CN1252037C - 利用分子印迹法对神经酰胺进行分离纯化的方法 - Google Patents
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Abstract
利用分子印迹法对神经酰胺进行分离纯化的方法，该方法将亲水单体甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、丙烯酸或丙烯酸酯类中的一种或两种与疏水单体苯乙烯和超分子单体混合后再分别与交联剂、致孔剂、引发剂和印迹分子神经酰胺标样混合，原位聚合，脱除致孔剂和模板分子后，得到分子印迹分离介质；采用有机溶剂提取法提取脂类；将脂类提取物加到装有分子印迹分离介质的色谱柱中，实现神经酰胺的分离纯化。本发明同目前神经酰胺分离纯化中采用的薄层色谱法相比，具有分离纯化过程简单，分离纯化效率高，成本低，可以实现连续化操作。神经酰胺作为一种新型生物活性物质，在医药保健和化妆品行业具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种对神经酰胺进行分离纯化的方法，属于神经酰胺的分离纯化技术。
背景技术
神经酰胺英文名称为Ceramide，化学结构是N-脂酰基(神经)鞘氨醇。它在皮肤角质层中含量很高，具有屏障，粘合，保湿，抗衰老和抗过敏作用。最新的研究表明，它还具有活化多种蛋白激酶和转录因子参与细胞内信号传导的功能，从而影响细胞生长、增殖、分化、凋亡及损伤等多种生理、病理过程。作为一种新型生物活性物质，神经酰胺在医药保健和化妆品行业具有广阔的应用前景。
目前实际中应用的神经酰胺一般为天然提取物，取自猪皮、牛脑、鸡蛋、血细胞、植物和酵母细胞等。神经酰胺分离纯化主要采用薄层色谱法。Robson等人于1994年在《Journal ofLipid Research》35卷中叙述了此种方法分离人皮肤角质层中神经酰胺的过程，包括脂类的提取、提取物水解和薄层色谱分离。具体操作如下：采用改进的Bligh and Dyer法提取脂类；在温和的条件下水解提取物；将水解后的提取物加到薄层色谱板上，氯仿/甲醇/乙酸为展开剂，将各组分展开，染色，将含有神经酰胺的部分从薄层色谱硅胶板上刮下，氯仿/甲醇将神经酰胺组分从硅胶上洗脱下来。Rupcic等人于1998年在《Chemistry and Physics of Lipids》91卷中叙述了薄层色谱方法分离酵母中神经酰胺的分离过程，包括酵母细胞的破碎、脂类的提取、提取物水解、正相色谱粗分离和薄层色谱分离。具体操作如下：利用匀浆机将酵母细胞破碎；采用改进的Floch法提取脂类；在温和的条件下水解提取物；正相色谱粗分离；将色谱分离的各组分加到薄层色谱板上，采用25步展开法展开，染色，将含有神经酰胺的部分从薄层色谱硅胶板上刮下，氯仿将神经酰胺组分从硅胶上洗脱下来。可见，采用薄层色谱法分离纯化神经酰胺需要提取液水解和色谱粗分离等预处理过程，分离过程繁琐，周期长，处理量低。
发明内容
针对目前神经酰胺分离纯化方法的不足和缺陷，本发明的目的是提供一种利用分子印迹法对神经酰胺进行分离纯化的方法，实现神经酰胺的高选择性分离，简化分离过程，实现分离过程的连续化，提高处理量。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种利用分子印迹法对神经酰胺进行分离纯化的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)将亲水单体甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、丙烯酸或丙烯酸酯类中的一种或两种与疏水单体苯乙烯和超分子单体含有乙烯基的β-环糊精混合后再分别与交联剂、致孔剂、引发剂和印迹分子神经酰胺标样混合，其中：
a.疏水单体与亲水单体摩尔比为0.25～1
b.超分子单体含有乙烯基的β-环糊精与疏水单体摩尔比为0.01～0.1；
c.交联剂与单体的摩尔比为0.5～20；
d.印迹分子与单体的摩尔比为0.01～1；
e.致孔剂用量占反应混合物体积含量的40～75％；
(2)将上述反应混合物超声混和均匀，加入到反应器中，原位聚合，聚合温度控制在65～85℃之间，反应时间为6～24小时；
(3)聚合反应结束后，将合成的聚合物从反应器中取出，研磨，利用有机溶剂抽提(有机溶剂优选采用乙醇或氯仿)，干燥后，筛分，装填到色谱柱管中，得到分子印迹分离柱；
(4)利用体积比例为2∶1的氯仿与甲醇混合溶液从酵母中提取出脂类物质，干燥后得到提取物样品，再溶入氯仿，配成溶液；
