CN115894651A - 一种大豆油体蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提取大豆油体蛋白的方法，属于大豆蛋白提取方法领域。具体方法为将整豆浸泡、研磨、离心，收集上层乳膏状粗油体，洗涤得到纯油体，用异丙醇：异辛烷(1:2v/v)混合试剂处理纯油体，分离得到油体蛋白。本发明与乙醚和丙酮、氯仿：甲醇(1:2v/v)方法提取油体蛋白相比，提取步骤大大减少，油体蛋白提取率和纯度显著提高，严格避免易制毒有机试剂的使用和附带危害，为油体蛋白的提取工艺优化和相关蛋白研究提供坚实的理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种大豆油体蛋白的提取方法，属于大豆蛋白提取方法领域。
背景技术
油体是由油体蛋白和单层磷脂复合成蛋白膜，包裹油脂形成的天然水包油乳液，大小约为0.5-2.5μm。油体蛋白作为油体中的重要组成部分，其含量约为0.6-3.0％，与磷脂含量相近，主要分为oleosin(15～20kDa)、caleosin(25～35kDa)和steroleosin(35～60kDa)三种。这些油体蛋白包含一个疏水中心和C-端、N-端两亲结构域，具有独特的拓扑结构和镶嵌式模型，更稳定地吸附在油体表面，赋予油体空间位阻和电负斥力，对其乳液稳定性和功能特性起着至关重要的作用。
油体蛋白因其含量低和较强的疏水性提取困难。常见的提取方法：乙醚丙酮法、甲醇氯仿法和超声辅助盐提取法。其中乙醚丙酮法最常用，通过乙醚渗透油体蛋白膜，将中性脂质溶解分离，丙酮脱去极性脂质并沉淀蛋白，离心后回收得到油体蛋白。甲醇氯仿法则通过与磷脂发生反应，破坏油体膜结构，使内核中的中性脂质释放到有机溶液中，离心后形成中间油体蛋白层、上层有机相和下层水相。但这两种方法操作步骤繁多，需多次萃取，且使用易制毒有机试剂，对人体伤害极大。超声辅助盐提取法借超声和盐(NaCl)之间的协同作用显著提高油体蛋白提取率和溶解度，但此方法在乙醚、丙酮等有机试剂去除脂质基础上进行，仍存在安全性问题。通过异丙醇和异辛烷混合对油体蛋白进行提取，异丙醇有效萃取油体中油脂，异辛烷在相似相溶原理的作用下萃取异丙醇中的油脂形成有机相，异丙醇溶解油体中水分形成水相，离心后形成中间蛋白层、有机油相和水相。
本发明通过异丙醇和异辛烷混合溶液一步将油体蛋白富集在油水界面层，简化提取步骤，降低蛋白提取时间，减少易制毒溶剂的使用和危害，同时油体蛋白提取率和纯度显著提高，为大豆蛋白、重组油体和有益成分的包埋递送研究提供坚实的理论支持。
发明内容
本发明解决现有大豆油体蛋白提取步骤繁琐，提取率低的问题，提供一种提取大豆油体蛋白的方法。本发明利用异丙醇对油体蛋白膜的较强渗透作用，萃取出油脂，保留油体蛋白，在相似相溶原理作用下，异丙醇混合油中的油脂被异辛烷萃取，形成油水两相，油体蛋白因其两亲性存在两相界面处，此方法较大程度地减少提取步骤和时间，为油体蛋白的研究和油体工业化发展提供有力的理论依据。
本发明的技术方案：
一种大豆油体蛋白的提取方法，该方法包括以下步骤：
步骤一，大豆油体的提取：将完整大豆清洗干净后沥干水分，与去离子水按1:5(w/v)的料液比进行混合，置于4℃下浸泡16h，收集浸泡好的大豆并称量，与9倍质量的去离子水混合倒入研磨机中研磨8min，用尼龙布过滤收集滤液，将蔗糖以1:4(w/v)的料液比与滤液混合，冰水浴搅拌30min，用1mol/L NaOH调节溶液pH值至11.0，以20000×g离心处理30min，离心完毕后收集上层粗油体，粗油体与20％(w/w)蔗糖溶液按1:8(w/w)混合后粗均3min，用1mol/L NaOH调节溶液pH值至11.0，以20000×g离心处理30min，离心完毕后收集上层油体，重复两次，将上层油体与去离子水按料液比1:8(w/w)混合后粗均3min，用0.1mol/LNaOH调节溶液pH值至11.0，20000×g离心处理30min，收集上层乳状层，得到纯大豆油体。
