CN109096363A - 一种线性pH梯度缓冲液及其应用 - Google Patents

一种线性pH梯度缓冲液及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109096363A
CN109096363A CN201811044022.2A CN201811044022A CN109096363A CN 109096363 A CN109096363 A CN 109096363A CN 201811044022 A CN201811044022 A CN 201811044022A CN 109096363 A CN109096363 A CN 109096363A
Authority
CN
China
Prior art keywords
buffer
linear
gradient
acid
negative
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811044022.2A
Other languages
English (en)
Inventor
李国荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHANGSHU NANOMICRO BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.
Original Assignee
Suzhou Wonderful Medical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Wonderful Medical Technology Co Ltd filed Critical Suzhou Wonderful Medical Technology Co Ltd
Priority to CN201811044022.2A priority Critical patent/CN109096363A/zh
Publication of CN109096363A publication Critical patent/CN109096363A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification

Abstract

本发明公开了一种线性pH梯度缓冲液及其应用，线性pH梯度缓冲液包括第一缓冲液和第二缓冲液；第一缓冲液为pH≤3的缓冲液，其包括负一价的酸根离子；第二缓冲液为pH≥8的缓冲液，其包括负二价的酸根离子、负三价的酸根离子和正一价的阳离子；pH梯度缓冲液的应用为进行蛋白分离纯化时，以第一缓冲液和第二缓冲液的混合液作为洗脱溶液；线性pH梯度缓冲液中的第一缓冲液和第二缓冲液混合时，可以得到pH呈线性梯度变化的缓冲液，并且该溶液含有的盐远远少于盐缓冲溶液，在生产应用的时候，可以省去除盐的步骤，节约成本。