(5)将上述溶液加入到色谱柱中，用有机溶剂冲洗去除非神经酰胺类的脂类物质，然后再用有机溶剂洗脱，收集洗脱组分。
本发明中所述的含有乙烯基的β-环糊精采用单取代或多取代丙烯酰基β-环糊精或单取代或多取代甲基丙烯酰基β-环糊精。
本发明中所述的交联剂采用二烯和三烯交联剂联合使用，二烯与三烯的比为0.5～2，二烯交联剂采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和甲基丙烯酸酯中的任一种；三烯交联剂采用三聚异腈尿酸三烯丙酯、三乙烯苯和甲基丙烯酸酯中的任一种。
本发明中所述的引发剂采用有机过氧类或偶氮类物质，优选采用过氧化二苯甲酰或偶氮二异丁腈。
本发明中所述的致孔剂采用杂环化合物、酰胺或砜类化合物，优选采用吡啶、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
本发明中冲洗所用有机溶剂为氯仿和正己烷的溶液，其中氯仿的体积百分比为0～40％；洗脱所用的有机溶剂为乙醇、甲醇或氯仿和正己烷的溶液，其中氯仿的体积百分比为50～100％。
本发明同目前神经酰胺分离纯化的方法相比，具有以下优点及突出性效果：以神经酰胺为印迹分子，采用亲水单体、疏水单体和超分子单体结合的方法，尤其是引入了含有乙烯基的β-环糊精后，可以使合成的分离介质具有和神经酰胺分子结构和功能基团相匹配的识别位点，从而实现分离介质对神经酰胺的高选择性分离纯化。同目前神经酰胺分离纯化中采用的薄层色谱法相比，采用本发明所合成的色谱介质通过原位聚合制备，仅通过常规的上样、冲洗、洗脱和平衡既可以实现神经酰胺的高效分离纯化，可以实现连续化操作，色谱柱的容量高，分离纯化过程简便，成本低。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明提供的方法予以进一步说明。
实施例1
称取疏水单体苯乙烯、亲水单体甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸和单取丙烯酰基-β-环糊精(1∶0.5∶0.5∶0.01mol/mol/mol/mol)、交联剂二乙烯基苯和三聚异腈尿酸三烯丙酯(1∶1mol/mol，交联剂/单体0.5∶1mol/mol)；致孔剂吡啶(致孔剂/反应混合物75vol％)；引发剂偶氮二异丁腈(引发剂/单体0.01∶1mol/mol)；印迹分子神经酰胺标样(印迹分子/单体0.01∶1mol/mol)，混合均匀，装入100×5.0mm的玻璃管中，将另一端密封，于65℃反应24小时。将聚合物单块取出，研磨，乙醇抽提，干燥。将粒径为37～74微米的色谱介质装填到150×4.6mm色谱柱中，连接到色谱仪上。利用Bligh-Dyer法，从酵母中提取出脂类物质，(Bligh-Dyer法以体积比例为2∶1的氯仿与甲醇混合溶液为提取液)，干燥后得到提取物样品，再溶入氯仿，配成浓度为1mg/ml的溶液。将1ml溶液加入到色谱柱中，正己烷冲洗，然后，氯仿/正己烷(50％∶50％vol/vol)洗脱，得到洗脱的神经酰胺组分。
实施例2
称取疏水单体苯乙烯、亲水单体丙烯酸和单取甲基丙烯酰基-β-环糊精(0.5∶1∶0.1mol/mol/mol/mol)、交联剂二乙烯基苯基甲烷和三甲基丙烯酸三甲醇基丙烷酯(1∶1mol/mol，交联剂/单体1∶1mol/mol)，致孔剂二甲基甲酰胺(致孔剂/反应混合物60vol％)，引发剂偶氮二异丁腈(引发剂/单体0.005∶1mol/mol)，印迹分子神经酰胺标样(印迹分子/单体0.1∶1mol/mol)，混合均匀，装入100×5.0mm的玻璃管中，将另一端密封，于75℃反应12小时。将聚合物单块取出，研磨，乙醇抽提，干燥。将粒径为37～74微米的色谱介质装填到150×4.6mm色谱柱中，连接到色谱仪上。利用Bligh-Dyer法，采用体积比例为2∶1的氯仿与甲醇混合溶液从酵母中提取出脂类物质，干燥后得到提取物样品，再溶入氯仿，配成1mg/ml的溶液。将1ml溶液加入到色谱柱中，30％氯仿/正己烷冲洗，然后，氯仿洗脱，得到洗脱的神经酰胺组分。
实施例3
称取反应单体苯乙烯、甲基丙烯酸羟丙脂、甲基丙烯酸和五取代甲基丙烯酰基-β-环糊精(0.5∶1∶1∶0.025mol/mol/mol/mol)、交联剂甲基丙烯酸烯丙酯和三乙烯苯(1∶2mol/mol，交联剂/单体20∶1mol/mol)，致孔剂二甲基亚砜(致孔剂/反应混合物40vol％)，引发剂过氧化二苯甲酰(引发剂/单体0.02∶1mol/mol)，印迹分子神经酰胺标样(印迹分子/单体1∶1mol/mol)，混合均匀，装入100×5.0mm的玻璃管中，将另一端密封，于85℃反应12小时。将聚合物单块取出，研磨，抽提，干燥。将粒径为37～74微米的色谱介质装填到150×4.6mm色谱柱中，连接到色谱仪上。利用Bligh-Dyer法，采用体积比例为2∶1的氯仿与甲醇混合溶液从酵母中提取出脂类物质，干燥后得到提取物样品，再溶入氯仿，配成1mg/ml的溶液。将1ml溶液加入到色谱柱中，40％氯仿/正己烷冲洗，然后，甲醇洗脱，得到洗脱的神经酰胺组分。