步骤二，大豆油体蛋白的提取：将纯大豆油体与异丙醇/异辛烷(1:2v/v)混合液按1:3(w/v)的比例混合，用均质机3000rpm粗均5min，5000×g离心处理10min，收集中间白色蛋白层，收集蛋白与水混合搅拌，用氮气吹去残留有机溶剂，置于冻干机中冻干并收集粉末，得到油体蛋白粉末。
与其他油体蛋白提取方法相比，本发明利用异丙醇的强渗透性和相似相溶原理，一步法快速分离油体蛋白，且蛋白提取率、纯度和溶解度显著高于其他方法，分别为91.71％、80.20％和63.10％。
附图说明
图1为异丙醇/异辛烷提取油体蛋白效果图；
图2为油体蛋白粉末图；
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
实施例1：
一种大豆油体蛋白的提取方法，该方法包括以下步骤：
步骤一，大豆油体的提取：将完整大豆清洗干净后沥干水分，与去离子水按1:5(w/v)的料液比进行混合，置于4℃下浸泡16h，收集浸泡好的大豆并称量，与9倍质量的去离子水混合倒入研磨机中研磨8min，用尼龙布过滤收集滤液，将蔗糖以1:4(w/v)的料液比与滤液混合，冰水浴搅拌30min，用1mol/L NaOH调节溶液pH值至11.0，以20000×g离心处理30min，离心完毕后收集上层粗油体，粗油体与20％(w/w)蔗糖溶液按1:8(w/w)混合后粗均3min，用1mol/L NaOH调节溶液pH值至11.0，以20000×g离心处理30min，离心完毕后收集上层油体，重复两次，将上层油体与去离子水按料液比1:8(w/w)混合后粗均3min，用0.1mol/LNaOH调节溶液pH值至11.0，20000×g离心处理30min，收集上层乳状层，得到纯大豆油体。
步骤二，大豆油体蛋白的提取：将纯大豆油体与异丙醇/异辛烷(1:2v/v)混合液按1:3(w/v)的比例混合，用均质机3000rpm粗均5min，5000×g离心处理10min，收集中间白色蛋白层，收集蛋白与水混合搅拌，用氮气吹去残留有机溶剂，置于冻干机中冻干并收集粉末，得到油体蛋白粉末。
对比例1：
本对比例与实施例1相比的区别为：使用无水乙醚和冰丙酮提取油体蛋白
步骤一，大豆油体的提取：将完整大豆清洗干净后沥干水分，与去离子水按1:5(w/v)的料液比进行混合，置于4℃下浸泡16h，收集浸泡好的大豆并称量，与9倍质量的去离子水混合倒入研磨机中研磨8min，用尼龙布过滤收集滤液，将蔗糖以1:4(w/v)的料液比与滤液混合，冰水浴搅拌30min，用1mol/L NaOH调节溶液pH值至11.0，以20000×g离心处理30min，离心完毕后收集上层粗油体，粗油体与20％(w/w)蔗糖溶液按1:8(w/w)混合后粗均3min，用1mol/L NaOH调节溶液pH值至11.0，以20000×g离心处理30min，离心完毕后收集上层油体，重复两次，将上层油体与去离子水按料液比1:8(w/w)混合后粗均3min，用0.1mol/LNaOH调节溶液pH值至11.0，20000×g离心处理30min，收集上层乳状层，得到纯大豆油体。
步骤二，大豆油体蛋白的提取：将纯大豆油体与无水乙醚按1:3(w/v)的比例混合，用均质机3000rpm粗均5min，5000×g离心处理10min，收集白色蛋白沉淀，重复两次，蛋白沉淀与三倍体积的冰丙酮混合，用均质机3000rpm粗均5min，5000×g离心处理10min，收集蛋白与水混合搅拌，用氮气吹去残留有机溶剂，置于冻干机中冻干并收集粉末，得到油体蛋白粉末。
对比例2：
本对比例与实施例1相比的区别为：使用氯仿：甲醇(1:2v/v)混合液提取油体蛋白
步骤一，大豆油体的提取：将完整大豆清洗干净后沥干水分，与去离子水按1:5(w/v)的料液比进行混合，置于4℃下浸泡16h，收集浸泡好的大豆并称量，与9倍质量的去离子水混合倒入研磨机中研磨8min，用尼龙布过滤收集滤液，将蔗糖以1:4(w/v)的料液比与滤液混合，冰水浴搅拌30min，用1mol/L NaOH调节溶液pH值至11.0，以20000×g离心处理30min，离心完毕后收集上层粗油体，粗油体与20％(w/w)蔗糖溶液按1:8(w/w)混合后粗均3min，用1mol/L NaOH调节溶液pH值至11.0，以20000×g离心处理30min，离心完毕后收集上层油体，重复两次，将上层油体与去离子水按料液比1:8(w/w)混合后粗均3 min，用0.1mol/L NaOH调节溶液pH值至11.0，20000×g离心处理30min，收集上层乳状层，得到纯大豆油体。
