CN100559957C - 禽蛋中卵黄高磷蛋白的分离方法 - Google Patents
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Abstract
一种食品工程技术领域的禽蛋中卵黄高磷蛋白的分离方法。本发明首先取禽蛋卵黄，使其中的卵黄脂蛋白与水溶性卵清蛋白分离，得到粗制卵黄脂蛋白。取具有铁原子亲和活性位点的铁系无机纳米材料同粗制卵黄脂蛋白混合，使具有铁原子亲和活性位点的铁系无机纳米材料与粗制卵黄脂蛋白间相互作用，相应卵黄高磷蛋白得到特异性吸附有的铁系纳米材料，最后经煮沸处理得到卵黄高磷蛋白。同传统技术相比，本发明具有操作过程简便易行，成本低廉，相应分离体系生物相容性与生物安全性好等优点。通过该技术分离得到的卵黄高磷蛋白可直接应用于相关食用性产品的深加工。
Description
技术领域
本发明涉及一种食品工程技术领域的方法，具体是一种禽蛋中卵黄高磷蛋白的分离方法。
背景技术
众所周知，鸡蛋、鸭蛋等禽蛋具有丰富营养价值，不仅含有人体所必需的蛋白质，而且还含有多种生物活性成分，包括：卵黄球蛋白、溶菌酶、卵铁传递蛋白、蛋黄卵磷脂、抗生素蛋白、卵清蛋白等。其中，磷酸化程度最高的蛋白质，即卵黄高磷蛋白是卵黄颗粒中主要的蛋白质之一，占蛋黄颗粒总重的16％，其相对分子量为35000，含氮11.9％，含磷9.7％，占蛋黄总磷量的80％，含碳水化合物6.5％。氨基酸分析表明卵黄高磷蛋白是由217个氨基酸残基组成，其中124个是丝氨酸残基，占其总氨基酸含量的56％，98％的丝氨酸残基与磷酸基团结合。
卵黄高磷蛋白结构中具有的磷酸根基团与阳离子间特异性结合作用能有效阻止蛋黄中磷脂被铁阳离子氧化，因此其可作为良好的抗氧化剂。同时卵黄高磷蛋白结构中的磷酸根的静电斥力对其乳化性影响很大，pH为7.0时其乳化稳定性要优于牛血清白蛋白，因此卵黄高磷蛋白是一种很好的天然食品抗氧化剂和乳化剂。同时，卵黄高磷蛋白在加热后还具有杀菌作用。这种杀菌作用与其强烈的金属螯合作用和较高的表面活性密切相关。在一定的热处理过程下，细胞膜基质可被弱化，使处于细胞外膜的金属离子变得不稳定，从而易于被卵黄高磷蛋白结构中的磷酸根螯合，扰乱细菌细胞正常的生理代谢，起到杀菌作用。因此，卵黄高磷蛋白可作为天然防腐剂应用于食品中。作为磷酸丝氨酰残基资源库的卵黄高磷蛋白，其本身或水解产物可作为钙强化辅助剂，有效提高Fe3+、Zn2+等营养元素生物利用率。从而，既提高食品安全性，又增加食品营养价值。综上所述，从禽蛋卵黄中简便分离卵黄高磷蛋白具有非常广阔的市场应用前景。
经对现有技术文献检索发现，刘瑜，殷涌光等发表的文章《卵黄高磷蛋白的功能性质及其制备方法研究》(食品科学，2006，Vol.27，No.12)中报道，目前卵黄高磷蛋白的分离提取方法可以分为两类，一是采用硫酸铵为代表的无机物，利用其与镁离子结合形成复合物沉淀，进而分离得到卵黄高磷蛋白的方法，二是使用有机溶剂如乙醇、己烷等进行抽提。但这些已有分离技术不仅过程繁琐，耗时长，而且分离过程中需要使用大量化学试剂，直接影响相应卵黄高磷蛋白最终产物的生物相容性与生物安全性，且分离效果也未尽如人意。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种从禽蛋中高选择性、高特异性地有效分离卵黄高磷蛋白的方法。本发明具有操作过程简便易行，成本低廉，相应分离体系生物相容性与生物安全性好等优点。
本发明通过以下技术方案实现，包括如下步骤：
第一步，首先取禽蛋卵黄，将其中的卵黄脂蛋白与水溶性卵清蛋白分离，得到粗制卵黄脂蛋白。
