CN102766206A

CN102766206A - 一种改善缺铁性贫血的产品及其制备方法

Info

Publication number: CN102766206A
Application number: CN2012102278455A
Authority: CN
Inventors: 于添
Original assignee: BEIJING JIFULIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING JIFULIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2012-07-02
Publication date: 2012-11-07
Also published as: WO2014005466A1

Abstract

本发明提供了一种从转基因克隆牛乳中大量纯化重组人乳铁蛋白的方法，同时提供了一种利用纯化出的重组人乳铁蛋白为原料进行改善缺铁性贫血产品的开发，提供一种新型的补铁制剂产品--铁饱和重组人乳铁蛋白(FerhLF)。利用这种新的补铁制剂，大大增强了改善缺铁性贫血的效果，显著的提高了缺铁性贫血大鼠的血红蛋白浓度，且没有明显的不良反应，使用安全，效果明显，制备方法简单。

Description

一种改善缺铁性贫血的产品及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种改善缺铁性贫血的产品及其制备方法。

背景技术

铁是血红蛋白的重要组成成分，在人体内起着输送氧气的作用，是人体必需的营养元素之一。机体缺铁会使免疫力下降，并伴有疲倦、易怒、烦躁、记忆力减退等症状。更重要的是机体缺铁会引起缺铁性贫血（Iron deficiency anemia，IDA）。缺铁性贫血(IDA)是全世界发病率最高的营养缺乏性疾病之一。世界50亿人口中约有1/3的人贫血。而IDA或铁营养不良的人群约占5亿。在发展中国家铁缺乏(ID)发生率是发达国家的4倍。我国是世界上缺铁性贫血发生率较高的国家之一，各类人群IDA的平均发生率为15%-20%，其中妇女和儿童发生率高达20%以上。严重的地区儿童IDA发生率高达70%，育龄妇女的IDA发生率高达35%，贫血严重威胁妇女健康。

虽然铁在食物中比较常见，但是铁在食物中的形态不利于机体的吸收和利用。目前医疗界普遍用补铁剂对缺铁性贫血的患者进行治疗。目前市场存在的补铁制剂主要有2大类：一类是传统的化学合成的铁制剂包括无机铁和有机铁（非血红素铁）；另一类是生物血红素铁。无机铁主要包括亚铁盐类，常用的如硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、富马酸亚铁、乳酸亚铁、琥珀酸亚铁等，这类补铁制剂虽然补铁效果较好，但其生物利用度低、口感较差且长期服用会对胃肠道粘膜刺激大，易引起恶心、胃胀、消化器官障碍、腹泻、便秘等副作用，特别对于胃病患者、孕妇或儿童更是不适用。由于无机铁制剂的不良副作用，人们开始进行新一代的补铁剂研究。20世纪90年代国家疾病预防控制中心成功的开发出新的补铁剂乙二胺四乙酸铁钠，它具有无机铁制剂明显的优势：不仅口感好，吸收率高且性质稳定无胃肠道刺激。随后，性质相近、结构类似的有机补铁制剂不断地开发出来，如甘氨酸铁、苏氨酸铁等。但由于氨基酸微量元素配合物生产成本高、制剂价格较为昂贵，目前在我国应用并不广泛。血红素铁(卟啉铁)是目前市场上吸收率最好，生物利用度最高的补铁剂主要是由从家畜合格血液中分离除去血清，所得血球部分再经蛋白酶酶解以除去血球蛋白后所得的富含卟啉的铁蛋白。但是由于其铁含量低，血液来源有限也限制了其广泛应用。

目前国内市场上用于药品和食品添加剂中的补铁制剂主要是亚铁制剂，有机补铁制剂虽然吸收率略有提高但仍然不尽人意，且价格昂贵还难以普及。因此，开发出稳定性更好、生物利用度更高、价格低廉的补铁制剂一直是人们研究的焦点。

长时期的研究表明，乳铁蛋白（LF）能够促进机体对铁的吸收和利用，维持机体铁代谢平衡。乳铁蛋白是一种分子量80kD的多功能金属结合蛋白，广泛存在与哺乳动物乳汁和其他多种组织以及其外分泌液中。它能参与多种生理过程，包括宿主防卫、炎症调节、生长刺激以及促进胃肠道对铁的吸收等。乳铁蛋白在结构上和生物化学特征上与转铁蛋白的高度的相似，但它与铁离子的亲和力是转铁蛋白的260倍，并在一个较广的范围内（pH4~11）保持铁的结合。由于转铁蛋白在胃内极酸性条件下不具有运送铁的功能，因此只有乳铁蛋白能够在动物肠道中运载铁离子。

