CN116554310B - 一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及血红蛋白制备技术领域，具体公开了一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法。包括：1）将新鲜牛血用纯净水溶胀破壁，过滤出去固体杂质，得血红蛋白裂解原液；2）将血红蛋白裂解原液上铜离子螯合树脂柱；3）用洗杂液过柱清洗杂质；4）用洗脱液洗脱血红蛋白，收集，得血红蛋白洗脱液；5）将血红蛋白洗脱液通过超滤进行浓缩、脱盐，然后进行冻干，得血红蛋白产品；洗杂液为乙二胺四乙酸、磷酸钠、磷酸氢钾、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、2‑吗啉乙磺酸、尿素、纯净水的复配；洗脱液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、咪唑、纯净水的复配。本发明具有使得提取高纯度血红蛋白时更为环保的优点。
Description
技术领域
本发明涉及血红蛋白制备技术领域，尤其是涉及一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法。
背景技术
血红蛋白是红细胞内运输氧的特殊蛋白质，是血液呈红色的蛋白质，由珠蛋白、血红素组成，血红蛋白与红细胞的使用价值近似，通过检测血液中血红蛋白的含量，可判断人体生体健康程度，有较大的临床价值。
当人体血液中血红蛋白含量不足时，可以通过注射血红蛋白进行补充，其中牛血红蛋白是常用的血液替代用品，为了提高注射效果，需要制备高纯度的血红蛋白。
现有制备高纯度血红蛋白的方法主要有硫酸铵分级沉淀法和PEG沉淀法之后再上阴离子交换柱或凝胶柱，以上制备方法虽然能获得高纯度血红蛋白，但是会有大量硫酸铵、PEG的废液产生，容易对环境造成污染，因此，还有改善空间。
发明内容
为了使得提取高纯度血红蛋白时更为环保，本申请提供一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法。
本申请提供的一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法采用如下的技术方案：
一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，包括以下步骤：
步骤1)，将新鲜牛血用纯净水溶胀破壁，过滤出去固体杂质，得血红蛋白裂解原液；
步骤2)，将血红蛋白裂解原液上铜离子螯合树脂柱；
步骤3)，用2-4倍柱体积的洗杂液过柱清洗杂质；
步骤4)，用洗脱液洗脱血红蛋白，收集，得血红蛋白洗脱液；
步骤5)，将血红蛋白洗脱液通过超滤进行浓缩、脱盐，然后进行冻干，得血红蛋白产品；
所述洗杂液为乙二胺四乙酸、磷酸钠、磷酸氢钾、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、尿素、纯净水的复配；
所述洗脱液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、咪唑、纯净水的复配。
通过采用上述技术方案，通过将新鲜牛血中的红细胞溶胀，然后过滤掉细胞膜等固体杂质后直接上柱吸附，利用铜离子熬合吸附柱中的铜离子与蛋白表面的组氨酸结合使得蛋白质吸附在树脂中，而其他杂质则跟随水流排出，实现蛋白质的初步分离，采用特殊的洗杂液过柱清洗，可将球蛋白、白蛋白等杂蛋白去除，再通过洗脱液将血红蛋白洗脱，除去洗脱液中的盐后即可获得高纯度血红蛋白，废液产生较少，树脂柱能重复使用，制备血红蛋白的工艺步骤简单，制备效率较高，较为环保，并且具有较高的经济价值。
