CN1421458A - 无脂血红蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种无脂血红蛋白的制备方法，其特征在于，采用疏水相互作用色谱，采用透过式层析方式，在聚乙二醇作保护剂的保护下，除去血红细胞裂解液中的磷脂成分和杂质，制备无脂血红蛋白；所述疏水相互作用色谱的疏水介质为苄基琼脂糖－6B型；所述血红细胞裂解液与其所需聚乙二醇保护剂的配比为：每100ml血红细胞裂解液需要2g－5g聚乙二醇保护剂；本发明的方法具有简单、快速、可大规模应用的除去血红细胞裂解液中的磷脂的新方法，并且在脱磷脂的同时，又能除去血红蛋白溶液中的部分杂蛋白；在实施中不需要特殊的设备，因而便于推广应用。
Description
发明领域
本发明属于生物化学技术，特别涉及一种无脂血红蛋白的制备方法。
背景技术
人血液代用品的研究开发是国际医药领域的研究热点，世界各主要发达国家都将其列入跨世纪的重大研究开发项目。尤其是最近二十年，基于对天然血液供应安全性的焦虑和预期的高回报潜力再度激起了人们对开发血液代用品的极大兴趣。目前使用的血液代用品可分为三大类即：全氟碳化合物、基于血红蛋白的血液代用品和通过血型周转换而成的红细胞。其中由于全氟碳化合物不具备天然血红蛋白的主职—载氧功能的特点，其研究与开发已不是重点，而通过血型转换成的红细胞则有贮存期短、不易运输等缺点，也极大地限制了其研究和应用，而基于血红蛋白的血液代用品由于具有天然血红蛋白的载氧、运输CO2和调节血液pH值的功能，倍受研究人员的关注，一直是血液代用品研究方面的重点和难点，而制备出高纯度的血红蛋白是保证该项研究顺利进行的基础。
血红蛋白存在于血红细胞中，可通过红细胞破裂的方法来制备血红蛋白。在血红细胞破裂之后，影细胞和大的基质碎片(红细胞膜碎片)可通过离心或过滤的方法除去，但对于更小的基质颗粒和游离的磷脂分子则必须借助于其它的方法。除去这些脂类的意义在于：可以完全避免在输注血液代用品后在血管内产生血凝固的现象发生，克服了输注血液代用品后所产生的巨大副作用问题。
为解决血红蛋白溶液的脱磷脂问题，研究人员进行了大量的探索工作并取得了很大的进展。1967年以前，许多研究者多采用蒸馏水破碎、超声破碎、机械破碎红细胞，或是冻融法等，后来发现这样破碎的血红蛋白溶液中含有高达10％的磷脂，于是人们采用有机溶剂比如甲苯作溶血剂，但这种处理常导致血红蛋白与甲苯的不可逆结合，引起血红蛋白变性；后来采用类似制备血影的方法，采用低渗液发展起来溶解红细胞的方法，Rabiner于1967年提出制取无基质血红蛋白(SFH)，Feola等发现导致血红蛋白毒性的原因是磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝胺酸(PS)，Sheffield利用中空纤维透析袋，将红细胞放入其中，采用低渗方法透析破碎血红蛋白并可除去细胞膜，进而制得无脂血红蛋白，解决了膜污染的问题，但此法所用的透析器使用一次就得扔掉，Deveneto利用结晶法制备纯血红蛋白，但需耗费大量磷酸缓冲液，Cheung利用DEAE-cellulose混合床层析，但效果不佳。人们还采取了多种方法，但直到今日，真正可以大量制备无脂血红蛋白溶液的方法还处在探索阶段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可简单、快速除去血红细胞裂解液中磷脂和血红蛋白溶液中部分杂蛋白的无脂血红蛋白的制备方法。
本发明提供的无脂血红蛋白的制备方法，其特征在于，采用疏水相互作用色谱，采用透过式层析方式，以聚乙二醇为血红蛋白保护下，除去血红细胞裂解液中的磷脂成分和杂质，制备无脂血红蛋白；所述疏水相互作用色谱的疏水介质为苄基琼脂糖-6B型；所述血红细胞裂解液与其所需聚乙二醇保护剂的配比为：每100ml血红细胞裂解液需要2g-5g聚乙二醇保护剂；所述疏水相互作用色谱使用的平衡液和洗脱液为0.02g-0.05g/ml的PEG4000或PEG10000的5-20mM磷酸缓冲液；本发明提供的无脂血红蛋白的制备方法，还包括对使用后的层析柱进行再生洗脱，其具体步骤为：用4-6倍色谱柱体积的含体积比为1∶10的PEG400无水乙醇逐步过渡到含0.02g-0.05g/ml的PEG4000或PEG10000的10mM磷酸缓冲液冲洗，然后再用2-4倍柱体积的同样的磷酸缓冲液冲洗。
