CN101357935B - 一种利用反胶团法分离纯化鱼精蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物活性物质分离纯化技术领域，特别涉及一种利用反胶团法直接从鱼精蛋白粗提液中分离纯化鱼精蛋白的方法。本发明的目的是解决目前鱼精蛋白纯化工艺复杂、步骤多、周期长的问题，它采用由表面活性剂和有机溶剂构成的反胶团溶液直接从鱼精蛋白粗提液中分离纯化鱼精蛋白，通过调节水相pH、离子强度、相比、两相接触时间等萃取工艺条件，可实现鱼精蛋白的高效萃取和反萃，酶活回收率最高可达到96％以上，纯化因子达到2.1以上，该工艺同时具有浓缩作用和脱色作用，此外，采用反胶团技术分离纯化鱼精蛋白周期短、便于连续操作、易于放大。

Description

一种利用反胶团法分离纯化鱼精蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物活性物质分离纯化技术领域，特别涉及利用反胶团法萃取技术直接从鱼精蛋白粗提液中分离纯化鱼精蛋白的方法。

背景技术

鱼精蛋白是一类从鱼类的鱼白组织中提取的碱性蛋白质。在鱼白中，鱼精蛋白是与DNA以2∶1的比例结合在一起的。鱼精蛋白是一种小而简单的球形碱性蛋白，一般由30～50个氨基酸组成，分子量比较小，一般在6000～10000道尔顿左右。其氨基酸组成上的最大特点就是碱性氨基酸占有较大比例，因此其碱性很强，等电点为：10-12。鱼精蛋白可溶于水和稀酸，可被稀氨水沉淀，加热不凝固，热稳定性较好。

毒理试验证明，鱼精蛋白无毒、弱蓄积性，无染色体畸变作用和基因突变作用，对DNA具有极强的吸附亲和作用。鱼精蛋白可以用作天然食品防腐剂，其特点是在中性和碱性范围抑菌能力强，抑菌范围广，热稳定性好，而且卫生安全，没有毒副作用。同时鱼精蛋白具有很重要的医学价值。临床上鱼精蛋白广泛用于抗肝素钠过量，起抗凝血作用，目前在心内直视手术中鱼精蛋白是唯一普遍用于拮抗肝素钠的药物。另外，鱼精蛋白可作为胰岛素、抗菌素、肾上腺皮质激素等药物的载体，延长这些药物在体内的半衰期。一名需每日注射3次胰岛素的病人，若使用鱼精蛋白与锌制成的鱼精蛋白锌胰岛素注射液，可使胰岛素的注射时间间隔延长为每24～48小时给药1次。在利用Vero细胞生产各种疫苗如乙脑、狂犬病、脊髓灰质炎等的过程中，硫酸鱼精蛋白被广泛用作去除疫苗中Vero细胞的DNA的工具试剂。

鱼精蛋白的提取无论是过去还是现在的办法，基本上是以硫酸或盐酸为主要提取剂，以柠檬酸盐或有机溶剂为纯化剂。如制备鱼精蛋白盐类，将鱼精蛋白在稀硫酸溶液中处理，抽取出鱼精蛋白及混杂蛋白。然后在抽提液中加入甲醇或乙醇等有机溶剂沉淀上述蛋白，分离干燥的固体溶于温水中，再冷却析出鱼精蛋白。也有在硫酸或盐酸抽提液中不用有机溶剂而用聚磷酸盐，使鱼精蛋白以磷酸盐形式沉淀出来，然后溶解在高浓度的硫酸铵中，复分解为鱼精蛋白硫酸盐。还有以鱿鱼鱼白为原料，用硫酸酸解、氯化钠抽提，乙醇沉淀成功地提取获得了鱿鱼鱼精蛋白。还有资料报道鱼精蛋白的提取方法是将鱼精蛋白加入NaCl溶液中捣碎离心，收集沉淀，加入HCl溶液捣碎，静置，离心，取上清液。滴加苦味酸，直至沉淀完全，离心，取出沉淀，溶于丙酮中，滴加硫酸使pH至1.8。往溶液中加入等体积的冷丙酮，静置或离心，得沉淀，真空干燥，即为鱼精蛋白盐。

