CN107312082A - 一种从血清中获取天然前白蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从血清中获取天然前白蛋白的方法，解决了现有技术中去除PA蛋白中的Alb蛋白的方式步骤复杂、速度慢或会导致目标蛋白变性的问题。本发明包括(1)血清过滤除脂肪后，调节pH值至4.60～4.90，加入Alb特异性结合物使Alb沉淀，离心过滤后收集滤液；(2)降低滤液的pH值至4.40～4.70，加入PA蛋白促凝剂后获得PA蛋白沉淀；(3)PA蛋白沉淀复溶，透析制成成品。本发明能有效达到快速去除PA蛋白中的Alb蛋白的目的，且该方法具有成本低廉、效果显著等优点。

Description

一种从血清中获取天然前白蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种试剂盒及其制备方法，具体涉及一种从血清中获取天然前白蛋白的方法及其制备方法。

背景技术

重组PA纯度高，但在抗原决定簇和蛋白结构上与天然PA有差异，导致PA抗体对重组PA和天然PA存在不同的识别情况，并且重组PA价格昂贵，因而从血清中获取高浓度天然前白蛋白是一种最为有效的方式。但是由于PA蛋白和Alb蛋白具有相近的等电点和分子量，现有技术中的分离纯化过程难区分两种蛋白，蛋白测定实验发现，在Alb和PA的复合物中，随着Alb蛋白浓度的逐渐升高PA蛋白浓度测定值逐步降低。因此，去除Alb蛋白显得尤为重要。

东华大学的专利公开了一种固相萃取剂富集人血浆中前白蛋白的方法(申请号201610109013.1)，包括：将氧化石墨烯分散液超声雾化，然后通过400℃～450℃的石英管，收集，干燥，得到石墨烯微球固相萃取剂；将氯化钠加入到含有前白蛋白的血浆中，然后加入苯酚溶液，搅拌，静置，离心，得上清液；将石墨烯微球加入到固相萃取柱，然后活化固相萃取柱，然后将上清液通过固相萃取柱，淋洗，真空泵抽至进干，洗脱，氮吹浓缩，进入HPLC分析检测。该方法并未考虑去除白蛋白步骤，并且提取过程繁琐、复杂。

山西瑞亚力科技有限公司的专利公开了从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法(申请号201510019329.7)。该方法包括下述步骤：取血浆，使用阴离子交换柱对其进行第一次层析纯化处理，获得PA-RBP复合物初体；使用疏水柱对所述PA-RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理，得到纯化后的PA-RBP复合物；将所述纯化后的PA-RBP复合物进行解离处理，得到含有PA和RBP的混合样品；使用疏水柱对将所述混合样品进行第三次层析纯化处理，分离得到PA和RBP。该方法并未考虑去除白蛋白步骤，并且提取过程繁琐、复杂。

财团法人化学及血清疗法研究所的专利公布了去除人血清白蛋白的方法(申请号：01805629.6)。具体而言，是将含有人血清白蛋白多聚体的人血清白蛋白溶液用盐浓度为50～75mM的缓冲液进行透析，强阴离子交换体选择性吸附白蛋白。该过程需要用到阴离子交换柱，去除过程还不够快、简化。

温州医学院的专利公布了一种用柠檬酸乙醇去除血清中白蛋白的方法。具体而言，包括如下步骤：1)将血清离心去除脂质；2)加入血清蛋白提取液，混匀后置于-20℃冰箱，静置30min；3)样品提取液离心；4)分别收集离心沉淀与上清液。去除过程中甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键，从而破坏了蛋白质中原有的氢键，可能会使血清中的目标蛋白变性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：现有技术中去除PA蛋白中的Alb蛋白的方式步骤复杂、速度慢或会导致目标蛋白变性的问题，目的在于提供了一种从血清中获取天然前白蛋白的方法，其通过试剂和工艺步骤的优化，在避免目的蛋白变性的同时，能有效达到快速去除PA蛋白中的Alb蛋白的目的，且该方法成本低廉、效果显著。

本发明通过下述技术方案实现：

一种从血清中获取天然前白蛋白的方法，包括：

(1)血清过滤除脂肪后，调节pH值至4.60～4.90，加入Alb特异性结合物使Alb沉淀，离心过滤后收集滤液；

(2)降低滤液的pH值至4.40～4.70，加入PA蛋白促凝剂后获得PA蛋白沉淀；

(3)PA蛋白沉淀复溶，透析制成成品。

由于蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有的电荷。如改变这两个因素蛋白质就容易沉淀折出。

等电点沉淀主要应用于蛋白质等两性电解质的分离提纯。在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等电点时的许多物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从而有利于悬浮液的过滤。

