大pH误差(Max pH Error)以评定一个线性度,如方程式3所示。
Max pH Error=Max|pHmeas(t)pHcalc(t)| (方程式3)
通过确定pHmeas与pHcalc之间的最大差异可以计算该最大pH误差。更接近于零的一个更低的Max pH Error值代表与一条完美直线相对应的一个直线度。
实例1
以下将描述图11中所示出的色谱系统100(UltiMate3000HPLC系统,赛尔飞世尔科技公司,美国加利福尼亚州桑尼维尔市)的装配。泵102是流速设为1mL/min并且压力设为2600PSI的一个HPLC泵(UltiMate3000生物兼容的双梯度微型泵(Biocompatible Dual-Gradient Micro Pump)DGP-3600BM,赛尔飞世尔科技公司,美国加利福尼亚州桑尼维尔市)。进样阀112(UltiMate3000自动进样器(Autosampler)WPS-3000TBFC,赛尔飞世尔科技公司,美国加利福尼亚州桑尼维尔市)被配置以具有一个10微升样品环。色谱分离装置114(MAbPacSCX-10,10μm,4x250mm,来自美国加利福尼亚州桑尼维尔市赛尔飞世尔科技公司)是适用于分离多种蛋白质并且更具体地说MAb的一种强阳离子交换柱。该强阳离子交换树脂具有10微米的一个粒子直径,并且该柱具有4mm的一个内径和250mm的一个长度。色谱系统100被配置以将色谱分离装置114加热至30℃。检测器116(UltiMate3000VWD-3400RS,赛尔飞世尔科技公司,美国加利福尼亚州桑尼维尔市)是处于一种UV-VIS分光光度计的形式并且设置为280纳米波长。在检测器116之后,安置一个pH和电导率传感器(UltiMate3000PCM-3000,赛尔飞世尔科技公司,美国加利福尼亚州桑尼维尔市)以监测洗脱液的pH。
制备该第一洗脱溶液(A)以具有在pH5.6下的以下浓度:16mM MES、10mM BES、12mM TAPS、10mM CAPSO以及30mM NaCl。制备该第二洗脱溶液(B)以具有在pH10.2下的以下浓度:10mM MES、12mM BES、14mM TAPS、16mM CAPSO以及30mM NaCl。
泵102被配置以使用一个比例的该第一洗脱溶液(A)与该第二洗脱溶液(B)来提供一个梯度流动相。该梯度被配置以提供显示在表1中的以下参数。
表1.
时间(分钟) | %A | %B |
0–1 | 100 | 0 |
1–31 | 100–0 | 0–100 |
31–34 | 0 | 100 |
34–40 | 100 | 0 |
图1是示出随时间变化所测量的pH值的图,其中该第一和第二洗脱液包含MES、BES、TAPS、CAPSO以及NaCl。在30分钟的时间段上该pH梯度从约pH6至约pH10基本上是线性的。相关系数值R2是0.9996。
将具有pI值范围是从约6至约10的若干种成分的一种蛋白质样品注入到色谱系统100中。这些成分包括多种凝集素(包括三种亚型,即凝集素-1、凝集素-2以及凝集素-3)、胰蛋白酶原、核糖核酸酶A以及细胞色素C。图2是使用此实例的缓冲液试剂盒的蛋白质样品的色谱图。对于该色谱图中的每个主峰,它们标记有成分名称、保留时间以及随着相对于UV-VIS峰的测量稍微延迟的时间测量的pH。这些峰具有一个高分辨率和高效率,显示了使用由此实例的缓冲液试剂盒产生的线性pH梯度可以有效分离具有从6至10的pI值范围的一种蛋白质样品。
实例2
以下将描述一种缓冲液试剂盒的另一个实施例的使用,其中来自实例1的缓冲液试剂盒的该第二缓冲盐BES用另一种古德缓冲液MOPS替换。此实例使用色谱系统100和与实例1所述相似的条件。制备该第一洗脱溶液(A)以具有在pH5.6下的以下浓度:16mM MES、10mM MOPS、12mM TAPS、10mM CAPSO以及30mM NaCl。制备该第二洗脱溶液(B)以具有在pH10.2下的以下浓度:10mMMES、12mM MOPS、14mM TAPS、16mM CAPSO以及30mM NaCl。泵102被配置以根据表1中的这些参数提供一个流动相梯度。图3是示出随时间变化所测量的pH值的图,其中该第一和第二洗脱液包含MES、MOPS、TAPS、CAPSO以及NaCl。在30分钟的时间段上该pH梯度从约pH6至约pH10基本上是线性的。该相关系数值R2是0.9996,这与实例1的缓冲液试剂盒相同。使用此实例的缓冲液试剂盒为实例1的蛋白质样品跑色谱图。所得色谱图与图2中的色谱图相似,显示了使用由此实例的缓冲液试剂盒产生的线性pH梯度可以有效分离具有从6至10的pI值范围的一种蛋白质样品(数据未显示)。