但是，通过上述鱼精蛋白的提取方法得到的鱼精蛋白实际是鱼精蛋白的粗品，还含有其他物质，如核酸、杂蛋白等，需要进一步纯化。一般采用葡聚糖凝胶柱层析法纯化。如将Sephadex G-25或Sephadex G-50按常规处理后装柱，然后用0.1M KCl-0.05M Tris洗脱液洗脱，280nm紫外检测，收集活性组分。利用鱼精蛋白的电荷和分子大小，可采用聚丙烯酰胺等电聚焦电泳法对提取的鱼精蛋白粗提物进行纯化，取胶板的碱性端，经扩散洗脱、透析除盐，就可得鱼精蛋白纯品。传统的鱼精蛋白分离纯化工艺复杂，周期长等缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用反胶团法分离纯化鱼精蛋白的方法，从利用鱼白制得的鱼精蛋白粗提液中萃取纯化鱼精蛋白，该方法可解决鱼精蛋白纯化工艺复杂、周期长的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种利用反胶团法分离纯化鱼精蛋白的方法，从利用鱼白制得的鱼精蛋白粗提液中萃取纯化鱼精蛋白，它包括如下步骤：

(1)制备鱼精蛋白粗提液；将鱼白置于组织捣碎机中，加入0.14M NaCl溶液，匀浆破碎组织后，用纱布过滤得浆液。然后进行离心分离，弃上清夜，得沉淀即鱼精蛋白与DNA的复合物DNP，每克DNP加入4ml7.5％的硫酸，搅拌，混合均匀，离心10min，弃沉淀，沉淀中主要为DNA，上清液即为鱼精蛋白粗提液；

这一步酸处理的目的在于使鱼精蛋白与DNA解离，鱼精蛋白在酸性条件

下溶于上清液中，而DNA则在酸性条件下形成沉淀。

(2)制备反胶团溶液，其由表面活性剂、助溶剂、有机溶剂和水构成，各组分重量份配比为，表面活性剂:助溶剂:有机溶剂:水＝(20-100):(0-200):(800-880):(0-10)，其配制步骤为：按上述比例称取各组分并均匀混合，震荡后静置，至完全溶解，混合均匀，制得反胶团溶液；

(3)进行前萃取，首先调节鱼精蛋白粗提夜的pH值到7.0-10.5；然后加入氯化钠调节离子强度到0.05-0.2M，然后将其同反胶团溶液混合，反胶团溶液与鱼精蛋白粗提液的体积比为1:1-1:50，混合时间为1-10分钟，操作温度为10-35℃；最后将反胶团溶液与鱼精蛋白粗提液的混合液进行离心处理，取上层液体为负载反胶团溶液；

在前萃取过程中，鱼精蛋白进入反胶团相，而大部分的杂质留在粗提液中。同时，由于萃取的粗提液的体积达于反胶团溶液的体积，因此前萃取也起到富集浓缩的作用。

(4)配制反萃水溶液，该反萃水溶液包括反萃助剂、碱化剂、盐和水，其重量份配比为，反萃助剂:碱化剂:盐:水＝(0.5-30):(0-10):(0.5-12):(48-98)；

(5)进行反萃取，将负载反胶团溶液与反萃水溶液按其体积比1:1-1:50混合，混合时间为1-60min，操作温度为20-45℃。然后将负载反胶团溶液与反萃水溶液的混合液进行离心处理，取下层液体为纯化后的鱼精蛋白溶液。反萃取时，反萃水溶液的体积小于反胶团溶液的体积，因此也能起到浓缩富集的作用。

所述鱼白来自于鲑鱼、大马哈鱼、带鱼、金枪鱼、大黄花鱼、小黄花鱼、鲅鱼、鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鲢鱼、武昌鱼、罗非鱼、鳝鱼鲤鱼、鱿鱼中的一种或几种。

所述的表面活性剂是阴离子型、非离子型表面活性剂中的一种或两种，所述表面活性剂的浓度为25-300mM；所述助溶剂是丁醇、戊醇、己醇、庚醇中的一种或几种，体积浓度为5％-25％；有机溶剂是戊烷、正己烷、环己烷、辛烷、异辛烷、庚烷、石油醚中的一种或几种。

所述反萃水溶液中的反萃助剂为乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇中的一种，其质量浓度为0％-35％；所述反萃水溶液中的盐为氯化钾、溴化钾、硫氰化钾中的一种，其浓度为0.1-3M，所述反萃水溶液中的碱化剂是氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的一种。

所述阴离子型表面活性剂为二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠(AOT)，所述非离子表面活性剂为脱水山梨醇硬脂酸酯(即为Span60)、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(即为Tween80)、聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯(即为Tween85)中的一种。

