KR20040004144A - 식물 종자로부터 기름체 및 올레오신 단백질의 제조방법 - Google Patents

식물 종자로부터 기름체 및 올레오신 단백질의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물의 종자 또는 기름골의 괴경에서 기름체 및 올레오신 단백질을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (a) 식물 종자 또는 기름골 괴경을 물에 함침시키는 단계; (b) 상기 종자 또는 괴경의 표면에 부착된 물을 제거한 다음 분쇄시키는 단계; (c) 상기 분쇄물을 원심분리하는 단계; (d) 원심분리하여 형성된 상층액을 회수하는 단계; 및 (e) 회수된 상층액을 세척하여 최종적으로 기름체를 수득하는 단계를 포함하는 식물의 종자 또는 기름골의 괴경에서 기름체를 제조하는 방법 및 올레오신 단백질을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법에 따르면, 식물 종자 또는 기름골 괴경으로부터 짧은 시간내에 기름체 및 올레오신 단백질을 효율적으로 얻을 수 있다.

Description

식물 종자로부터 기름체 및 올레오신 단백질의 제조방법{Method for Preparing Oil Bodies and Oleosin Proteins from Plant Seeds}
본 발명은 식물의 종자 또는 기름골의 괴경에서 기름체 및 올레오신 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 외국에서는 백겨자(Sinapis alba), 유채(rape,Brassica napus), 대두(soybean,Glycine max), 목화(cotton plant,Gossypium), 땅콩(peanut,Arachis hypogaea), 호박(pumpkin,Cucurbita spp.), 아마(flax,Linum usitatissimum), 해바라기(sunflower,Helianthus annuus), 옥수수(maize,Zea mays), 올리브(olive,Olea europaea), 아보카도(avocado,Persea americana) 등의기름을 산업용이나 식용 기름으로 이용하는 반면에, 국내에서는 외국에서 이용되고 있는 종자뿐만 아니라 참깨(sesame,Sesamum indicum), 들깨(Perilla frutescensvar. japonica), 고추(hot pepper,Capsicum annuum), 잇꽃(홍화, safflower, Carthamus tinctorius), 동백(Camellia japonica), 아주까리(피마자,Ricinus communis), 달맞이꽃(Evening primrose,Oenothera odorata) 등을 이용하고 있다.
또한 지중해 근처의 국가에서 유래되어 북한에서 토착화된 기름골(Chufa,Cyperus esculentusL.)은 고급 식용 기름으로 이용되며 종자 대신에 괴경을 이용하여 기름을 생산한다. 국내 일부에서도 기름골을 식용으로 사용하기 위하여 연구 개발이 활발히 진행되고 있다.
대부분의 식물은 활발한 대사 과정이 이루어지는 동안에 세포 아래 부위에 저장 에너지로서 지질을 저장한다. 이러한 지질은 식물의 종자, 꽃가루, 포자 및 영양기관에 존재한다고 보고되어 있다 (Huang, A. H. C., 1992; Rossler, P. G., 1988). 식물 세포에 저장된 지질 소립자들의 대부분은 광범위하게 종자에서만 연구가 이루어지고 있다.
많은 식물의 종자들은 발아 시기나 발아 후의 성장을 위하여 트리아실글리세롤 (TAGs)을 저장한다고 보고되었다 (Huang, 1992; Gurr, 1980). TAGs는 전체 종자 건중량당 약 5-40%를 차지한다. TAGs는 작으면서 연속적으로 나열된 세포 아래 기관인 기름체 (oil bodies, lipid bodies, oleosomes, sphrosomes)들 안에 존재한다. 둥근 모양의 기름체는 식물의 발생 시기에 따라서 대략 0.6-2.0 ㎛의 크기를 가진다. 각각의 기름체는 인지질 (PL) 층으로 쌓여 있는 TAGs 기질을 가지고 있으며, 올레오신 (oleosin)이라고 불리는 단백질들이 PL 층에 박혀 있다 (Tzen and Huang, 1992 ). 올레오신들은 기본적으로 기름체 전체 표면을 싸고 있으며, 기름체 전체 무게의 1-4% 정도 존재한다. 이러한 비율은 전적으로 기름체의 크기에 따라 결정된다. 올레오신들은 식물의 종에 따라 이성질체 단백질로 이루어져 있으며 15-26 kD 범위의 크기를 가진다 (Ting et al., 1997).
