CN1128663C - β－环糊精键合硅胶作为固相萃取吸附介质的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及β-环糊精键合硅胶作为固相萃取吸附介质的应用。β-环糊精键合硅胶具有合成简单、原料便宜的特点，用于固相萃取时，表现出穿透体积大，单位质量吸附量高，选择性高，可再生重复利用的特点。它可以用于环境水样中如硝基酚类化合物的选择性萃取，也可用于生物样品中的药物分子的预富集。
Description
技术领域
本发明涉及β-环糊精键合硅胶作为固相萃取吸附介质的应用。
背景技术
在环境水样和生物样品等的分析中，样品进行预富集和复杂基体的消除是至关重要的。传统的样品预处理通常采用液液萃取(LLE)的方法，但LLE法存在着操作繁琐，有机溶剂消耗量大，对极性化合物的萃取效率低的缺点。在70年代末，80年代初出现的固相萃取技术是一种相对于液液萃取方法萃取效率高，操作简便，有机溶剂消耗量低的方法。近年来无论是在其离线(off-line)模式或在线(on-line)模式均有很快的发展，而离线模式由于其操作具有更大的灵活性，在针对环境水样和生物样品等具复杂基体的样品分析中具有优势。
由于现代分析的检测对象中，极性化合物占有很大的比例，比如环境中的农药降解产物、染料、炸药行业排出的硝基酚类化合物，生物体液、血液中的药物等。对于此类化合物进行预富集时，传统的固相萃取填料如烷基键合硅胶型填料，对于此类化合物存在回收率低，样品在填料上的穿透体积小的问题，随后针对此类极性化合物出现了一些新型填料，如功能高分子聚合物，高度交联聚合物、分子印记聚合物和石墨化碳黑等，它们表现出了对极性化合物较高的萃取效率，方法的回收率较高。
一般而言，固相萃取的填料能对一系列的化合物表现出吸附性能，但最近人们的兴趣又转到了具有选择性的萃取填料上。怎样从复杂基体中获取较为纯净的对象分析物成为人们关注的问题。与此相应地出现了建立在高选择性基础上的填料，而免疫型填料和分子印记型聚合物就是主要的两大类型。它们在应用中表现出了高的选择性，但同时也存在缺陷。对于免疫型填料，纯度较高的抗体获取难，一般较昂贵，而且目前针对小分子化合物的抗体缺乏；对于分子印记聚合物而言，其合成与制备过程较长，操作繁琐，不易得到特异作用位点含量高的聚合物，在水溶液中选择性较差，传质慢。
β-环糊精键合硅胶是在液相色谱中使用广泛、研究较多的一类化学键合相硅胶。由于环糊精能够和一些特定的化合物形成包结络合物，因此在液相色谱中广泛的用于位置异构体、手性对映体的分离。
发明内容
本发明所要解决的问题是寻找一种具有选择性的固相萃取吸附介质，这种吸附介质选择性高、样品容量大且容易得到。
本发明以β-环糊精键合硅胶作为吸附介质用于固相萃取。β-环糊精键合硅胶可由硅胶和环糊精反应得到，其合成过程简便，易于控制，后处理简单，原料易得且便宜。它可以用于环境水样中如硝基酚类化合物的选择性萃取，也可用于生物样品中的药物分子的预富集，并表现出大的穿透体积，样品承受量高，选择性好，可再生重复利用的特点。
具体实施方式
1.β-环糊精键合硅胶(CDS)的合成：取经真空干燥过的β-环糊精5g，以无水二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，NaH为催化剂，在室温下搅拌反应1h，滤去未反应的固体物质。于滤液中加入KH-560(γ-环氧丙基丙基三乙氧基硅烷)2mL，在氮气保护下，于85-90℃反应5h，然后加入10g硅胶(20～30μm)。将反应温度提高到110-115℃继续反应24h，待反应液冷却至室温后，抽滤。产物依次用DMF，甲醇，二次水洗涤，最后再次用甲醇洗涤，滤干后，置烘箱中于80～90℃烘1h，转入干燥器中保存备用。
