CN104558155B - 从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于蛋白纯化技术领域，提供了一种从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法。该方法包括下述步骤：取血浆，使用阴离子交换柱对其进行第一次层析纯化处理，获得PA‑RBP复合物初体；使用疏水柱对所述PA‑RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理，得到纯化后的PA‑RBP复合物；将所述纯化后的PA‑RBP复合物进行解离处理，得到含有PA和RBP的混合样品；使用疏水柱对将所述混合样品进行第三次层析纯化处理，分离得到PA和RBP。
Description
技术领域
本发明属于蛋白纯化技术领域，尤其涉及从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法。
背景技术
前白蛋白(Prealbumin,PA)由肝细胞合成，又称转甲状腺素蛋白(transthyretin)，分子量54KD，它是一种运载蛋白，它能结合甲状腺素T4与T3，PA与视黄醇结合蛋白形成的复合物，具有运载维生素A的作用。前白蛋白在人血液中正常含量约300mg/L，其半衰期很短，仅约1.9天。因此，测定其在血浆中的浓度对于了解蛋白质的营养不良、肝功能不全、比之白蛋白和转铁蛋白具有更高的敏感性。除了作为一种灵敏的营养蛋白质指标，PA在急性炎症、恶性肿瘤、肝硬化或肾炎时其血浓度下降。
视黄醇结合蛋白(Retinol binding protein,RBP)主要由肝细胞合成，分子量21KD，是一种低分子量的亲脂载体蛋白。RBP广泛分布于人体血清、脑脊液、尿液及其他体液中。在血液中，视黄醇结合蛋白与视黄醇、前白蛋白以复合物形式存在，转运视黄醇至机体组织，当RBP与细胞表面的RBP受体结合，视黄醇进入细胞内，复合体解体，游离的RBP从肾小球滤出，其中绝大部分被近端肾小管上皮细胞重吸收，并被分解成氨基酸，供组织利用，仅有少量从尿中排出。当肾脏疾患或感染等导致肾小管重吸收功能障碍时，尿中RBP浓度升高，血清RBP浓度下降。因此尿中RBP测定是诊断早期肾小管损伤的敏感指标。由于其具有半衰期短的特点，RBP还可特异地反映机体的营养状态，因此也是一项诊断早期营养不良的敏感指标。
由于前白蛋白与视黄醇结合蛋白在疾病诊断中的应用，开发高效的纯化方案具有显著的现实意义和应用价值。现有报道的相关纯化技术方法，仅能够纯化前白蛋白或视黄醇结合蛋白其中一种蛋白，见胡大荣等著“人血浆前白蛋白的纯化及其抗血清制备”(《解放军医学杂志》1986年05期)；赵霞等著“人血浆前白蛋白的分离和纯化”(《上海第二医科大学学报》1995年03期)；金宏等发表的“视黄醇结合蛋白的分离纯化及其抗血清的制备”(《生物化学与生物物理进展》1993年06期)。上述方法均不能实现从血浆中同时纯化PA和RBP的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，旨在解决现有技术不能从血浆中同时纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的问题。
本发明是这样实现的，一种从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，包括下述步骤：
取血浆，使用阴离子交换柱对其进行第一次层析纯化处理，获得PA-RBP复合物初体；
使用疏水柱对所述PA-RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理，得到纯化后的PA-RBP复合物；
将所述纯化后的PA-RBP复合物进行解离处理，得到含有PA和RBP的混合样品；
使用疏水柱对将所述混合样品进行第三次层析纯化处理，分离得到PA和RBP。