乳铁蛋白能根据机体机体对铁的需求，通过调节肠粘膜细胞对铁的吸收，保持体内的铁平衡。在生理pH值条件下Fe³⁺不溶于水，很难被生物体所利用。乳铁蛋白能够螯合Fe³⁺增加其溶解度，1摩尔乳铁蛋白能溶解70摩尔Fe³⁺远远高于其铁离子结合能力。乳铁蛋白结合Fe³⁺改变其化学形式促进机体细胞吸收Fe³⁺。结合铁离子的乳铁蛋白进入小肠后，通过小肠上皮细胞上的受体将铁离子转运到血液中；肠细胞还能直接吸收大量的乳铁蛋白从而获取铁离子。同时，乳铁蛋白还能提高铁的生物利用率，维持机体铁代谢，因而能用于预防和治疗缺铁所导致的贫血性疾病。大鼠饲喂实验证明乳铁蛋白结合铁能够明显的改善缺铁性贫血且效果远远优于FeSO₄和FeCl₃,等无机铁离子，不仅提高了铁的生物利用率还避免了无机铁对胃肠道粘膜的损伤。2010年《International Journal of Immunopathology and Pharmacology（国际免疫病理学和药理学杂志）》报道，意大利研究人员在治疗孕妇缺铁性贫血的临床研究中发现乳铁蛋白提高血清中铁蛋白、血红蛋白、铁含量要显著强于FeSO₄，而且没有明显副作用，进一步证实乳铁蛋白可用于治疗缺铁症和缺铁性贫血。另外，临床研究表明乳铁蛋白还有预防运动性贫血及肌肉疲劳的效果。

乳铁蛋白能根据机体对铁的需求，通过调节肠粘膜细胞对铁的吸收，保持体内的铁平衡。乳铁蛋白促进铁吸收的作用主要是通过增加Fe³⁺的溶解性，且能够特异性结合动物小肠粘膜细胞的乳铁蛋白受体（LFR），增加铁吸收效率，避免铁离子对动物肠道的直接刺激作用。乳铁蛋白到达肠道以后与LFR识别并结合通过细胞内吞作用浸入细胞并释放Fe³⁺。细胞对铁的吸收有负反馈调节机制,当细胞内缺铁时,细胞表面的LFR增多,增加LF与其受体的结合的机会。如果细胞内铁含量较高时，细胞表面的LFR表达减少，减少铁元素的摄入。以降低铁离子对机体造成的不良反应。有研究表明乳铁蛋白可以通过调节炎症反应，降低血液中前炎症因子IL-6的表达来调节机体对铁的吸收。

综上所述，乳铁蛋白不仅可以增强铁的吸收率而且能降低有效铁的使用量，减少铁对机体的负面影响。因此，乳铁蛋白可以作为一种很好的补铁剂。

然而目前利用乳铁蛋白进行补铁制剂的大规模开发还很受限制，这是因为目前市场上存在的都是牛乳铁蛋白（bLF），牛乳铁蛋白在牛乳中含量极低，生产成本极高且牛乳铁蛋白作为异源蛋白质其在人体内的稳定性和吸收率都不如人乳铁蛋白，因此一直以来大量开发生产人乳铁蛋白就一直成为人们研究的焦点和难点。目前，应用原核及真核表达系统大量生产重组人乳铁蛋白已经进行了许多尝试，然而许多表达系统的表达量及翻译后修饰并不合适，这也就限制了这些重组蛋白的应用。最近，研究者利用体细胞克隆技术成功的获得了人乳铁蛋白转基因克隆牛。重组人乳铁蛋白（rhLF）在乳中具有很高的表达量平均可达2.5g/L。重组人乳铁蛋白具有与天然人乳铁蛋白相似的生物活性，包括对胰酶的敏感程度，铁结合释放能力以及抗菌活性等。利用这种重组人乳铁蛋白进行补铁剂的开发可以替代牛乳铁蛋白大大节约了成本，而且其能够与人小肠上皮细胞特异性受体结合会大大增强其运铁效果，提高铁的吸收效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种改善缺铁性贫血的产品及其制备方法。