步骤二，大豆油体蛋白的提取：将纯大豆油体与氯仿：甲醇(1:2v/v)混合液按1:3(w/v)的比例混合，用均质机3000rpm粗均5min，5000×g离心处理10min，收集中间白色蛋白层，重复三次，收集蛋白与水混合搅拌，用氮气吹去残留有机溶剂，置于冻干机中冻干并收集粉末，得到油体蛋白粉末。
对上述各实施例和对比例获得的油体蛋白进行提取率、纯度和氮溶解度对比，测试结果如下各表所示：
表1各实施例与对照组油体蛋白的提取率、纯度和氮溶解度
| 实验组 | 提取率(％) | 纯度(％) | 氮溶解度(％) |
| 实施例1 | <![CDATA[91.71±1.03<sup>a</sup>]]> | <![CDATA[80.20±0.49<sup>a</sup>]]> | <![CDATA[63.10±0.86<sup>a</sup>]]> |
| 对比例1 | <![CDATA[65.34±0.63<sup>b</sup>]]> | <![CDATA[75.43±0.65<sup>b</sup>]]> | <![CDATA[53.03±0.66<sup>b</sup>]]> |
| 对比例2 | <![CDATA[50.64±0.57<sup>c</sup>]]> | <![CDATA[49.32±0.70<sup>c</sup>]]> | <![CDATA[42.39±0.73<sup>c</sup>]]> |
由表1可知，异丙醇/异辛烷对油体蛋白的提取效果显著优于其他两种方法，提取率为91.71％，油体蛋白纯度较高为80.20％，氮溶解度较高为63.10％；无水乙醚和冰丙酮提取法提取效果次之，蛋白提取率、纯度和氮溶解度分别为65.34％、75.43％和53.03％；氯仿：甲醇法提取效果最差，蛋白提取率、纯度和氮溶解度分别为50.64％、49.32％和42.39。
图1所示为异丙醇/异辛烷提取油体蛋白观察图，上层为异辛烷混合油相，下层为异丙醇水相，中间油体蛋白层聚集在两相界面处，说明该方法对油体蛋白的提取效果非常显著且高效。
图2所示为异丙醇/异辛烷提取油体蛋白冻干研磨粉末。
Claims (1)
1.一种大豆油体蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，大豆油体的提取：将完整大豆清洗干净后沥干水分，与去离子水按1:5(w/v)的料液比进行混合，置于4℃下浸泡16h，收集浸泡好的大豆并称量，与9倍质量的去离子水混合倒入研磨机中研磨8min，用尼龙布过滤收集滤液，将蔗糖以1:4(w/v)的料液比与滤液混合，冰水浴搅拌30min，用1mol/L NaOH调节溶液pH值至11.0，以20000×g离心处理30min，离心完毕后收集上层粗油体，粗油体与20％(w/w)蔗糖溶液按1:8(w/w)混合后粗均3min，用1mol/L NaOH调节溶液pH值至11.0，以20000×g离心处理30min，离心完毕后收集上层油体，重复两次，将上层油体与去离子水按料液比1:8(w/w)混合后粗均3min，用0.1mol/L NaOH调节溶液pH值至11.0，20000×g离心处理30min，收集上层乳状层，得到纯大豆油体。
步骤二，大豆油体蛋白的提取：将纯大豆油体与异丙醇/异辛烷(1:2v/v)混合液按1:3(w/v)的比例混合，用均质机3000rpm粗均5min，5000×g离心处理10min，收集中间白色蛋白层，收集蛋白与水混合搅拌，用氮气吹去残留有机溶剂，置于冻干机中冻干并收集粉末，得到油体蛋白粉末。
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