本发明提供的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，基于血浆中PA与RBP以复合物形式存在的特点，并根据PA-RBP复合物及其组成部分PA和RBP表面电荷或疏水性的差异，采取柱层析技术，可以获得高纯度的PA和RBP，从而同时实现了对两种蛋白质的纯化，该方法不仅简单可行，还是一种一举两得的高效技术方法。
附图说明
图1是本发明实施例第一次层析纯化处理的UV280nm层析图谱和溶液电导率曲线图；
图2是本发明实施例第二次层析纯化处理的UV280nm层析图谱和溶液电导率曲线图；
图3是本发明实施例第三次层析纯化处理的UV280nm层析图谱和溶液电导率曲线图；
图4是本发明实施例所述方法中各步纯化样品的SDS-PAGE蛋白电泳检测图谱。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例基于血浆中PA及RBP以复合物的形式存在，并根据PA-RBP复合物组成特点、研究其组成部分PA和RBP表面电荷或疏水性的差异，进而研发了一种基于层析技术手段、可同时纯化制备此两种蛋白质的技术方法。本发明实施例是通过下述技术方案实现：
一种从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，包括下述步骤：
S01.取血浆，使用阴离子交换柱对其进行第一次层析纯化处理，获得PA-RBP复合物初体；
S02.使用疏水柱对所述PA-RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理，得到纯化后的PA-RBP复合物；
S03.将所述纯化后的PA-RBP复合物进行解离处理，得到含有PA和RBP的混合样品；
S04.使用疏水柱对将所述混合样品进行第三次层析纯化处理，分离得到PA和RBP。
上述步骤S01中，所述血浆不受限制，可取自人类或其他动物的血浆，如鼠血浆、猴血浆等。本发明实施例PA-RBP复合物，不同类型的柱色谱也许都能在一定程度上实现PA-RBP复合物的分离，然而，对于产业化生产而言，成本的控制至为重要，而生产效率的提高是降低生产成本的重要因素。因此，在保证分离效果的前提下，尽可能的提高所述PA-RBP复合物中PA和RBP的纯化效率，是本领域技术人员所要研究的重点、也是难点。发明人基于柱层析技术，寻找可用于分离血浆PA-RBP复合物的离子色谱填料。本申请发明人基于所述PA-RBP复合物的组成对其电荷特点进行分析：本发明实施例所述PA分子单体由147个氨基酸组成，其中，包括18个带负电荷的氨基酸和13个带正电荷的氨基酸，完整的4聚体PA分子等电点为4.7，在pH中性溶液中带负电荷；而所述RBP分子单体由135个氨基酸组成，其中，包括25个带负电荷的氨基酸和19个带正电荷的氨基酸，所述RBP分子等电点为4.4，在pH中性溶液中带负电荷；所述PA-RBP复合物经软件预测等电点为4.5，在中性溶液中也携带较多的负电荷。有鉴于此，发明人基于所述PA-RBP复合物的电荷性，对填料选择进行了反复研究。经研究发现，采用阴离子交换填料与所述PA-RBP复合物结合，所述PA-RBP复合物吸附在阴离子交换填料表面，进而进行柱洗脱，能获得较好的初提效果。本发明实施例基于PA-RBP复合物表面电荷特性，优选使用阴离子交换填料UNOsphere Q对血浆中进行第一次层析纯化处理，初步分离获得PA-RBP复合物初体。
柱层析技术中，上样物质与填料的用量比对色谱效果的影响很大。本发明实施例中，为了提高色谱效果、进而获得纯度较高的PA-RBP复合物初体，同时节约填料成本，在使用离子交换层析柱对血浆进行第一次层析纯化处理的步骤中，所述阴离子交换柱的填料和所述样品的体积比为1:(1-1.2)。作为进一步优选实施例，所述阴离子交换柱的填料和所述样品的体积比为1:1。
在进行第一次层析纯化处理上样之前，需要对所述血浆进行前处理，具体的，所述前处理的方法为：先采用缓冲溶液调整所述血浆，一方面，使得血浆与缓冲溶液充分结合，形成血浆体系；另一方面，采用缓冲溶液调整所述血浆的PH，防止柱色谱过程中，由于血浆样品与洗脱体系不一致导致的溶液扩散、进而影响色谱带扩散造成色谱效果不好的现象；将上述调整后的血浆进行离心处理后取上清液备用。作为具体实施例，当使用阴离子交换填料UNOsphere Q对血浆进行第一次层析纯化处理时，采用1M的Tris-base溶液将所述血浆PH调整为9后进行离心处理，取上清液。