实例3
以下将描述一种缓冲液试剂盒的另一个实施例的使用,其中来自实例1的缓冲液试剂盒的该第三缓冲盐TAPS用另一种缓冲液TRIS替换。与TAPS不同,TRIS在约6至约10的pH范围上可带中性电荷抑或正电荷并且不具有一个磺酸基。此实例使用色谱系统100和与实例1所述相似的条件。制备该第一洗脱溶液(A)以具有在pH5.6下的以下浓度:16mM MES、10mM BES、12mM TRIS、10mMCAPSO以及30mM NaCl。制备该第二洗脱溶液(B)以具有在pH10.2下的以下浓度:10mM MES、12mM BES、14mM TRIS、16mM CAPSO以及30mM NaCl。泵102被配置以根据表1中的这些参数提供一个流动相梯度。图4是示出随时间变化所测量的pH值的图,其中该第一和第二洗脱液包含MES、BES、TRIS、CAPSO以及NaCl。在30分钟的时间段上该pH梯度从约pH6至约pH10是近似线性的。在此实例中,该pH梯度具有一个比实例1和2的pH梯度更明显的S形状。出于比较的目的,产生如图6中所示的一张图,用来比较当使用具有实例1的MES、BES、TAPS以及CAPSO的缓冲液试剂盒(箭头602)和具有此实例的MES、BES、TRIS以及CAPSO的缓冲液试剂盒(箭头604)时pH轨迹的线性度。使用TRIS的缓冲液试剂盒的相关系数值R2是0.9868,这比实例1和2的缓冲液试剂盒小。使用此实例的缓冲液试剂盒为实例1的蛋白质样品跑色谱图。尽管此实例的缓冲液试剂盒提供了一个稍微较小线性的pH梯度,但是所得色谱图与图2中的色谱图相似,这显示了使用由此实例的缓冲液试剂盒产生的线性pH梯度可以有效分离具有从6至10的pI值范围的一种蛋白质样品(数据未显示)。
实例4
以下将描述一种缓冲液试剂盒的又一个实施例的使用,其中来自实例1的缓冲液试剂盒的该第二缓冲盐BES用另一种缓冲盐磷酸盐替换。与BES不同,磷酸盐在约6至约10的pH范围上仅带负电荷、是一种多价缓冲液并且不具有一个胺基或一个磺酸基。此实例使用色谱系统100和与实例1所述相似的条件。制备该第一洗脱溶液(A)以具有在pH5.6下的以下浓度:16mM MES、10mM磷酸盐、12mM TAPS、10mM CAPSO以及30mM NaCl。制备该第二洗脱溶液(B)以具有在pH10.2下的以下浓度:10mM MES、12mM磷酸盐、14mM TAPS、16mM CAPSO以及30mM NaCl。泵102被配置以根据表1中的这些参数提供一个流动相梯度。图5是示出随时间变化所测量的pH值的图,其中该第一和第二洗脱液包含MES、磷酸盐、TAPS、CAPSO以及NaCl。在30分钟的时间段上该pH梯度从约pH6至约pH10基本上是线性的。在此实例中,该pH梯度具有一个比实例1和2的pH梯度更明显但是比实例3更小的S形状。该相关系数值R2是0.998,这与实例1和2的缓冲液试剂盒大致相同。使用此实例的缓冲液试剂盒为实例1的蛋白质样品跑色谱图。尽管此实例的缓冲液试剂盒提供了一个稍微较小线性的pH梯度,但是所得色谱图与图2中的色谱图相似,这显示了使用由此实例的缓冲液试剂盒产生的线性pH梯度可以有效分离具有从6至10的pI值范围的一种蛋白质样品(数据未显示)。
实例5
评定评估pH梯度的相对直线度的其他方法。相关系数R2不总是用于计算线性度的最可靠方法,特别是当这些数据点是平均线性时。例如,具有一个比例近似相等的正偏压和负偏压的一条S型曲线将提供接近统一的一个相关系数R2。通过使用方程式2至4计算MAE、最大pH误差、MAPE以及R2来评定实例1至4的pH梯度的相对直线度,这显示在表2中(注意:R2是使用Microsoft Excel来计算的)。
表2.
