CN103012581A

CN103012581A - 制备白蛋白的方法

Info

Publication number: CN103012581A
Application number: CN2012104974174A
Authority: CN
Inventors: 李英俊; 臧丽; 徐新萍; 鞠录欣; 李苏超; 刘江静; 金越红; 张丛茹; 孙静文; 许宁; 李光健
Original assignee: 李英俊
Current assignee: Beijing Tonghe Litai Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2012-11-28
Filing date: 2012-11-28
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2032-11-28
Also published as: CN103012581B

Abstract

本发明给提供了一种制备犬血清白蛋白的方法，该方法包括：（1）将血清与生理盐水混合，并加入饱和硫酸铵溶液；（2）将步骤（1）中所得到的混合物静置，以便形成含有沉淀的混合物；（3）从步骤（2）中所得到的含有沉淀的混合物中分离第一上清液，该上清液含有目标白蛋白；（4）将上述第一上清液的pH调节至目标白蛋白的等电点，以便形成白蛋白沉淀；以及（5）收集目标白蛋白。通过该制备方法能够有效制备白蛋白。

Description

制备白蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的而言，涉及一种制备白蛋白的方法。

背景技术

血清蛋白又称白蛋白。一类分子量较小，呈球状，能溶于水的蛋白质。主要存在于哺乳动物、细菌、霉菌和植物中。卵白蛋白、乳白蛋白、豆白蛋白和血清白蛋白等都属此类。卵白蛋白是蛋清中的一种重要蛋白质，约占蛋清总蛋白的70%。血清白蛋白是血清中含量最丰富的蛋白质，占血清总蛋白量的50%以上，不含糖，在饱和硫酸铵溶液中沉淀析出。血清白蛋白在血液中有重要生理功能，和维持血液正常渗透压有关，是血液总渗透压的主要调节物质，缺少该白蛋白可能导致机体浮肿。血清白蛋白的另一作用是作为脂肪酸的载体参与运送脂肪酸。

然而，目前制备白蛋白的方法，仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备白蛋白的方法。根据本发明实施例，该方法包括以下步骤：（1）将血清与生理盐水混合，并加入饱和硫酸铵溶液；（2）将步骤（1）中所得到的混合物静置，以便形成含有沉淀的混合物；（3）从步骤（2）中所得到的含有沉淀的混合物中分离第一上清液，所述上清液含有所述白蛋白；（4）将所述第一上清液的pH调节至所述白蛋白的等电点，以便形成白蛋白沉淀；以及（5）收集所述白蛋白。由此，利用根据本发明实施例的制备白蛋白的方法，能够有效地制备白蛋白。另外，根据本发明实施例的方法，白蛋白的提取率高、效率高、并且白蛋白的纯度高，所形成聚合物及其他杂质的含量少，从而能够进一步对含有上述白蛋白的生物样本例如血浆进行分析，可以有效地获得关于生物样本的生化或者病理信息，例如可以用于疾病诊断、治疗和化学领域应用。根据本发明的实施例尤其适合制备犬血清白蛋白。

根据本发明的实施例，可以利用本发明的方法提取的白蛋白的类型不受特别限制。例如，根据本发明的实施例，可以提取的白蛋白的非限制性实例包括：卵白蛋白和血清白蛋白。根据本发明的具体实施例，可以利用本发明的方法提取血清白蛋白，例如犬血清白蛋白，其中，根据本发明的实施例，为提取犬血清白蛋白，可以从犬动脉血分离血清样本。发明人发现，犬动脉血中含氧量丰富，而含二氧化碳的量少，其pH值相对较低，由此易于控制体系的酸碱度，另外，发明人惊奇地发现在分离过程中，犬动脉血中犬血清白蛋白的等电点稳定性显著高于其他血样样本。由此，可以提高制备白蛋白效率和白蛋白的质量。另外，根据本发明实施例的方法制备得到的犬血清白蛋白可以用于制备治疗急、危、难、重、病犬的特效生物制品。用于犬失血性创伤性、严重烧伤、烫伤等引起的休克，犬脑水肿及损伤引起的颅压升高，犬肝硬化及肾病引起的水肿或腹水和犬低蛋白血症的防治。