透析是膜技术的一种，利用透析膜可以选择性地透过一定大小分子，从而将待分离纯化的物质和杂质离子分离开。

本发明利用等电点沉淀的原理，即采用将废弃人血清离心过滤除脂肪，调节血清pH值至Alb等电点附近使Alb溶解度降低，然后加入Alb特异性结合物使Alb蛋白发生沉淀，通过离心过滤获得滤液，然后再将滤液pH值降低至PA等电点附近，加入PA蛋白促凝剂使PA蛋白沉淀，获得PA蛋白的沉淀，PA蛋白成沉淀复溶后通过透析即可获得高纯度的PA蛋白，为了获得更高的浓度，还可以采取浓缩的方式，进而有效获得高浓度的PA蛋白。

本发明通过各个工艺、试剂和参数的优化，能有效去除PA蛋白中的Alb蛋白，并且在去除PA蛋白中的Alb蛋白过程中，操作更加简便、快速，且不会导致目标蛋白的变性。而且采用本发明方法制备时具有成本低廉的效果，并且由于通过本发明获取的天然前白蛋白中白蛋白含量极低，因而非常适用于科研目的，如：用于单克隆抗体或多克隆抗体免疫原的制备，效果十分显著。

进一步，步骤(1)和步骤(2)中均采用稀盐酸调节pH值。所述Alb特异性结合物为正辛酸或辛酸盐。所述PA蛋白促凝剂采用分子量为2000～6000的PEG。所述Alb特异性结合物的加入量为5％～10％。所述PA蛋白促凝剂的加入量为5％～11％。

通过上述试剂的优化选择，能有效避免PA蛋白的变性，并且与试剂的用量相配合后，能最大化的保证PA蛋白的纯度和收率，效果更加显著。

所述透析时采用含高分子材料的透析液进行处理，该高分子材料的含量为5％～15％。所述高分子材料采用分子量为20000～35000的PEG。本发明以特殊分子量的高分子材料作为透析液，同步实现PA蛋白纯化及浓缩。

优选地，所述步骤(1)中的pH值调整到4.60～4.80；所述步骤(2)中的pH值降低到4.40～4.60。

为了能最大化的去除Alb蛋白，所述步骤(1)的离心过滤过程为：首先在4℃、18000r/min高速条件下离心20min，上清液采用0.65μm的PP滤膜进行过滤后获得滤液。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明在保证PA蛋白不变性的前提下，优化了Alb蛋白的去除步骤，有效达到操作快速、成本低廉、无杂质引入的效果；

2、本发明在高度保留PA蛋白的前提下，实现对Alb蛋白的有效去除。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

一种从血清中获取天然前白蛋白的方法，包括：

a.将废弃人血清离心过滤除脂肪，取100ml；

b.稀盐酸调节血清pH值至4.80；

c.加入8ml正辛酸，Alb蛋白发生沉淀；

d.4℃18000r/min 20min高速离心，0.65μm的PP滤膜过滤获得滤液；

e.调节滤液pH值至4.60，加入9％的PEG4000，PA蛋白聚集生成浅蓝色沉淀，获得PA

f.PA蛋白沉淀复溶，然后透析去除杂质并浓缩制成成品，浓缩倍数为10倍，透析液中含10％PEG20000。

对成品中的PA蛋白、Alb蛋白以及TP蛋白的含量进行测定，检测结果如表1所示。

表1

通过表1可知，本发明能显著去除PA蛋白中的Alb蛋白，得到高浓度的天然前蛋白，并且经过检测得知，本实施例获得的体积为17.5ml，PA收率为59.18％，Alb去除率为99.79％。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中参数不同，本实施例的具体制备方法如下：

a.将废弃人血清离心过滤除脂肪，取100ml；

b.稀盐酸调节血清pH值至4.30；

c.加入3ml正辛酸，Alb蛋白发生沉淀；

d.4℃18000r/min 20min高速离心，0.65μm的PP滤膜过滤获得滤液；

e.调节滤液pH值至4.30，加入3％的PEG4000，PA蛋白聚集生成浅蓝色沉淀，获得PA蛋白沉淀；

f.PA蛋白沉淀复溶，然后透析去除杂质并浓缩2.5倍，透析液中含3％的PEG20000。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中参数不同，本实施例的具体制备方法如下：