第二步，取具有铁原子亲和活性位点的具有铁原子亲和活性位点的铁系无机纳米材料同得到的粗制卵黄脂蛋白混合。利用粗制卵黄脂蛋白中的卵黄高磷蛋白结构中丰富的磷酸化位点同铁系无机纳米材料骨架结构中的铁原子亲和活性位点间高选择性、高特异性螯合相互作用，得到特异性吸附有卵黄高磷蛋白的铁系纳米材料，经煮沸处理铁系纳米材料，分离得到较高纯度的卵黄高磷蛋白。
所述取禽蛋卵黄，是指：先选取新鲜禽蛋，在冰箱内4℃低温保存，小心敲开鸡蛋蛋壳，用滤纸吸去蛋黄表面蛋清后，用针挑破卵黄膜，收集蛋黄内容物。
所述将其中的卵黄脂蛋白与水溶性卵清蛋白分离，是指：在卵黄内容物中加入0～4℃蒸馏水稀释十倍后，置于冰水浴中搅拌至卵黄和水的混合物形成均一稳定的乳浊液，取上述卵黄乳浊液于聚四氟乙烯离心管中，在10000转/分钟下离心5分钟，得到的下层沉淀即为粗质卵黄脂蛋白，上层是可溶性卵清蛋白。去除上层水溶性蛋白，得到粗制卵黄脂蛋白。
所述铁系无机纳米材料同得到的粗制卵黄脂蛋白混合，是指：在1.5ml的聚四氟乙烯离心管中加入75mg粗制卵黄脂蛋白沉淀、20mg骨架结构中具有铁原子亲和活性位点的铁系无机纳米材料，pH为6.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液至离心管满刻度，间歇充分振摇离心管，持续30分钟。
所述得到特异性吸附有卵黄高磷蛋白的铁系纳米材料，是指：将铁系无机纳米材料与粗制卵黄脂蛋白混合的聚四氟乙烯离心管，在5000转/分钟下，离心分离3分钟，得到的下层沉淀即为特异性吸附有卵黄高磷蛋白的铁系纳米材料。
所述经煮沸处理铁系纳米材料，分离得到卵黄高磷蛋白，是指：将特异性吸附有卵黄高磷蛋白的铁系纳米材料同一次去离子水间按照质量比1∶1充分混合均匀后，100℃下煮沸，使特异性结合于材料中的卵黄高磷蛋白充分解离。后离心取上层蛋白溶液，通过SDS-PAGE电泳鉴定技术，说明特异性吸附于铁系纳米材料结构中的蛋白条带，同Sigma公司提供的高纯卵黄高磷蛋白标准条带进行对比，主要特征条带完全符合，直接证明了本发明的有效性。
与现有技术相比，本发明利用卵黄高磷蛋白结构中丰富的磷酸根基团与铁系无机纳米材料骨架结构中存在的铁原子活性位点间高选择性、高特异性的相互作用，提出一种简便有效的卵黄高磷蛋白分离富集技术。该技术不仅能够有效避免过程中大量使用硫酸铵、己烷等化学提取剂，影响相应得到的卵黄高磷蛋白的生物相容性与生物安全性，而且操作简便，关键分离过程的操作仅需耗时60分钟，成本低廉。通过该技术分离得到的卵黄高磷蛋白纯度约为80％以上，可直接应用于相关食用性产品的深加工。
具体实施方式：
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：小心敲开鸡蛋蛋壳，用滤纸吸去蛋黄表面蛋清后，用针挑破卵黄膜，收集蛋黄内容物。在卵黄中加0～4℃蒸馏水稀释十倍后，放置于冰水浴中搅拌60min，可将卵黄脂蛋白和水溶性蛋白分离。取卵黄混合物于离心管中，选择10000转/分钟下，离心5分钟，下层沉淀为粗质卵黄脂蛋白，上层是可溶性卵清蛋白。去除上层水溶性蛋白，得到粗制的卵黄脂蛋白。
实施例2：小心敲开鸡蛋蛋壳，用滤纸吸去蛋黄表面蛋清后，用针挑破卵黄膜，收集蛋黄内容物。在卵黄中加0～4℃蒸馏水稀释十倍后，放置于冰水浴中搅拌12hour，可将卵黄脂蛋白和水溶性蛋白分离。取卵黄混合物于离心管中，选择10000转/分钟条件下离心30分钟，去除上层水溶性卵清蛋白，得到的下层沉淀为粗制的卵黄脂蛋白。
实施例3：取75.0mg粗制卵黄脂蛋白沉淀，加入20.0mg具有铁原子亲和活性位点的铁系无机纳米材料，再加入pH6.0左右的醋酸-醋酸钠缓冲溶液1.5ml，振荡混匀，静置三十分钟，进行目标卵黄高磷蛋白的特异性吸附作用。其间多次上下振荡摇晃反应体系，使得目标分离体系可以充分与具有铁原子亲和活性位点的纳米材料间相互接触。后选择5000转/分钟条件下离心分离3分钟，得到吸附有卵黄高磷蛋白的铁系纳米材料。
