CN116813707B

CN116813707B - 一种血蛋白多肽及其应用

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Publication number: CN116813707B
Application number: CN202310811458.4A
Authority: CN
Inventors: 王阿琴; 任迪峰; 余钧; 周敏
Original assignee: Hangzhou Baibeiyou Biotechnology Co ltd; Beijing Forestry University
Current assignee: Hangzhou Baibeiyou Biotechnology Co ltd; Beijing Forestry University
Priority date: 2023-07-04
Filing date: 2023-07-04
Publication date: 2024-05-10
Anticipated expiration: 2043-07-04
Also published as: CN116813707A

Abstract

本发明属于蛋白质多肽技术领域，具体涉及一种提取自牛血蛋白的胰脂肪酶抑制肽及其制备方法与应用。所述抑制肽的氨基酸序列为：Thr‑Gln‑Arg‑Phe‑Phe，简称TQRFF。肽段TQRFF在体外具有较好的PL抑制活性，IC50值为260.02±17.01μg/mL。本发明还提供包埋TQRFF的纳米颗粒TQRFF‑CMCS NPs，其对PL的抑制率达到64.18±2.91％，与甘氨胆酸钠、胆酸钠、牛磺胆酸钠的结合率分别为40.23±5.45％、33.99±0.99％、30.33±1.42％，能够有效抑制BS的吸收，进而减少脂肪摄入。

Description

一种血蛋白多肽及其应用

技术领域：

本发明属于蛋白质多肽技术领域，具体涉及一种提取自牛血蛋白的胰脂肪酶抑制肽及其制备方法与应用。

背景技术：

膳食脂肪主要为混合甘油三酯(TAG)，胃和口腔脂肪酶负责膳食TAG的部分水解，经历一系列复杂的生化反应，将其转化为游离脂肪酸(FFA)和甘油二酯(DAG)。胃中的部分消化物形成大的脂肪分子与胆酸盐(BS)乳化形成小的脂肪滴。脂肪滴是结构复杂的乳状液滴，液滴的中心是TAG和DAG，中层是极性脂质、磷脂甘油酯(PLs)、胆固醇(C)和FFA的混合物，最外层是低聚糖、变性蛋白质和BS。胰腺腺泡细胞分泌的PL(pancreatic lipase；EC3.1.1.3)是胰液中的一种重要消化酶，负责消化小肠中的膳食TAG。PL与乳状液滴相互作用，水解过程产生游离脂肪酸、甘油一酯(MAG)、甘油二酯与游离的胆固醇、BS、脂溶性维生素和溶血磷脂酸(LPA)结合形成混合胶束(MM)，可被肠细胞吸收。

目前，PL抑制是最广泛的抗肥胖药物的研究机制。PL本质上是脂解性的，从胰腺腺泡细胞释放出来，在TAG分解中起着关键作用。TAG是主要脂肪摄入来源，控制其分解有助于减少吸收，因此减少脂质吸收的一个有效方法是抑制PL活性。此外，PL在肠道中起着关键作用，不直接涉及血液或大脑，避免了其他相关的副作用和并发症，PL抑制靶点为肥胖治疗提供了一种相对安全的药物机制，因此，有必要开发出安全性高的抑制PL活性和甘油三酯吸收的天然成分。

近年来，肽在肥胖和代谢疾病治疗中的研究越来越受关注。脂肪细胞中TAG的脂解已被认为是肥胖症的潜在治疗靶点。PL抑制活性的肽可以从各种植物源和动物源蛋白质以及蓝藻中生产，也可以通过合成手段获得。

目前食品上对牛血资源的利用一方面在于提高货架稳定性、改进技术功能(调味化合物、水粘合剂、乳化剂)、改善感官质量(颜色、质地、味道)等；另一方面是生产生物活性肽等功能性成分。现有技术已经证明血肽具有多种生物活性，Nakashima等人从消化性的牛血红蛋白水解物中提取出生物活性肽，分别鉴定出两种强效降压肽LGFPTTKTYFFHF和VVYPWT，分别对应于牛血红蛋白α链的34～46片段和β链的34～39片段，对ACE具有较好的体外抑制活性，IC₅₀值分别为4.92和6.02μM。Nedjar-Arroume等人通过数次HPLC纯化，鉴定出三十种抗菌肽，其中24个肽来自血红蛋白的α链，6个肽来自血红蛋白的β链，并且确定了完全抑制4种细菌菌株生长所必需的这些肽的最小抑制浓度(MIC)。目前，对于牛血源血肽潜在的PL抑制活性并未有研究验证。