通过洗杂液为乙二胺四乙酸、磷酸钠、磷酸氢钾、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、尿素、纯净水的复配，能很好地除去球蛋白、白蛋白等杂蛋白，并且对血红蛋白的洗脱效果极差，基本不会带出血红蛋白，使得目标产物血红蛋白在洗杂液的冲洗下依旧能很好地稳定附着在树脂柱中，实现了高纯度血红蛋白的制备的同时减少血红蛋白的消耗，产物收率较高，具有更高的经济价值。
优选的，所述洗杂液中，乙二胺四乙酸的浓度为0.3-0.4mol/L、磷酸钠浓度为0.01-0.02mol/L、磷酸氢钾浓度为0.01-0.02mol/L、十二烷基磺酸钠浓度为0.5-0.6mol/L、二硫苏糖醇浓度为0.4-0.5mol/L、三羟甲基氨基甲烷浓度为0.7-0.8mol/L、2-吗啉乙磺酸浓度为0.03-0.04mol/L、尿素浓度为0.3-0.4mol/L。
通过采用上述技术方案，通过具体选择乙二胺四乙酸、磷酸钠、磷酸氢钾、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、尿素的浓度，制得的洗杂液对球蛋白、白蛋白等杂蛋白的洗脱效果更佳，并且更不易洗脱血红蛋白，制得的血红蛋白的纯度较高的同时血红蛋白的损耗更少，收率更高，具有更高的经济价值。
优选的，所述洗脱液中，磷酸二氢钠的浓度为0.01-0.02mol/L、磷酸氢二钠的浓度为0.01-0.02mol/L、氯化钠的浓度为0.4-0.5mol/L、咪唑的浓度为0.4-0.5mol/L。
通过采用上述技术方案，通过具体选择磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、咪唑的浓度，洗脱血红蛋白的效果较佳，后续除盐时难度更低，工艺操作更为简单。
优选的，所述铜离子螯合树脂柱的制备方法如下：
步骤01)，将大孔螯合型亚胺乙酸基螯合树脂水洗干净后装柱；
步骤02)，用浓度为4-6％的盐酸溶液过柱清洗；
步骤03)，用纯净水过柱清洗至中性；
步骤04)，用浓度为4-6％的氢氧化钠溶液过柱清洗；
步骤05)，用纯净水过柱清洗至中性；
步骤06)，用浓度为0.4-0.6mol/L的硫酸铜溶液上样至铜离子吸附饱和；
步骤07)，用纯净水过柱清洗多余的铜离子；
步骤08)，用平衡液过柱平衡，得铜离子螯合树脂柱；
所述平衡液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、纯净水的复配。
通过采用上述技术方案，通过采用特殊工艺制得铜离子螯合树脂柱，对表面含有组氨酸的蛋白质的吸附效果较佳，在血红蛋白裂解原液上柱时，能有效吸附目标蛋白，减少血红蛋白在血红蛋白裂解原液上柱过程中的流失，有效提高血红蛋白的收率。
优选的，所述平衡液中，磷酸二氢钠的浓度为0.01-0.02mol/L、磷酸氢二钠的浓度为0.01-0.02mol/L、氯化钠的浓度为0.45-0.55mol/L。
通过采用上述技术方案，通过具体选择磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠的浓度，制得的铜离子螯合树脂柱吸附带有组氨酸的蛋白质的效果更佳，更好地减少上样时血红蛋白的流失，具有更高的经济价值。
优选的，所述步骤08)中，采用3-4倍柱体积的平衡液过柱平衡。
通过采用上述技术方案，通过具体选择平衡液过柱平衡的用量，制得的铜离子螯合树脂柱吸附血红蛋白的效果更好，减少上样过程中血红蛋白的流失，收率更高，具有更高的经济价值。
优选的，所述步骤02)中，采用2-4倍柱体积的盐酸溶液过柱清洗。
通过采用上述技术方案，通过具体选择盐酸溶液酸洗的用量，制得的铜离子螯合树脂柱质量更佳，吸附血红蛋白的效果更好，更好地减少上样过程中血红蛋白的流失。
优选的，所述步骤04)中，采用2-4倍柱体积的氢氧化钠溶液过柱清洗。
通过采用上述技术方案，通过具体选择氢氧化钠溶液碱洗的用量，制得的铜离子螯合树脂柱质量对血红蛋白的吸附效果更佳，更好地减少上样过程中血红蛋白的流失。