作为具体优选实施例，在所述血浆上柱前，还包括对层析柱进行柱平衡处理；在所述血浆上柱后，对血浆样品进行冲洗处理。如：当使用阴离子交换填料UNOsphere Q对血浆中进行第一次层析纯化处理时，所述柱平衡处理和所述对血浆样品进行冲洗处理均采用平衡液进行洗脱，作为优选实施例，所述平衡液为Tris-HCl浓度为20mM、NaCl浓度为150mM、且PH9.0的平衡体系。
洗脱体系是影响柱层析分离效果的重要因素。作为具体实施例，当使用阴离子交换填料UNOsphere Q对血浆中进行第一次层析纯化处理时，所述洗脱体系采用Tris-HCl浓度为20mM、NaCl浓度为500mM、且PH9.0的洗脱液。
其中，所述Tris-HCl缓冲溶液在碱性区具有较强的缓冲能力，pH缓冲范围7.1-9.0。随着溶液pH的升高，所述PA-RBP复合物表面净负电荷越多，与阴离子交换填料UNOsphere Q结合能力愈强，采用pH9.0的所述Tris-HCl缓冲溶液能尽可能增加阴离子交换填料UNOsphere Q对所述PA-RBP复合物吸附效果。高盐浓度不利于杂质蛋白的吸附，因此，在提升PA-RBP复合物与UNOsphere Q结合力之后，采用较高NaCl浓度的平衡液-如150mM的NaCl溶液，可使大多数的杂质蛋白质在上样过程中直接经层析柱流出，达到部分纯化的目的。同时，采用含有500mM NaCl的洗脱液对结合在层析柱上的所述PA-RBP复合物进行洗脱，在此浓度下与层析柱结合力较高的PA-RBP复合物被洗脱，且洗脱较为完全，同时被洗脱下来的杂质蛋白较少。该优选的洗脱液及其浓度，是一个考虑回收率和纯度的优选平衡点。进一步的，由于层析流速过快导致调料压力过大造成填料颗粒破碎、同时可能导致洗脱效果不佳；层析流速过慢，柱色谱效果虽好，但效率过低，本发明实施例中，为了平衡第一次层析纯化处理中色谱效果和效率的关系，作为优选实施例，第一次层析纯化处理所述层析流速为10-25ml/min，进一步优选为20ml/min。
本发明实施例中，使用阴离子交换柱对其进行第一次层析纯化处理，并根据紫外吸收图谱，例如280nm吸收图谱收集洗脱峰，获得PA-RBP复合物初体。
由于所述PA-RBP复合物初体为初提样品，因此，里面不可避免的含有一些杂质。为了后续分离步骤中获得纯度高的PA和RBP样品，需对所述PA-RBP复合物初体进行进一步纯化。
本发明实施例步骤S02中，发明人研究发现，利用PA-RBP复合物疏水性较高的特点，具体为所述PA-RBP复合物具有较其他蛋白质更高的疏水性特点，可寻求合适的疏水填料来对所述利用PA-RBP复合物进行进一步纯化。经过多次摸索实验，本发明实施例优选采用Phenyl sepharose FF/HS作为第二次层析纯化处理的疏水层析柱填料，进而获得纯度更高的纯化后的PA-RBP复合物。
进一步的，在进行第二次层析纯化处理上样之前，需要对所述PA-RBP复合物初体进行前处理。作为具体实施例，当使用疏水填料Phenyl sepharose FF/HS对所述PA-RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理时，先使用固体NaH2PO4调PH为6.0，然后加入固体(NH4)2SO4调整电导与下述第二次层析纯化平衡液相同，离心后取上清。采用上述前处理步骤，可以保持蛋白质样品与层析柱平衡溶液的pH和盐浓度一致，即使得样品与层析柱环境保持一致，进而提高层析柱纯化蛋白质样品的色谱效果。
作为具体优选实施例，在所述PA-RBP复合物初体上柱前，还包括对层析柱进行柱平衡处理；在所述PA-RBP复合物初体上柱后，对PA-RBP复合物初体样品进行冲洗处理。如：当使用疏水填料Phenyl sepharose FF/HS对所述PA-RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理时，所述柱平衡处理和所述对PA-RBP复合物初体样品进行冲洗处理均采用平衡液进行洗脱，作为优选实施例，所述平衡液为Na2HPO4-NaH2PO4浓度为50mM、(NH4)2SO4浓度为1.5M、且PH6.0的平衡体系。
