CN115010801A - 一种前白蛋白的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种前白蛋白的纯化方法。本发明提供的前白蛋白的纯化方法，先从血清中获得前白蛋白粗制品，再进行阴离子交换层析去除大部分杂质蛋白，然后依次经过前白蛋白抗体亲和层析、视黄醇结合蛋白抗体亲和层析和白蛋白抗体亲和层析，获得高纯度的前白蛋白样品。
Description
技术领域
本发明属于蛋白纯化技术领域，具体涉及一种前白蛋白的纯化方法。
背景技术
前白蛋白(Prealbumin，PA)又称转甲状腺素蛋白(transthyretin)，是由肝细胞合成的一种血浆蛋白质，具有重要的生物活性。在血浆中，前白蛋白与甲状腺素结合，参与血液中甲状腺激素的运转，也能与视黄醇和视黄醇结合蛋白三者缔合成复合物，参与维生素A的运转和代谢。前白蛋白在维生素A和甲状腺素代谢，蛋白质营养不良和肝脏毒性等方面研究较为广泛。
与白蛋白和转铁蛋白相比，测定前白蛋白在血浆中的浓度，对于了解蛋白质的营养不良、肝功能不全具有更高的敏感性。现有的方法尽管能够获取前白蛋白，但是生产周期长，操作复杂，在纯化过程中会有大量前白蛋白失去活性，造成前白蛋白有效产率低，且纯度不高，特别是难以去除视黄醇结合蛋白及白蛋白。
因此，如何能够高效制备满足需要的前白蛋白成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种前白蛋白的纯化方法，获得高纯度的前白蛋白，并且有效去除视黄醇结合蛋白及白蛋白的干扰。
为达此目的，本发明提供了一种前白蛋白的纯化方法。所述纯化方法包括如下步骤：
从血清中获得前白蛋白粗制品；
将所述前白蛋白粗制品进行阴离子交换层析，收集第一洗脱液；
将收集的第一洗脱液进行前白蛋白抗体亲和层析，收集第二洗脱液；
将收集的第二洗脱液进行视黄醇结合蛋白抗体亲和层析，收集第一穿透液；
将收集的第一穿透液进行白蛋白抗体亲和层析，收集第二穿透液。
由于抗原抗体的结合强度强于前白蛋白与视黄醇结合蛋白之间的结合强度，因此，主要在视黄醇结合蛋白抗体亲和层析过程中，前白蛋白与视黄醇结合蛋白形成的复合物发生解离，释放出前白蛋白。
在一些实施方式中，所述从血清中获得前白蛋白粗制品包括以下步骤：
对所述血清进行过滤处理，收集滤液；
利用中性饱和硫酸铵溶液对所述滤液进行透析，之后离心取上清液。上清液即为前白蛋白粗制品。
在一些实施方式中，所述从血清中获得前白蛋白粗制品还包括：向所述上清液中加入防腐剂的步骤。
在一些实施方式中，所述防腐剂选自庆大霉素或氯霉素。
在一些实施方式中，所述防腐剂选自庆大霉素。
在一些实施方式中，所述防腐剂的浓度为0.05％w/v。
在一些实施方式中，所述阴离子交换层析的填料配体选自DEAE(二乙氨乙基)、ANX或QAE。
在一些实施方式中，所述阴离子交换层析的填料选自DEAE交联纤维素、DEAE交联琼脂糖凝胶、DEAE交联葡聚糖、ANX交联琼脂糖凝胶、ANX交联葡聚糖、QAE交联纤维素、QAE交联琼脂糖凝胶或QAE交联葡聚糖。
在一些实施方式中，阴离子交换层析柱选自DEAE-纤维素层析柱、DEAE-葡聚糖层析柱、QAE-纤维素层析柱、Sephadex G-150或Sephadex G-200。
在一些实施方式中，阴离子交换层析柱为DEAE-纤维素层析柱或DEAE-葡聚糖层析柱。
在一些实施方式中，所述阴离子交换层析包括以下步骤：
将所述前白蛋白粗制品加载到所述阴离子交换层析柱；
利用第一洗脱液洗脱所述阴离子交换层析柱，收集第一洗脱液；
其中，所述第一洗脱液为含有0.4mol/LNaCl和0.05mol/L Tris-HCl的缓冲液，pH为7.5。
在一些实施方式中，所述阴离子交换层析包括以下步骤：
利用第一平衡液平衡所述阴离子交换层析柱；
将所述前白蛋白粗制品加载到所述阴离子交换层析柱；
利用第一洗脱液洗脱所述阴离子交换层析柱，收集所述含有前白蛋白的第一洗脱液；
其中，所述第一平衡液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH为7.5；