本发明的另一目的是提供制备所述改善缺铁性贫血产品的方法。

本发明是利用转基因克隆牛乳中表达的重组人乳铁蛋白为原料进行改善缺铁性贫血产品的开发，提供一种新型的补铁制剂产品--铁饱和重组人乳铁蛋白(FerhLF)。

本发明还提供从转基因牛乳中大量纯化重组人乳铁蛋白的方法以及制备一种补铁剂—铁饱和重组人乳铁蛋白的方法。

从转基因牛乳中大量纯化重组人乳铁蛋白的方法包括：表达重组人乳铁蛋白的转基因牛的制备、牛乳脱脂、过滤除菌、离子交换层析分离纯化脱脂乳中的重组人乳铁蛋白。具体包括如下步骤：

1）转基因牛的制备。包括如下步骤：

i)利用含有完整人乳铁蛋白基因的hLF BAC DNA作为乳腺特异表达载体；

ii)将hLF BAC DNA与双标记选择载体pEGFP-NEO或单标记选择载体pNEO按比例混合，导入家畜体细胞核内，进行细胞转染，获得转入hLF BAC DNA的转基因细胞；

iii)细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得转有hLF BAC DNA的转基因牛；

2)将由上述转基因牛产生的rhLF牛乳加热到40-45℃后进行乳脂分离，以65-75转/分钟连续脱脂两次；然后利用孔径为1.4μm的滤膜对脱脂牛乳进行微滤除菌；

3)利用BPG140/500层析柱，以SP Sepharose Big Beads作为柱填料进行阳离子交换层析，用pH值6.5的PBS液进行洗脱，收集合并具有同一rhLF活性洗脱峰峰值的洗脱液；

4)对洗脱液进行超滤浓缩及冷冻干燥，即得重组人乳铁蛋白粉末。

前述方法中，步骤3)中优选用含0.4M NaCl，pH值6.5的20mM PBS进行预洗脱去除杂蛋白，然后用含1M NaCl，pH值6.5的20mM PBS进行洗脱，收集合并具有同一rhLF活性洗脱峰峰值的洗脱液。

前述方法中，步骤4)中所述超滤具体为：将步骤3）中得到的具有同一rhLF活性洗脱峰峰值的洗脱液，经蠕动泵泵入超滤膜进行超滤浓缩，加入pH值6.0的20mM磷酸盐缓冲液，循环7次，直至浓缩液出口电导率低于1mS/cm，再将溶液进一步进行浓缩。

制备所述改善缺铁性贫血产品的方法为：利用转基因克隆牛乳表达的重组人乳铁蛋白（rhLF，氨基酸序列如Seq ID No.1所示）与Fe³⁺在NaHCO₃溶液（或KHCO₃溶液）中进行螯合。具体地，其是将重组人乳铁蛋白溶于水配制成溶液，然后将该溶液与FeCl₃溶液以及NaHCO₃或KHCO₃溶液混合，搅拌后制成铁饱和重组人乳铁蛋白溶液，随后经过脱盐与冻干后即得铁饱和重组人乳铁蛋白（FerhLF）粉末，其中铁含量为6.62mg/g。

本发明首次尝试利用转基因克隆牛乳表达的重组人乳铁蛋白进行补铁产品的开发。利用这种新的补铁制剂，大大增强了改善缺铁性贫血的效果，显著的提高了缺铁性贫血大鼠的血红蛋白浓度，其恢复效果远比阳性对照（FeSO₄）组迅速且没有明显的不良反应，使用安全，效果明显，制备方法简单。

附图说明

图1为本发明rhLF中试纯化SP Sepharose Big Beads层析效果图。

图2为本发明SDS-PAGE电泳检测rhLF纯度结果。

图3为本发明连续进行8次纯化的rhLF SDS-PAGE电泳检测结果。

图4为本发明利用高效凝胶过滤比较分析rhLF与hLF。

图5为本发明利用圆二色谱比较rhLF与hLF二级结构。

图6为本发明利用FerhLF进行大鼠贫血恢复实验中的血常规检测结果，A为血红蛋白浓度，B为红细胞个数，C为红细胞压积，D为红细胞平均血红蛋白含量，不同小写字母标识标识组间有显著差异。

