CN113929733A

CN113929733A - 一种混合型离子交换填料的单抗纯化方法

Info

Publication number: CN113929733A
Application number: CN202111238775.9A
Authority: CN
Inventors: 李永刚; 吴德风; 詹文悦
Original assignee: Jiangsu Fanbo Biological Products Co ltd
Current assignee: Jiangsu Fanbo Biological Products Co ltd
Priority date: 2021-10-25
Filing date: 2021-10-25
Publication date: 2022-01-14

Abstract

本发明公开了一种混合型离子交换填料的单抗纯化方法，包括如下步骤：（1）鼠源腹水的深层过滤；（2）蓝胶亲和/离子交换层析；（3）阴离子交换层析。本发明属于单抗纯化的一种方法，从腹水的深层过滤、到两步离子交换，该纯化方法采用了各种优化操作条件，包括蓝胶与腹水的上样比例，Q柱解离抗体的缓冲液。本方法可以稳定有效的从腹水中纯化出单抗。该方法操作简便，抗体稳定、没有透析过程，实验过程中缓冲液均温和，对抗体更没有损伤，而且能够有效提高抗体的纯度、得率，且对于单克隆抗体的生产化具有重大价值。

Description

一种混合型离子交换填料的单抗纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种混合型离子交换填料的单抗纯化方法。

背景技术

单克隆抗体是通过杂交瘤技术培养得到的。B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂；而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。当动物体受到抗原刺激后，机体可以产生抗体，将杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。

单抗的纯化方法有很多，例如辛酸硫酸铵沉淀、蛋白A柱、G柱等等，但是这些纯化方法都是在酸性条件下进行的，对抗体有很大的损害。离子交换层析是根据在一定pH 条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有负电荷的称之阳离子交换树脂；而带有正电荷的称之阴离子树脂。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

蓝胶（DEAE Aff-Gel Blue gel）是一种双官能团填料，结合了亲和和离子交换，即活性蓝染料和DEAE琼脂糖凝胶。其中吸附的活性蓝（Cibacron blue F3GA）染料，它具有带电荷的、疏水的、能够与白蛋白结合的功能；而DEAE琼脂糖凝具有离子交换的功能，它可以结合蛋白当蛋白的等电点高于所处环境的pH时。这两种功能使得蓝胶具有很大的功能，因为小鼠腹水中有很大一部分的蛋白是白蛋白，所以这是一个去除白蛋白非常好的填料，而且它的解离条件很温和，不会对抗体有所伤害。

一步纯化法往往得不到较高纯度的抗体，所以在纯化方法的选择上，多步纯化能够非常有效的提高抗体的纯度。Q柱是强阴离子交换层析柱，它的缓冲液pH的范围更广，解离过程中通过不同的离子强度洗脱不同的蛋白。而且Q柱也相当于富集蛋白的功能。蓝胶能够去除小鼠腹水中的白蛋白，而Q柱能进一步纯化得到纯度更高的抗体。

发明内容

本发明提供了一种混合型离子交换填料的单抗纯化方法，以解决现有技术中的问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种混合型离子交换填料的单抗纯化方法，包括以下步骤：

S1、鼠源腹水的深层过滤，得到浊度低于40NTU的样品溶液；

S2、装填200ml蓝胶填料至中空层析柱中，安装完后将层析柱连接AKTA设备，用0.1M NaOH冲洗蓝胶柱5个柱体积，用纯化水洗涤5个柱体积，用平衡缓冲液20mM Tris平衡蓝胶柱4个柱体积进行柱准备；

S3、取90ml中步骤S1中得到的样品，加入等体积的20mM Tris缓冲液稀释上步骤S2的蓝胶柱，收集样品；

S4、装填50ml Q柱填料至中空层析柱中，安装完后将层析柱连接AKTA设备，用0.1MNaOH冲洗Q柱5个柱体积，用纯化水洗涤5个柱体积，用平衡缓冲液20mM Tris平衡Q柱4个柱体积进行柱准备；

S5、取步骤S3收集的样品，上步骤S4的Q柱，上样结束后使用洗杂缓冲液洗杂，再用解离缓冲液进行解离；

S6、步骤S5解离完成的样品用0.22μm滤膜过滤后，添加0.1% Proclin 300，-20℃长期保存。

进一步的，所述步骤S1中，鼠源腹水的深层过滤的步骤为：将冷冻的腹水在水浴融化，用脱脂棉过滤，再使用孔径为0.04-9μm的深层过滤器过滤并收集滤液，得到浊度低于40NTU的样品溶液。