根据本发明的一个实施例，在将血清与生理盐水混合之前，可以对血清进行预处理，例如可以预先对血清进行下列处理：将血清进行离心，并收集第二上清液和将第二上清液进行过滤除菌。根据本发明的一个示例，收集第二上清液的方法并不受特别限制，例如，对于犬动脉全血，可以先将犬动脉全血在4摄氏度环境下静置分离得到血清，然后将血清进行离心收集得到第二上清液。由此，可以提高血清的纯度，从而进一步提高制备白蛋白纯度和效果。根据本发明的另一个示例，对第二上清液的处理过程还进一步包括对第二血清进行过滤除菌的步骤，由此，可以除去在样本收集，例如采犬血过程中引入的各种细菌病毒等，进一步可以避免引入的细菌和病毒对血清的污染，从而提高提取白蛋白的纯度。

根据本发明的一些示例，在将血清与生理盐水混合之前对血清进行预处理的方法进一步包括向经过过滤除菌的第二上清液中添加防腐剂，根据本发明的具体示例，可以添加的防腐剂并不受特别限制，根据本发明的实施例，可以采用硫柳汞溶液，其中，硫柳汞的终浓度不超过0.01重量%。由此，可以避免在制备白蛋白的过程中蛋白质腐败变性，导致白蛋白含量降低，产生附加杂质等不利影响。因此，添加适量的防腐剂可以有效的提高白蛋白提取效率和纯度，避免血浆的浪费。另外，上述方法获得的经过除菌和加入防腐剂的第二上清液，可以直接作为血清样品进行后续处理，以便获得白蛋白。

另外，根据本发明的实施例，在步骤（1）中，所采用的生理盐水的量并不受特别限制，根据本发明的实施例，可以将血清与生理盐水按照等体积进行混合。由此，发明人惊奇地发现，可以通过添加生理盐水，优选地按照等体积将血清与生理盐水进行混合，可以防止在后续加入饱和硫酸铵溶液进行处理时，防止白蛋白与其他蛋白同时沉淀出来，即通过添加生理盐水，可以防止“共沉淀”现象，从而可以有效地提高制备白蛋白的效率。根据本发明的实施例，在将血清与生理盐水混合之后，可以向所得到的混合物中添加饱和硫酸铵，从而可以将血清中所包含的除白蛋白以外的蛋白质有效地沉淀出来。根据本发明的实施例，所添加的饱和硫酸铵溶液的量并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用的饱和硫酸铵溶液的pH值为7.2~7.4，并且所添加饱和硫酸铵溶液的体积为血清体积的两倍。由此，可以有效地提高利用硫酸铵溶液沉淀蛋白质的效率，进而可以提高白蛋白提取率的和提取效果，使得提取的白蛋白的效率更高。

另外，本发明的发明人还发现，随着搅拌，优选磁力搅拌，向血清和生理盐水的混合物中加入饱和硫酸铵溶液，由此，可以避免因血清中加入的饱和硫酸铵溶液后局部饱和硫酸铵溶液浓度过高而产生白蛋白共沉淀现象。由此，可以进一步有效地将血清中除白蛋白以外的其他蛋白质以沉淀的形式与白蛋白进行分离，从而提高提取白蛋白的纯度。同时，本发明的发明人还发现，优选，缓慢地（例如加入饱和硫酸铵溶液的速度可以为20滴/分钟）向血清和生理盐水的混合物中加入饱和硫酸铵溶液，例如，向血清和生理盐水的混合物中滴加饱和硫酸铵溶液，可以避免气泡的产生。发明人发现，通常在体系中蛋白质沉淀不均匀的情况下，搅拌的过程中会产生气泡，缓慢加入饱和硫酸铵溶液可以避免。由此，可以进一步提高制备白蛋白的纯度。根据本发明的一个实施例，将血清中白蛋白进行沉淀后所得到的混合物在4摄氏度下静置6~12小时，例如静置过夜。由此，在该条件下可以使得血清中除白蛋白以外的其他蛋白得到充分沉淀，进而与白蛋白充分分离，从而提高制备白蛋白的提取率。