图7为本发明利用FerhLF进行大鼠贫血恢复实验中的其他指标分析结果，A为红细胞平均容量，B为肝铁，C为脾铁，不同小写字母标识组间有显著差异。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例使用的试剂及其来源：

Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、NaOH、95%乙醇、NaCl、Fe_SO₄FeCl₃、NaHCO₃均为国产分析纯，购自北京化学试剂公司。其他试剂均为国产分析纯。天然人乳铁蛋白（hLF）购自sigma公司。牛乳铁蛋白购自新西兰Tatua公司（蛋白含量90%其中乳铁蛋白含量95%）。牛乳铁蛋白去内毒素购自比利时NFQ公司。

所用仪器如下：

陶瓷膜超滤系统，陶普森

蠕动泵（Easy load Masterflex），Millpore

层析柱（BPG140/500），GE Healthcare

层析介质(SP Sepharose Big Beads)，GE Healthcare

层析系统（AKTA Pilot），GE Healthcare

乳脂分离机（Ж5-Плава-100），俄罗斯

超滤浓缩系统，Millpore

全自动血细胞分析仪，MEK-6318k

圆二色光谱仪为Jasco810(Jasco，日本)。

缓冲溶液配制：

1)PBS储液配制

储液1：Na₂HPO₄·12H₂O(0.2M，Mw：358.14，16L)：称取1146g Na₂HPO₄.12H₂O倒入20L容器中，加入去离子水16L，搅拌备用。

储液2：NaH₂PO₄·2H₂O(0.2M，Mw：156.01，18L)：称取561.636g NaH₂PO₄.2H₂O倒入20L容器中，加入去离子水18L，搅拌备用。

2)层析缓冲液配制

Buffer A(100L)：使用量筒分别量取8.77L储液2和1.23L0.2M储液1于100L容器中，即为10×BufferA备用。临用前加入去离子水90L，搅拌溶解完全后用1M NaOH（或1M HCl）调pH值至6.5，存储于两个50L PP桶中备用。

Buffer B(50L)：使用量筒分别量取0.265L储液2和4.735L储液1于100L容器中，同时称取NaCl2922g，即为10×BufferB，0.45μm滤膜微滤备用；临用前加入去离子水45L，搅拌溶解完全后用1M NaOH（或1M HCl）调pH值至6.5，存储于50L PP桶中备用。

3）超滤缓冲溶液配制

Buffer A(50L)：使用量筒分别量取4.385L储液2和0.615L0.2 M储液1于100L容器中，即为10×BufferA。加入去离子水45L，搅拌溶解完全后用1M NaOH（或1M HCl）调pH值至6.5，存储于50L PP桶中备用。

实施例1 表达重组人乳铁蛋白的转基因牛的制备

根据CN1873001（发明名称：转人乳铁蛋白基因的转基因克隆大型家畜的生产方法）中公开的方法制备重组人乳铁蛋白转基因牛。操作步骤如下：(1)利用含有完整人乳铁蛋白基因的hLF BAC DNA作为乳腺特异表达载体；(2)将hLF BAC DNA与双标记选择载体pEGFP-NEO或单标记选择载体pNEO按比例混合，导入家畜体细胞核内，进行细胞转染，获得转入hLF BAC DNA的转基因细胞；(3)细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得转有hLF BAC DNA的转基因牛。

所述重组人乳铁蛋白（rhLF）的氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

实施例2 重组人乳铁蛋白的中试纯化及质量控制

1.1制备rhLF牛乳脱脂乳

将由实施例1中的转基因牛产生的rhLF牛乳加热到40-45℃，将牛乳排进乳脂分离机调整转数为65-75转/分钟。每批次牛乳连续脱脂两次，以充分去除脂肪。

1.2陶瓷膜过滤除菌

利用陶瓷膜（孔径1.4μm）对脱脂牛乳进行超滤，因细菌大小在0-5μm左右，可以达到冷除菌的效果。

实验操作如表1所示。

表1 利用陶瓷膜过滤除菌的操作步骤

1.3从脱脂乳中分离纯化rhLF

1.3.1缓冲液配制

(1)PBS储液配制

储液1：Na₂HPO₄.12H₂O(0.2M，Mw：358.14，16L)：称取1146gNa₂HPO₄.12H₂O倒入20L容器中，加入去离子水16L，搅拌备用。