Description

一种线性pH梯度缓冲液及其应用
技术领域
本发明涉及一种线性pH梯度缓冲液及其应用，属于缓冲试剂技术领域。
背景技术
生物制药(包括以蛋白为基础的治疗药物和单克隆抗体mAbs)下游的提纯，例如蛋白的分离纯化，目前普遍采用离子交换层析法(IEC)，以盐缓冲溶液作为流动相来使药用蛋白质从潜在的污染物中分离：根据蛋白质的电荷，选取亲和填料(介质)，以盐缓冲溶液作为流动相进行离子交换，这样的下游层析方法是现在行业的主流工艺。但是，由于进行蛋白分离特别是单克隆抗体蛋白分离纯化中，亲和填料普遍使用美国General Electric公司生产的亲和填料，亲和填料纯化原理主要是根据蛋白与配基之间的特异性结合的原理，将能与蛋白特异性结合的配基交联到填料上，就可以纯化特定的蛋白，亲和填料由于选择单一，因此成本较高。并且，普通的酸碱溶液混合为在弱酸性溶液中加入弱碱，p H值从5到8.5会发生跳变，只会得到一个S形曲线，如图1所示。pH值的突然急剧上升，经常导致蛋白质和与之密切相关的电荷相近的杂质同时在IEC柱上洗脫出来，无法达到以分离为目的的生产和质量检测。同时，采用盐分离出的目标蛋白质需要除去大量的来自盐缓冲溶液中的盐成分，才能再进行下一道工序，浪费时间也增加生产成本。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种线性pH梯度缓冲液，第一缓冲液和第二缓冲液混合时，可以得到pH呈线性梯度变化的缓冲液，并且该溶液含有的盐远远少于盐缓冲溶液，在生产应用的时候，可以省去除盐的步骤，节约成本。
本发明的第二个目的在于提供上述线性pH梯度缓冲液的应用，可应用于离子交换层析法中作为洗脱液。
实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种线性pH梯度缓冲液，包括第一缓冲液和第二缓冲液；第一缓冲液为pH≤3的缓冲液，其包括负一价的酸根离子；第二缓冲液为pH≥8的缓冲液，其包括负二价的酸根离子、负三价的酸根离子和正一价的阳离子。
进一步地，负一价的酸根离子为H2PO4 -(磷酸二氢根离子)。
进一步地，负二价的酸根离子为HPO4 2-(磷酸氢根离子)；负三价的酸根离子为C5H5O5COO3-(负三价柠檬酸根离子)；正一价阳离子为Na+。
进一步地，第一缓冲液包括磷酸和柠檬酸；磷酸和柠檬酸的摩尔之比为1:(0.5-3)。
进一步地，磷酸和柠檬酸的摩尔之比为1:(1-2)。
进一步地，第二缓冲液包括磷酸氢二钠和柠檬酸三钠；磷酸氢二钠和柠檬酸三钠的摩尔之比为4:(3-5)。
进一步地，磷酸氢二钠和柠檬酸三钠的摩尔之比为4:(3-4)。
进一步地，第一缓冲液包括磷酸二氢钠和柠檬酸；磷酸二氢钠和柠檬酸的摩尔之比为(1-3):2。
进一步地，磷酸二氢钠和柠檬酸的摩尔之比为(1-2):2。
进一步地，第二缓冲液包括磷酸氢二钠和柠檬酸三钠；磷酸氢二钠和柠檬酸三钠的摩尔之比为(1-4):2。
进一步地，磷酸氢二钠和柠檬酸三钠的摩尔之比为(2-4):2。
实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种如上所述的线性pH梯度缓冲液的应用，进行蛋白分离纯化时，以第一缓冲液和第二缓冲液的混合液作为洗脱溶液。
进一步地，将第一缓冲液和第二缓冲液分别装载于两个输液器中；洗脱时，第一缓冲液和第二缓冲液分别从各自的输液器中流出，第一缓冲液流量逐渐减少，第二缓冲液的流量逐渐增加，而第一缓冲液和第二缓冲液的总流量始终恒定不变，在限定时间内，第一缓冲液流量减至0。
进一步地，第一缓冲液和第二缓冲液的总流量为0.5-9.9mL/min或1-6L/mi n。
本发明的线性pH梯度缓冲液配方设计原理如下：
第一缓冲液和第二缓冲液进行混合时，混合液产生线性的pH值的梯度变化，根据目标蛋白质和杂质具有不同的PI(等电点)，使蛋白和杂质分离，完成提纯过程。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明线性pH梯度缓冲液可以实现稳定的线性pH变化，适用于蛋白的分离纯化，克服了常规盐缓冲溶液pH不稳定而使得杂质不易分离的缺陷；
2、本发明线性pH梯度缓冲液的稳定线性pH变化范围广，适用于不同的蛋白分离过程；
3、本发明线性pH梯度缓冲液作为蛋白分离纯化的洗脱溶液，含有的盐远远少于盐缓冲溶液，在生产应用的时候，可以省去除盐的步骤，节约成本；