根据本发明的实施例，饱和硫酸铵的制备方法并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，可以通过下列步骤获得饱和硫酸铵溶液：将500ml蒸馏水加热到70～80℃，在搅拌下加入450g硫酸铵，搅拌20min，使之全部溶解，趁热过滤后，将滤液室温放置过夜，当部分硫酸铵结晶析出时，即得到饱和硫酸铵溶液，再用28重量%的NH₄OH调至溶液pH为7.4~7.2。由此，得到的饱和硫酸铵溶液，可以进一步提高沉淀蛋白的效率，提高制备白蛋白的效率。另外，根据本发明的实施例，所采用的饱和硫酸铵溶液不含金属离子，例如通过采用纯硫酸铵制备得到的饱和硫酸铵溶液，由此，可以避免硫酸铵溶液中含有的金属离子与白蛋白结合。由于金属离子的存在会与白蛋白结合，进而影响白蛋白的结构和功能。

根据本发明的实施例，在添加饱和硫酸铵溶液后，可以使得除白蛋白以外的蛋白质形成沉淀，从而可以得到含有沉淀的混合物。接下来，可以从所得到的混合物中分离第一上清液，该第一上清液中含有白蛋白。根据本发明的实施例，从混合物中分离第一上清液的方法并不受特别限制，根据本发明的一些示例，可以将混合物在3,800rpm离心20分钟的条件下进行分离，获得第一上清液，第一上清液中含有白蛋白。由此，可以将血清中除白蛋白以外的其他蛋白质与白蛋白进行有效地分离，得到含有白蛋白的第一上清液，从而进一步提高制备白蛋白的效率。

根据本发明的一个实施例，在分离第一上清液之后，可以进一步对第一上清液中含有的白蛋白进行提纯。根据本发明的一些示例，可以通过将第一上清液的pH调节至白蛋白的等电点，以便形成白蛋白沉淀。从而可以有效地实现从第一上清液中分离白蛋白。根据本发明的实施例，可以利用等电点沉淀法分离的白蛋白的等电点为4.7~4.9，根据本发明的具体示例，可以提取的白蛋白为犬血清白蛋白，犬血清白蛋白的等电点为4.7。根据本发明的实施例，可以通过在4摄氏度下按照下列操作将第一上清液的pH调节至白蛋白的等电点：随着搅拌，向第一上清液中滴加1mol/L的醋酸调节溶液pH值到白蛋白的等电点，由此，在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。根据本发明的实施例，在4摄氏度下向第一上清液中缓慢滴加1mol/L的醋酸，调节溶液pH达到4.7时，立即停止滴加醋酸。由此，可使白蛋白在达到等电点时形成沉淀，进而达到与第一上清液中的其他成分有效的分离开。从而，使得白蛋白得到进一步纯化，提高制备白蛋白的纯度和质量。根据本发明的实施例，将含有白蛋白沉淀的第一上清液在3,800rpm离心20分钟的条件下进行分离，收集白蛋白沉淀。

利用根据本发明实施例的制备白蛋白的方法，在得到高纯度的白蛋白沉淀之后，还可以进一步将所收集的白蛋白沉淀按照1:10的重量比与双蒸水混合；向所得到的混合物中添加1mol/L的氢氧化钠溶液以便将该混合物的pH调节至7.0，获得白蛋白的水溶液。由此，可使白蛋白沉淀溶解，得到白蛋白溶液。在将白蛋白沉淀进行溶解的过程中，本发明的发明人惊奇的发现，先向白蛋白沉淀中加入少量双蒸水，然后用玻璃棒搅成糊状，再慢慢加入所需浓度的氢氧化钠溶液适量。由此，可以提高白蛋白的溶解效率。

需要说明的是，本发明的技术方案是发明人经过大量研究实验，意外获得的。由于白蛋白自身性质的特殊性，目前常规的蛋白质分离纯化技术，难以有效地用于制备白蛋白，尤其是对于犬血清样本，由于犬血清样本成份复杂，目前常规的蛋白质分离纯化技术，难以有效地用于制备白蛋白，发明人惊奇地发现，利用本发明的技术方案，能够有效地从犬血清样本中制备白蛋白，其可以回收血清中98%的白蛋白，而且纯度可达99.5%，另外发明人惊奇地发现，利用本发明的技术方案所得到的白蛋白的生物活性显著高于其他现有技术。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

下面通过具体的实施例，对本发明进行说明。需要说明的是，下面的实施例仅仅是说明性的，而不以任何方式限制本发明的范围，另外，在下面实施例中所采用的试剂和设备均为市售可得的，在下面的实施例中没有描述的处理和制剂配制方法，则均为本领域技术人员公知的方法进行处理和配制。