각각의 올레오신 분자는 세 종류의 구조로 이루어져 있다 (Li et al., 1992). 첫째는 기름체의 표면에 존재하는 불확정의 2차 구조로 뻗어 있는 양극성의 N-말단(20-60 잔기)이고, 둘째는 기질 안으로 삽입되어 있는 긴 비대칭형의 β구조에 주요한 소수성 영역이며, 마지막으로 PL층과 상호 작용하여 기름체 표면에 위치하고 있는 양극성 α-사슬의 C-말단(30-40 잔기)으로 이루어져 있다.
이러한 세 종류의 구조적인 부분으로 이루어진 각각의 올레오신은 기름체의 표면에서 다른 분자들과 상호 작용하는 것을 가능하게 한다. 올레오신들은 기름체의 표면에서 입체적 장벽으로 형성되어지며 인접한 기름체들의 PL층은 접촉이나 유착되는 것을 방어한다. 기름체들은 단위 TAGs에 많은 표면 영역을 제공하며 지질 분해 효소나 발아 동안의 지질 분해를 촉진한다.
종자 성숙 분열 기간 동안에 기름체들은 신생 분리 과정에 의해 조면소포체(rough ER)에서 합성된다. TAGs는 소포체에 있는 효소에 의해 합성되고 그들의 소수성 성분 때문에 소포체 막의 2개의 PL층 사이에서 하나의 TAG가 형성되고 분리된다. 소포체에 있는 효소에 의해 합성된 PL은 새로 형성된 TAG 입자의 표면으로 확산된다. 동시에 올레오신도 확실한 전사나 전사 후 과정 없이 소포체에 결합한 폴리리보좀에서 합성된다. 새로 합성된 올레오신은 주요한 소수성 영역에 의해 유도되어 새로 형성된 PL로 둘러 쌓여 있는 TAG 입자로 이동하여 직접 삽입된다. 그런 후 TAG 기질은 올레오신을 가지고 PL로 둘러 쌓여 있는 입자, 즉 완전한 기름체로서 세포질 안으로 방출된다.
분리 과정시 기름체는 원래의 상태대로 유지되어 원심분리시 세포 추출물로부터 쉽게 분리되어 표면에 찌꺼기처럼 부유한다 (Gijs and Moloney, 1995).
최근에는 올레오신 단백질이 외래에서 도입한 재조합 단백질이나 펩타이드의 발현과 생산을 위한 시스템으로 활용되어 왔다 (Parmenteret al., 1995; van Rooijen and Moloney, 1995). 식물체에서 재조합 단백질이나 펩타이드의 생산이 경제적으로 매우 효율적이라 하여 가장 경제적인 중요한 식물 종에 외부 단백질을 발현하였으나 유용한 단백질을 분리하는데는 경제적인 것이 제한적이었다. 식물체에서 재조합 단백질이나 펩타이드를 생산하는 방법으로는 강력하게 항상 발현하는 식물 프로모터를 이용하는 전사적 융합 (transcriptional fusion)을 이용하여 접근하는 연구가 다양하게 진행되어 왔다. 예를 들면, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus(Sijmons)), 기관 특이성 프로모터 서열을 가지는 전사적 융합 (Radke), 생산된 재조합 단백질에 수반되는 절단 부위를 가지는 전사적 융합 (Vanderkerkore) 연구 등이 그것이다.
본 발명자들은 다양한 식물의 종자 또는 기름골의 괴경으부터 기름체 및 올레오신 단백질을 분리할 수 있는 가장 효율적인 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 결과적으로 단시간 내에 효율적으로 기름체 및 올레오신 단백질을 얻을 수 있는 방법을 개발하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 식물의 종자 또는 기름골의 괴경에서 기름체를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 식물의 종자 또는 기름골의 괴경에서 올레오신 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
도 1은 국내에서 식용으로 사용하는 고추, 참깨, 들깨 종자 및 기름골의 괴경에서의 분리된 기름체 단백질, 올레오신을 나타내는 사진.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 식물 종자 또는 기름골 괴경을 물에 함침시키는 단계; (b) 상기 종자 또는 괴경의 표면에 부착된 물을 제거한 다음 분쇄시키는 단계; (c) 상기 분쇄물을 원심분리하는 단계; (d) 원심분리하여 형성된 상층액을 회수하는 단계; 및 (e) 회수된 상층액을 세척하여 최종적으로 기름체를 수득하는 단계를 포함하는 식물의 종자 또는 기름골의 괴경에서 기름체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 식물 종자 또는 기름골 괴경을 물에 함침시키는 단계; (b) 상기 종자 또는 괴경의 표면에 부착된 물을 제거한다음 분쇄시키는 단계; (c) 상기 분쇄물을 원심분리하는 단계; (d) 원심분리하여 형성된 상층액을 회수하는 단계; (e) 회수된 상층액을 세척하여 최종적으로 기름체를 수득하는 단계; 및 (f) 상기 수득한 기름체를 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylaminde gel electrophoresis)하여 올레오신 단백질을 분리하는 단계; 및 (g) 상기 올레오신 단백질을 SDS-PAGE 겔에서 용출시켜 올레오신 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 식물의 종자 또는 기름골의 괴경에서 올레오신 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 기름체 및 올레오신 단백질을 분리할 수 있는 가장 효율적인 방법을 개발하고자 노력하였고, 결국 상기한 과정을 포함하는 방법을 개발하게 되었다.