实例1和2的缓冲液试剂盒显示最低的MAPE值并且因此是最线性的。实例3显示比实例1和2大几乎5倍的一个MAPE值。实例4显示比实例1和2大约2倍的一个MAPE值。还应注意,MAE和最大pH误差的趋势近似用MAPE值进行追踪。
实例6
进行一项分析以显示多个峰的洗脱pH与这些蛋白质组分的相应pI值之间存在一个相关性。返回来参考图2,记录六个色谱峰中的的pH值以与在通过UV检测器检测该峰之时的流出液的近似pH值相对应。以相继次序列出的这六个色谱峰是凝集素-1、凝集素-2、凝集素-3、胰蛋白酶原、核糖核酸酶A以及细胞色素C的峰,它们分别具有约7.8、8.0、8.2、8.7、9.3以及10.2的基于文献的pI值。
图7是比较当使用包含图1的MES、BES、TAPS以及CAPSO的缓冲液试剂盒时随着相应pI值变化测量的六种蛋白质组分峰的pH值的图。测量的六种蛋白质组分峰的pH值显示与基于文献的pI值的一个强线性相关性。因此,在一个校准程序之后,此实例支持与在此所述的这些缓冲液试剂盒相联系的线性回归可用于基于峰保留时间和测量的pH来评估一种蛋白质组分的pI的事实。应注意,进行实例2至4的缓冲液试剂盒的多个相似实验,并且这些实验还显示这些保留时间可用于评估这些蛋白质组分的pI(数据未显示)。
实例7
研究实例1和3的缓冲液试剂盒随着时间变化的电导率特征曲线。此实例使用色谱系统100和与实例1所述相似的条件。在此实例中,还分析来自电导率检测器的数据。该电导率检测器与色谱分离装置的一个输出端处于流体接触。泵102被配置以根据表1中的这些参数提供一个流动相梯度。图8是示出使用具有实例1的MES、BES、TAPS以及CAPSO的缓冲液试剂盒(箭头802)和具有实例3的MES、BES、TRIS以及CAPSO的缓冲液试剂盒(箭头804)的随着时间变化的电导率值的图。对于实例1的缓冲液试剂盒,它显示测量的电导率值的一个近似线性的增加。与此相反,对于实例3的缓冲液试剂盒,它显示与近似不变的测量的电导率值基本上平直的一条近似线性的线。因此,用TRIS替换古德缓冲液TAPS引起了不再线性地增加的电导率特征曲线。申请人相信,除一个线性增加的pH梯度之外,一个线性增加的盐浓度梯度帮助集中并削尖色谱峰形状。申请人相信,一个近似平直的盐浓度特征曲线可允许可接受的色谱图,但是有稍微不太理想的性能。然而,申请人相信,减小的盐浓度特征曲线将通过使色谱峰形状散焦来降低性能。
实例8
以下将描述使用实例2的缓冲液试剂盒来分离包含各种电荷变体的一种异质MAb样品。此实例使用色谱系统100和与实例2所述相似的条件。泵102被配置以根据表1中的这些参数提供一个流动相梯度。图9是示出与多种电荷变体相对应的多个峰的色谱图,其中该色谱图轨迹由导向线902表示。此外,图9示出了由导向线904表示的随时间变化的线性pH特征曲线。总之,实例2的缓冲液试剂盒提供了足以提供一种异质MAb样品的优异分离和表征的一个线性pH梯度。
实例9
以下将说明具有高直线度的一个线性pH梯度的多个优点之一,这允许产生高分辨率色谱图。返回来参考图9,洗脱出色谱分离装置的最大峰群是在约pH6.7至7.9下,而相对小的峰数目是在小于pH6.7和大于7.9下。使用实例1的缓冲液试剂盒可以实现具有一个更窄pH范围的一个随后更高分辨率色谱图。通过如表3所示地简单地减小每单位时间的pH变化率可以增加色谱图的分辨率。
表3.