所述第二次层析纯化处理的洗脱体系是影响所述纯化后的PA-RBP复合物纯度高低的重要因素。作为具体实施例，当使用疏水填料Phenyl sepharose FF/HS对所述PA-RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理时，所述洗脱体系采用Na2HPO4-NaH2PO4浓度为50mM、(NH4)2SO4浓度为0.5M、且PH6.0的洗脱液。该优选的该洗脱条件，可以除去绝大多数的杂质蛋白，而使所述目的PA-RBP复合物得到充分的回收，如附图4所示，经过第二次层析纯化处理后，在电泳泳道5中仅残留少量的高分子量杂质蛋白。进一步的，由于层析流速过快导致调料压力过大造成填料颗粒破碎、同时可能导致洗脱效果不佳；层析流速过慢，柱色谱效果虽好，但效率过低，本发明实施例中，为了平衡第一次层析纯化处理中色谱效果和效率的关系，作为优选实施例，第二次层析纯化处理所述层析流速为1.3-3ml/min，进一步优选为2.5ml/min。
本发明实施例中，使用疏水交换柱对其进行第二次层析纯化处理，并根据紫外吸收图谱，例如280nm吸收图谱收集洗脱峰，获得纯化后的PA-RBP复合物。
上述步骤S03中，为了分别获得高纯度的PA和RBP，需要对上述PA-RBP复合物中的PA和RBP进行解离。作为优选实施例，采用在所述纯化后的PA-RBP复合物中加入尿素的方法实现PA-RBP复合物的解离，使得所述尿素的终浓度为4-6mol/L，进一步优选为5mol/L。所述尿素对生物体的毒害作用较小，同时所述年俗对蛋白质的变形效果较温和，变形过程和使用浓度较易控制，故使用所述尿素作为优选解离试剂。为了达到更优的解离效果，解离时间优选为24h。
本发明实施例步骤S04中，由于PA表面亲水氨基酸较多、而RBP中疏水氨基酸较多，导致所述PA比所述RBP亲水性强的特点，可优选采用Phenyl sepharose FF/HS作为第三次层析纯化处理的疏水层析柱填料，来实现PA和RBP的分离。
作为具体优选实施例，在上述得到的含有PA和RBP的混合样品上柱前，还包括对层析柱进行柱平衡处理；在所述PA和RBP的混合样品上柱后，对PA和RBP的混合样品进行冲洗处理。如：当使用疏水填料Phenyl sepharose FF/HS对所述PA-RBP复合物初体进行第三次层析纯化处理时，所述柱平衡处理和所述对PA-RBP复合物初体样品进行冲洗处理均采用平衡液进行洗脱，作为优选实施例，所述平衡液为Na2HPO4-NaH2PO4浓度为50mM、(NH4)2SO4浓度为1.5M、且PH6.0的平衡体系。
所述第三次层析纯化处理的洗脱体系是影响PA和RBP纯度的重要因素。作为具体实施例，当使用疏水填料Phenyl sepharose FF/HS对所述PA-RBP复合物初体进行第三次层析纯化处理时，所述第三次层析纯化处理分别先后采用下述洗脱液A和洗脱液B作为洗脱体系，
洗脱液A：Na2HPO4-NaH2PO4浓度为50mM、(NH4)2SO4浓度为0.5M、且PH6.0；
洗脱液B：Na2HPO4-NaH2PO4浓度为50mM、且PH6.0。
在所述洗脱液A的作用下PA被从层析柱上洗脱，在所述洗脱液B中，盐浓度进一步降低，溶液的疏水性也随之降低，有利于疏水性更高、且与层析柱结合更牢固的所述RBP在此条件下被从层析柱上洗脱下来。进一步的，由于层析流速过快导致调料压力过大造成填料颗粒破碎、同时可能导致洗脱效果不佳；层析流速过慢，柱色谱效果虽好，但效率过低，本发明实施例中，为了平衡第一次层析纯化处理中色谱效果和效率的关系，作为优选实施例，第三次层析纯化处理所述层析流速为1.3-3ml/min，进一步优选为2.5ml/min。
本发明实施例中，使用疏水交换柱对其进行第三次层析纯化处理，先后分别使用洗脱液A和洗脱液B来作为PA和RBP的洗脱液，并根据紫外吸收图谱，例如280nm吸收图谱收集得到PA和RBP的洗脱峰。