4、本发明线性pH梯度缓冲液应用于蛋白单克隆分离纯化中，不需使用亲和填料，可以大大降低成本。
附图说明
图1为常规的酸碱溶液混合时的pH变化图示；
图2-3为组合一使用时的pH线性梯度变化示意图；
图4-5为组合二使用时的pH线性梯度变化示意图；
图6为实施例1的层析法分离示意图；
图7为实施例2的层析法分离示意图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
一种线性pH梯度缓冲液，包括第一缓冲液和第二缓冲液；第一缓冲液为p H≤3的缓冲液，其包括负一价的酸根离子；第二缓冲液为pH≥8的缓冲液，其包括负二价的酸根离子、负三价的酸根离子和正一价的阳离子。
其中，第一缓冲液中的负一价的酸根离子为H2PO4 -(磷酸二氢根离子)，可以通过添加磷酸或者磷酸二氢钠，使得第一缓冲液中含有H2PO4 -。
其中，第二缓冲液中的负二价的酸根离子为HPO4 2-(磷酸氢根离子)，负三价的酸根离子为C5H5O5COO3-(负三价柠檬酸根离子)，正一价阳离子为Na+，可以通过添加磷酸氢二钠和柠檬酸三钠，使得第二缓冲液中含有HPO4 2-、C5H5O5COO3-和Na+。
线性pH梯度缓冲液有两种组合：
组合一：
第一缓冲液包括磷酸和柠檬酸；磷酸的摩尔浓度为20mM，柠檬酸的摩尔浓度为20-40mM；
第二缓冲液包括磷酸氢二钠和柠檬酸三钠；磷酸氢二钠的摩尔浓度为40m M；柠檬酸三钠的摩尔浓度为30-40mM；
组合一中第一缓冲液和第二缓冲液混合可以得到pH在4-8.5范围内的线性梯度变化的缓冲液。
组合二：
第一缓冲液包括磷酸二氢钠和柠檬酸；磷酸二氢钠的摩尔浓度为15-30mM；柠檬酸的摩尔浓度为30mM；
第二缓冲液包括磷酸氢二钠和柠檬酸三钠；磷酸氢二钠的摩尔浓度为15-30mM；柠檬酸三钠的摩尔浓度为15mM；
组合二中第一缓冲液和第二缓冲液混合可以得到pH在3-7范围内的线性梯度变化的缓冲液。
线性pH梯度缓冲液的应用方式：以离子交换层析法(IEC)进行蛋白分离纯化时，以第一缓冲液和第二缓冲液的混合液作为洗脱溶液。
将第一缓冲液和第二缓冲液分别装载于液相色谱分析仪的两个输液泵中；洗脱时，第一缓冲液和第二缓冲液分别从各自的输液泵中泵出，第一缓冲液流量逐渐减少至0，第二缓冲液的流量从0逐渐增加，而第一缓冲液和第二缓冲液的总流量始终恒定不变，在限定时间内，第一缓冲液流量减至0。
第一缓冲液和第二缓冲液的总流量为0.5-9.9mL/min，该总流量为实验室使用的流量；或者1-6L/min，该总流量可以进行工业化生产。
如图2-3所示为组合一应用时的pH梯度变化示意图，图2为总流量0.5mL/min，GEAKTA Pure蛋白质分离纯化系统，图3为总流量3L/min，中试设备(Supreme PharmaceuticalTechnology pilot-scale equipment)，图3中横轴为时间，约30min。
如图2所示，pH在4-8.5范围内成稳定的线性梯度变化，如图3所示，pH在4-7.8范围内成稳定的线性梯度变化。
如图4-5所示为组合二应用时的pH梯度变化示意图，图4为总流量0.5mL/min，GEAKTA Pure蛋白质分离纯化系统；图5为总流量3L/min，中试设备(Supreme PharmaceuticalTechnology pilot-scale equipment)，图5中横轴为时间，约25min。
如图4和5所示，pH在3-7范围内成稳定的线性梯度变化。
实施例1：
单克隆抗体提纯试验：
填料：Nano SP15L阳离子填料；
试剂：组合一的线性pH4-8.5梯度缓冲液：
第一缓冲液：磷酸和柠檬酸组成；磷酸的摩尔浓度为20mM；柠檬酸的摩尔浓度为40mM；
第二缓冲液：磷酸氢二钠和柠檬酸三钠组成；磷酸氢二钠的摩尔浓度为40mM；柠檬酸三钠的摩尔浓度为40mM；
将第一缓冲液和第二缓冲液分别装载于液相色谱分析仪的两个输液泵中；洗脱时，第一缓冲液和第二缓冲液分别从各自的输液泵中泵出，第一缓冲液流量从1mL/min逐渐减少至0，第二缓冲液的流量从0逐渐增加至1mL/min，而第一缓冲液和第二缓冲液的总流量始终恒定不变，第一缓冲液流量减至0。如图6所示，pH梯度缓冲液呈现pH为4-8.5的线性变化。
柱子：PP 7.7×100mm(4.65mL)
流速：1mL/min
程序
平衡：3CV 1CV＝4.65mL
上样：8mL mAb igG1(4.5mg/mL单抗液稀释5倍)