본 발명의 방법은 제한 없이 모든 식물 종자에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 백겨자, 유채, 대두, 목화, 땅콩, 호박, 아마, 해바라기, 옥수수, 올리브, 아보카도, 참깨, 들깨, 고추, 잇꽃, 동백, 아주까리 및 달맞이꽃으로 구성된 군으로부터 선택되는 식물의 종자에 적용되며, 보다 바람직하게는 고추, 참깨 또는 들깨의 종자에 적용된다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 물에 함침시키는 단계는 식물의 종자인 경우에는 20-28 시간 (보다 바람직하게는 23-25 시간, 가장 바람직하게는 약 24 시간) 동안 함침시키고, 기름골의 괴경인 경우에는 43-52 시간 (보다 바람직하게는 46-50 시간, 가장 바람직하게는 약 48 시간)동안 함침시켜 실시한다. 만일, 상기 함침시키는 시간이 20 시간 미만인 경우에는 각 식물 종자를 분쇄 완충 용액에서 분쇄될 때 기름체가 식물 조직으로부터 분리가 어려워 정확한 양의 회수를 하지 못하는 문제점이 있고, 28 시간을 초과하는 경우에는 완충 용액이 아닌 많은 양의 물이 식물 종자 조직으로 들어가 기름체의 안정한 리피드 양상을 파괴하는 경우가 있어 동량의 종자을 처리하는 실험에서 많은 양의 온전한 오일 바디를 잃어 버리는 문제점이 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분쇄시키는 단계는 Tris-HCl, 수크로스 및 NaCl을 포함하는 분쇄 완충액에서 실시한다. 분쇄 완충액에서 Tris-HCl은 pH 완충제의 역할을 하고, 수크로스 때문에 농도 구배를 가지므로 인하여 분리 정제를 용이하게 하는 역할을 하며, NaCl은 기름체 이외의 이온 물질들을 제거하며 오일 바디의 가장 안정한 양상의 리피드 이중 구조를 유지하는 역할을 한다. Tris-HCl에 의해 달성되는 pH는 7.5-8.5가 바람직하고, 보다 바람직하게는 7.8-8.2이고, 가장 바람직하게는 약 8.0이다. 수크로스의 함량은 0.03-0.08 mole이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.05-0.07 mole이고, 가장 바람직하게는 약 0.06 mole이다. NaCl의 함량은 0.04-0.09 mole이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.06-0.08 mole이며, 가장 바람직하게는 약 0.075 mole이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 원심분리하는 단계는 10,000-20,000 rpm에서 실시되며, 보다 바람직하게는 13,000-18,000 rpm, 가장 바람직하게는 약 16,000 rpm에서 실시된다. 원심분리가 10,000 rpm 미만에서 실시되는 경우에는 현탁되어 있는 용액에서 기름체의 분리가 어려우며 순수한 기름체의 회수에 문제점이 있고, 20,000 rpm 보다 큰 조건에서 실시되는 경우에는 분리 회수된 기름체가 독립적으로 존재하는 경우가 어려워 기름체 주위의 불순물을 제거하는 세척 과정에 어려움을 가지는 문제점이 있다. 원심분리가 10,000-20,000 rpm에서 실시되는 경우에는 20분-60분 동안 실시하는 것이 바람직하고, 13,000-18,000 rpm에서 실시되는 경우에는 25분-40분 동안 실시하는 것이 바람직하며, 약 16,000 rpm에서 실시되는 경우에는 약 30분 동안 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 세척하는 단계는 Tris-HCl, 수크로스 및 NaCl을 포함하는 완충액을 회수된 상층액에 첨가한 다음 원심분리하여 실시된다. Tris-HCl에 의해 달성되는 pH는 7.5-8.5가 바람직하고, 보다 바람직하게는 7.8-8.2이고, 가장 바람직하게는 약 8.0이다. 수크로스의 함량은 0.03-0.08 mole이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.05-0.07 mole이고, 가장 바람직하게는 약 0.06 mole이다. NaCl의 함량은 0.04-0.09 mole이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.06-0.08 mole이며, 가장 바람직하게는 약 0.075 mole이다. 상기 세척을 위한 원심분리는 3,000-8,000 rpm에서 실시하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5,000-7,000 rpm, 가장 바람직하게는 약 6,000 rpm에서 실시한다.