本发明实施例提供的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，基于人血浆中PA与RBP以复合物形式存在的特点，并根据PA-RBP复合物及其组成部分PA和RBP表面电荷或疏水性的差异，采取柱层析技术，可以获得高纯度的PA和RBP，从而同时实现了对两种蛋白质的纯化，该方法不仅简单可行，而且可以同时从血浆中获得PA和RBP两种纯化蛋白质，不仅提高了原材料血浆的利用率，而且节省了原材料成本同时降低了劳动强度，是一种一举两得的高效技术方法。
下面结合具体实施例进行说明。
一种从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，包括下述步骤：
S11.第一次层析纯化处理：取人血浆400ml，使用1M Tris-base调整PH为9.0，6000g离心10min后取上清备用；使用UNOsphere Q(Bio-rad)填料阴离子交换柱对其进行第一次层析纯化处理，获得PA-RBP复合物初体。其中，层析柱直径为2cm，装填高度为9.5cm，装填最大线性流速为800cm/H。层析步骤如下：
S111.柱平衡；采用Tris-HCl浓度为20mM、NaCl浓度为150mM、且PH9.0的平衡液平衡UNOsphere Q(Bio-rad)填料阴离子交换柱；
S112.样品上柱；按样品体积与填料体积为1:1的比例，将上述血浆上清液上柱处理；
S113.冲洗未结合血浆；使用上述平衡液对血浆上清液样品进行洗脱，冲洗未结合的血浆；
S114.目的产物洗脱：使用Tris-HCl浓度为20mM、NaCl浓度为500mM、且PH9.0的洗脱体系进行洗脱，层析流速为20ml/min，UV280nm条件下监视采集吸收峰，获得PA-RBP复合物初体。
第一次层析纯化处理的UV280nm层析图谱和溶液电导率曲线如附图1所示。
S12.第二次层析纯化处理：将上述PA-RBP复合物初体使用固体NaH2PO4调PH为6.0，加入固体(NH4)2SO4调整电导与平衡液相同，6000g离心10min，取上清备用；使用Phenylsepharose FF/HS填料疏水柱对所述PA-RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理，得到纯化后的PA-RBP复合物。其中，层析柱直径为1.6cm；装填高度为11cm；装填最大线性流速为300cm/H。层析步骤如下：
S121.柱平衡；采用Na2HPO4-NaH2PO4浓度为50mM、(NH4)2SO4浓度为1.5M、且PH6.0的平衡液平衡Phenyl sepharose FF/HS填料疏水柱；
S122.样品上柱；将上述PA-RBP复合物初体上清液上柱处理；
S123.冲洗未结合血浆；使用上述平衡液对PA-RBP复合物初体样品进行洗脱，冲洗未结合的血浆；
S124.目的产物洗脱：使用Na2HPO4-NaH2PO4浓度为50mM、(NH4)2SO4浓度为0.5M、且PH6.0的洗脱体系进行洗脱，层析流速为2.5ml/min，UV280nm条件下监视采集吸收峰，获得纯化后的PA-RBP复合物。
第二次层析纯化处理的UV280nm层析图谱和溶液电导率曲线如附图2所示。
S13.PA-RBP复合物的解离：将所述纯化后的PA-RBP复合物加入固体(NH4)2SO4调整电导率与平衡液相同，加入固体尿素进行解离处理，使得尿素的终浓度为5M，处理过夜，得到含有PA和RBP的混合样品。
S14.第三次层析纯化处理：使用Phenyl sepharose FF/HS填料疏水柱对所述含有PA和RBP的混合样品进行第三次层析纯化处理，分离得到PA和RBP。其中，层析柱直径为1.6cm；装填高度为11cm；装填最大线性流速为300cm/H。层析步骤如下：
S141.柱平衡；采用Na2HPO4-NaH2PO4浓度为50mM、(NH4)2SO4浓度为1.5M、且PH6.0的平衡液平衡Phenyl sepharose FF/HS填料疏水柱；
S142.样品上柱；将上述含有PA和RBP的混合样品上柱处理；
S143.冲洗未结合血浆；使用上述平衡液对上述含有PA和RBP的混合样品进行洗脱，冲洗未结合的血浆；