洗脱：30-100％B，10CV；(30％B pH＝4.27)
结果如图6所示，线性pH梯度配合阳离子填料，50.33min时可从单抗原液中提取单抗。
实施例2：
单抗IgG二次纯化试验：
填料：NanoGel 50sp，0.66×29cm；
试剂：组合一的线性pH梯度缓冲液：
第一缓冲液：磷酸和柠檬酸组成；磷酸的摩尔浓度为20mM；柠檬酸的摩尔浓度为40mM；
第二缓冲液：磷酸氢二钠和柠檬酸三钠组成；磷酸氢二钠的摩尔浓度为40mM；柠檬酸三钠的摩尔浓度为40mM；
将第一缓冲液和第二缓冲液分别装载于液相色谱分析仪的两个输液泵中；洗脱时，第一缓冲液和第二缓冲液分别从各自的输液泵中泵出，第一缓冲液流量从1.9mL/min逐渐减少至0，第二缓冲液的流量从0逐渐增加至1.9mL/min，而第一缓冲液和第二缓冲液的总流量始终恒定不变，第一缓冲液流量减至0。如图7所示，pH梯度缓冲液呈现pH为4.5-8.5(图中为第一缓冲液占总流量体积的30％时的图示，因此图上pH显示为4.5起始，完整的pH线性范围为4-8.5)的线性变化。
上样：IgG 1.44mg/mL,5mL,稀释到55mL，进样40mL
系统最大压力0.6MPa
总流速1.9mL/min，1CV＝9.8mL，5mins
平衡5CV，30％B
冲洗3CV，30％B
洗脱20CV，30-100％B
延时5CV，100％B。
结果如图7所示，线性pH梯度配合阳离子填料，144min时可从单抗原液中提取单抗。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种线性pH梯度缓冲液，其特征在于，包括第一缓冲液和第二缓冲液；所述第一缓冲液为pH≤3的缓冲液，其包括负一价的酸根离子；所述第二缓冲液为pH≥8的缓冲液，其包括负二价的酸根离子、负三价的酸根离子和正一价的阳离子。
2.如权利要求1所述的线性pH梯度缓冲液，其特征在于，所述负一价的酸根离子为H2PO4 -。
3.如权利要求1所述的线性pH梯度缓冲液，其特征在于，所述负二价的酸根离子为HPO4 2-；所述负三价的酸根离子为C5H5O5COO3-；所述正一价阳离子为Na+。
4.如权利要求1所述的线性pH梯度缓冲液，其特征在于，所述第一缓冲液包括磷酸和柠檬酸；所述磷酸和柠檬酸的摩尔之比为1:(0.5-3)。
5.如权利要求4所述的线性pH梯度缓冲液，其特征在于，所述第二缓冲液包括磷酸氢二钠和柠檬酸三钠；所述磷酸氢二钠和柠檬酸三钠的摩尔之比为4:(3-5)。
6.如权利要求1所述的线性pH梯度缓冲液，其特征在于，所述第一缓冲液包括磷酸二氢钠和柠檬酸；所述磷酸二氢钠和柠檬酸的摩尔之比为(1-3):2。
7.如权利要求6所述的线性pH梯度缓冲液，其特征在于，所述第二缓冲液包括磷酸氢二钠和柠檬酸三钠；所述磷酸氢二钠和柠檬酸三钠的摩尔之比为(1-4):2。
8.一种如权利要求1所述的线性pH梯度缓冲液的应用，其特征在于，进行蛋白分离纯化时，以第一缓冲液和第二缓冲液的混合液作为洗脱溶液。
9.如权利要求8所述的线性pH梯度缓冲液的应用，其特征在于，将第一缓冲液和第二缓冲液分别装载于两个输液器中；洗脱时，第一缓冲液和第二缓冲液分别从各自的输液器中流出，第一缓冲液流量逐渐减少，第二缓冲液的流量逐渐增加，而第一缓冲液和第二缓冲液的总流量始终恒定不变，在限定时间内，第一缓冲液流量减至0。
10.如权利要求9所述的线性pH梯度缓冲液的应用，其特征在于，所述第一缓冲液和第二缓冲液的总流量为0.5-9.9mL/min或1-6L/min。
CN201811044022.2A 2018-09-07 2018-09-07 一种线性pH梯度缓冲液及其应用 Pending CN109096363A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811044022.2A CN109096363A (zh) 2018-09-07 2018-09-07 一种线性pH梯度缓冲液及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811044022.2A CN109096363A (zh) 2018-09-07 2018-09-07 一种线性pH梯度缓冲液及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109096363A true CN109096363A (zh) 2018-12-28