实施例1

器械：5000ml三角烧瓶×10、试管、玻璃棒、烧杯、磁力搅拌器、超滤器。

试剂：（NH4）2SO4、BaCl2、NaHCO3、NaOH、HgI₂、KI、NH₄OH、醋酸。

制备饱和硫酸铵：

将500ml蒸馏水，加热到70～80℃，在搅拌下加入450g硫酸铵，搅拌20min，使之全部溶解，趁热过滤后，将滤液室温放置过夜，部分硫酸铵结晶析出，得到饱和硫酸铵溶液，此饱和硫酸铵溶液的pH值约为5，再用28%的NH₄OH调至溶液pH为7.4或者7.2。

纳氏试剂制备：将70ml的10重量%的NaOH、15ml双碘化物溶液（配制方法见后）和15ml蒸馏水混合得到纳氏试剂。

双碘化物溶液的制备：

称取5.75g的HgI₂和4g的KI置于25ml蒸馏水中，再加入25ml的6mol/L NaOH溶液，即得双碘化物溶液，将其存于棕色的瓶中备用。

实施例2

成年健康犬在控食不控水8h后深度麻醉，用四联采血袋、16号针头从股动脉采血，采血量以体重的3%为上限量。放入4℃冰箱中静置48h，以便血清自然析出，在3,600rpm×20min条件下离心，分离血清，再用0.22μm的滤膜对得到的血清进行过滤除菌，加入0.01%的硫柳汞防腐，硫柳汞的终浓度不超过0.01重量%。

取100ml经过处理后的血清，加入生理盐水100ml，电磁搅拌下，缓慢加入pH7.2饱和硫酸铵200ml，使体系中硫酸铵的饱和度达到50%。

将上述体系放入4℃环境静置过夜，使其充分沉淀。沉淀完全后以3,800rpm离心20min获得沉淀和上清液。将上清液在4℃环境中边搅拌边滴加1mol/L的冰醋酸，并实时测定体系的pH值，当pH值达到4.7时立即停止滴加醋酸，此时已达到犬血清白蛋白的等电点并继续搅拌30min。然后放入4℃环境中，使白蛋白充分沉淀。

将上一步所得的白蛋白沉淀以1:10的比例置入双蒸水中，在10℃的环境中，缓慢滴加经灭菌的1mol/L的NaOH溶液，调节体系的pH达到7.0。此时体系澄清透明，并呈棕黄色，即为所提取的犬血白蛋白溶液。

结果：根据本实施例的方法，可获取血清中98%的白蛋白，而且纯度可达99.5%。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种制备白蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将血清与生理盐水混合，并加入饱和硫酸铵溶液；

（2）将步骤（1）中所得到的混合物静置，以便形成含有沉淀的混合物；

（3）从步骤（2）中所得到的含有沉淀的混合物中分离第一上清液，所述上清液含有所述白蛋白；

（4）将所述第一上清液的pH调节至所述白蛋白的等电点，以便形成白蛋白沉淀；以及

（5）收集所述白蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白蛋白为犬血清白蛋白，所述血清是从犬动脉血分离的。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在将血清与生理盐水混合之前，预先对血清进行下列处理：

将所述血清进行离心，并收集第二上清液；将所述第二上清液进行过滤除菌；

向经过过滤除菌的第二上清液中添加硫柳汞，其中，所述硫柳汞的终浓度不超过0.01重量%。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述血清与所述生理盐水按照等体积混合。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述饱和硫酸铵溶液的pH值为7.2~7.4，并且所述饱和硫酸铵溶液的体积为所述血清体积的两倍。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，将步骤（1）中所得到的混合物在4摄氏度下静置6~12小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述步骤（2）中所得到的含有沉淀的混合物，在3800rpm下离心20分钟，以便获得第一上清液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白蛋白为犬血清白蛋白，所述白蛋白的等电点为4.7。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述第一上清液的pH调节至所述白蛋白的等电点是通过在4摄氏度下，随着搅拌，向所述第一上清液中滴加1M的醋酸而完成的。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：

将所收集的白蛋白按照1∶10的重量比与双蒸水混合；

向所得到的混合物种添加1mol/L的NaOH以便将该混合物的pH调节至7.0，以便获得所述白蛋白的水溶液。