优选的，所述步骤01)中，大孔螯合型亚胺乙酸基螯合树脂在40-45℃温水中浸泡洗净。
通过采用上述技术方案，清洗大孔树脂的效果更佳，制得的铜离子螯合树脂柱的质量更佳，对血红蛋白的吸附效果更好。
优选的，所述步骤2)中，血红蛋白裂解原液上铜离子螯合树脂柱的工艺条件为：上样量15-25mg/g铜离子螯合树脂，柱温15-25℃，上样流速0.5-1.5ml/min。
通过采用上述技术方案，通过具体选择上样时的工艺条件，使得血红蛋白更好地被树脂柱吸附，减少血红蛋白在上样过程中的流失，具有更高的经济价值。
优选的，所述步骤1)中，采用新鲜牛血3-4倍体积的纯净水进行溶胀破壁。
通过采用上述技术方案，溶胀红细胞的效果较佳，能较好地除去细胞膜，使得血红蛋白充分释放，制得的血红蛋白收率较高，具有更高的经济价值。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、由于本申请通过将新鲜牛血中的红细胞溶胀，然后过滤掉细胞膜等固体杂质后直接上柱吸附，利用铜离子熬合吸附柱中的铜离子与蛋白表面的组氨酸结合使得蛋白质吸附在树脂中，而其他杂质则跟随水流排出，实现蛋白质的初步分离，采用特殊的洗杂液过柱清洗，可将球蛋白、白蛋白等杂蛋白去除，再通过洗脱液将血红蛋白洗脱，除去洗脱液中的盐后即可获得高纯度血红蛋白，废液产生较少，树脂柱能重复使用，制备血红蛋白的工艺步骤简单，制备效率较高，较为环保，并且具有较高的经济价值。
2、本申请中优选通过洗杂液为乙二胺四乙酸、磷酸钠、磷酸氢钾、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、尿素、纯净水的复配，能很好地除去球蛋白、白蛋白等杂蛋白，并且对血红蛋白的洗脱效果极差，基本不会带出血红蛋白，使得目标产物血红蛋白在洗杂液的冲洗下依旧能很好地稳定附着在树脂柱中，实现了高纯度血红蛋白的制备的同时减少血红蛋白的消耗，产物收率较高，具有更高的经济价值。
3、本申请中优选通过采用特殊工艺制得铜离子螯合树脂柱，对表面含有组氨酸的蛋白质的吸附效果较佳，在血红蛋白裂解原液上柱时，能有效吸附目标蛋白，减少血红蛋白在血红蛋白裂解原液上柱过程中的流失，有效提高血红蛋白的收率。
附图说明
图1为实施例1的电泳图；
图2为实施例2的电泳图；
图3为实施例3的电泳图；
图4为对比例1的电泳图；
图5为对比例2的电泳图；
图6为对比例3的电泳图；
图7为对比例4的电泳图；
图8为对比例5的电泳图；
图9为对比例6的电泳图；
图10为对比例7的电泳图；
图11为对比例8的电泳图；
图12为对比例9的电泳图。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
实施例1
一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，包括以下步骤：
步骤1)，向新鲜牛血中注入3倍新鲜牛血体积的纯净水，转速60r/min，搅拌30min，溶胀破壁，通过直径为30mm的0.45μm滤膜过滤除去细胞膜等固体杂质，得血红蛋白裂解原液。
步骤2)，将血红蛋白裂解原液上铜离子螯合树脂柱，上柱工艺条件为上样量15mg/g铜离子螯合树脂，柱温15℃，上样流速0.5ml/min。
步骤3)，用2倍柱体积的洗杂液过柱清洗杂质，过柱流速为1.5ml/min。
步骤4)，用2-4倍柱体积的洗脱液洗脱血红蛋白至无红色液体流出，收集，得血红蛋白洗脱液，洗脱流速为1.5ml/min。
步骤5)，将血红蛋白洗脱液采用3k超滤膜进行超滤以进行浓缩、脱盐，冻干后得血红蛋白产品。
其中，洗杂液为乙二胺四乙酸、磷酸钠、磷酸氢钾、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、尿素、纯净水的复配。