2.固相萃取：
将所得β-环糊精键合硅胶(CDS)装入柱中构成固相萃取柱，采用真空泵提供负压来驱动样品溶液。
在进行萃取之前，首先用5mL甲醇、5mL二次水或相应的缓冲溶液活化CDS，然后在真空泵负压驱动下使样品溶液流过柱子，采用适量体积清洗液洗去基体的杂质，使用合适的洗脱液把分析物洗脱收集到试管中，于60～70℃水浴中用氮气浓缩后，加入内标物后进行定量分析。实施例1：CDS用于水样中4-硝基酚的选择性固相萃取
1.在线评价CDS(穿透体积的测量)：采用匀浆法，将0.3137gCDS装入一50×4.6mm，I.D.的不锈钢柱，4-硝基酚配成10mg/L的溶液作为流动相，测得穿透体积为136mL，即对应于4-硝基酚的吸附量为4.34mg/lgCDS。结果表明CDS对4-硝基酚有很强的保留能力。
2.固相萃取
活化：采用装填有500mg CDS的固相萃取柱，用5mL甲醇、5mL二次水依次通过柱子，流速为5mL/min。
萃取：250mL样品溶液，含有8种酚类化合物：间二酚，邻二酚，苯酚，4-硝基酚，2-硝基酚，2，4-二甲基酚，4-氯-3-甲基酚和2，4-二氯酚。其浓度均为20μg/L。在填料仍为湿润状态时，保持流速为5mL/min使样品溶液通过柱子。
洗脱：采用混合型洗脱液进行洗脱，其组成为4.7mL甲醇以及0.3mL醋酸钠缓冲溶液(用氢氧化钠调pH9，加入氯化钠使纳离子浓度为0.65mol/L)。5mL/min流速下进行洗脱，收集洗脱物于试管中。
浓缩：将试管置于60～70℃水浴中，用氮气将洗脱物浓缩至1mL。
检测：采用液相色谱系统、紫外检测器进行定量检测，分析柱为ODS柱。流动相条件为A：38％ CH3CN，61％ H2O和1％ HAc；B：25％ CH3CN，74％ H2O和1％ HAc。2，4-二甲基酚，4-氯-3-甲基酚和2，4-二氯酚在A条件下检测，间二酚，邻二酚，苯酚，4-硝基酚，2-硝基酚在B条件下检测。采用3-硝基酚为内标，浓度为2mg/L。将1mL内标溶液加入浓缩后的样品中，振荡摇匀，进样20μL检测。
回收率：进行三次萃取，计算平均回收率为100％，RSD为1.4％。
选择性试验：同以上条件，萃取时，其它酚类化合物，2-硝基酚回收率为83％，4-氯-3-甲基酚为40％，2，4-二氯酚为60％，其余酚类无回收(RSD均小于6％)。加大样品体积到1L，酚类化合物加入浓度为5μg/L，萃取后，4-硝基酚回收率为96％，2-硝基酚回收率降为19％，4-氯-3-甲基酚为0，2，4-二氯酚为20％。若保持样品溶液为250mL，加入浓度为20μg/L，当样品溶液通过柱子后，用5mL甲醇洗去干扰物，得到结果为4-硝基酚回收率为94％，2-硝基酚回收率降为74％，4-氯-3-甲基酚为0，2，4-二氯酚为20％，其余酚类无回收。以上说明，CDS具有对4-硝基酚较大的样品承受容量、大的穿透体积和高的选择性。
3.实际水样的分析：
取武汉东湖水250mL，过滤后，加入上述8种酚类化合物，加入浓度为20μg/L，同2的操作程序萃取后，结果为，4-硝基酚回收率为63％，其余酚类几乎无回收。结果表明，β-环糊精键合硅胶可以用于实际水样的分析，具有很好的选择性。经水样中腐殖酸污染的柱子在再次萃取时回收率无明显降低。实施例2：CDS用于水样中2，4-二硝基酚的选择性固相萃取