我国拥有丰富的牛血资源，但是牛血并没有得到真正利用，资源大量浪费。牛血中含丰富的蛋白质，提高蛋白的利用率是目前牛血液研究利用的关键。血肽具有多种重要的生理功能，未有研究进一步探索作用机理及鉴定多肽中的生物活性肽段。本发明从牛血蛋白酶解液中鉴定PL抑制肽，创新牛血的深加工开发应用，提高牛血资源的经济效益。牛血PL抑制肽作为一种能有效改善肥胖的天然活性物质具有一定的研究意义和较大的研究潜力，将为开发新的无副作用的抗肥胖肽提供了理论基础。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明以牛血为原料，通过冻融、超声、离心提取牛血蛋白，利用蛋白酶酶解法，以PL(胰脂肪酶)抑制率、多肽得率和电子舌风味为指标筛选出最适蛋白酶，再以多肽得率为指标获得制备PL抑制活性肽的最佳工艺条件，通过Box-behnken分析方法对酶解条件进行优化，最后进行超滤，获得活性最高的多肽组分并测定其BS结合率。将活性较高的多肽进行液质鉴定，再将小分子肽段与受体PL通过计算机虚拟筛选、分子对接，结合理化性质筛选出可能具有高PL抑制活性的肽段，人工合成此肽段，验证其体外PL抑制活性。并进一步制备肽段的纳米颗粒，探究纳米颗粒的抗肥胖功效。

本发明提供的技术方案之一，是一种胰脂肪酶抑制肽，所述抑制肽的氨基酸序列为：Thr-Gln-Arg-Phe-Phe，以下简称TQRFF；或者，所述抑制肽的氨基酸序列为：Phe-Thr-Pro-Val-Phe，以下简称FTPVF；

所述胰脂肪酶抑制肽TQRFF、FTPVF可通过对牛血酶解筛选获得，也可通过人工合成的方式获得。

本发明提供的技术方案之二，是上述蛋白酶抑制肽TQRFF、或FTPVF在抑制胰脂肪酶活性中的应用，TQRFF对胰脂肪酶的半抑制浓度(IC₅₀)达到260.02±17.01μg/mL；FTPVF对胰脂肪酶的半抑制浓度(IC₅₀)达到760.04±59.03μg/mL。

本发明提供的技术方案之三，是一种纳米颗粒体系包埋短肽，是将技术方案一所述抑制肽由羧甲基壳聚糖包埋获得；

进一步地，制备方法如下：

取CMCS(羧甲基壳聚糖)溶解于PBS中，加入TQRFF或FTPVF继续搅拌，边搅拌边缓慢滴入CaCl₂溶液；析出沉淀，然后将混悬液离心，取沉淀冷冻干燥，即得到TQRFF-CMCS NPs(TQRFF-羧甲基壳聚糖纳米微粒)或FTPVF-CMCS NPs(FTPVF-羧甲基壳聚糖纳米微粒)。

本发明提供的技术方案之四，是上述纳米颗粒的应用，特别是在抑制胰脂肪酶活性或结合胆酸盐中的应用。

有益效果：

本发明提供了一种新型胰脂肪酶抑制肽以及含有该抑制肽的纳米颗粒，其酶抑制作用明显，且采用牛血为原料，生产成本低，经济效益高。

基于试验结果，肽段TQRFF和FTPVF在体外均具有较好的PL抑制活性，IC50值分别为260.02±17.01μg/mL、760.04±59.03μg/mL。

同时负载短肽TQRFF的TQRFF-CMCS NPs的PL抑制率为64.18±2.91％，相比TQRFF和CMCS有所增加。TQRFF-CMCS纳米颗粒与甘氨胆酸钠、胆酸钠、牛磺胆酸钠的结合率分别为40.23±5.45％、33.99±0.99％、30.33±1.42％，相较于TQRFF、CMCS均有所增加，说明TQRFF与CMCS复合具有协同增效的效果，能够有效抑制BS的吸收，进而减少脂肪摄入。