储液2：NaH₂PO₄.2H₂O(0.2M，Mw：156.01，18L)：称取561.636gNaH₂PO₄.2H₂O倒入20L容器中，加入去离子水18L，搅拌备用。

(2)缓冲液A和B的配制

Buffer A(100L)：使用量筒分别量取8.77L储液2和1.23L0.2M储液1于100L容器中，即为10×Buffer A，备用。使用前加入去离子水90L，搅拌溶解完全后用1M NaOH（或1M HCl）调pH值至6.5，存储于两个50L PP桶备用。

Buffer B(50L)：使用量筒分别量取0.265L储液2和4.735L储液1于100L容器中，同时称取NaCl2922g，即为10×Buffer B，0.45μm滤膜微滤后备用；使用前加入去离子水45L，搅拌溶解完全后用1MNaOH（或1M HCl）调pH值至6.5，存储于50L PP桶备用。

1.3.2装层析柱

(1)将离子交换介质SP Sepharose Big Beads（新介质，保存于20%乙醇中）摇匀后备用；

(2)取BPG140/500层析柱，清洗干净后垂直放置，排空出口端adapter的气泡后将其接到层析柱上，添加约1cm高度的超纯水，然后由玻璃棒将搅拌均匀的离子交换介质缓慢引入层析柱中，接着将已排出气泡的入口端的adapter连接到层析柱上；

(3)层析柱安装完毕后通过常压层析系统先用超纯水冲洗（冲洗掉保存介质的乙醇）5个柱体积（流速：1L/min），然后再用2个柱体积的BufferA（平衡缓冲液）平衡层析柱至层析柱出口液体pH平衡；

(4)最后降低入口端adapter至介质表面，注意排空气泡。记录最终层析柱高度，柱床体积控制在3L左右。

1.3.3离子交换层析

层析柱型号：BPG140/500层析介质：SP Sepharose Big Beads柱高：20cm；柱体积：3L；层析系统：AKTA Pilot；总时间：304min。平行上样8次。（表2）

表2 离子交换层析的洗脱步骤

Figure 2012102278455100002DEST_PATH_IMAGE001

离子交换层析结果如图1所示。

层析过程中，脱脂乳开始上样一个柱体积后，层析柱上介质呈现出黄色；上样完成后，黄色的乳清流穿，层析柱上部约四分之一体积的介质呈浅灰色。对穿透峰分段取样，在开始穿透时所得样品较为浑浊，呈灰黄色，穿透峰中期取样为白色，为流穿的酪蛋白，使用BufferA冲洗介质时所得穿透峰为清亮的黄色。40%Buffer B预洗脱时所得洗脱峰为黄色，此时与介质结合较弱的乳过氧化物酶被洗脱下来，预洗脱10个柱体积后，杂质乳清蛋白及内毒素被去除，层析柱上原来为浅灰色的部分变为淡红色。开始用100%Buffer B洗脱后，淡红色条带在柱上向下移动并被洗脱出来，得到的LF目标洗脱峰呈淡红色。

1.3.3SDS PAGE电泳分析rhLF纯度

将hLF、bLF、100%Buffer B洗脱下来的rhLF以及40%B洗脱收集的样品用10%SDS-PAGE进行电泳，利用原料奶作为对照。电泳时间为50V，1h；90V，2h。从电泳图中可看出，中试工艺中100%Buffer B洗脱得到的rhLF纯化产物与天然hLF标准品（Sigma）分子量相同，与市售hLF标准品（Sigma）、bLF标准品（天淳）、去内毒素bLF标准品（新百利）相比纯度更高，灰度扫描得LF纯度大于95%。40%BufferB预洗脱峰中hLF损失较少，其中与LF分子量相近的条带可能为乳过氧化物酶（图2）。