活化：采用装填有500mg CDS的固相萃取柱，用5mL甲醇、5mL二次水依次通过柱子，流速为5mL/min。
萃取：250mL样品溶液，含有8种酚类化合物：间二酚，邻二酚，苯酚，2，4-二硝基酚，2-硝基酚，2，4-二甲基酚，4-氯-3-甲基酚和2，4-二氯酚。其浓度均为20μg/L。在填料仍为湿润状态时，保持流速为5mL/min使样品溶液通过柱子。
洗脱：采用混合型洗脱液进行洗脱，其组成为4.7mL甲醇以及0.3mL醋酸钠缓冲溶液(用氢氧化钠调pH9，加入氯化钠使纳离子浓度为0.65mol/L)。5mL/min流速下进行洗脱，收集洗脱物于试管中。
浓缩：将试管置于60～70℃水浴中，用氮气将洗脱物浓缩至1mL。
检测：采用液相色谱系统、紫外检测器进行定量检测，分析柱为ODS柱。流动相条件为A：38％ CH3CN，61％ H2O和1％ HAc；B：25％ CH3CN，74％ H2O和1％ HAc。2，4-二甲基酚，4-氯-3-甲基酚和2，4-二氯酚在A条件下检测，间二酚，邻二酚，苯酚，2，4-二硝基酚，2-硝基酚在B条件下检测。采用3-硝基酚为内标，浓度为2mg/L。将1mL内标溶液加入浓缩后的样品中，振荡摇匀，进样20μL检测。
回收率：进行三次萃取，计算平均回收率为96％，RSD为1％。
选择性试验：同以上条件，萃取时，其它酚类化合物，2-硝基酚回收率为83％，4-氯-3-甲基酚为40％，2，4-二氯酚为60％，其余酚类无回收(RSD均小于6％)。加大样品体积到1L，酚类化合物加入浓度为5μg/L，萃取后，4-硝基酚回收率为99％，2-硝基酚回收率降为19％，4-氯-3-甲基酚为0，2，4-二氯酚为20％。若保持样品溶液为250mL，加入浓度为20μg/L，当样品溶液通过柱子后，用5mL甲醇洗去干扰物，得到结果为4-硝基酚回收率为90％，2-硝基酚回收率降为74％，4-氯-3-甲基酚为0，2，4-二氯酚为20％，其余酚类无回收。以上说明，CDS具有对2，4-二硝基酚较大的样品承受容量，大的穿透体积，和高的选择性。
3.实际水样的分析：
取武汉东湖水250mL，过滤后，加入上述8种酚类化合物，加入浓度为20μg/L，同2的操作程序萃取后，结果为，2，4-二硝基酚回收率为46％，其余酚类几乎无回收。结果表明，β-环糊精键合硅胶可以用于实际水样的分析，具有很好的选择性。实施例3：CDS用于人体血浆样品中心得安的分析。
活化：将5mL甲醇、5mL磷酸二氢钾缓冲液(0.1mol/mL，pH7.2)依次通过固相萃取柱。
萃取：将取肝素抗凝的血浆1mL，加入磷酸二氢钾缓冲液(0.1mol/mL，pH7.2)1mL，振荡混匀后将其通过已活化的CDS固相萃取柱。
清洗：用磷酸二氢钾缓冲液2mL清洗柱体，再用甲醇—磷酸二氢钾缓冲液(1∶9)清洗。
洗脱：用甲醇—水(85∶15)2mL洗涤，收集洗脱液，在60℃水浴中氮气吹干，以流动相200μL溶解，取20μL进样。
检测：通过工作曲线法定量测的回收率为：心得安浓度为10ng/mL，100ng/mL时，回收率为95，93％，RSD为4，5％。
结果表明，由于CDS对于血浆中大量的蛋白质无吸附，可以是血浆样品直接进样，经清洗步骤除去干扰杂质和基体后，心得安回收率较高。萃取柱可以重复使用。
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1.β-环糊精键合硅胶作为吸附介质用于固相萃取。
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