反胶团是表面活性剂在有机溶剂中形成的纳米级聚集体，其中的微水相能溶解蛋白质等生物活性物质。通过控制萃取过程的有关工艺条件，可以选择性地萃取目标蛋白质。同传统的蛋白质分离纯化手段相比，它具有酶活回收率高，可连续操作、处理量大、分离步骤少、易于放大、高选择性、低成本的特点。本专利主要利用反胶团萃取技术的优势，改良鱼精蛋白的分离纯化工艺。

本发明的有益效果为：

本发明主要利用反胶团萃取技术的优势，改良鱼精蛋白的分离纯化工艺通过控制萃取过程的有关工艺条件，可以选择性地萃取目标蛋白质。同传统的蛋白质分离纯化手段相比，它具有酶活回收率高，可连续操作、处理量大、分离步骤少、易于放大、高选择性、低成本的特点。

具体实施方式

下面对本发明作进一步的详细说明。

实施例一

从鲤鱼鱼精蛋白粗提液中分离纯化鲤鱼鱼精蛋白

(1)制备鲤鱼鱼精蛋白粗提液：称取100g解冻后的鲤鱼鱼白置于组织捣碎机中，加入200ml浓度为0.14M的NaCl溶液，匀浆1min后，用纱布过滤得浆液，然后在8000r/min下离心分离10min，弃上清夜，得沉淀即鱼精蛋白与DNA的复合物DNP。每克DNP加入4ml的7.5％的硫酸，搅拌，混合均匀，8000r/min离心10min，弃沉淀，上清液即为鲤鱼鱼精蛋白粗提液。

(2)配制反胶团溶液，按其重量份配比为AOT:辛烷＝20:878，分别称取AOT和辛烷，取4.44g二琥珀酸酯磺酸钠(即AOT)和195.56g辛烷后，将其混合均匀，静置，直到完全溶解，得200g反胶团溶液。

AOT为表面活性剂，即二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠(AOT)

(3)前萃取过程：调节鲤鱼鱼精蛋白粗提液的pH＝7；以2M氯化钠调节鲤鱼鱼精蛋白粗提液的离子强度到0.1M。鲤鱼鱼精蛋白粗提液和反胶团溶液以重量份比1:1加入到三角瓶中，两相在摇床上以240rpm的速度振荡8min，温度控制在20℃。将混合液以4000rpm的速度离心5min，获得清晰分相。

(4)配制反萃水溶液：反萃水溶液包括异丙醇、氯化钾、和水。按其重量份配比为异丙醇、氯化钾和水＝15:5:80比例分别称取异丙醇、氯化钾、和水，其中异丙醇30g、氯化钾10g和水160g。将其混合均匀，静置，直到完全溶解，用NaOH调pH＝11得200g反萃水溶液。

(5)反萃取过程：负载鱼精蛋白的反胶团溶液同反萃水溶液等体积混合，在摇床上35℃以240rpm的速度振荡10min，然后将混合液中以4000rpm的速度离心5min，获得分相。经过一次萃取循环后，活性回收率可以达到96.5％，蛋白回收率可以达到33％，纯化因子达到2.8左右。而现有技术活性回收率为60-70％。

实施例二

从大马哈鱼鱼精蛋白粗提液中分离纯化大马哈鱼鱼精蛋白

(1)制备大马哈鱼鱼精蛋白粗提液：称取100g大马哈鱼鱼白于组织捣碎机中，加入200ml0.14M NaCl溶液，匀浆1min后，冰浴中搅拌20min，静置10min，4000r/min，离心分离10min，倾出上清液，沉淀再重复操作一次。将沉淀物捣碎，每克沉淀物DNP加入4ml的7.5％的硫酸提取，4000r/min离心分离10min，上清液过滤，离心后的沉淀再重复上述操作一次。合并两次提取液，真空过滤，滤液即大马哈鱼鱼精蛋白粗提液。

(2)配制反胶团溶液：取22gAOT和178g正己烷，其重量份配比为AOT:正己烷＝100:800，按上述比例分别称取AOT和正己烷后，将其混合均匀，静置，直到完全溶解，得200g反胶团溶液。

(3)前萃取过程：调解粗提液的pH＝8；以2M氯化钠调解粗提液的离子强度到0.15M。反胶团溶液和粗提液以1:15比例加入到三角瓶中，两相在摇床上以240rpm的速度振荡8min，温度10℃。将混合液以4000rpm的速度离心5min，获得清晰分相。