상기 올레오신 단백질을 분리하기 위한 SDS-PAGE는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있다 (참조: Robert K. Scopes,Protein Purification2판, Springer-Verlag, 1988). 상기 올레오신 단백질을 SDS-PAGE 겔에서 용출시키는 방법도 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있다 (참조: Robert K. Scopes,Protein Purification2판, Springer-Verlag, 1988).
본 발명의 방법에 따르면, 식물 종자 또는 기름골 괴경으로부터 짧은 시간내에 기름체 및 올레오신 단백질을 효율적으로 얻을 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1.종자 및 괴경
고추, 참깨 및 들깨 종자는 전년에 수확한 볶지 않은 것으로 완전히 건조된 것을 구입하여 사용하였으며, 기름골 괴경은 마찬가지로 전년 수확한 것을 구입하여 사용하였다.
2.시약 및 기기
본 연구에 사용한 모든 시약은 시그마-알드리치사 (Sigma-aldrich, 미국)에서 구입하였다. 기름체 분리에 사용된 원심분리기는 한일산업(한국)에서 제조한 것을 사용하였고, 단백질 전기영동 장치는 바이오-래드사 (Bio-Rad, 미국)의 미니-프로테인 Ⅲ (Mini-proteinⅢ) 장비를 사용하였다.
3.기름체 분리
고추, 참깨 및 들깨 종자의 기름체 분리를 위하여 종자를 물에 24시간 정도 담가 두었고, 기름골 괴경은 48시간 이상을 물에 담가 두었다. 이어, 종자와 괴경의 물기를 완전히 제거하고 난 후, 각각 30 g을 측정하여 냉장 보관된 분쇄 완충액 (Grinding buffer: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.4 M 수크로스, 0.5 M NaCl) 150㎖를 첨가하여 파쇄기를 이용하여 미세하게 분쇄하였다. 분쇄한 용액을 원심분리기를 이용하여 16,000 rpm에서 30분간 실온에서 원심 분리하였다.
분리된 용액의 상층액을 시약 수저를 이용하여 조심스럽게 분리하여 회수하였다. 회수한 기름체에 분쇄 완충액 150 ㎖를 튜브벽면을 이용하여 조심스럽게 첨가하고 잘 혼합한 후 6,000 rpm에서 실온에서 원심분리하여 기름체를 세척하였다. 세척 과정을 두 번 반복하여 정제된 기름체를 확보하였다.
세척한 기름체를 유화제 형태로 보관하기 위하여 저장 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5)를 15 ㎖ 첨가하여 잘 혼합하여 냉장고에 보관하였다.
4.Oleosin 분리
원심분리로 분리 정제한 기름체에서 올레오신을 분리하기 위하여 SDS-PAGE를 이용하였다. 우선, 회수한 100 ㎕ 기름체와 100 ㎕ 시료완충용액을 잘 혼합한 후 끓는 물에 10분간 처리하였다. 처리된 각 시료들은 10,000-13000 rpm에서 1-2분간 원심분리한 후에 상등액 50 ㎕에 전기영동 염색액 5 ㎕을 첨가하여 만들어진 SDS-폴리아크릴아미드 단백질 전기영동 겔 웰에 조심스럽게 주입하였다. 각 시료들을 모두 주입한 후에 전압을 100 V로 고정하여 30분간 단백질을 전기영동을 실시한 후에 200 V로 1-1.5 시간 동안 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝난 후에는 겔을 쿠마시 염색액으로 염색한 후에 메탄올이 들어 있는 탈색 용액으로 겔을 탈색시킨 후에 각 시료들의 올레오신 단백질을 관찰하였다.
도 1에서 볼 수 있듯이, 고추, 참깨, 들깨 및 기름골 종자에서 여러 종류의 올레오신 단백질이 확인되었다 (도면에서 화살표 표시). 올레오신 단백질을 확인함으로 인하여 4 종류의 식물 종자에서도 기름체가 존재하는 것을 알 수 있었으며, 다양한 크기의 올레오신 단백질을 함유하고 있음을 알 수 있었다. 특히 고추는 다른 3 종의 식물 종자와는 다른 양상이 두드러지게 나타났다. 고추를 제외한 3 종의 식물 종자의 오일 바디는 크기와 양상이 매우 유사한 것으로 나타났다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 식물의 종자 또는 기름골의 괴경에서 기름체를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 식물의 종자 또는 기름골의 괴경에서 올레오신 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 식물 종자 또는 기름골 괴경으로부터 짧은 시간내에 기름체 및 올레오신 단백질을 효율적으로 얻을 수 있다.