进一步的，所述步骤S3中，样品收集的方法为上样过程中在线监测UV值，当UV值升至200mAu时，开始收集，降至200mAu以下，收集结束。

进一步的，所述步骤S3收集结束后，使用20mM Tris+1.4M NaCl清洗蓝胶柱，至UV值显示为0，再用纯化水洗涤5个柱体积；蓝胶柱长期不使用则柱内填充20%乙醇，4-8℃保存。

进一步的，所述步骤S5解离结束后，使用20mM Tris+1.4M NaCl清洗Q柱，至UV值显示为0，再用纯化水洗涤5个柱体积；Q柱长期不使用则柱内填充20%乙醇，4-8℃保存。

进一步的，所述步骤S5中，洗杂方法为用10mM PB+30mM NaCl缓冲液冲洗Q柱10个柱体积，至UV值降到0。

进一步的，所述步骤S5中，解离收集方法为用10mM PBS解离，在线监测UV值，当UV值升至200mAu时，开始收集，降至200mAu以下，收集结束。

优选的，所述Tris的pH均为8.0。

优选的，所述PB和PBS的pH=7.4。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明属于单抗纯化的一种方法，从腹水的深层过滤、到两步离子交换，该纯化方法采用了各种优化操作条件，包括蓝胶与腹水的上样比例，Q柱解离抗体的缓冲液。本方法可以稳定有效的从腹水中纯化出单抗。该方法操作简便，抗体稳定、没有透析过程，实验过程中缓冲液均温和，对抗体更没有损伤，而且能够有效提高抗体的纯度、得率，且对于单克隆抗体的生产化具有重大价值。

附图说明

图1是步骤S3蓝胶的洗脱曲线。

图2是步骤S6Q柱的洗脱曲线。

图3是步骤S8高效液相色谱图。

图4是混合离子交换工艺纯化得到的抗体与旧工艺纯化得到的抗体的电泳图，其中：泳道1为辛硫工艺纯化抗体还原条带；泳道2为体混合离子交换工艺纯化抗体的还原条带；泳道3为混合离子交换工艺纯化抗体冻融三次的还原条带；泳道4为混合离子交换工艺纯化抗体37℃放置三天的还原条带；泳道5为Marker；泳道6为辛硫工艺纯化抗体非还原条带；泳道7为混合离子交换工艺纯化抗体的非还原条带；泳道8为混合离子交换工艺纯化抗体冻融三次的非还原条带；泳道10为混合离子交换工艺纯化抗体37℃放置三天的非还原条带。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。

一种混合型离子交换填料的单抗纯化方法，包括以下步骤：

S1、鼠源腹水的深层过滤：将冷冻的腹水在水浴融化，用脱脂棉过滤，再使用孔径为0.04-9μm的深层过滤器过滤并收集滤液，得到浊度低于40NTU的样品溶液；作为一个优选方案，腹水的深层过滤采用的滤器型号为CDCFCDCSD0140PCP（Cobetter FiltrationEquipment Co., Ltd）。

S2、装填200ml蓝胶填料至中空层析柱中，安装完后将层析柱连接AKTA设备，用0.1M NaOH冲洗蓝胶柱5个柱体积，用纯化水洗涤5个柱体积，用平衡缓冲液20mM Tris（pH8.0）平衡蓝胶柱4个柱体积进行柱准备；

S3、取90ml步骤S1得到的样品，加入等体积的20mM Tris（pH8.0）缓冲液稀释上步骤S2的蓝胶柱，收集样品，样品收集的方法为上样过程中在线监测UV值，当UV值升至200mAu时，开始收集，降至200mAu以下，收集结束；

S4、收集结束后，使用20mM Tris（pH8.0）+1.4M NaCl清洗蓝胶柱，至UV值显示为0，再用纯化水洗涤5个柱体积；蓝胶柱长期不使用则柱内填充20%乙醇，4-8℃保存；