洗杂液中，乙二胺四乙酸的浓度为0.3mol/L、磷酸钠浓度为0.01mol/L、磷酸氢钾浓度为0.01mol/L、十二烷基磺酸钠浓度为0.5mol/L、二硫苏糖醇浓度为0.4mol/L、三羟甲基氨基甲烷浓度为0.7mol/L、2-吗啉乙磺酸浓度为0.03mol/L、尿素浓度为0.3mol/L。
其中，洗脱液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、咪唑、纯净水的复配。
洗脱液中，磷酸二氢钠的浓度为0.01mol/L、磷酸氢二钠的浓度为0.01mol/L、氯化钠的浓度为0.4mol/L、咪唑的浓度为0.4mol/L。
其中，铜离子螯合树脂柱的制备方法如下：
步骤01)，将S930大孔螯合型亚胺乙酸基螯合树脂在40℃温水中浸泡30min并洗净后装柱。
步骤02)，用2倍柱体积浓度为4％的盐酸溶液过柱清洗。
步骤03)，用纯净水过柱清洗至流出液呈中性。
步骤04)，用2倍柱体积浓度为4％的氢氧化钠溶液过柱清洗。
步骤05)，用纯净水过柱清洗至流出液中性。
步骤06)，用浓度为0.4mol/L的硫酸铜溶液上样至铜离子吸附饱和，当流出液呈现蓝色硫酸铜溶液的颜色时，即为铜离子吸附饱和。
步骤07)，用纯净水过柱清洗多余的铜离子，当流出液澄清后，再用两倍柱体积的纯净水过柱，即为多余的铜离子清洗干净。
步骤08)，用2倍柱体积的平衡液过柱平衡，得铜离子螯合树脂柱。
平衡液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、纯净水的复配。
平衡液中，磷酸二氢钠的浓度为0.01mol/L、磷酸氢二钠的浓度为0.01mol/L、氯化钠的浓度为0.45mol/L。
实施例2
一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，包括以下步骤：
步骤1)，向新鲜牛血中注入3.5倍新鲜牛血体积的纯净水，转速60r/min，搅拌30min，溶胀破壁，通过直径为30mm的0.45μm滤膜过滤除去细胞膜等固体杂质，得血红蛋白裂解原液。
步骤2)，将血红蛋白裂解原液上铜离子螯合树脂柱，上柱工艺条件为上样量20mg/g铜离子螯合树脂，柱温20℃，上样流速1ml/min。
步骤3)，用3倍柱体积的洗杂液过柱清洗杂质，过柱流速为2ml/min。
步骤4)，用2-4倍柱体积的洗脱液洗脱血红蛋白至无红色液体流出，收集，得血红蛋白洗脱液，洗脱流速为2ml/min。
步骤5)，将血红蛋白洗脱液采用3k超滤膜进行超滤以进行浓缩、脱盐，冻干后得血红蛋白产品。
其中，洗杂液为乙二胺四乙酸、磷酸钠、磷酸氢钾、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、尿素、纯净水的复配。
洗杂液中，乙二胺四乙酸的浓度为0.35mol/L、磷酸钠浓度为0.015mol/L、磷酸氢钾浓度为0.015mol/L、十二烷基磺酸钠浓度为0.55mol/L、二硫苏糖醇浓度为0.45mol/L、三羟甲基氨基甲烷浓度为0.75mol/L、2-吗啉乙磺酸浓度为0.035mol/L、尿素浓度为0.35mol/L。
其中，洗脱液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、咪唑、纯净水的复配。
洗脱液中，磷酸二氢钠的浓度为0.015mol/L、磷酸氢二钠的浓度为0.015mol/L、氯化钠的浓度为0.45mol/L、咪唑的浓度为0.45mol/L。
其中，铜离子螯合树脂柱的制备方法如下：
步骤01)，将S930大孔螯合型亚胺乙酸基螯合树脂在42℃温水中浸泡30min并洗净后装柱。
步骤02)，用3倍柱体积浓度为5％的盐酸溶液过柱清洗。
步骤03)，用纯净水过柱清洗至流出液呈中性。
步骤04)，用3倍柱体积浓度为5％的氢氧化钠溶液过柱清洗。
步骤05)，用纯净水过柱清洗至流出液中性。