时间(分钟) | %A | %B |
0–1 | 75 | 25 |
1–31 | 75–50 | 25–50 |
31–34 | 50 | 50 |
34–40 | 75 | 25 |
不是在30分钟时间间隔上将pH改变4个单位,而是在相同时间间隔上将pH单位改变约1.2个单位。因为实例1的缓冲液试剂盒具有一个高线性度,所以随着时间变化的更低pH变化率也将具有一个高线性度以允许缓冲液试剂盒成为一种成比例且可扩展的平台方法。图10是示出了与图9中的多个带电变体的一部分相对应的多个峰但具有更高分辨率(即增加多个峰之间的间距)的色谱图。该色谱轨迹由一条导向线1002表示,并且该线性pH轨迹由一条导向线1004表示。因此,不仅实例2的缓冲液试剂盒提供了足以提供一种异质MAb样品的优异分离的一个线性pH梯度,而且它能够通过仅仅减小随着时间变化的pH变化率来提供一个更高的分辨率分离。
虽然在此已经显示并描述了本发明的多个优选实施例,但是本领域技术人员将清楚这些实施例是仅通过实例的方式来提供的。对于本领域技术人员目前将发生很多变化、改变和替代而不背离本发明。虽然已经根据多个具体变化和说明性附图来描述本发明,但是本领域技术人员将认识到本发明并不限于这些变化或所述附图。此外,在上文描述的多种方法和步骤表明以特定顺序发生某些事件时,本领域技术人员将认识到可以修改某些步骤的顺序并且这些修改是根据本发明的变化来进行的。另外,可能时可以在一个平行过程中同时进行以及如上文所述地依次进行这些步骤中的某些。因此,在本发明存在处于本披露的精神内或者等同于权利要求书中找到的这些发明的多种变化的程度上,意图是此专利也将覆盖那些变化。
Claims (41)
1.一种缓冲液试剂盒,包含:
a)包含至少四种缓冲盐的一种第一洗脱溶液,其中该四种缓冲盐中的至少三种是:
一种单价缓冲盐、
在6至10的一个pH范围上具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷、并且
包含一个磺酸基和一个胺,
其中该第一洗脱溶液具有6的一个第一pH和大于25毫摩尔的总缓冲盐浓度;
b)包含至少四种缓冲盐的一种第二洗脱溶液,其中该四种缓冲盐中的至少三种是:
一种单价缓冲盐、
在6至10的一个pH范围上具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷、并且
包含一个磺酸基和一个胺,
其中该第二洗脱溶液具有10的一个第二pH和大于25毫摩尔的总缓冲盐浓度;
由此该缓冲液试剂盒基于时间和pH值的函数提供了一个线性pH梯度,该线性pH梯度针对至少pH 6至pH 10的pH范围形成一条近似直线。
2.如权利要求1所述的缓冲液试剂盒,其中该第一洗脱溶液和该第二洗脱溶液各自进一步包含选自下组的单价非缓冲离子盐,该组由以下各项组成:氯化钠、氯化钾、甲磺酸钠、以及其组合。
3.如权利要求2所述的缓冲液试剂盒,其中该单价非缓冲离子盐具有15毫摩尔或更大的一个浓度。
4.如权利要求1所述的缓冲液试剂盒,其中对于该第一洗脱溶液,该至少四种缓冲盐中的最高缓冲液浓度不大于该至少四种缓冲盐中的最低缓冲液浓度的60%以上。
5.如权利要求1所述的缓冲液试剂盒,其中对于该第二洗脱溶液,该至少 四种缓冲盐中的最高缓冲液浓度不大于该至少四种缓冲盐中的最低缓冲液浓度的60%以上。
6.如权利要求1所述的缓冲液试剂盒,其中该第一洗脱溶液的该四种缓冲盐包含:
包括2-(N-吗啉代)乙磺酸盐(MES)的一种第一缓冲盐,
包括3-(N-吗啉代)丙磺酸盐(MOPS)的一种第二缓冲盐,
包括(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷-1-磺酸盐(TAPS)的一种第三缓冲盐,以及
包括3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)的一种第四缓冲盐。