附图说明：

图1 0～3KDa牛血蛋白多肽的BS结合率。

图2总离子流色谱图。

图3肽段TQRFF(左)、FTPVF(右)的化学结构。

图4FTPVF的MS/MS图。

图5TQRFF的MS/MS图。

图6TQRFF与PL相互作用的对接图。

图7FTPVF与PL相互作用的对接图。

图8TQRFF、CMCS和TQRFF-CMCS NPs的PL抑制率。

图9TQRFF、CMCS和TQRFF-CMCS NPs的BS结合率。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明所述的多肽TQRFF和FTPVF，本领域技术人员可通过对牛血酶解筛选获得，也可通过人工合成的方式获得。

本发明及实施例涉及的部分试验方法如下：

1、胰脂肪酶抑制率的测定

参考Chen等人的方法进行修改，反应原理为对硝基苯酚月桂酸酯(p-nitrophenyllaurate，p-NPL)被PL分解生成对硝基苯酚(p-nitrophenol，p-NP)，颜色由无色透明变为黄色，以奥利司他为阳性对照，测定PL抑制率。

(1)溶液配制

10mg/mL胰脂肪酶溶液：使用0.1mol/L pH 7.2～7.4PBS缓冲溶液配置。

底物缓冲溶液：先配置5mmol/L乙酸钠缓冲溶液，溶解10％的曲拉通-X，加热溶解。

80mg/mL p-NPL溶液：底物缓冲溶液溶解，在沸水浴中助溶1min后迅速置于冷水中冷却，待溶液澄清透明即可使用，注意现配现用。

奥利司他溶液：先使用DMSO溶解，再使用pH7.2～7.4PBS缓冲溶液稀释。

(2)酶解液的胰脂肪酶抑制率的测定

牛血蛋白多肽溶解至一定浓度，取1mL多肽稀释液和1mL PL于PE管中，混合均匀，于37℃孵育10min，加入1mL p-NPL溶液，混合均匀，置于37℃恒温培养箱中反应2h；最后加入1mL无水乙醇停止反应，于405nm波长下测OD值；空白组为PBS缓冲溶液代替样品，背景组为PBS缓冲溶液代替酶溶液，以奥利司他为阳性对照，计算公式如下：

式中OD值分别表示不同样品的吸光值。

2、胆酸盐结合率的测定

(1)溶液配制

磷酸缓冲溶液：pH6.3，浓度为0.1mol/L。

三种BS标准溶液：2mmol/L的BS标准溶液，准确称取0.050g甘氨胆酸钠、0.053g牛磺胆酸钠、0.060g胆酸钠，分别溶解定容至50mL。

(2)标准曲线及结合率测定方法

参照朱晓连和Ngoh等人的方法修改测定步骤：准确移取0mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL BS标准溶液于25mL具塞试管中，加入60％硫酸反应，最后于387nm波长下测OD值。甘氨胆酸钠的标准曲线为y＝2.7924x+0.0060，R²＝0.9925；牛磺胆酸钠的标准曲线为y＝2.7095x-0.0152，R²＝0.9994；胆酸钠的标准曲线为y＝2.6776x-0.0083，R²＝0.9995。

取0.5mL的20mg/mL(根据需求进行调整)的待测多肽溶液样品，加入0.25mL0.01mol/L盐酸溶液混匀，置于37℃振荡孵育1h；然后加入1mL 0.6mmol/L BS标准溶液和10mg/mL胰酶溶液，持续振荡孵育1h；结束后加入4倍体积的95％(v/v)乙醇，以转速6000rpm离心10min去除沉淀，取2.5mL上清液按标准曲线的测定步骤测定结合后BS的浓度；已有报道证明抗坏血酸具有较强的BS结合能力，所以以20mg/mL抗坏血酸为阳性对照。