实施例4
称取反应单体苯乙烯、丙烯酸甲脂、丙烯酸和五取代丙烯酰基-β-环糊精(0.5∶1∶1∶0.05mol/mol/mol/mol)、交联剂二乙烯苯和三聚异腈尿酸三烯丙酯(2∶1mol/mol，交联剂/单体10∶1mol/mol)，致孔剂二甲基甲酰胺(致孔剂/反应混合物50vol％)，引发剂过氧化二苯甲酰(引发剂/单体0.01∶1mol/mol)，印迹分子神经酰胺标样(印迹分子/单体0.75∶1mol/mol)，混合均匀，装入100×5.0mm的玻璃管中，将另一端密封，于85℃反应6小时。将聚合物单块取出，研磨，乙醇抽提，干燥。将粒径为37～74微米的色谱介质装填到150×4.6mm色谱柱中，连接到色谱仪上。利用Bligh-Dyer法，采用体积比例为2∶1的氯仿与甲醇混合溶液从酵母中提取出脂类物质，干燥后得到提取物样品，再溶入氯仿，配成1mg/ml的溶液。将1ml溶液加入到色谱柱中，40％氯仿/正己烷冲洗，然后，乙醇洗脱，得到洗脱的神经酰胺组分。
Claims (9)
1.一种利用分子印迹法对神经酰胺进行分离纯化的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)将亲水单体甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、丙烯酸或丙烯酸酯类中的一种或两种与疏水单体苯乙烯和超分子单体含有乙烯基的β-环糊精混合后再分别与交联剂、致孔剂、引发剂和印迹分子神经酰胺标样混合，其中：
a.疏水单体与亲水单体的摩尔比为0.25～1；
b.超分子单体含有乙烯基的β-环糊精与疏水单体物质的摩尔比为0.01～0.1；
c.交联剂与单体的摩尔比为0.5～20；
d.印迹分子与单体的摩尔比为0.01～1；
e.致孔剂用量为反应混合物体积的40～75％；
(2)将上述反应混合物超声混和均匀，加入到反应器中，原位聚合，聚合温度控制在65～85℃之间，反应时间为6～24小时；
(3)聚合反应结束后，将合成的聚合物从反应器中取出，研磨，利用有机溶剂抽提，干燥后筛分，装填到色谱柱管中，得到分子印迹分离柱；
(4)利用体积比例为2∶1的氯仿与甲醇混合溶液从酵母中提取出脂类物质，干燥后得到提取物样品，再溶入氯仿，配成溶液；
(5)将上述溶液加入到色谱柱中，用有机溶剂冲洗去除非神经酰胺类的脂类物质，然后再用有机溶剂洗脱，收集洗脱组分。
2.按照权利要求1所述的分离纯化的方法，其特征在于：所述的含有乙烯基的β-环糊精采用单取代或多取代丙烯酰基β-环糊精或单取代或多取代甲基丙烯酰基β-环糊精。
3.按照权利要求1或2所述的分离纯化的方法，其特征在于：所述的交联剂采用二烯和三烯交联剂联合使用，二烯与三烯的摩尔比为0.5～2，二烯交联剂采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和甲基丙烯酸酯中的任一种；三烯交联剂采用三聚异腈尿酸三烯丙酯、三乙烯苯和甲基丙烯酸酯中的任一种。
4.按照权利要求3所述的分离纯化的方法，其特征在于：所述的引发剂采用有机过氧类或偶氮类物质。
5.按照权利要求4所述的分离纯化的方法，其特征在于：所述的引发剂采用过氧化二苯甲酰或偶氮二异丁腈。
6.按照权利要求3所述的分离纯化的方法，其特征在于：所述的致孔剂采用杂环化合物、酰胺或砜类化合物。
7.按照权利要求6所述的分离纯化的方法，其特征在于：所述的致孔剂为吡啶、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
8.按照权利要求1所述的分离纯化的方法，其特征在于：步骤(3)中的有机溶剂采用乙醇或氯仿。
9.按照权利要求1所述的分离纯化的方法，其特征在于：步骤(5)中冲洗所用有机溶剂为正己烷或氯仿和正己烷的混合溶液，其中混合溶液中氯仿的体积百分比小于等于40％；洗脱所用的有机溶剂为乙醇、甲醇、氯仿或氯仿和正己烷的混合溶液，其中混合溶液中，氯仿的体积百分比大于等于50％。
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