참고문헌
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2. Gurr, M.I. 1980. In the Biochemistry of plants ; Sumpf, P.K. and Conn, E.E., eds. vol. 4. pp 204-208, Academic Press, New York.
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4. Vance, V.B., and Huang, A.H.C. 1987. J. Biol. Chem. 262:11275-11279.
5. Qu, R., Wang, S.M., Lin, Y.H., Vance, V.B., and Huang, A.H.C. 1986. Biochem. J. 235:57-65.
6. Tzen, J.T.C., Lie, G.C., and Huang, A.H.C. 1992. J. Biol. Chem. 267:15626-15634.
7. Li, M., Smith, L.J., Clark, D.C., Wilson, R., and Murphy, D.J. 1992. J. Biol. Chem. 267:8245-8253.
8. Huang, A. H. C. 1992. Annu. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 43:177-200.
9. Rossler, P. G. 1988. J. Physiol. (London) 24: 394-400.
10. Parmenter, D. L., Boothe, J. G., van Rooijen, G. J., Yeung, E. C., and Moloney, M. M. 1995. Plant Mol. Biol. 29(6): 1167-1180.
11. Van Rooijen, G. J., and Moloney, M. M. 1995. Plant Physiol. 109(4): 1353-1361.

Claims (16)

  1. 다음의 단계를 포함하는 식물의 종자 또는 기름골의 괴경에서 기름체를 제조하는 방법:
    (a) 식물 종자 또는 기름골 괴경을 물에 함침시키는 단계;
    (b) 상기 종자 또는 괴경의 표면에 부착된 물을 제거한 다음 분쇄시키는 단계;
    (c) 상기 분쇄물을 원심분리하는 단계;
    (d) 원심분리하여 형성된 상층액을 회수하는 단계; 및
    (e) 회수된 상층액을 세척하여 최종적으로 기름체를 수득하는 단계.
  2. 다음의 단계를 포함하는 식물의 종자 또는 기름골의 괴경에서 올레오신 단백질을 제조하는 방법:
    (a) 식물 종자 또는 기름골 괴경을 물에 함침시키는 단계;
    (b) 상기 종자 또는 괴경의 표면에 부착된 물을 제거한 다음 분쇄시키는 단계;
    (c) 상기 분쇄물을 원심분리하는 단계;
    (d) 원심분리하여 형성된 상층액을 회수하는 단계;
    (e) 회수된 상층액을 세척하여 최종적으로 기름체를 수득하는 단계; 및
    (f) 상기 수득한 기름체를 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylaminde gel electrophoresis)하여 올레오신 단백질을 분리하는 단계; 및
    (g) 상기 올레오신 단백질을 SDS-PAGE 겔에서 용출시켜 올레오신 단백질을 수득하는 단계.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 식물종자는 백겨자, 유채, 대두, 목화, 땅콩, 호박, 아마, 해바라기, 옥수수, 올리브, 아보카도, 참깨, 들깨, 고추, 잇꽃, 동백, 아주까리 및 달맞이꽃으로 구성된 군으로부터 선택되는 식물의 종자인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 식물종자는 고추, 참깨 또는 들깨의 종자인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 물에 함침시키는 단계는 식물의 종자인 경우에는 20-28 시간 동안 함침시키고, 기름골의 괴경인 경우에는 43-52 시간 동안 함침시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 분쇄시키는 단계는 Tris-HCl, 수크로스 및 NaCl을 포함하는 분쇄완충액에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 원심분리하는 단계는 10,000-20,000 rpm에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 원심분리하는 단계는 13,000-18,000 rpm에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 원심분리하는 단계는 약 16,000 rpm에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 원심분리하는 단계는 20분-60분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 원심분리하는 단계는 25분-40분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 원심분리하는 단계는 약 30분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 세척하는 단계는 Tris-HCl, 수크로스 및 NaCl을 포함하는 완충액을 회수된 상층액에 첨가한 다음 원심분리하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 원심분리는 3,000-8,000 rpm에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 원심분리는 5,000-7,000 rpm에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 원심분리는 약 6,000 rpm에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
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