实施例4：取50mg粗制卵黄蛋白沉淀，加入10mg具有铁原子亲和活性位点的铁系无机纳米材料，再加入pH6.0左右的NaAc缓冲溶液1.5ml，振荡混匀，放置三十分钟，进行吸附作用。其间多次上下振荡摇晃反应体系，使得卵黄可以充分与具有铁原子亲和活性位点的铁系无机纳米材料相互接触，相互作用。在5000转条件下离心分离5分钟，得到吸附有卵黄高磷蛋白的纳米材料。
实施例5：取100mg粗制卵黄蛋白沉淀，加入50mg具有铁原子亲和活性位点的铁系无机纳米材料，再加入pH6.0左右的NaAc缓冲溶液1.5ml，振荡混匀，放置六十分钟，进行吸附作用。其间多次上下振荡摇晃反应体系，使得卵黄可以充分与具有铁原子亲和活性位点的铁系无机纳米材料相互接触，发生作用。在3000转条件下离心分离3分钟，得到吸附有卵黄高磷蛋白的纳米材料。
实施例6：将特异性吸附有卵黄高磷蛋白的铁系纳米材料同一次去离子水间按照质量比1∶1充分混合均匀后，100℃下煮沸，使特异性结合于铁系纳米材料中的卵黄高磷蛋白充分解离，进而得到纯度约为80％以上的卵黄高磷蛋白。
Claims (6)
1、一种禽蛋中卵黄高磷蛋白的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步，首先取禽蛋卵黄，将其中的卵黄脂蛋白与水溶性卵清蛋白分离，得到粗制卵黄脂蛋白；
第二步，取具有铁原子亲和活性位点的铁系无机纳米材料同得到的粗制卵黄脂蛋白混合，利用粗制卵黄脂蛋白中的卵黄高磷蛋白结构中丰富的磷酸化位点同铁系无机纳米材料骨架结构中的铁原子亲和活性位点间相互作用，得到特异性吸附有卵黄高磷蛋白的铁系纳米材料，经煮沸处理铁系纳米材料，分离得到卵黄高磷蛋白；
所述铁系无机纳米材料同得到的粗制卵黄脂蛋白混合，是指：在1.5ml的聚四氟乙烯离心管中分别加入75.0mg粗制卵黄脂蛋白沉淀、20.0mg骨架结构中具有铁原子亲和活性位点的铁系无机纳米材料，pH值为6.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液至离心管满刻度，后间歇充分振摇离心管。
2、根据权利要求1所述的禽蛋中卵黄高磷蛋白的分离方法，其特征是，所述取禽蛋卵黄，是指：先选取新鲜禽蛋，在冰箱内4℃低温保存，敲开禽蛋蛋壳，用滤纸吸去蛋黄表面蛋清后，用针挑破卵黄膜，收集蛋黄内容物。
3、根据权利要求1所述的禽蛋中卵黄高磷蛋白的分离方法，其特征是，所述将其中的卵黄脂蛋白与水溶性卵清蛋白分离，是指：在卵黄内容物中加入0～4℃蒸馏水稀释十倍后，置于冰水浴中搅拌至卵黄和水的混合物形成均一稳定的乳浊液，取上述卵黄乳浊液于聚四氟乙烯离心管中，离心，上层是可溶性卵清蛋白，去除上层水溶性蛋白，得到粗制卵黄脂蛋白。
4、根据权利要求3所述的禽蛋中卵黄高磷蛋白的分离方法，其特征是，所述离心，是指：在10000转/分钟下离心3分钟。
5、根据权利要求1所述的禽蛋中卵黄高磷蛋白的分离方法，其特征是，所述间歇充分振摇离心管，其持续时间为30分钟。
6、根据权利要求1所述的禽蛋中卵黄高磷蛋白的分离方法，其特征是，所述得到特异性吸附有卵黄高磷蛋白的铁系纳米材料，是指：将铁系无机纳米材料与粗制卵黄脂蛋白混合的聚四氟乙烯离心管，在5000转/分钟下，离心分离5分钟，得到的下层沉淀即为特异性吸附有卵黄高磷蛋白的铁系纳米材料。
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