7.如权利要求1所述的缓冲液试剂盒,其中该第一洗脱溶液的该四种缓冲盐包含:
包括2-(N-吗啉代)乙磺酸盐(MES)的一种第一缓冲盐,
包括N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐(BES)的一种第二缓冲盐,
包括(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷-1-磺酸盐(TAPS)的一种第三缓冲盐,以及
包括3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)的一种第四缓冲盐。
8.如权利要求1所述的缓冲液试剂盒,其中该第二洗脱溶液的该四种缓冲盐包含:
包括2-(N-吗啉代)乙磺酸盐(MES)的一种第一缓冲盐,
包括3-(N-吗啉代)丙磺酸盐(MOPS)的一种第二缓冲盐,
包括(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷-1-磺酸盐(TAPS)的一种第三缓冲盐,以及
包括3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)的一种第四缓冲盐。
9.如权利要求1所述的缓冲液试剂盒,其中该第二洗脱溶液的该四种缓冲盐包含:
包括2-(N-吗啉代)乙磺酸盐(MES)的一种第一缓冲盐,
包括N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐(BES)的一种第二缓冲盐,
包括(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷-1-磺酸盐(TAPS)的一种第三缓冲盐, 以及
包括3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)的一种第四缓冲盐。
10.如权利要求1所述的缓冲液试剂盒,其中所述第一洗脱溶液和第二洗脱溶液各自的至少四种缓冲盐在6至10的一个pH范围上各自具有一个净负电荷或一个净中性电荷。
11.如权利要求1所述的缓冲液试剂盒,其中所述第一洗脱溶液和第二洗脱溶液各自的至少四种缓冲盐之一是选自下组,该组由以下各项组成:三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)和磷酸盐。
12.如权利要求1所述的缓冲液试剂盒,其中该第一洗脱溶液和第二洗脱溶液的该至少四种缓冲盐各自包含具有一个第一pKa的一种第一缓冲盐、具有一个第二pKa的一种第二缓冲盐、具有一个第三pKa的一种第三缓冲盐以及具有一个第四pKa的一种第四缓冲盐,其中该第一pKa是这四个pKa值中最小的并且该第四pKa是这四个pKa值中最大的,并且该第一pKa与该第一pH值相同并且该第四pKa与该第二pH值相同,其中该至少四种缓冲盐在该第二pKa与该第一pKa之间具有小于1.5的一个第一差异、在该第三pKa与该第二pKa之间具有小于1.5的一个第二差异、并且在该第三pKa与该第四pKa之间具有小于1.5的一个第三差异。
13.如权利要求1所述的缓冲液试剂盒,其中针对pH 6至pH 10的该pH范围的该直线具有大于0.97的一个相关系数。
14.如权利要求1所述的缓冲液试剂盒,其中针对pH 6至pH 10的该pH范围的该直线具有小于1.4%的一个平均绝对百分比误差。
15.如权利要求1所述的缓冲液试剂盒,其中该胺是处于质子化铵形式。
16.一种采用一种色谱分离装置使用具有随着时间变化从一个第一pH值至一个第二pH值的线性pH梯度的一种梯度洗脱液流来从一种样品的基质组分中分离至少一种分析物的方法,该方法包括:
将该样品注入到一个进样阀中,该进样阀与该色谱分离装置处于流体联 通;
将具有该第一pH值的一种第一洗脱溶液泵入到该色谱分离装置中,该第一洗脱溶液包含:一种第一缓冲盐、一种第二缓冲盐、一种第三缓冲盐以及一种第四缓冲盐,其中所述第一洗脱溶液中的所述四种缓冲盐中的至少三种是:
一种单价缓冲盐、在6至10的一个pH范围上具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷、并且包含一个磺酸基和一个胺;
将具有该第二pH值的一种第二洗脱溶液泵入到该色谱分离装置中,该第二洗脱溶液包含:一种第一缓冲盐、一种第二缓冲盐、一种第三缓冲盐以及一种第四缓冲盐,其中所述第二洗脱溶液中的所述四种缓冲盐中的至少三种是:
一种单价缓冲盐、在6至10的一个pH范围上具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷、并且包含一个磺酸基和一个胺,
对于该第一和第二洗脱溶液二者,该第一缓冲盐具有一个第一pKa,该第二缓冲盐具有一个第二pKa,该第三缓冲盐具有一个第三pKa,并且该第四缓冲盐具有一个第四pKa,其中该第一pKa是这四个pKa值中最小的并且该第四pKa是这四个pKa值中最大的,并且该第一pKa与该第一pH值相同并且该第四pKa与该第二pH值相同,
在该第二pKa与该第一pKa之间的一个第一差异是小于1.5,在该第三pKa与该第二pKa之间的一个第二差异是小于1.5,并且在该第三pKa与该第四pKa之间的一个第三差异是小于1.5;
随着时间变化改变所泵入的第一洗脱溶液与所泵入的第二洗脱溶液的比例;
基于时间和pH值的函数产生一个线性pH梯度,该线性pH梯度形成从该第一pH值至该第二pH值的一条近似直线;
通过该色谱分离装置来洗脱该样品;
从该样品的多种基质组分中分离该分析物;并且
在一个检测器上检测该分析物。
17.如权利要求16所述的方法,其中该线性pH梯度是具有大于0.97的一个相关系数的一条近似直线,其中该第一pH值是6并且该第二pH值是10。
18.如权利要求16所述的方法,其中该线性pH梯度是具有小于1.4%的一个平均绝对百分比误差的一条近似直线,其中该第一pH值是6并且该第二pH值是 10。
19.如权利要求16所述的方法,进一步包括:
在与产生该线性pH梯度的该步骤的同时产生一个线性电导率梯度,其中所产生的线性pH梯度具有随着时间变化而增加的pH值并且所产生的线性电导率梯度具有随着时间变化而增加的电导率值。
20.如权利要求16所述的方法,其中该色谱分离装置包含一种阳离子交换树脂,其中用于该第一和第二洗脱溶液的这些缓冲盐中的每一种都不结合该阳离子交换树脂。
21.如权利要求16所述的方法,其中该分析物包含一种抗体。
22.如权利要求16所述的方法,其中在该色谱分离装置中形成所产生的线性pH梯度。
23.如权利要求16所述的方法,其中所述第一洗脱溶液和第二洗脱溶液中的第一缓冲盐包括2-(N-吗啉代)乙磺酸盐(MES)。
24.如权利要求16所述的方法,其中所述第一洗脱溶液和第二洗脱溶液中的第二缓冲盐选自下组,该组由以下各项组成:2-[双(2-羟乙基)氨基]乙磺酸盐(BES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸盐(MOPS)以及磷酸盐。
25.如权利要求16所述的方法,其中所述第一洗脱溶液和第二洗脱溶液中的第三缓冲盐选自下组,该组由以下各项组成:N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸盐(TAPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁烷磺酸盐)(HEPBS)、以及三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
26.如权利要求16所述的方法,其中所述第一洗脱溶液和第二洗脱溶液中的第四缓冲盐选自下组,该组由以下各项组成:3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)和2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)。