步骤06)，用浓度为0.5mol/L的硫酸铜溶液上样至铜离子吸附饱和，当流出液呈现蓝色硫酸铜溶液的颜色时，即为铜离子吸附饱和。
步骤07)，用纯净水过柱清洗多余的铜离子，当流出液澄清后，再用两倍柱体积的纯净水过柱，即为多余的铜离子清洗干净。
步骤08)，用3倍柱体积的平衡液过柱平衡，得铜离子螯合树脂柱；
平衡液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、纯净水的复配。
平衡液中，磷酸二氢钠的浓度为0.015mol/L、磷酸氢二钠的浓度为0.015mol/L、氯化钠的浓度为0.5mol/L。
实施例3
一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，包括以下步骤：
步骤1)，向新鲜牛血中注入4倍新鲜牛血体积的纯净水，转速60r/min，搅拌30min，溶胀破壁，通过直径为30mm的0.45μm滤膜过滤除去细胞膜等固体杂质，得血红蛋白裂解原液。
步骤2)，将血红蛋白裂解原液上铜离子螯合树脂柱，上柱工艺条件为上样量25mg/g铜离子螯合树脂，柱温25℃，上样流速1.5ml/min。
步骤3)，用4倍柱体积的洗杂液过柱清洗杂质，过柱流速为2.5ml/min。
步骤4)，用2-4倍柱体积的洗脱液洗脱血红蛋白至无红色液体流出，收集，得血红蛋白洗脱液，洗脱流速为2.5ml/min。
步骤5)，将血红蛋白洗脱液采用3k超滤膜进行超滤以进行浓缩、脱盐，冻干后得血红蛋白产品。
其中，洗杂液为乙二胺四乙酸、磷酸钠、磷酸氢钾、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、尿素、纯净水的复配。
洗杂液中，乙二胺四乙酸的浓度为0.4mol/L、磷酸钠浓度为0.02mol/L、磷酸氢钾浓度为0.02mol/L、十二烷基磺酸钠浓度为0.6mol/L、二硫苏糖醇浓度为0.5mol/L、三羟甲基氨基甲烷浓度为0.8mol/L、2-吗啉乙磺酸浓度为0.04mol/L、尿素浓度为0.4mol/L。
其中，洗脱液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、咪唑、纯净水的复配。
洗脱液中，磷酸二氢钠的浓度为0.02mol/L、磷酸氢二钠的浓度为0.02mol/L、氯化钠的浓度为0.5mol/L、咪唑的浓度为0.5mol/L。
其中，铜离子螯合树脂柱的制备方法如下：
步骤01)，将S930大孔螯合型亚胺乙酸基螯合树脂在45℃温水中浸泡30min并洗净后装柱。
步骤02)，用4倍柱体积浓度为6％的盐酸溶液过柱清洗。
步骤03)，用纯净水过柱清洗至流出液呈中性。
步骤04)，用4倍柱体积浓度为6％的氢氧化钠溶液过柱清洗。
步骤05)，用纯净水过柱清洗至流出液中性。
步骤06)，用浓度为0.6mol/L的硫酸铜溶液上样至铜离子吸附饱和，当流出液呈现蓝色硫酸铜溶液的颜色时，即为铜离子吸附饱和。
步骤07)，用纯净水过柱清洗多余的铜离子，当流出液澄清后，再用两倍柱体积的纯净水过柱，即为多余的铜离子清洗干净。
步骤08)，用4倍柱体积的平衡液过柱平衡，得铜离子螯合树脂柱。
平衡液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、纯净水的复配。
平衡液中，磷酸二氢钠的浓度为0.02mol/L、磷酸氢二钠的浓度为0.02mol/L、氯化钠的浓度为0.55mol/L。
对比例1
与实施例2相比，区别仅在于：
采用乙酸钠等量替换乙二胺四乙酸。
对比例2
与实施例2相比，区别仅在于：
采用N-氨基甲酰甲基乙磺酸等量替换磷酸钠。
对比例3
与实施例2相比，区别仅在于：
采用哌嗪-1,4-二乙磺酸等量替换磷酸氢钾。
对比例4
与实施例2相比，区别仅在于：
采用乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸等量替换十二烷基磺酸钠。