所述第一洗脱液为含有0.4mol/LNaCl和0.05mol/L Tris-HCl的缓冲液，pH为7.5。
在一些实施方式中，所述第一洗脱液的用量为3倍柱体积。
在一些实施方式中，在所述阴离子交换层析中，流速为1.0mL/min。
在一些实施方式中，在所述阴离子交换层析中，紫外检测波长为280nm。
在一些实施方式中，所述前白蛋白抗体亲和层析包括以下步骤：
将收集的第一洗脱液加载到所述前白蛋白抗体亲和层析柱；
利用第二洗脱液洗脱所述前白蛋白抗体亲和层析柱，收集第二洗脱液；
其中，所述第二洗脱液含有0.02mol/L的磷酸盐和0.5mol/L的NaCl的缓冲液，pH为7.1～7.5。
在一些实施方式中，所述前白蛋白抗体亲和层析包括以下步骤：
利用第二平衡液平衡前白蛋白抗体亲和层析柱；
将收集的第一洗脱液加载到所述前白蛋白抗体亲和层析柱；
利用第二洗脱液洗脱所述前白蛋白抗体亲和层析柱，收集第二洗脱液；
其中，所述第二平衡液为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，pH为7.1～7.5；
所述第二洗脱液含有0.02mol/L的磷酸盐和0.5mol/L的NaCl的缓冲液，pH为7.1～7.5。
在一些实施方式中，所述第二洗脱液的用量为2倍柱体积。
在一些实施方式中，在所述前白蛋白抗体亲和层析中，流速为0.4mL/min。
在一些实施方式中，在所述前白蛋白抗体亲和层析中，紫外检测波长为280nm。
在一些实施方式中，所述视黄醇结合蛋白抗体亲和层析包括以下步骤：
将收集的第二洗脱液加载到所述视黄醇结合蛋白抗体亲和层析柱；
利用第三洗脱液洗脱所述视黄醇结合蛋白抗体亲和层析柱，收集第一穿透液；
其中，所述第三洗脱液为含有0.5mol/LNaCl和0.02mol/L Tris-HCl的缓冲液，pH为7.1～7.5。
视黄醇结合蛋白抗体亲和层析所使用洗脱液能够使前白蛋白与视黄醇结合蛋白形成的复合物解离，从而使视黄醇结合蛋白仍然与其抗体结合，而前白蛋白随着第三洗脱液从视黄醇结合蛋白抗体亲和层析柱流出，实现前白蛋白高效地分离纯化。
在一些实施方式中，视黄醇结合蛋白抗体亲和层析包括以下步骤：
利用第三平衡液平衡视黄醇结合蛋白亲和层析柱；
将收集的第二洗脱液加载到所述视黄醇结合蛋白抗体亲和层析柱；
利用第三洗脱液洗脱所述视黄醇结合蛋白抗体亲和层析柱，收集第一穿透液；
其中，所述第三平衡液为0.02mol/LTris-HCl缓冲液，pH为7.1～7.5；
所述第三洗脱液为含有0.5mol/LNaCl和0.02mol/L Tris-HCl的缓冲液，pH为7.1～7.5。
在一些实施方式中，所述第三洗脱液的用量为3倍柱体积。
在一些实施方式中，在所述视黄醇结合蛋白抗体亲和层析中，流速为1mL/min。
在一些实施方式中，在所述视黄醇结合蛋白抗体亲和层析中，紫外检测波长为280nm。
在一些实施方式中，所述白蛋白抗体亲和层析包括以下步骤：
将收集的第一穿透液加载到所述白蛋白抗体亲和层析柱；
利用第四洗脱液洗脱所述白蛋白亲和层析柱，收集第二穿透液；
其中，所述第四洗脱液为含有1.0mol/LNaCl和0.02mol/L甘氨酸的缓冲液，pH为7.1～7.5。
在一些实施方式中，所述白蛋白抗体亲和层析包括以下步骤：
利用第四平衡液平衡白蛋白亲和层析柱；
将收集的第一穿透液加载到所述白蛋白抗体亲和层析柱；
利用第四洗脱液洗脱所述白蛋白亲和层析柱，收集第二穿透液；
其中，所述第四平衡液为0.02mol/L的甘氨酸缓冲液，pH为7.1～7.5；
所述第四洗脱液为含有1.0mol/LNaCl和0.02mol/L甘氨酸的缓冲液，pH为7.1～7.5。
在一些实施方式中，所述第四洗脱液的用量为3.5倍柱体积。
在一些实施方式中，所述纯化方法还包括利用0.22μm滤膜对所述前白蛋白粗制品过滤。过滤后的前白蛋白粗制品再进行所述阴离子交换层析。
在一些实施方式中，所述纯化方法还包括将收集的第一洗脱液进行浓缩的步骤。
在一些实施方式中，所述浓缩方式为采用中空纤维膜浓缩。
在一些实施方式中，浓缩后的第一洗脱液中的前白蛋白的浓度≥1000mg/L。