S144.目的产物洗脱：分别先后采用下述洗脱液A和洗脱液B作为洗脱体系，
洗脱液A：Na2HPO4-NaH2PO4浓度为50mM、(NH4)2SO4浓度为0.5M、且PH6.0；
洗脱液B：Na2HPO4-NaH2PO4浓度为50mM、且PH6.0；层析流速为2.5ml/min，UV280nm条件下监视采集吸收峰，获得PA和RBP单体。
第三次层析纯化处理的UV280nm层析图谱和溶液电导率曲线如附图3所示。
图4是本发明实施例所述方法中各步纯化样品的SDS-PAGE蛋白电泳检测图谱，其中M为蛋白质分子量标准(100KD、70KD、55KD、35KD、25KD、15KD)；1代表人血浆；2代表UNOsphere Q离子交换层析柱流穿样品；3/4代表UNOsphere Q离子交换层析先后获得的洗脱峰样品；5代表使用疏水层析柱进行第二次层析纯化处理获得的纯化后的PA-RBP复合物；6代表使用疏水层析柱进行第三次层析纯化处理，得到的PA样品(洗脱峰A)；7代表使用疏水层析柱进行第三次层析纯化处理，得到的RBP样品(洗脱峰B)。
说明：本发明中，所述表示浓度的M表示mol/L，mM表示mmol/L；
所述UNOsphere Q、所述UNOsphere Q(Bio-rad)和所述sepharose FF/HS，均表示色谱填料的型号。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，包括下述步骤：
取血浆，使用阴离子交换柱对其进行第一次层析纯化处理，获得PA-RBP复合物初体，所述阴离子交换柱采用UNOsphere Q填料的阴离子交换层析柱，其中，所述第一次层析纯化处理的洗脱体系采用Tris-HCl浓度为20mM、NaCl浓度为500mM、且PH9.0的洗脱液；
使用疏水柱对所述PA-RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理，得到纯化后的PA-RBP复合物，所述疏水柱采用Phenyl sepharose FF/HS填料的疏水层析柱，其中，所述第二次层析纯化处理的洗脱体系采用Na2HPO4-NaH2PO4浓度为50mM、(NH4)2SO4浓度为0.5M、且PH6.0的洗脱液；
将所述纯化后的PA-RBP复合物进行解离处理，得到含有PA和RBP的混合样品；
使用疏水柱对将所述混合样品进行第三次层析纯化处理，分离得到PA和RBP，所述疏水柱采用Phenyl sepharose FF/HS填料的疏水层析柱，其中，所述第三次层析纯化处理分别先后采用下述洗脱液A和洗脱液B作为洗脱体系，洗脱液A：Na2HPO4-NaH2PO4浓度为50mM、(NH4)2SO4浓度为0.5M、且PH6.0；洗脱液B：Na2HPO4-NaH2PO4浓度为50mM、且PH6.0；
所述第二次层析纯化处理、所述第三次层析纯化处理的层析流速为1.5-3ml/min。
2.如权利要求1所述的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，其特征在于，将所述纯化后的PA-RBP复合物进行解离处理的方法为：在所述纯化后的PA-RBP复合物中加入尿素，使得所述尿素的终浓度为4-6mol/L。
3.如权利要求1所述的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，其特征在于，在使用离子交换层析柱对血浆进行第一次层析纯化处理的步骤中，所述阴离子交换柱的填料和所述样品的体积比为1:(1-1.2)。
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| CN201510019329.7A CN104558155B (zh) | 2015-01-14 | 2015-01-14 | 从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法 |
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