S5、装填50mlQ柱填料至中空层析柱中，安装完后将层析柱连接AKTA设备，用0.1MNaOH冲洗Q柱5个柱体积，用纯化水洗涤5个柱体积，用平衡缓冲液20mM Tris（pH8.0）平衡Q柱4个柱体积进行柱准备；

S6、取步骤S3收集的样品，上步骤S5的Q柱，上样结束后使用洗杂缓冲液洗杂，再用解离缓冲液进行解离；洗杂方法为用10mM PB（pH7.4）+30mM NaCl缓冲液冲洗Q柱10个柱体积，至UV值降到0，解离收集方法为，用10mM PBS（pH7.4）解离，在线监测UV值，当UV值升至200mAu时，开始收集，降至200mAu以下，收集结束。

S7、解离结束后，使用20mM Tris（pH8.0）+1.4M NaCl清洗Q柱，至UV值显示为0，再用纯化水洗涤5个柱体积；Q柱长期不使用则柱内填充20%乙醇，4-8℃保存；

S8、步骤S6解离完成的样品用0.22μm滤膜过滤后添加0.1%Proclin300，-20℃长期保存；收集到的目的抗体的pH应在7.3-7.5之间。

本发明中抗体的纯度由高效液相色谱法（HPLC）和凝胶电泳（SDS-PAGE）检测。将6μg（300μg/mL，20μL）上样到高效液相色谱柱（Aglient Technologies SEC-300），以高效液相层析系统进行分离15分钟。凝胶电泳（SDS-PAGE）采用12%凝胶进行电泳，Marker购自于Solarbio Life Science。从图3与4能够看出，混合离子交换工艺得到的抗体纯度高于90%。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种混合型离子交换填料的单抗纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、鼠源腹水的深层过滤，得到浊度低于40NTU的样品溶液；

S2、装填200ml蓝胶填料至中空层析柱中，安装完后将层析柱连接AKTA设备，用0.1MNaOH冲洗蓝胶柱5个柱体积，用纯化水洗涤5个柱体积，用平衡缓冲液20 mM Tris平衡蓝胶柱4个柱体积进行柱准备；

2.根据权利要求1所述的混合型离子交换填料的单抗纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中，鼠源腹水的深层过滤的步骤为：将冷冻的腹水在水浴融化，用脱脂棉过滤，再使用孔径为0.04-9μm的深层过滤器过滤并收集滤液，得到浊度低于40NTU的样品溶液。

3.根据权利要求1所述的混合型离子交换填料的单抗纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中，样品收集的方法为上样过程中在线监测UV值，当UV值升至200mAu时，开始收集，降至200mAu以下，收集结束。

4.根据权利要求1或3所述的混合型离子交换填料的单抗纯化方法，其特征在于，所述步骤S3收集结束后，使用20mM Tris+1.4M NaCl清洗蓝胶柱，至UV值显示为0，再用纯化水洗涤5个柱体积；蓝胶柱长期不使用则柱内填充20%乙醇，4-8℃保存。

5.根据权利要求1所述的混合型离子交换填料的单抗纯化方法，其特征在于，所述步骤S5中，洗杂方法为用10mM PB+30mM NaCl缓冲液冲洗Q柱10个柱体积，至UV值降到0。

6.根据权利要求5所述的混合型离子交换填料的单抗纯化方法，其特征在于，所述步骤S5解离结束后，使用20mM Tris+1.4M NaCl清洗Q柱，至UV值显示为0，再用纯化水洗涤5个柱体积；Q柱长期不使用则柱内填充20%乙醇，4-8℃保存。

7.根据权利要求1所述的混合型离子交换填料的单抗纯化方法，其特征在于，所述步骤S5解离结束后，使用20mM Tris+1.4M NaCl清洗Q柱，至UV值显示为0，再用纯化水洗涤5个柱体积；Q柱长期不使用则柱内填充20%乙醇，4-8℃保存。

8.根据权利要求1所述的混合型离子交换填料的单抗纯化方法，其特征在于，所述步骤S5中，解离收集方法为用10mM PBS解离，在线监测UV值，当UV值升至200mAu时，开始收集，降至200mAu以下，收集结束。

9.根据权利要求1所述的混合型离子交换填料的单抗纯化方法，其特征在于，所述Tris的pH均为8.0。

10.根据权利要求6所述的混合型离子交换填料的单抗纯化方法，其特征在于，所述PB和PBS的pH=7.4。