对比例5
与实施例2相比，区别仅在于：
采用三(羟甲基)甲基甘氨酸等量替换二硫苏糖醇。
对比例6
与实施例2相比，区别仅在于：
采用异硫氰酸胍等量替换三羟甲基氨基甲烷。
对比例7
与实施例2相比，区别仅在于：
采用3-(N-吗啉代)丙磺酸等量替换2-吗啉乙磺酸。
对比例8
与实施例2相比，区别仅在于：
采用硫脲等摩尔浓度替换尿素。
对比例9
与实施例2相比，区别仅在于：
采用乙酸钠等量替换乙二胺四乙酸。
采用N-氨基甲酰甲基乙磺酸等量替换磷酸钠。
采用哌嗪-1,4-二乙磺酸等量替换磷酸氢钾。
采用乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸等量替换十二烷基磺酸钠。
采用三(羟甲基)甲基甘氨酸等量替换二硫苏糖醇。
采用异硫氰酸胍等量替换三羟甲基氨基甲烷。
采用3-(N-吗啉代)丙磺酸等量替换2-吗啉乙磺酸。
采用硫脲等摩尔浓度替换尿素。
实验例1
与实施例1相比，区别仅在于：
采用血红蛋白溶液替换新鲜牛血。
血红蛋白溶液由牛血红蛋白、纯净水混匀配置而成。
血红蛋白溶液中，牛血红蛋白的浓度为150g/L。
实验例2
与实施例2相比，区别仅在于：
采用血红蛋白溶液替换新鲜牛血。
血红蛋白溶液由牛血红蛋白、纯净水混匀配置而成。
血红蛋白溶液中，牛血红蛋白的浓度为150g/L。
实验例3
与实施例3相比，区别仅在于：
采用血红蛋白溶液替换新鲜牛血。
血红蛋白溶液由牛血红蛋白、纯净水混匀配置而成。
血红蛋白溶液中，牛血红蛋白的浓度为150g/L。
对比例实验例1
与对比例1相比，区别仅在于：
采用血红蛋白溶液替换新鲜牛血。
血红蛋白溶液由牛血红蛋白、纯净水混匀配置而成。
血红蛋白溶液中，牛血红蛋白的浓度为150g/L。
对比例实验例2
与对比例2相比，区别仅在于：
采用血红蛋白溶液替换新鲜牛血。
血红蛋白溶液由牛血红蛋白、纯净水混匀配置而成。
血红蛋白溶液中，牛血红蛋白的浓度为150g/L。
对比例实验例3
与对比例3相比，区别仅在于：
采用血红蛋白溶液替换新鲜牛血。
血红蛋白溶液由牛血红蛋白、纯净水混匀配置而成。
血红蛋白溶液中，牛血红蛋白的浓度为150g/L。
对比例实验例4
与对比例4相比，区别仅在于：
采用血红蛋白溶液替换新鲜牛血。
血红蛋白溶液由牛血红蛋白、纯净水混匀配置而成。
血红蛋白溶液中，牛血红蛋白的浓度为150g/L。
对比例实验例5
与对比例5相比，区别仅在于：
采用血红蛋白溶液替换新鲜牛血。
血红蛋白溶液由牛血红蛋白、纯净水混匀配置而成。
血红蛋白溶液中，牛血红蛋白的浓度为150g/L。
对比例实验例6
与对比例6相比，区别仅在于：
采用血红蛋白溶液替换新鲜牛血。
血红蛋白溶液由牛血红蛋白、纯净水混匀配置而成。
血红蛋白溶液中，牛血红蛋白的浓度为150g/L。
对比例实验例7
与对比例7相比，区别仅在于：
采用血红蛋白溶液替换新鲜牛血。
血红蛋白溶液由牛血红蛋白、纯净水混匀配置而成。
血红蛋白溶液中，牛血红蛋白的浓度为150g/L。
对比例实验例8
与对比例8相比，区别仅在于：
采用血红蛋白溶液替换新鲜牛血。
血红蛋白溶液由牛血红蛋白、纯净水混匀配置而成。
血红蛋白溶液中，牛血红蛋白的浓度为150g/L。
对比例实验例9
与对比例9相比，区别仅在于：
采用血红蛋白溶液替换新鲜牛血。
血红蛋白溶液由牛血红蛋白、纯净水混匀配置而成。
血红蛋白溶液中，牛血红蛋白的浓度为150g/L。
实验1
对各实施例及对比例制得的血红蛋白产品进行SDS-PAGE电泳实验。
实验条件：
分离胶15％，浓缩胶5％，血红蛋白产品与上样缓冲液的质量比例为5：1，血红蛋白产品与上样缓冲液混合后100℃加热5min后上样，采用考马斯亮蓝R-250染色，脱色后得到电泳图。
实验2
计算各实验例及对比实验例的血红蛋白产品的收率。