(4)配制反萃水溶液：取异丙醇60g、氢氧化钠2.4g、氯化钾10g、和水106g。其重量份配比为异丙醇、氢氧化钠、氯化钾、和水＝30:1.2:5:53。按上述比例分别称取异丙醇、氯化钾、甘氨酸-氢氧化钠和水后，将其混合均匀，静置，直到完全溶解，得178.4g反萃水溶液。

(5)反萃取过程：负载鱼精蛋白的反胶团溶液同反萃水溶液按5:1混合，在摇床上35℃以240rpm的速度振荡10min，然后将混合液中以4000rpm的速度离心5min，获得分相。鱼精蛋白抗菌活力回收率可以达到93％，纯化因子可以达到2.7左右。

实施例三

从鲢鱼鱼精蛋白粗提液中分离纯化鲢鱼鱼精蛋白

(1)制备鲢鱼鱼精蛋白粗提液：称取100g鲢鱼鱼白于组织捣碎机中，加入200ml0.2M NaCl溶液，匀浆1min后，冰浴中搅拌10min，静置5min，5000r/min，离心分离10min，倾出上清液，沉淀再重复操作一次。将沉淀物捣碎，每克沉淀物DNP加入4ml的7.5％的硫酸提取，4000r/min离心分离10min，4000r/min，离心分离10min，上清液过滤，离心后的沉淀再重复上述操作一次。合并两次提取液，真空过滤，滤液即鲢鱼鱼精蛋白粗提液。

(2)配制反胶团溶液：取8g AOT、3g Tween80和189g辛烷，其重量份配比为AOT:Tween80:辛烷＝40:15:945。按上述比例分别称取AOT、Tween80和辛烷，将其混合均匀，静置，直到完全溶解，得200g反胶团溶液。

(3)前萃取过程：调解粗提液的pH＝8；以2M氯化钠调解发酵液的离子强度到0.1M。反胶团溶液和粗提液以1:20比例加入到三角瓶中，两相在摇床上以240rpm的速度振荡8min，温度控制在35℃。将混合液以4000rpm的速度离心5min，获得清晰分相。

(4)配制反萃水溶液：取异丙醇30g、溴化钾10g和水146g，其重量份配比为异丙醇:溴化钾:水＝15:5:73。按上述比例分别称取异丙醇、溴化钾、和水后，将其混合均匀，静置，直到完全溶解，得186g反萃水溶液。

(5)反萃取过程：负载鱼精蛋白的反胶团溶液同反萃水溶液等体积混合，在摇床上35℃以240rpm的速度振荡10min，然后将混合液中以4000r pm的速度离心5min，获得分相。鱼精蛋白抗菌活力回收率可以达到78％，纯化因子可以达到2.6左右。

实施例四

从鲑鱼鱼鱼精蛋白粗提液中分离纯化鲑鱼鱼精蛋白

(1)制备鲑鱼鱼鱼精蛋白粗提液：称取150g鲑鱼鱼白于组织捣碎机中，加入300ml0.2M NaCl溶液，匀浆1min后，，静置15min，5000r/min，离心分离10min，倾出上清液，保留沉淀再重复操作一次。将沉淀物捣碎，每克沉淀物DNP加入4ml的7.5％的硫酸提取，6000r/min离心分离10min，上清液过滤，离心后的沉淀再重复上述操作一次。合并两次提取液，真空过滤，滤液即鲑鱼鱼精蛋白粗提液。

(2)配制反胶团溶液：取8.8gAOT和91.2g石油醚，其重量份配比为AOT:石油醚＝88:912。将其混合均匀，静置，直到完全溶解，得100g反胶团溶液。

(3)前萃取过程：调解粗提液的pH＝9；以2M氯化钠调解粗提液的离子强度到0.11M。反胶团溶液和粗提液和反胶团溶液以1:10比例加入到三角瓶中，两相在摇床上以240rpm的速度振荡4min，温度15℃。将混合液以4000rpm的速度离心5min，获得清晰分相。

(4)配制反萃水溶液：按其重量份配比为异丙醇:氢氧化钾:溴化钾:水＝25:2:12:53，分别称取异丙醇50g、氢氧化钾4g、溴化钾24g和水106g，然后将异丙醇、氢氧化钾、溴化钾和水混合均匀，静置，直到完全溶解，得184g反萃水溶液。