Family

ID=64865541

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811044022.2A Pending CN109096363A (zh) 2018-09-07 2018-09-07 一种线性pH梯度缓冲液及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109096363A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111905584A (zh) * 2020-08-25 2020-11-10 苏州美极医疗科技有限公司 溶液配制系统及一体化系统

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000055203A1 (en) * 1999-03-15 2000-09-21 Novo Nordisk A/S Ion exchange chromatographic separation of glp-1 and related peptides
WO2004103519A2 (en) * 2003-05-16 2004-12-02 Cryobiophysica, Inc. External gradient chromatofocusing
CN102890516A (zh) * 2012-10-09 2013-01-23 荣捷生物工程（苏州）有限公司 可生成线性pH梯度溶液的控制系统及其方法
CN103884816A (zh) * 2012-12-21 2014-06-25 戴安公司 产生线性pH梯度的缓冲液试剂盒和方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000055203A1 (en) * 1999-03-15 2000-09-21 Novo Nordisk A/S Ion exchange chromatographic separation of glp-1 and related peptides
WO2004103519A2 (en) * 2003-05-16 2004-12-02 Cryobiophysica, Inc. External gradient chromatofocusing
CN102890516A (zh) * 2012-10-09 2013-01-23 荣捷生物工程（苏州）有限公司 可生成线性pH梯度溶液的控制系统及其方法
CN103884816A (zh) * 2012-12-21 2014-06-25 戴安公司 产生线性pH梯度的缓冲液试剂盒和方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SONJA SCHNEIDER: "Protein Separation with pH Gradients Using Composite Buffer Systems Calculated by the Agilent Buffer Advisor Software", 《AGILENT TECHNOLOGIES》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111905584A (zh) * 2020-08-25 2020-11-10 苏州美极医疗科技有限公司 溶液配制系统及一体化系统

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10919930B2 (en) Enhanced purification of antibodies and antibody fragments by apatite chromatography
CN105777896B (zh) 一种抗体酸性峰的纯化方法
US11965018B2 (en) Chromatography system and method for capturing a biopolymer
CN102762585B (zh) 单一单元抗体纯化
EP3004163B1 (en) Method for purifying antibody
US20100069617A1 (en) Enhanced protein aggregate removal by mixed mode chromatography on hydrophobic interaction media in the presence of protein-excluded zwitterions
CN106574934B (zh) 分析装置以及分析方法
US20210080434A1 (en) Chromatography System with Guard Columns
CN110272491A (zh) 一种抗pd-1抗体的纯化工艺
CN107849122A (zh) 用低电导率洗涤缓冲液进行亲和层析纯化
CN105777895A (zh) 苯丁酸钠在抗体酸性峰纯化中的应用
St. Amand et al. Development of at‐line assay to monitor charge variants of MAbs during production
CN113416243B (zh) 一种纯化抗体的方法
Abaye et al. Strong anion exchange liquid chromatographic separation of protein amino acids for natural 13C‐abundance determination by isotope ratio mass spectrometry
KR20200121802A (ko) 표적물질을 포함하는 액체를 처리하기 위한 장치
CN109096363A (zh) 一种线性pH梯度缓冲液及其应用
CN104437408A (zh) 黄曲霉毒素b1免疫亲和柱的制备方法及其应用
WO2020010004A1 (en) Use of multiple hydrophobic interaction chromatography for preparing a polypeptide from a mixture
US20210109107A1 (en) Methods for characterizing host-cell proteins
CN108548876A (zh) 一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法
JP2014142258A (ja) アミノ酸分析法およびアミノ酸分析装置
WO2021021260A1 (en) Method for viral inactivation
CN108350026A (zh) 离子交换色谱法中改进的蛋白质分离
CN103619868A (zh) 单一单元色谱抗体纯化
CN104558155B (zh) 从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20211210

Address after: 215000 No. 8, Haiwang Road, new material industrial park, Haiyu Town, Changshu City, Suzhou City, Jiangsu Province

Applicant after: CHANGSHU NANOMICRO BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

Address before: 215000 second floor, administration building, No. 2, Jiujiang Road, Shengpu, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province

Applicant before: SUZHOU MEIJI MEDICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181228