采用各实验例及对比实验例的方法，以1L血红蛋白溶液为原料，制备血红蛋白产品，即血红蛋白溶液在采用各实验例及对比实验例的方法制备前，血红蛋白溶液中的血红蛋白含量为150g，在经过各实验例及对比实验例的方法制备后，称量制得的血红蛋白的重量，通过以下公式计算收率：
收率＝(制得的血红蛋白产品的重量/150)*100％。
收率越高，证明血红蛋白在采用各实验例及对比实验例的方法制备的过程中的损耗越少。
实验1中，各实施例及对比例制得的血红蛋白产品的电泳图详见图1-12。
图1中：1-Marker；2-血红蛋白标准样品；3-实施例1样品；4-血红蛋白裂解原液。
图2中：1-血红蛋白裂解原液；2、3-实施例2样品；4-血行蛋白标准样品；5-Marker。
图3中：1-Marker；2-血红蛋白标准样品；3、4-实施例3样品；5-血红蛋白裂解原液。
图4中：1-血红蛋白裂解原液；2-对比例1样品；3-血行蛋白标准样品；4-Marker。
图5中：1-Marker；2-血红蛋白标准样品；3、4-对比例2样品；5-血红蛋白裂解原液。
图6中：1-Marker；2-血红蛋白标准样品；3-血红蛋白裂解原液；4-对比例3样品。
图7中：1-血红蛋白裂解原液；2-对比例4样品；3-血行蛋白标准样品；4-Marker。
图8中：1-Marker；2-血红蛋白标准样品；3-对比例5样品；4-血红蛋白裂解原液。
图9中：1-血红蛋白裂解原液；2-对比例6样品；3-血行蛋白标准样品；4-Marker。
图10中：1-血红蛋白裂解原液；2-对比例7样品；3-血行蛋白标准样品；4-Marker。
图11中：1-Marker；2-血红蛋白标准样品；3-血红蛋白裂解原液；4、5-对比例8样品。
图12中：1、2-对比例9样品；3-血红蛋白裂解原液；4-血行蛋白标准样品；5-Marker。
实验2中，各实施例及对比例制得的血红蛋白产品的收率详见表1。
表1
| 收率(％) | |
| 实施例1 | 99.5 |
| 实施例2 | 99.7 |
| 实施例3 | 99.3 |
| 对比例1 | 82.8 |
| 对比例2 | 83.9 |
| 对比例3 | 81.6 |
| 对比例4 | 82.4 |
| 对比例5 | 84.3 |
| 对比例6 | 81.9 |
| 对比例7 | 83.1 |
| 对比例8 | 84.6 |
| 对比例9 | 77.2 |
根据图1-12及表1的数据对比可得，采用乙二胺四乙酸、磷酸钠、磷酸氢钾、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、尿素以特定浓度复配制成的洗杂液过柱清洗杂蛋白，能有效去除杂蛋白的同时很好地保留目标蛋白(血红蛋白)，在制备血红蛋白的过程中，对原料中的血红蛋白消耗较少，血红蛋白的收率较高，具有较高的经济价值，且制得的血红蛋白纯度较高，质量较好。
而当采用其他配方制得的洗杂液过柱清洗杂蛋白时，虽然也能很好地去除杂蛋白，制得的血红蛋白纯度较高，但是对目标蛋白(血红蛋白)的消耗较大，收率较低，经济价值显著下降。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (9)
1.一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1），将新鲜牛血用纯净水溶胀破壁，过滤出去固体杂质，得血红蛋白裂解原液；
步骤2），将血红蛋白裂解原液上铜离子螯合树脂柱；
步骤3），用2-4倍柱体积的洗杂液过柱清洗杂质；
步骤4），用洗脱液洗脱血红蛋白，收集，得血红蛋白洗脱液；
步骤5），将血红蛋白洗脱液通过超滤进行浓缩、脱盐，然后进行冻干，得血红蛋白产品；
所述洗杂液为乙二胺四乙酸、磷酸钠、磷酸氢钾、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、尿素、纯净水的复配；