本发明提供的无脂血红蛋白的制备方法具有突出的实质性特点和显著的进步：
根据研究得知，由于磷脂具有的长链疏水尾部结构，因而可以与与疏水层析介质表面的疏水基团发生很强的相互作用；对于血红蛋白四聚体来说，其疏水基团总是趋向于埋藏在分子内部，尽管如此，在血红蛋白的表面仍有一些未被极性基团完全遮盖的疏水区域，该区域也可以与疏水填料的疏水基团有弱的相互作用，该过程属于熵驱动的自发过程；因此，利用疏水色谱技术可除去血红蛋白溶液中的磷脂成分；相对于磷脂分子的强疏水性，血红蛋白的疏水性弱一些，但就血红蛋白本身来看，其疏水性还是很强的，因此添加保护剂如聚乙二醇(PEG)以减轻疏水介质对血红蛋白的吸附；因此本发明方法为一种简单、快速、可大规模应用的除去血红细胞裂解液中的磷脂的新方法，并且在脱磷脂的同时，又能除去血红蛋白溶液中的部分杂蛋白；在实施中不需要特殊的设备，因而便于推广应用。
附图说明
附图1为本发明的方法处理血红细胞裂解液的凝胶过滤图谱；
附图2为用5％PEG4000洗脱样的凝胶过滤图谱。
实施方式
结合实施例及附图进一步描述本发明：
1.疏水作用色谱：
疏水介质作用色谱的过程为：柱子的平衡→上样→洗脱→再生→平衡；
疏水作用色谱介质：琼脂糖-6B型(即苄基琼脂糖)，由本实验室自制；
色谱柱：150mm×16mm，实际装填高度为12-13cm，淋洗速度：0.52ml/min；
层析柱固定后，取适量的已处理好的疏水层析介质置于小烧杯中，加入平衡液(平衡液组成：10mM磷酸缓冲液，一定浓度的不同分子量的PEG4000或PPEG10000，pH7.4)以充分平衡介质，装柱后，用一个柱体积的上述平衡液淋洗色谱柱；将血红细胞裂解液(上样液)用高浓度的PEG调至与平衡液等浓度，上样结束后，用平衡液淋洗色谱柱并用紫外检测仪检测淋洗过程；根据出峰情况分步收集样品；样品收集完后，继续淋洗至基线，然后柱子用再生液(90％乙醇，10％PEG400)再生4个柱体积，之后用平衡液平衡；所得样品用考马斯亮蓝法测定其蛋白量、凝胶过滤分析法判断其蛋白纯度、磷钼酸比色法测定其磷脂含量；
2.凝胶过滤分析：
用Waters紫外检测系统和控制系统进行凝胶过滤分析，凝胶柱为Superdex 200预装柱；待分析的样品在进柱前最好用0.22μm滤膜过滤，淋洗液为含0.15M的10mM的磷酸盐缓冲液(用前需经脱气和过滤处理)；
3.考马斯亮蓝法测定其蛋白浓度：
通过上样前后的蛋白含量的测定可以给出疏水作用色谱的蛋白回收率；
4.磷钼酸比色法测定其磷脂含量：
通过上样前后的磷脂含量的测定可以判断疏水作用色谱的脱磷效果。
实施例1
取经过0.9％NaCl洗涤后的堆积血红细胞1mL，加入4mL的10mM磷酸盐缓冲液，4℃振荡1小时，10000g离心30分钟，上清液即为含有磷脂的血红蛋白溶液；用3倍含5％PEG4000的10mM磷酸盐缓冲液平衡层析柱后上样1mL；样品在上样之前先用10％PEG4000的10mM磷酸盐缓冲液使PEG4000稀释至5％；上样后用含5％PEG4000的10mM磷酸盐缓冲液洗脱，普通的紫外检测仪监测洗脱过程并收集洗脱峰，收集的样品以及上样样品分别测定蛋白含量并计算回收率、磷脂水平和蛋白纯度。蛋白回收率为85％；上样前的磷脂含量为6.25μg/ml，层析后为0.0μg/ml即所有的磷脂均被填料吸附；上样前的样品的凝胶过滤图见图2，层析后洗脱样的凝胶过滤图见图3，从两图可以看出，经过层析后，蛋白峰减少了一条，表明对血红细胞裂解液有初步纯化作用。
实施例2