中试过程中8次平行层析所得LF目标峰电泳结果表明中试工艺重复性较好，8次层析所得目标蛋白纯度较高（图3）。

1.4rhLF纯化溶液的超滤浓缩与冷冻干燥

1.4.1超滤凝缩脱盐：

(1)取rhLF活性洗脱峰组分（体积约50L），经蠕动泵泵入超滤膜进行超滤，将上述溶液浓缩至体积8L。

(2)加入4L20mM PB,pH6.0循环7次，以充分除去溶液中的氯化钠，至浓缩液出口电导率低于1mS/cm。

(3)将上述溶液浓缩至体积4L。

(4)取样2mL×2，测定蛋白浓度（A280法，或考马斯亮兰法A595），称重法定浓缩脱盐液的体积。（蛋白溶液的密度为0.99g/ml）。

1.4.2真空冷冻干燥：

操作条件：冻干分三个阶段，第一阶段预冻-40℃4个小时；第二阶段冻干升华分5次升温，每次升10℃用时一个小时，然后直接升到30℃保持温度400分钟，压强300mtorr相当于0.399mbar，对应样品温度-29℃。第三阶段冻干条件30℃，压强为0，240分钟。

1.5rhLF的纯度与理化性质分析

1.5.1高效凝胶过滤比较分析rhLF与hLF

凝胶过滤使用Agilent1260层析系统和SuperSW3000(4.6mm(ID)×30cm(L),TOSOH）层析柱，缓冲液为0.1M PB-0.1M Na₂SO₄，流速0.5ml/min，进样量20μL。高效凝胶过滤分析表明中试纯化所得rHLF与天然HLF标准品出峰时间一致，具有非常相近的分子量（图4）。

1.5.2圆二色谱分析rhLF与hLF结构

利用圆二色谱。扫描波长为190~260nm，分辨率为1nm。用与待测样品中溶液相同的体系作为空白，CD谱图为三次测量结果的平均值。结果表明，中试纯化得到的重组人乳铁蛋白的圆二色谱图与与天然人乳铁蛋白基本重合，表明牛乳腺表达的重组人乳铁蛋白与天然乳铁蛋白的二级结构基本一致。离子交换介质上的吸附解吸没有造成蛋白二级结构的不可逆变化，这有利于得到完整生物活性的重组蛋白（图5）。

实施例3 铁饱和重组人乳铁蛋白（FerhLF）的制备

具体实验步骤如下：

1）将纯化后冻干的120g rhLF粉末用蒸馏水溶解定容至12L，制备成1%的rhLF溶液。

2）分别配制1.4%FeCl₃溶液28L和10%NaHCO₃溶液28L。

3）将12L1%的rhLF溶液与28L1.4%FeCl₃,28L10%NaHCO₃混合，不断搅拌充分混匀，室温静置1小时。

4）将反应后的溶液离心收集上清，上清液呈棕红色。

5）利用Millpore的超滤浓缩系统将60L上清溶液进行超滤浓缩与缓冲液置换（20mM PB），每批循环6次，将体积压缩至8L并将置换后溶液冻干获得FerhLF粉末。

6）铁含量测定：利用原子发射光谱对FerhLF进行铁含量测定，铁含量为6.62mg/g。

实施例4 FerhLF改善大鼠缺铁性贫血

实验原理：

依据《改善营养性贫血功能检验方法》，用低铁饲料喂饲动物可形成实验性缺铁性贫血模型，再给予“铁饱和重组人乳铁蛋白”，观察其对动物血液细胞学、血液生化学等指标的影响，可判定该受试样品对改善动物营养性贫血的作用。

实验动物：

健康初断乳SD种系大鼠，雄性，正式贫血恢复实验时每组大鼠8～12只。

3.1建立缺铁性贫血大鼠模型

大鼠在实验环境下适应3～5天后，饲予低铁饲料（配方见表3）及双蒸水，采用不锈钢笼及食罐，实验过程中避免铁污染。自第3周开始每周选取部分大鼠采尾血测定血红蛋白（HGB）含量，直至多数动物HGB低于100g/L以下时，测定全部大鼠的体重及HGB。4周以后饲喂缺铁性饲料的大鼠血红蛋白平均值已低于90g/L,红细胞数（RBC），红细胞压积（HCT）,红细胞平均容量（MCV），红细胞平均血红蛋白含量（MCH也显著低于正常值(表4)，表明大鼠贫血模型建立成功。