(3)计算公式

式中C₀表示BS初始浓度(mmol/L)，C₁表示结合后BS的浓度(mmol/L)。

以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。

实施例1牛血蛋白酶解液的制备

1、牛血蛋白的制备

将屠宰场获得的新鲜牛血加入抗凝剂(0.2％柠檬酸钠)，通过4℃冷链运输至实验室。按照质量比例为1:1(牛血:水)加入无菌水，超声波辅助溶血。细胞破碎仪选用6号超声变幅杆，超声参数设置为间歇比2:2、超声功率500w和工作时间20min。破碎细胞后，离心15min去除细胞壁，将牛血蛋白液分装，置于-80℃冰箱备用。

采用BSA法测定蛋白含量为：20.77±0.32％。

2、牛血蛋白酶解液的制备

取牛血蛋白液加入蒸馏水稀释至牛血蛋白含量5.57％，90℃水浴20min灭菌，调节pH值8.0，按牛血蛋白质量加入碱性蛋白酶，添加量为5870U/g，50℃酶解3.9h，沸水浴10min灭酶，冷却；调节pH值为6.5，按牛血蛋白质量加入木瓜蛋白酶，添加量为2130U/g，55℃酶解1.2h。沸水浴10min灭酶，冷却后调节酶解液的pH为4.5以沉淀蛋白质，取上清液，调节pH值为7.0，即得牛血蛋白酶解液，测定多肽得率。经过3次平行试验，多肽得率为42.14±0.59％，真空冷冻干燥，置于-18℃冰箱备用。

3、牛血蛋白多肽的超滤

将制备获得的牛血蛋白酶解液按序使用10KDa、5KDa和3KDa的超滤膜包，超滤过程中注意保持溶液低温，冷干存放备用，分别测定不同分子量的多肽的PL抑制率，计算半抑制浓度。结果如下表：

表1不同组分的牛血蛋白多肽含量及PL抑制率

注：含量为该超滤组分占总质量的比值。

水解牛血蛋白得到的产物中包括未分解的蛋白、酶、多肽、小分子寡肽、氨基酸、磷酸盐、钠盐等，需要超滤进行进一步纯化。不同组分的牛血多肽成分各不相同，也呈现出不同的抑制活性。由表1可知，牛血蛋白酶解液中含量最高的是0～3KDa的多肽，质量占总酶解液中肽含量的67.20±1.55％。四个组分的多肽均具有PL抑制活性，0～3KDa的多肽具有高于其他组分的PL抑制率(P＜0.05)，IC₅₀值为0.75±0.01mg/mL；超滤组分≥10KDa的肽抑制效果最低。

4、0～3KDa多肽胆酸盐结合率的测定

牛血多肽具有BS结合能力。由图1可得，20mg/mL的0～3KDa的多肽溶液对甘氨胆酸钠、胆酸钠和牛磺胆酸钠的结合率分别为55.57±2.80％、48.51±5.31％、44.84±1.87％，20mg/mL的抗坏血酸对BS结合率分别为65.98±3.13％、70.89±3.69％、67.25±2.80％，抗坏血酸具有较高的BS结合率，与报道结果接近，证明测定方法可行。

膳食脂肪吸收的减少可以通过两种机制介导：直接抑制PL和结合BS降低脂肪乳化特性。PL抑制和BS结合的协同抗肥胖作用的研究，为开发控制肥胖和高血脂的活性成分提供理论支持。

为进一步探索具有活性的肽段，对0～3KDa超滤组分进行活性肽段鉴定分析。

实施例2多肽的鉴定和筛选

1、LC-MS/MS肽段组成的鉴定

参考Mudgil等人的测试参数和检索参数进行测定，质谱原始文件使用Byonic检索目标蛋白数据库。

将0～3KDa多肽组分经过LC-MS/MS分析，共鉴定出592条肽段，总离子流图如图2，其中氨基酸数量在10个及以下的肽段序列有544条。

除去氨基酸个数在10以上的肽段，首先使用ChemDraw软件绘制肽的2D、3D结构，并将其能量最小化，保存为配体；从https://www.rcsb.org下载胰脂肪酶(PDB:1ETH)三维结构文件(PDB format格式)，再使用Autodock Tools1.5.6软件对PL的结构进行处理，保存为受体(pdbqt格式)；使用PyRx软件将所有配体与受体依次进行对接，对接范围设置最大，获得对接结果。