取经过0.9％NaCl洗涤后的堆积血红细胞1mL，加入4mL的10mM磷酸盐缓冲液，4℃振荡1小时，10000g离心30分钟，上清液即为含有磷脂的血红蛋白溶液；用3倍含2％PEG4000的10mM磷酸盐缓冲液平衡层析柱后上样1mL；样品在上样之前先用4％PEG4000的10mM磷酸盐缓冲液使PEG4000稀释至2％；上样后用含2％PEG4000的10mM磷酸盐缓冲液洗脱，普通的紫外检测仪监测洗脱过程并收集洗脱峰，收集的样品以及上样样品分别测定蛋白含量并计算回收率、磷脂水平和蛋白纯度。蛋白回收率为65％；上样前的磷脂含量为6.25μg/ml，层析后为0.0μg/ml即所有的磷脂均被填料吸附。
实施例3
取经过0.9％NaCl洗涤后的堆积血红细胞1mL，加入4mL的10mM磷酸盐缓冲液，4℃振荡1小时，10000g离心30分钟，上清液即为含有磷脂的血红蛋白溶液；用3倍含3.5％PEG4000的10mM磷酸盐缓冲液平衡层析柱后上样1mL；样品在上样之前先用7％PEG4000的10mM磷酸盐缓冲液使PEG4000稀释至3.5％；上样后用含5％PEG4000的10mM磷酸盐缓冲液洗脱，普通的紫外检测仪监测洗脱过程并收集洗脱峰，收集的样品以及上样样品分别测定蛋白含量并计算回收率、磷脂水平和蛋白纯度。蛋白回收率为80％；上样前的磷脂含量为6.25μg/ml，层析后为0.0μg/ml即所有的磷脂均被填料吸附。
Claims (5)
1.一种无脂血红蛋白的制备方法，其特征在于，采用疏水相互作用色谱，采用透过式层析方式，在聚乙二醇作保护剂的保护下，除去血红细胞裂解液中的磷脂成分和杂质，制备无脂血红蛋白。
2.按权利要求1所述的无脂血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述疏水相互作用色谱的疏水介质为苄基琼脂糖-6B型。
3.按权利要求1所述的无脂血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述血红细胞裂解液与其所需聚乙二醇保护剂的配比为：每100ml血红细胞裂解液需要2g-5g聚乙二醇保护剂。
4.按权利要求1所述的无脂血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述疏水相互作用色谱使用的平衡液和洗脱液为0.02g-0.05g/ml的PEG4000或PEG10000的5-20mM磷酸缓冲液。
5.按权利要求1所述的无脂血红蛋白的制备方法，其特征在于，还包括对使用后的层析柱进行再生，其具体步骤为：用4-6倍色谱柱体积的含体积比为1∶10的PEG400无水乙醇逐步过渡到含0.02g-0.05g/ml的PEG4000或PEG10000的10mM磷酸缓冲液冲洗，然后再用2-4倍柱体积的同样的磷酸缓冲液冲洗。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105561631A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-05-11 | 袁泳 | 高效液相色谱仪中正相填料柱的再生方法 |
| CN116554310A (zh) * | 2023-06-20 | 2023-08-08 | 广州蕊特生物科技有限公司 | 一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法 |
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2001
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| CN116554310B (zh) * | 2023-06-20 | 2024-01-26 | 广州蕊特生物科技有限公司 | 一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法 |
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