本发明提供的前白蛋白的纯化方法，先从血清中获得前白蛋白粗制品，再进行阴离子交换层析去除大部分杂质蛋白，然后依次经过前白蛋白抗体亲和层析、视黄醇结合蛋白抗体亲和层析和白蛋白抗体亲和层析，获得高纯度的前白蛋白样品。并且该纯化方法简单高效。
附图说明
图1为前白蛋白的纯化流程图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
DEAE-纤维素层析柱：General Electric Company
前白蛋白抗体亲和层析柱：General Electric Company
视黄醇结合蛋白亲和层析柱：General Electric Company
白蛋白亲和层析柱：General Electric Company
Proclin 300：上海伊卡生物技术有限公司
制备例中性饱和硫酸铵溶液
将80g硫酸铵和100mL去离子水在不断搅拌下加热至60℃，并保持7min后，趁热过滤，滤液置室温过夜，再以28％NH4OH调pH至7.0，形成中性饱和硫酸铵溶液。
实施例1
本实施例提供了一种前白蛋白的纯化方法。如图1所示，该纯化方法包括以下步骤：
1.前白蛋白粗制品
取人血清经无纺布进行过滤，过滤后装入透析袋，使用中性饱和硫酸铵溶液进行透析48小时，每隔2小时更换一次透析液；将透析后的血清4000r/min离心20min，离心后取上清液加入0.05％(w/v)庆大霉素，磁力搅拌使其充分混合溶解后备用。
2.阴离子交换层析
2-1)将前白蛋白粗制品用0.22μm滤膜进行抽滤，获得抽滤后的前白蛋白粗制品。
2-2)平衡DEAE-纤维素层析柱，平衡液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH为7.5。
2-3)将抽滤后的前白蛋白粗制品加载到DEAE-纤维素层析柱；
2-4)洗脱DEAE-纤维素层析柱，流速为1.0mL/min，用280nm波长紫外检测仪自动记录，收集含有前白蛋白的洗脱液；洗脱液为含有0.4mol/LNaCl和0.05mol/LTris-HCl的缓冲液，pH为7.5，用量为3倍柱体积。
2-5)采用中空纤维膜浓缩含有前白蛋白的洗脱液，浓缩后的洗脱液中前白蛋白的浓度≥1000mg/L。
3.前白蛋白抗体亲和层析
3-1)平衡前白蛋白抗体亲和层析柱，平衡液为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，pH为7.1～7.5。
3-2)将浓缩后的洗脱液加载到前白蛋白抗体亲和层析柱。
3-3)洗脱前白蛋白抗体亲和层析柱，流速为0.4mL/min，紫外检测波长为280nm，收集含有前白蛋白的洗脱液；洗脱液含有0.02mol/L的磷酸盐和0.5mol/L的NaCl的缓冲液，pH为7.1～7.5，用量为2倍柱体积。
4.视黄醇结合蛋白亲和层析
4-1)平衡视黄醇结合蛋白亲和层析柱，平衡液为0.02mol/LTris-HCl缓冲液，pH为7.1～7.5。
4-2)将前白蛋白亲和层析收集的洗脱液加载到视黄醇结合蛋白亲和层析柱。
4-3)洗脱视黄醇结合蛋白亲和层析柱，流速0.4mL/min，用280nm波长紫外检测仪自动记录，收集含有前白蛋白的穿透液；脱缓冲液为含有0.5mol/LNaCl和0.02mol/LTris-HCl的缓冲液，pH为7.1～7.5，用量为3倍柱体积。
5.白蛋白抗体亲和层析
5-1)平衡白蛋白亲和层析柱；平衡液为0.02mol/L的甘氨酸缓冲液，pH为7.1～7.5。
5-2)将收集的穿透液加载到白蛋白亲和层析柱。
5-3)洗脱白蛋白亲和层析柱，流速0.4mL/min，用280nm波长紫外检测仪自动记录，收集含有前白蛋白的穿透液，即为纯化后的前白蛋白样品；脱缓冲液为含有1.0mol/LNaCl和0.02mol/L甘氨酸的缓冲液，pH为7.1～7.5，用量为3.5倍柱体积。
5-4)采用中空纤维膜浓缩纯化后的前白蛋白样品，浓缩后的前白蛋白样品中前白蛋白的浓度≥1000mg/L。
6.纯度鉴定
通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向免疫扩散结合鉴定前白蛋白的样品。结果显示前白蛋白的纯度为≥95％。