27.如权利要求16所述的方法,其中该第一洗脱溶液和该第二洗脱溶液各自进一步包含选自下组的单价非缓冲离子盐,该组由以下各项组成:氯化钠、氯化钾、甲磺酸钠、以及其组合。
28.如权利要求16所述的方法,其中该第一pH值是6并且该第二pH值是10。
29.如权利要求16所述的方法,其中该第一和第二洗脱溶液各自具有大于25毫摩尔的总缓冲盐浓度。
30.如权利要求27所述的方法,其中该单价非缓冲离子盐具有15毫摩尔或更大的一个浓度。
31.如权利要求16所述的方法,其中对于该第一洗脱溶液,该四种缓冲盐中的最高缓冲液浓度不大于该四种缓冲盐中的最低缓冲液浓度的60%以上。
32.如权利要求16所述的方法,其中对于该第二洗脱溶液,该四种缓冲盐中的最高缓冲液浓度不大于该四种缓冲盐中的最低缓冲液浓度的60%以上。
33.如权利要求16所述的方法,进一步包括:
在将该第一洗脱溶液和该第二洗脱溶液泵入到该色谱分离装置中之前,将该第一洗脱溶液和该第二洗脱溶液混合在一起。
34.如权利要求16所述的方法,进一步包括:
将两种或更多种溶液源输入到一个泵中,其中该两种或更多种溶液源一起的一个组合包含:该第一洗脱溶液的该第一缓冲盐、该第二缓冲盐、该第三缓冲盐、以及该第四缓冲盐;
由该两种或更多种溶液源形成该第一洗脱溶液。
35.如权利要求16所述的方法,进一步包括:
将两种或更多种溶液源输入到一个泵中,其中该两种或更多种溶液源一起的一个组合包含:该第二洗脱溶液的该第一缓冲盐、该第二缓冲盐、该第三缓冲盐、以及该第四缓冲盐; 由该两种或更多种溶液源形成该第二洗脱溶液。
36.如权利要求16所述的方法,其中这些缓冲盐中的每一种都是一种单价缓冲盐、在从该第一pH值至该第二pH值的一个pH范围上具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷、并且包含一个磺酸基和一个胺。
37.如权利要求16所述的方法,其中该胺是处于质子化铵形式。
38.一种缓冲液试剂盒,包含:
a)一种第一洗脱溶液,该第一洗脱溶液由一种第一缓冲盐、一种第二缓冲盐、一种第三缓冲盐、一种第四缓冲盐、以及一种单价非缓冲离子盐组成,其中该第一洗脱溶液具有6的一个第一pH和大于25毫摩尔的总缓冲盐浓度;以及
b)一种第二洗脱溶液,该第二洗脱溶液由一种第一缓冲盐、一种第二缓冲盐、一种第三缓冲盐、一种第四缓冲盐、以及一种单价非缓冲离子盐组成,其中该第二洗脱溶液具有10的一个第二pH和大于25毫摩尔的总缓冲盐浓度;
其中这些缓冲盐中的每一种都是:
一种单价缓冲盐、具有一个净负电荷或一个净中性两性离子电荷、并且包含一个磺酸基和一个胺。
39.如权利要求38所述的缓冲液试剂盒,其中该第一洗脱溶液和第二洗脱溶液的该四种缓冲盐各自包含具有一个第一pKa的一种第一缓冲盐、具有一个第二pKa的一种第二缓冲盐、具有一个第三pKa的一种第三缓冲盐、以及具有一个第四pKa的一种第四缓冲盐,其中该第一pKa是这四个pKa值中最小的并且该第四pKa是这四个pKa值中最大的,并且该第一pKa与该第一pH值相同并且该第四pKa与该第二pH值相同,其中该四种缓冲盐在该第二pKa与该第一pKa之间具有小于1.5的一个第一差异、在该第三pKa与该第二pKa之间具有小于1.5的一个第二差异、并且在该第三pKa与该第四pKa之间具有小于1.5的一个第三差异。
40.如权利要求38所述的缓冲液试剂盒,其中对于该第一洗脱溶液,该四种缓冲盐中的最高缓冲液浓度不大于该四种缓冲盐中的最低缓冲液浓度的60%以上。
41.如权利要求38所述的缓冲液试剂盒,其中对于该第二洗脱溶液,该四种缓冲盐中的最高缓冲液浓度不大于该四种缓冲盐中的最低缓冲液浓度的60%以上。
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