所述洗脱液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、咪唑、纯净水的复配；
所述洗杂液中，乙二胺四乙酸的浓度为0.3-0.4mol/L、磷酸钠浓度为0.01-0.02mol/L、磷酸氢钾浓度为0.01-0.02mol/L、十二烷基磺酸钠浓度为0.5-0.6mol/L、二硫苏糖醇浓度为0.4-0.5mol/L、三羟甲基氨基甲烷浓度为0.7-0.8mol/L、2-吗啉乙磺酸浓度为0.03-0.04mol/L、尿素浓度为0.3-0.4mol/L。
2.根据权利要求1所述的一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，其特征在于：所述洗脱液中，磷酸二氢钠的浓度为0.01-0.02mol/L、磷酸氢二钠的浓度为0.01-0.02mol/L、氯化钠的浓度为0.4-0.5mol/L、咪唑的浓度为0.4-0.5mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，其特征在于：所述铜离子螯合树脂柱的制备方法如下：
步骤01），将大孔螯合型亚胺乙酸基螯合树脂水洗干净后装柱；
步骤02），用浓度为4-6%的盐酸溶液过柱清洗；
步骤03），用纯净水过柱清洗至中性；
步骤04），用浓度为4-6%的氢氧化钠溶液过柱清洗；
步骤05），用纯净水过柱清洗至中性；
步骤06），用浓度为0.4-0.6mol/L的硫酸铜溶液上样至铜离子吸附饱和；
步骤07），用纯净水过柱清洗多余的铜离子；
步骤08），用平衡液过柱平衡，得铜离子螯合树脂柱；
所述平衡液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、纯净水的复配。
4.根据权利要求3所述的一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，其特征在于：所述平衡液中，磷酸二氢钠的浓度为0.01-0.02mol/L、磷酸氢二钠的浓度为0.01-0.02mol/L、氯化钠的浓度为0.45-0.55mol/L。
5.根据权利要求4所述的一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，其特征在于：所述步骤08）中，采用3-4倍柱体积的平衡液过柱平衡。
6.根据权利要求3所述的一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，其特征在于：所述步骤02）中，采用2-4倍柱体积的盐酸溶液过柱清洗。
7.根据权利要求3所述的一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，其特征在于：所述步骤04）中，采用2-4倍柱体积的氢氧化钠溶液过柱清洗。
8.根据权利要求3所述的一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，其特征在于：所述步骤01）中，大孔螯合型亚胺乙酸基螯合树脂在40-45℃温水中浸泡洗净。
9.根据权利要求1所述的一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，其特征在于：所述步骤2）中，血红蛋白裂解原液上铜离子螯合树脂柱的工艺条件为：上样量15-25 mg/g铜离子螯合树脂，柱温15-25℃，上样流速0.5-1.5 ml/min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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2023
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