(5)反萃取过程：负载鱼精蛋白的反胶团溶液同反萃水溶液按8:1混合，在摇床上35℃以240r pm的速度振荡20min，然后将混合液中以4000rpm的速度离心5min，获得分相。鱼精蛋白抗菌活力回收率可以达到90％，纯化因子可以达到2.0左右。

实施例五

从武昌鱼鱼精蛋白粗提液中分离纯化武昌鱼鱼精蛋白

(1)制备武昌鱼鱼鱼精蛋白粗提液：称取150g武昌鱼鱼白于组织捣碎机中，加入300ml0.2M NaCl溶液，匀浆1min后，，静置15min，5000r/min，离心分离10min，倾出上清液，保留沉淀再重复操作一次。将沉淀物捣碎，每克沉淀物DNP加入4ml的7.5％的硫酸提取，6000r/min离心分离10min，上清液过滤，离心后的沉淀再重复上述操作一次。合并两次提取液，真空过滤，滤液即武昌鱼鱼精蛋白粗提液。

(2)配制反胶团溶液：按重量份配比为AOT:tween80:石油醚＝66:22:912，分别称取6.6gAOT、2.2g聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(tween80)、91.2g石油醚后，将其混合均匀，静置，直到完全溶解，得100g反胶团溶液。

(3)前萃取过程：调解粗提液的pH＝7；以2M氯化钠调解粗提液的离子强度到0.14M。反胶团溶液和粗提液和反胶团溶液以1:9相比加入到三角瓶中，两相在摇床上以240rpm的速度振荡4min，温度25℃。将混合液以4000rpm的速度离心5min，获得清晰分相。

(4)配制反萃水溶液：按重量份配比为异丙醇、溴化钾、氨水和水＝25:10:4:53，分别称取异丙醇50g、溴化钾20g、氨水8g和水106g。然后将异丙醇、溴化钾、氨水和水混合均匀，静置，直到完全溶解，得184g反萃水溶液。

(5)反萃取过程：负载鱼精蛋白的反胶团溶液同反萃水溶液按8:1混合，在摇床上35℃以240rpm的速度振荡20min，然后将混合液中以4000rpm的速度离心5min，获得分相。鱼精蛋白抗菌活力回收率可以达到87％，纯化因子可以达到2.7左右。

Claims (1)

1.一种利用反胶团法分离纯化鱼精蛋白的方法，从利用鱼白制得的鱼精蛋白粗提液中萃取纯化鱼精蛋白，其特征是包括如下步骤：

(1)制备鲤鱼鱼精蛋白粗提液：称取100g解冻后的鲤鱼鱼白置于组织捣碎机中，加入200ml浓度为0.14M的NaCl溶液，匀浆1min后，用纱布过滤得浆液，然后在8000r/min下离心分离10min，弃上清液，得沉淀即鱼精蛋白与DNA的复合物DNP，每克DNP加入4ml的7.5％的硫酸，搅拌，混合均匀，8000r/min离心10min，弃沉淀，上清液即为鲤鱼鱼精蛋白粗提液；

(2)配制反胶团溶液：分别称取4.44g二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠和195.56g辛烷后，将其混合均匀，静置，直到完全溶解，得200g反胶团溶液；

(3)前萃取过程：调节鲤鱼鱼精蛋白粗提液的pH＝7；以2M氯化钠调节鲤鱼鱼精蛋白粗提液的离子强度到0.1M；鲤鱼鱼精蛋白粗提液和反胶团溶液以重量份比1∶1加入到三角瓶中，两相在摇床上以240rpm的速度振荡8min，温度控制在20℃，将混合液以4000rpm的速度离心5min，获得清晰分相；

(4)配制反萃水溶液：反萃水溶液包括异丙醇、氯化钾、和水，按其重量份配比为异丙醇、氯化钾和水＝15∶5∶80比例分别称取异丙醇、氯化钾、和水，其中异丙醇30g、氯化钾10g和水160g，将其混合均匀，静置，直到完全溶解，用NaOH调pH＝11得200g反萃水溶液；

(5)反萃取过程：负载鱼精蛋白的反胶团溶液同反萃水溶液等体积混合，在摇床上35℃以240rpm的速度振荡10min，然后将混合液中以4000rpm的速度离心5min，获得分相，取下层液体为纯化后的鱼精蛋白溶液。