表2牛血蛋白多肽与PL对接虚拟筛选与BIOPEP-uWM肽段数据库比对结果

虚拟筛选及数据库比对结果如表2所示，得到对接能排名的前8条肽段，氨基酸数量为4～7。这8条肽段对接能≤-8.3kcal mol^-1，说明配体与受体结合力比较强，TQRFF结合力最强，对接能为-9.2kcal mol^-1。经过与NCBI中牛(Bos taurus)蛋白质数据库同源序列比对，肽段TQRFF和FTPVF均为牛源多肽序列，且与已知生物活性肽序列均不匹配，确定为新型多肽。

通过对接能大小判断其相互作用力的强弱，选择对接能排名前六位的肽段通过Peptide Ranker(http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)对其可能具有的生物活性排序，然后进行致敏原(http://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/index.html)的估测以及毒害性和理化性质(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/design.php)检验和预测，筛选出较优肽段进行下一步半柔性对接。

表3肽段的Peptide Ranker分数和毒害性

Peptide Ranker对其可能具有的生物活性排序结果以及毒害性预测结果如表3所示，Peptide Ranker排名前三的肽段分别是FTPVF、TQRFF和WAGDL。所有肽段均无毒害性，安全性较高。最终选择对接能和Peptide Ranker分数排名前两条肽段TQRFF(Thr-Gln-Arg-Phe-Phe)和FTPVF(Phe-Thr-Pro-Val-Phe)进行人工合成，验证其体外PL抑制活性。

FTPVF、TQRFF占总肽的质量比分别为0.142％、0.162％。肽段TQRFF和FTPVF化学结构及二级质谱图分别如图3、图4和图5所示。

2、Autodock分子对接

参考Urbizo-Reyes等人报道的步骤进行分析。(1)使用软件ChemDraw和AutodockTools进行，处理后将受体和配体均保存成pdbqt文件，用于后续对接；(2)使用Autodock Vina将TQRFF和FTPVF分别与1ETH对接，对接后结果保存，最后使用DiscoveryStudio client 2019查看和分析对接图。

TQRFF和FTPVF对PL的不同结合能力可能导致了不同的抑制作用。因此，使用AutoDock进行了分子对接模拟，以评估TQRFF和FTPVF对PL(PDB代码：1ETH)之间的相互作用。可以从分子对接的结果得知配体与PL氨基酸残基的结合位置。图6和7列出了PL对接结果的结合位点。

如图6所示，TQRFF与PL对接作用力有氢键、阳离子、π键、π烷基、烷基键，以下氨基酸表现出特异性相互作用：Arg65D、Lys24D、Lys42D、Arg338C、Leu41D、Arg368C、Glu64D、Glu13D和Asp12D，其中TQRFF以氢键方式分别与Lys24D、Glu13D和Asp12D结合，以烷基键作用与Leu41D和Arg368C结合，Discovery Studio 2019client计算的对接分数(Lib DockScore)为146.333。

如图7所示，FTPVF与PL对接作用力有盐桥、氢键、阳离子、π键、烷基键，作用的氨基酸有Lys42B、Leu41B、Glu64B、Arg368A、Tyr404A、Glu371A、Arg65B、Asp332A和Arg338A，其中FTPVF通过盐桥分别与Glu371A、Arg65B、Asp332A和Arg338A结合，通过烷基键与Leu41B和Arg368A结合，与Lys42B、Glu64B和Tyr404A的羟基和羧基上的氢原子和氧原子形成氢键，对接分数(Lib Dock Score)为157.393，相互作用力稳定了肽-PL复合物。

实施例3肽段人工合成和活性验证

肽段TQRFF、FTPVF的合成由南京源肽生物科技有限公司完成，纯度≥95％；根据前述方法测定不同浓度的肽段对PL的抑制率，计算肽段对PL的半抑制浓度(IC₅₀)，结果如下表4所示。