a.将废弃人血清离心过滤除脂肪，取100ml；

b.稀盐酸调节血清pH值至4.60；

c.加入5ml正辛酸，Alb蛋白发生沉淀；

d.4℃18000r/min 20min高速离心，0.65μm的PP滤膜过滤获得滤液；

e.调节滤液pH值至4.40，加入5％的PEG4000，PA蛋白聚集生成浅蓝色沉淀，获得PA蛋白沉淀；

f.PA蛋白沉淀复溶，然后透析去除杂质并浓缩2.5倍，透析液中含5％的PEG20000。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中参数不同，本实施例的具体制备方法如下：

a.将废弃人血清离心过滤除脂肪，取100ml；

b.稀盐酸调节血清pH值至4.80；

c.加入10ml正辛酸，Alb蛋白发生沉淀；

d.4℃18000r/min 20min高速离心，0.65μm的PP滤膜过滤获得滤液；

e.调节滤液pH值至4.60，加入11％的PEG6000，PA蛋白聚集生成浅蓝色沉淀，获得PA蛋白沉淀；

f.PA蛋白沉淀复溶，然后透析去除杂质并浓缩2.5倍，透析液中含15％的PEG20000。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中参数不同，本实施例的具体制备方法如下：

a.将废弃人血清离心过滤除脂肪，取100ml；

b.稀盐酸调节血清pH值至5.20；

c.加入13ml正辛酸，Alb蛋白发生沉淀；

d.4℃18000r/min 20min高速离心，0.65μm的PP滤膜过滤获得滤液；

e.调节滤液pH值至4.90，加入15％的PEG6000，PA蛋白聚集生成浅蓝色沉淀，获得PA蛋白沉淀；

f.PA蛋白沉淀复溶，然后透析去除杂质并浓缩2.5倍，透析液中含18％的PEG20000。

分别对上述实施例2～实施例5的浓缩前后的成品中的脂蛋白、免疫球蛋白、补体蛋白等的含量进行测定，检测结果如表2所示。

表2

分别对上述实施例2～实施例5的浓缩前后的成品中的PA蛋白、Alb蛋白的含量进行测定，计算PA收率及Alb去除率，结果如表3所示。

表3

通过上述表2和表3可知，采用本发明数值范围的方法能获得较佳的PA收率及Alb去除率，效果十分显著。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从血清中获取天然前白蛋白的方法，其特征在于，包括：

(1)血清过滤除脂肪后，调节pH值至4.60～4.90，加入Alb特异性结合物使Alb沉淀，离心过滤后收集滤液；

(2)降低滤液的pH值至4.40～4.70，加入PA蛋白促凝剂后获得PA蛋白沉淀；

(3)PA蛋白沉淀复溶，透析制成成品。

2.根据权利要求1所述的一种从血清中获取天然前白蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中均采用稀盐酸调节pH值。

3.根据权利要求1所述的一种从血清中获取天然前白蛋白的方法，其特征在于，所述Alb特异性结合物为正辛酸或辛酸盐。

4.根据权利要求1所述的一种从血清中获取天然前白蛋白的方法，其特征在于，所述Alb特异性结合物的加入量为5％～10％。

5.根据权利要求1所述的一种从血清中获取天然前白蛋白的方法，其特征在于，所述PA蛋白促凝剂采用分子量为2000～6000的PEG。

6.根据权利要求1所述的一种从血清中获取天然前白蛋白的方法，其特征在于，所述PA蛋白促凝剂的加入量为5％～11％。

7.根据权利要求1所述的一种从血清中获取天然前白蛋白的方法的制备方法，其特征在于，所述透析时采用含高分子材料的透析液进行处理，该高分子材料的含量为5％～15％。

8.根据权利要求7所述的一种从血清中获取天然前白蛋白的方法，其特征在于，所述高分子材料采用分子量为20000～35000的PEG。

9.根据权利要求1所述的一种从血清中获取天然前白蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的pH值调整到4.60～4.80；所述步骤(2)中的pH值降低到4.40～4.60。

10.根据权利要求1所述的一种从血清中获取天然前白蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(1)的离心过滤过程为：首先在4℃、18000r/min高速条件下离心20min，上清液采用0.65μm的PP滤膜进行过滤后获得滤液。