表3 低铁饲料配方

表4 制备大鼠缺铁性贫血模型后的血常规

3.2利用FerhLF进行缺铁性贫血大鼠模型血红蛋白恢复实验

选取Hb<100g/L的大鼠作为实验动物，根据贫血大鼠Hb水平和体重将其随机分为低铁对照组和实验组，各组均继续饲予低铁饲料，低铁对照组给予相应溶剂，实验组分别于每日上午8：00给予不同剂量的受试样品，受试样品给予时间30天，必要时延长至45天，测定体重及各项血液学指标。另设常规饲料喂养组，不造贫血模型，实验期间以双蒸水灌胃(表5)。

表5 实验动物分组及剂量选择

3.3血液学指标检测

利用MEK-6318k全自动血细胞生化仪对各组动物血液进行分析，检测血红蛋白浓度，红细胞个数，红细胞压积，红细胞平均血红蛋白含量，平均红细胞容量，肝铁，脾铁等指标以评价铁饱和乳铁蛋白改善缺铁性贫血的效果如图6和图7所示（不同小写字母标识标识组间有显著差异）。

28天饲喂实验后，各实验组大鼠血红蛋白浓度相比模型对照组都恢复显著且都提高至100g/L以上。其中FerhLF(高)和FerhLF(中)组血红蛋白浓度恢复较其他组更为快速有效。FerhLF(高)组血红蛋白浓度已经与正常对照组血红蛋白浓度无明显差异，表明FerhLF(高)组已经基本恢复正常。在相同铁含量下，阳性对照（FeSO₄）组血红蛋白恢复能力较慢，且效果逊于FerhLF(高)。FerhLF(低),rhLF+Fe²⁺和bLF+Fe²⁺组血红蛋白浓度与FeSO4组无明显差异，表明乳铁蛋白单独添加Fe²⁺并没有更好的增加铁的吸收这可能是由于乳铁蛋白不能结合Fe²⁺，并不能以乳铁蛋白的机制将其转运到血液中。另外，FerhLF(高)还能够显著提高红细胞数目，红细胞压积，红细胞平均血红蛋白量，红细胞平均容量，肝铁及脾铁水平等指标且明显优于其他组进一步证实FerhLF(高)能够明显的改善缺铁性贫血。

根据《改善营养性贫血功能检验方法》，受试物组与模型对照组相比Hb浓度升高幅度达到10g/L以上，判定该受试物有升高血红蛋白作用。若受试物组Hb浓度升高接近正常水平，则说明该受试物具有较强的升高Hb浓度的作用。因此，中、高剂量FerhLF都具有较强的升高Hb浓度的作用。FerhLF(低),rhLF+Fe²⁺和bLF+Fe²⁺以及FeSO₄组也都具有升高血红蛋白作用。

以上实验表明FerhLF改善缺铁性贫血的效果最为突出，添加rhLF的铁制剂效果也能够改善缺铁性贫血。利用rhLF作为补铁补血药品保健品的开发不仅可以增强补铁效果降低铁离子的副作用，而且还能够增强机体免疫力。因此，对于rhLF的开发将具有广阔的商业前景和应用价值。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种改善缺铁性贫血的产品，其特征在于，其为铁饱和重组人乳铁蛋白。

2.制备权利要求5所述改善缺铁性贫血产品的方法，其特征在于，使重组人乳铁蛋白与Fe³⁺在NaHCO₃或KHCO₃溶液中进行螯合；其中，所述重组人乳铁蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

3.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，其是将重组人乳铁蛋白粉末溶于水配制成溶液，然后将该溶液与FeCl₃溶液以及NaHCO₃或KHCO₃溶液混合，搅拌后制成铁饱和重组人乳铁蛋白溶液，随后经过脱盐与冻干后即得铁饱和重组人乳铁蛋白粉末。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组人乳铁蛋白粉末的制备包括如下步骤：

1）转基因牛的制备。包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中用含0.4MNaCl，pH值6.5的20mM PBS进行预洗脱去除杂蛋白，然后用含1MNaCl，pH值6.5的20mM PBS进行洗脱，收集合并具有同一rhLF活性洗脱峰峰值的洗脱液。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述超滤具体为：将步骤3）中得到的具有同一rhLF活性洗脱峰峰值的洗脱液，经蠕动泵泵入超滤膜进行超滤浓缩，加入pH值6.0的20mM磷酸盐缓冲液，循环7次，直至浓缩液出口电导率低于1mS/cm，再将溶液进一步进行浓缩。