表4肽段TQRFF和FTPVF对PL半抑制浓度

如表4所示，在牛血肽中发现了新的胰脂肪酶抑制肽，肽段TQRFF和FTPVF在体外均具有较好的PL抑制活性，IC₅₀值分别为260.02±17.01μg/mL、760.04±59.03μg/mL。TQRFF和FTPVF在体外对PL表现出不同的抑制活性，这为牛血在抵抗肥胖方面的应用提供新的参考依据。

实施例4TQRFF-羧甲基壳聚糖纳米颗粒

1、TQRFF-CMCS NPs制备

准确称取CMCS(羧甲基壳聚糖)12.5mg，于25℃、4mL的pH7.4 PBS中搅拌30min，搅拌速度200r/min，加入5.5mg的TQRFF继续搅拌30min，最后边搅拌边缓慢滴入1mL 1.1mg/mLCaCl₂溶液，5mL溶液体系中CMCS浓度为2.5mg/mL，TQRFF的浓度为1.1mg/mL(二者比值约为2.3:1)。析出沉淀，功率300w、超声时间2min(间隔2s、超声2s)，然后将混悬液12000r/min离心30min，取沉淀冷冻干燥，即得到TQRFF-CMCS NPs(TQRFF-羧甲基壳聚糖纳米微粒)。

2、测定包埋率：

将适量TQRFF-CMCS NPs于PBS中溶解，使用1KDa超滤离心管6000rpm离心30min，取离心出的含有未包埋的肽的液体，采用双缩脲法测定多肽含量，计算包封率。

式中C₁为游离TQRFF的浓度(mg/mL)，C₀为添加的总TQRFF的浓度(mg/mL)。

结果显示，上述方法制备的TQRFF-CMCS NPs包封率为65.43±1.26％。

3、胰脂肪酶抑制活性的测定

将纳米颗粒溶解，比较0.5mg/mL TQRFF，1.8mg/mL CMCS、2.5mg/mL TQRFF-CMCS(相当于包含0.5mg/mL TQRFF、1.8mg/mL CMCS)的PL抑制率，PL抑制率结果如图8所示。

TQRFF-CMCS纳米颗粒的PL抑制率为64.18±2.91％，TQRFF的PL抑制率为52.52±2.14％，TQRFF-CMCS NPs的抑制率比TQRFF增加11.66％；CMCS的PL抑制率为10.25±2.11％，比NPs低53.93％，可能是由于CMCS与TQRFF形成较大的空间位阻，阻碍酶与底物结合，从而影响了酶的活性。

4、胆酸盐结合率的测定

比较5mg/mL TQRFF、18mg/mL CMCS、25mg/mL TQRFF-CMCS NPs(相当于包含5mg/mLTQRFF、18mg/mL CMCS)与2mg/mL BS结合率，测定TQRFF、CMCS、TQRFF-CMCS NPs的BS结合率。

如图9所示，TQRFF-CMCS纳米颗粒对甘氨胆酸钠、胆酸钠、牛磺胆酸钠的结合率分别为40.23±5.45％、33.99±0.99％、30.33±1.42％，大于TQRFF和CMCS的BS结合率，分别是同浓度TQRFF的BS结合率的7.86倍、6.80倍和5.70倍，相较于同浓度CMCS的BS结合率提高了4.85％、10.70％和10.22％，说明TQRFF与CMCS复合能够提高BS结合率，有效抑制BS的重吸收。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims

1.一种胰脂肪酶抑制肽在制备抗肥胖药物中的应用，其特征在于，所述胰脂肪酶抑制肽的氨基酸序列为TQRFF。

2.一种TQRFF纳米颗粒在制备抗肥胖药物中的应用，其特征在于，所述TQRFF纳米颗粒的制备方法如下，取羧甲基壳聚糖CMCS溶解于PBS中，加入氨基酸序列为TQRFF的肽继续搅拌，滴入CaCl₂溶液；析出沉淀，将混悬液离心，取沉淀冷冻干燥，即得到TQRFF-羧甲基壳聚糖纳米颗粒。