7.保存
向加入0.04％(w/v)Proclin 300冷冻保存备用。
本发明提供的前白蛋白的纯化方法，相比于现有的前白蛋白的纯化方法，前白蛋白的浓度提高6倍以上。并且本发明提供的前白蛋白的纯化方法有效地去除视黄醇结合蛋白和白蛋白的干扰。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种前白蛋白的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括如下步骤：
从血清中获得前白蛋白粗制品；
将所述前白蛋白粗制品进行阴离子交换层析，收集第一洗脱液；
将收集的第一洗脱液进行前白蛋白抗体亲和层析，收集第二洗脱液；
将收集的第二洗脱液进行视黄醇结合蛋白抗体亲和层析，收集第一穿透液；
将收集的第一穿透液进行白蛋白抗体亲和层析，收集第二穿透液。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述从血清中获得前白蛋白粗制品包括以下步骤：
对所述血清进行过滤处理，收集滤液；
利用中性饱和硫酸铵溶液对所述滤液进行透析，之后离心取上清液。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析的填料配体选自DEAE、ANX或QAE；
优选地，所述阴离子交换层析的填料选自DEAE交联纤维素、DEAE交联琼脂糖凝胶、DEAE交联葡聚糖、ANX交联琼脂糖凝胶、ANX交联葡聚糖、QAE交联纤维素、QAE交联琼脂糖凝胶或QAE交联葡聚糖。
4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，阴离子交换层析柱选自DEAE-纤维素层析柱、DEAE-葡聚糖层析柱、QAE-纤维素层析柱、Sephadex G-150或Sephadex G-200。
5.根据权利要求1-4任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析包括以下步骤：
将所述前白蛋白粗制品加载到阴离子交换层析柱；
利用第一洗脱液洗脱所述阴离子交换层析柱，收集第一洗脱液；
其中，所述第一洗脱液为含有0.4mol/L NaCl和0.05mol/L Tris-HCl的缓冲液，pH为7.5。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述前白蛋白抗体亲和层析包括以下步骤：
将收集的第一洗脱液加载到所述前白蛋白抗体亲和层析柱；
利用第二洗脱液洗脱所述前白蛋白抗体亲和层析柱，收集第二洗脱液；
其中，所述第二洗脱液含有0.02mol/L的磷酸盐和0.5mol/L的NaCl的缓冲液，pH为7.1～7.5。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述视黄醇结合蛋白抗体亲和层析包括以下步骤：
将收集的第二洗脱液加载到所述视黄醇结合蛋白抗体亲和层析柱；
利用第三洗脱液洗脱所述视黄醇结合蛋白抗体亲和层析柱，收集第一穿透液；
其中，所述第三洗脱液为含有0.5mol/L NaCl和0.02mol/L Tris-HCl的缓冲液，pH为7.1～7.5。
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述白蛋白抗体亲和层析包括以下步骤：
将收集的第一穿透液加载到所述白蛋白抗体亲和层析柱；
利用第四洗脱液洗脱所述白蛋白亲和层析柱，收集第二穿透液；
其中，所述第四洗脱液为含有1.0mol/L NaCl和0.02mol/L甘氨酸的缓冲液，pH为7.1～7.5。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法还包括将收集的第一洗脱液进行浓缩的步骤；
优选地，所述浓缩方式为采用中空纤维膜浓缩。
10.根据权利要求9所述的前白蛋白纯化方法，其特征在于，浓缩后的第一洗脱液中的前白蛋白的含量≥1000mg/L。
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